用于工程化的可植入組織和器官的平臺及其制備方法
【專利摘要】本文公開了包含一個或多個肌肉層的工程化組織和器官，該工程化組織或器官基本上由細胞材料組成，條件是該工程化組織或器官可植入到脊椎動物受試者中，并且不是血管。
【專利說明】用于工程化的可植入組織和器官的平臺及其制備方法
相關申請的交叉引用
[0001]本申請要求提交于2011年9月12日的美國申請序列號61/533，761和提交于2011年9月12日的美國申請序列號61/533，766的權益，二者均通過引用整體并入本文。
發(fā)明背景
[0002]醫(yī)療行業(yè)面臨著許多緊迫的問題。截至2009年12月，有105，305名患者因需要器官移植而在器官分享聯(lián)合網(wǎng)絡(United Network for Organ Sharing,UNOS)上登記。2009年I月至9月之間，只進行了 21，423例移植。與進行的移植相比，每年有更多的患者加入UNOS名單，導致等待移植的患者人數(shù)凈增長。例如，在2008年初，有75，834人因需要腎臟而登記；在當年年底，這個數(shù)字已經(jīng)增長到80，972。當年進行了 16，546例腎臟移植，但該名單中增加了 33，005名新的患者。UNOS登記需要腎臟的患者在2008年的移植率為20%。等待名單中的患者的死亡率為7%。

【發(fā)明內容】

[0003]對能促進再生醫(yī)學和組織工程學技術應用于緩解對可植入組織和器官的迫切需求的材料、工具和技術存在需求。此外，對適用于創(chuàng)傷修復、組織增大、器官修復和器官置換的可植入組織和器官存在需求。因此，本發(fā)明人在此描述了可植入的組織、器官及其制備方法。
[0004]一方面，本 文公開了包含一個或多個層的、活的三維工程化組織或器官，該一個或多個層的特征在于以下的一項或多項:a)使用時基本無支架(scaffold-free);和b)生物打印的，該一個或多個層適合于在充分成熟后植入脊椎動物受試者中；條件是該工程化組織或器官的至少一個層包含肌細胞，并且該工程化組織或器官不是血管。在一些實施方案中，至少一個層包含多種細胞類型，該細胞類型相對于彼此空間排列從而構建平面幾何形狀。在進一步的實施方案中，至少一個層在制作時在其最小維度上為至少IOOym厚。在一些實施方案中，該組織或器官包含多個層，至少一個層在組成上或結構上與至少一個其它層不同，以構建層狀的幾何形狀。在進一步的實施方案中，至少一個層在制作時在其最小維度上為至少IOOym厚。在一些實施方案中，該組織或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。在一些實施方案中，該組織或器官在使用時基本不含任何預形成的支架。在一些實施方案中，該組織或器官是生物打印的。在一些實施方案中，該一個或多個層生成細胞外基質。在一些實施方案中，該肌細胞是平滑肌細胞。在一些實施方案中，該肌細胞是骨骼肌細胞。在一些實施方案中，該肌細胞是心肌細胞。在一些實施方案中，該肌細胞來源于能夠分化成肌細胞的干細胞或祖細胞。在進一步的實施方案中，該干細胞或祖細胞在制作之前、期間或之后分化成肌細胞。在一些實施方案中，該組織或器官進一步包含選自以下的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞、內胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞及其組合。在一些實施方案中，除肌細胞以外的細胞被分配到該一個或多個層的至少一個表面上。在進一步的實施方案中，除肌細胞以外的細胞被生物打印到該一個或多個層的至少一個表面上。在一些實施方案中，除肌細胞以外的細胞基本在一個或多個層制作的同時、在一個或多個層制作之后、在一個或多個層成熟期間或在一個或多個層成熟之后被分配到該一個或多個層上。在一些實施方案中，除肌細胞以外的細胞被分配到該一個或多個層上成為約I至約20個細胞厚的細胞層。在一些實施方案中，該一個或多個層基本是平面的。在進一步的實施方案中，該組織或器官是適用于創(chuàng)傷修復、組織置換或組織增大的含肌細胞的片或補片(patch)。在一些實施方案中，該一個或多個層基本上是管狀的。在進一步的實施方案中，該組織或器官是輸尿管、泌尿導管、肝門十二指腸(portoduodenal)腸導管、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、尿道、腸、結腸、食道或其一部分。在一些實施方案中，該一個或多個層基本是囊。在進一步的實施方案中，該組織或器官是胃、膀胱、子宮或膽囊或其一部分。在一些實施方案中，該組織或器官選自:尿道、泌尿導管、肝門十二指腸腸導管、輸尿管、膀胱、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、食道、胃、膽囊、腸和結腸。
[0005]另一方面，本文描述了該組織和/或器官的植入。
[0006]另一方面，本文描述了在培養(yǎng)物中維持該組織和/或器官用于離體研究用途。
[0007]另一方面，本文描述了用于制備包含含肌細胞層的可植入組織或器官的方法，該方法包括:將含肌細胞的生物墨水生物打印成形式；并且將該生物墨水融合成凝聚的細胞結構；條件是該組織或器官可植入脊椎動物受試者，并且不是血管。在一些實施方案中，可植入組織或器官在使用時基本不含任何預形成的支架。在一些實施方案中，該肌細胞是平滑肌細胞。在一些實施方案中，該肌細胞是骨骼肌細胞。在一些實施方案中，該肌細胞是心肌細胞。在一些實施方案中，該肌細胞分化自祖細胞。在一些實施方案中，該肌細胞由組織樣品產(chǎn)生。在進一步的實施方案中，該組織樣品是脂肪抽吸物。在一些實施方案中，該形式是囊或片。在一些實施方案中，該形式是在生物打印時內徑為約0.15_或更大的管，其中該管不打算用作血管旁路移植物或動脈-靜脈分流物(shunt)。在一些實施方案中，該生物墨水進一步包含選自以下的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞、內胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞及其組合。在一些實施方案中，該方法進一步包括將除肌細胞以外的細胞生物打印、噴涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、接種、注射或分層到生物打印的形式之中或之上的步驟。在一些實施方案中，該方法進一步包括將除肌細胞以外的細胞生物打印、噴涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、注射、接種或分層到凝聚的細胞結構之中或之上。
[0008] 另一方面，本文描述了包含一個或多個層的、活的三維工程化組織或器官，該一個或多個層的特征在于以下的一項或多項:a)使用時基本無支架，和b)生物打印的，該一個或多個層成熟到針對脊椎動物受試者的植入就緒狀態(tài)；該工程化組織或器官基本上由細胞材料組成；條件是該工程化組織或器官的至少一個層包含肌細胞，并且該工程化組織或器官不是血管。在一些實施方案中，至少一個層包含多種細胞類型，該細胞類型相對于彼此空間排列從而構建平面幾何形狀。在進一步的實施方案中，至少一個層在制作時在其最小維度上為至少IOOym厚。在一些實施方案中，該組織或器官包含多個層，至少一個層在組成上或結構上與至少一個其它層不同，以構建層狀的幾何形狀。在進一步的實施方案中，至少一個層在制作時在其最小維度上為至少100μπι厚。在一些實施方案中，該組織或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。在一些實施方案中，該肌細胞是平滑肌細胞。在一些實施方案中，該肌細胞是骨骼肌細胞。在一些實施方案中，該肌細胞是心肌細胞。在一些實施方案中，該組織或器官進一步包含選自以下的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞、內胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞及其組合。在一些實施方案中，細胞被分配到至少一個層的至少一個表面上。在進一步的實施方案中，細胞被生物打印到至少一個層的至少一個表面上。
[0009]另一方面，本文描述了該組織和/或器官的植入。
[0010]另一方面，本文描述了在培養(yǎng)物中維持該組織和/或器官用于離體研究用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]在所附權利要求書中詳細闡明了本發(fā)明的新穎特征。通過參考以下闡明了說明性實施方案的發(fā)明詳述(其中利用了本發(fā)明的原理)和附圖，將獲得對本發(fā)明特征和優(yōu)點的更好理解，附圖中:
[0012]圖1描繪了生物打印的平滑肌補片(例如，片)的非限制性實例，其由含有平滑肌細胞(SMC)并且還含有內皮細胞(EC)的生物墨水構建。在此實例中，該生物墨水在生物打印之前被配制成圓柱形形式。示出了各種組織學染色，以指示細胞類型的分布和位置。
[0013]圖2描繪了生物打印的平面平滑肌補片(例如，片)的非限制性實例，其由僅含SMC的生物墨水構建。在此實例中，該SMC生物墨水不含任何支架或外源性加入的生物材料，并且采用圓柱形生物打印形式在NovoGen MMX生物打印機上生物打印。在此實例中，在制作后立即將第二細胞類型(內皮細胞)生物打印到生物打印的SMC補片的單個表面上形成薄層。示出了各種組織學染色，以指示細胞類型的分布和位置。
[0014]圖3a描繪了從由人動脈來源的SMC組成的生物墨水生物打印的平面平滑肌補片(例如，片)的非限制性實例。在此實例中，SMC被打印到人皮膚成纖維細胞(HDF)層之上，以模擬與含成纖維細胞的外膜相鄰的平滑肌細胞層的天然生物學。在此實例中，第三細胞類型(人動脈來源的內皮細胞)被生物打印到該生物打印的平滑肌補片之上形成薄層。對HASMC進行a SMA染色。
[0015]圖3b是描繪了平滑肌補片(由SMC生物墨水構成)的一個非限制性實例的宏觀圖像，其緊隨在NovoGen MMX生物打印機上進行生物打印之后示出。在此實例中，利用非粘附性水凝膠限制材料(NovoGel?)作為在其上打印構建體的基底支持物，以及環(huán)繞該生物打印的平滑肌補片的限制窗。
[0016]圖4a是描繪了生物打印的平面平滑肌補片(例如，片)的一個非限制性實例的宏觀圖像，該補片由含有人動脈來源的SMC組合人動脈來源的內皮細胞(以85:15的比例混合)的圓柱形生物墨水構建。
[0017]圖4b描繪了生物打印的平面平滑肌補片(例如，片)的非限制性實例，該補片由含有比例為85:15的SMC: EC的圓柱形生物墨水構建。通過對內皮細胞的特異性標志物⑶31進行免疫染色來鑒定EC (內皮細胞)。
[0018]圖5是生物打印的平滑肌片的一個非限制性實例，其已經(jīng)被生物打印在非粘附性水凝膠支持結構內，其中置于生物打印的平滑肌補片之上的限制材料被配置成網(wǎng)格結構，以允許直接接觸生物打印的片的至少一些部分以及營養(yǎng)培養(yǎng)基；還示出了制作它們的示例性步驟。
[0019]圖6是含有生物打印的平滑肌的管的一個非限制性實例。在此實例中，生物墨水包含SMC與兩種其它細胞類型(成纖維細胞和內皮細胞)的組合，比例為75:25:5、
47.5:47.5:5 和 85:10:5 (從左到右)。
[0020]圖7是描繪了工程化肝組織的一個非限制性實例的宏觀圖像，在此實例中，肝組織是通過使用連續(xù)沉積機構采用由在擠出化合物(例如，PF-127)中包封的細胞構成的生物墨水而生物打印的。(A)示出了單個功能單元的示意圖；(B)每一層具有平面的棋盤格狀幾何形狀的多層片；(C)和(D)示出了培養(yǎng)基施加和擠出化合物溶出之后的構建體。
[0021]圖8是H&E染色的圖7的多層構建體的顯微照片，描繪了棋盤格狀幾何形狀的示例性“輪輻(spoke) ”。
[0022]圖9是圖示了雙細胞系統(tǒng)中可能的混合物的線圖。
[0023]圖10是管狀構建體的橫截面的示意圖。示例性命名約定由圓柱形生物墨水單元的數(shù)目和緊隨其后的軸向NovoGel?圓柱體的數(shù)目組成:(A) 6/1，(B) 12/4，(C) 10/4，和(D)12/7 ο
[0024]圖11描繪了 用多型生物墨水組合物生物打印的6/1管狀構建體，包括(A)宏觀總體形態(tài)學，(B)示出了不透明性和光滑表面的總體形態(tài)學的放大圖，和橫截面組織學的顯微照片(下面一排)。
[0025]圖12圖示了通過連續(xù)縫合(A)或多個間斷縫合(B)像外科手術一樣附接在一起的生物打印的組織片。
[0026]圖13描繪了為了長期保持和成熟而制作到多孔插入物上的生物打印的骨骼肌組織㈧。培養(yǎng)3天和9天后，生物打印的骨骼肌組織的H&E染色(B，C)。
發(fā)明詳述
[0027]本發(fā)明涉及再生醫(yī)學和組織/器官工程領域。更具體地，本發(fā)明涉及包含至少一個含肌細胞層的組織和器官，其中該工程化組織或器官基本上由細胞材料組成，并且涉及其制備方法。本文所公開的組織、器官和方法的優(yōu)勢包括，例如，柔性三維組織幾何形狀，這允許制作任選分層的含肌細胞的片、管和囊。另一個優(yōu)勢在于靈活的分層法，這允許將除肌細胞以外的一種或多種細胞類型布置、分配和/或生物打印到該層的至少一個表面上。這些優(yōu)勢導致能模擬天然組織組成和結構的工程化組織和器官。
[0028]在某些實施方案中，本文公開了包含一個或多個層的、活的三維工程化組織或器官，該一個或多個層的特征在于以下的一項或多項:a)使用時基本無支架；和《生物打印的，該一個或多個層適合于在充分成熟后植入脊椎動物受試者中；條件是該工程化組織或器官的至少一個層包含肌細胞，并且該工程化組織或器官不是血管。
[0029]在某些實施方案中，本文還公開了該組織和/或器官的植入。
[0030]在某些實施方案中，本文還公開了用于制備包含含肌細胞層的可植入組織或器官的方法，該方法包括:將含肌細胞的生物墨水生物打印成形式；以及將該生物墨水融合成凝聚的細胞結構；條件是該組織或器官可植入脊椎動物受試者，并且不是血管。
[0031]在某些實施方案中，本文還公開了包含一個或多個層的、活的三維工程化組織或器官，該一個或多個層的特征在于以下的一項或多項:a)使用時基本無支架；和《生物打印的，該一個或多個層成熟到針對脊椎動物受試者的植入就緒狀態(tài)；該工程化組織或器官基本上由細胞材料組成；條件是該工程化組織或器官的至少一個層包含肌細胞，并且該工程化組織或器官不是血管。
[0032]在某些實施方案中，本文還公開了該組織和/或器官的植入。
某些定義
[0033]除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。
[0034]如在本說明書和所附權利要求書中使用的，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復數(shù)的指示物，除非上下文另有明確規(guī)定。因此，例如，提及“一種核酸”包括一種或多種核酸，和/或本領域技術人員在閱讀本公開內容等之后將會明白的、本文所述的類型的組合物。本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有說明。
[0035]如本文中使用的，“生物墨水”意指包含多個細胞的液體、半固體或固體組合物。在一些實施方案中，生物墨水包含細胞溶液、細胞聚集體、包含細胞的凝膠、多細胞體或組織。在一些實施方案中，生物墨水另外還包含支承材料。在一些實施方案中，生物墨水另外還包含提供使生物打印能夠進行的特定生物力學特性的非細胞材料。
[0036]如本文中使用的，“生物打印”是指:經(jīng)由與自動的或半自動的、計算機輔助的三維原型裝置(例如生物打印機)相匹配的方法，利用細胞(例如細胞溶液、含細胞的凝膠、細胞懸浮液、細胞濃縮物、多細胞聚集體、多細胞體等)的三維精確沉積。
[0037]如本文中使用的，“血管”意指平滑肌細胞管，其進一步包含血管內皮細胞并具有大于100μπι的內徑，且旨在于體內作為間置血管移植物、旁路血管移植物或動靜脈血管分流物使用。如本文使用的“血管”明確不包括其它器官或組織的組成血管元件(動脈、靜脈、小動脈、小靜脈、毛細血管和微脈管系統(tǒng))。例如，與膀胱、腸或食道有關的血管網(wǎng)絡將不包括在如本文所提出的“血管”的定義中。
[0038]如本文中使用的，“凝聚(cohere) ”、“凝聚的(cohered) ”和“凝聚(cohesion) ”指將細胞、細胞聚集體、多細胞聚集體、多細胞體和/或它們的層結合起來的細胞-細胞粘附性質。該術語可以與“融合(fuse) ”、“融合的(fused)”和“融合(fusion) ”互換使用。
[0039]如本文中使用的，“細胞外基質”意指由細胞產(chǎn)生并被轉運出細胞進入細胞外隙的蛋白質，在其中它們作為支持物將組織保持在一起，以提供拉伸強度和/或促進細胞信號傳導。
[0040]如本文中使用的，“可植入”意指生物相容的以及能夠暫時或基本永久地插入或移植到或附著到活生物體中。
[0041]如本文中使用的，“層狀”是指多層的、生物打印的組織，其中兩個或多個平面層組合起來以增加該組織在z平面的總厚度。在一些實施方案中，每個平面層在結構和/或組成上基本類似。在其它實施方案中，每個平面層在結構和/或組成上是基本上獨特的。
[0042]如本文中使用的，“多層的”是指由兩個或多個組織層組成，其中每個組織層是一個或多個細胞層的厚度。在一些實施方案中，組織層一次沉積一個。在其它實施方案中，同時沉積多個層。任選地，每個層是由多種細胞類型組成的。進一步地，在每個層中的多種細胞類型任選地在χ-y平面(即:水平平面)上以空間限定的結構相對于彼此排列。此外，在某些情況下，在Z-平面(即:垂直平面)上的層增加導致細胞在層內相對于彼此的受控空間定位，使得空間限定的結構在Z-平面上繼續(xù)。
[0043]如本文中使用的，“器官”意指加入結構單元中發(fā)揮共同功能的組織集合。器官的實例包括但不限于皮膚、尿道、導管、輸尿管、膀胱、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、食道、胃、膽囊、小腸、大腸和結腸。
[0044]如本文中使用的，“平面的”是指生物打印的多細胞組織的層，其中在該組織層的x-y平面內，多個生物墨水組合物和/或空隙空間相對于彼此空間布置成設定的圖案。“平面的”當用于描述組織“片”或“補片”的形狀時還意指基本是平的。
[0045]如本文中使用的，“支架”是指:合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝膠；非合成的支架，例如預形成的細胞外基質層、死細胞層和脫細胞的組織，以及任何其它類型的預形成支架，它對于工程化組織和/或器官的物理結構而言是必要的，并且不能在不損壞/破壞所述組織和/或器官的情況下從該組織和/或器官除去。在進一步的實施方案中，脫細胞的組織支架包括脫細胞的天然組織或以任意方式由培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生的脫細胞的細胞材料；例如，使之死亡或者脫細胞的細胞層，留下它們在活著時產(chǎn)生的ECM。本文使用的術語“無支架(scaffold-free)”表示含細胞的管、囊或片在使用時基本不含支架(如以上所定義的)?！盁o支架(scaffold-free) ”可以與“無支架(scaffoldless) ”或“無預形成的支架”互換使用。
[0046]如本文中使用的，“干細胞”意指表現(xiàn)出潛能和自我更新的細胞。干細胞包括但不限于全能細胞、多能細胞、多潛能細胞、寡能細胞、單能細胞和祖細胞。在各個實施方案中，干細胞是胚胎干細胞、圍產(chǎn)期干細胞、成體干細胞、羊膜干細胞和誘導性多能干細胞。
[0047]如本文中使用的，“受試者”意指任何個體。該術語與“患者”、“受體”和“供體”是可以互換的。這些術語都不應被解釋為需要醫(yī)療專業(yè)人員(例如，醫(yī)師、護士、執(zhí)業(yè)護士、醫(yī)生助理、護理員、臨終關懷工作者、社會工作者和臨床研究助理)或科研人員的(持續(xù)的或以其它方式的)監(jiān)督。
[0048]如本文中使用的，“組織”是指細胞的聚集體。組織的實例包括但不限于:結締組織(例如，網(wǎng)形結締組織、致密結締組織、彈性組織、網(wǎng)狀結締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經(jīng)組織和上皮組織(例如，單層上皮和復層上皮)、內胚層來源的組織、中胚層來源的組織和外胚層來源的組織。
組織工程
[0049]組織工程是跨學科的領域，其應用并結合了工程學和生命科學的原理，指向生物替代品的發(fā)展，該生物替代品通過器官或組織的增大(augmentation)、修復或更換來恢復、保持或改善組織功能。經(jīng)典組織工程學的基本方法是將活細胞接種到生物相容且最終可生物降解的環(huán)境中(例如支架)，隨后在生物反應器中培養(yǎng)該構建體，以便初始細胞群進一步擴充和成熟，以在植入后生成目標組織。采用模擬該生物細胞外基質(ECM)的適當支架，發(fā)育中的組織在體外和體內成熟之后采取了所需器官的形態(tài)和功能。然而，由于控制細胞在整個支架上的分布和空間布置的能力有限，達到足夠高的細胞密度并具有類似于天然組織的結構是具有挑戰(zhàn)性的。這些限制經(jīng)常導致組織或器官具有較差的機械性能和/或不足的功能。在支架的生物降解性、殘留聚合物的夾雜和制造工藝的工業(yè)規(guī)?；矫妫嬖陬~外的挑戰(zhàn)。已經(jīng)嘗試了無支架的方法。目前的無支架方法受到一些限制:?復雜的幾何形狀，例如多層結構，其中各層包含不同細胞類型，通常需要將細胞類型在特定結構中進行明確的、高分辨率的放置，以可再現(xiàn)地獲得類似于天然組織的結果。
?規(guī)模和/或幾何形狀受到擴散和/或營養(yǎng)供給需要功能血管網(wǎng)絡的限制。
?在許多情況下，組織的存活力受到限制材料的損害，該限制材料限制了擴散并限制細胞獲得營養(yǎng)物。
[0050]在一些實施方案中，本文中公開了工程化的組織和器官，以及制作方法。本文中公開的組織工程方法具有以下優(yōu)點:
?它們能夠產(chǎn)生包含細胞的組織和/或器官。
?通過重新產(chǎn)生類似于天然組織的細胞間相互作用，它們模擬在天然組織的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和/或發(fā)病中發(fā)現(xiàn)的環(huán)境條件。
?它們任選地獲得多樣的復雜拓撲結構(例如多層結構、節(jié)段、片、管、囊等)。
?它們與自動制造手段相匹配，并且是可規(guī)?；摹?br> [0051]生物打印使得產(chǎn)生包含細胞的可植入組織的改進方法成為可能，該可植入組織在組織修復、組織增大、組織置換和器官置換中是有用的(參見下文)。
牛物打印
[0052]在一些實施方案，工程化的可植入組織和/或器官的至少一個部件是生物打印的。在進一步的實施方案中，工程化的可植入組織和/或器官完全是生物打印的。在又進一步的實施方案中，生物打印的構建體是采用使用了快速原型技術的方法得到的，該快速原型技術是基于通過三維遞送裝置(例如生物打印機)將細胞和限制材料向(例如由水凝膠和/或多孔膜組成的)生物相容性表面上進行三維、自動化、計算機輔助的沉積，該細胞包括細胞溶液、細胞懸浮液、包含細胞的凝膠或漿料、細胞濃縮物、多細胞體(例如圓柱體、球形體、帶形體等)。如本文中使用的，在一些實施方案中，在用于指代組織和/或器官時，術語“工程化的”是指:根據(jù)計算機腳本，通過計算機輔助的裝置(例如生物打印機)，將細胞、細胞溶液、細胞懸浮液、包含細胞的凝膠或漿料、細胞濃縮物、多細胞聚集體和它們的層放置以形成三維結構。在進一步的實施方案中，計算機腳本例如是一個或多個計算機程序、計算機應用或計算機模塊。在更進一步的實施方案，通過細胞或多細胞體的打印后融合來形成三維組織結構，這類似于早期形態(tài)發(fā)生中的自組裝現(xiàn)象。
[0053]盡管有許多方法可以用來將細胞、多細胞聚集體和/或它們的層布置在生物相容性表面上以產(chǎn)生三維結構，包括手動放置，但通過自動化的、計算機輔助的機器(例如生物打印機)來放置是有利的。采用這種技術遞送細胞或多細胞體的優(yōu)點包括:快速、精確和可再現(xiàn)地放置細胞或多細胞體以產(chǎn)生構建體，該構建體表現(xiàn)出具有各種組成的細胞、多細胞聚集體和/或它們的層的計劃的或預先確定的取向或圖案。優(yōu)點還包括確定的高細胞密度，同時使細胞破壞減至最小。
[0054]在 一些實施方案中，生物打印方法是連續(xù)的和/或基本連續(xù)的。連續(xù)生物打印方法的非限制性實例是:經(jīng)由連接到生物墨水儲存器的分配末端(例如，注射器、毛細管等)從生物打印機分配生物墨水。在進一步的非限制性實施方案中，連續(xù)生物打印方法是按功能單元的重復圖案(pattern)分配生物墨水。在各個實施方案中，重復功能單元具有任何適宜的幾何形狀，包括例如:圓形、正方形、矩形、三角形、多邊形和不規(guī)則的幾何形狀。在進一步的實施方案中，生物打印的功能單元的一個重復圖案包括一個層，相鄰地生物打印(例如堆疊)多個層以形成工程化組織或器官。在各個實施方案中，相鄰地生物打印(例如堆疊)了 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個層，以形成工程化組織或器官。
[0055]在一些實施方案中，生物打印的功能單元以棋盤格狀圖案重復?！捌灞P格狀圖案”是沒有向該平面填充重疊和空隙的圖形平面。圖7A顯示任選地重復以產(chǎn)生圖7B所示的棋盤格狀圖案的功能單元的實例。作為非限制性的實例，連續(xù)和/或棋盤格狀生物打印的優(yōu)點包括提高的生物打印組織的生產(chǎn)率。另一個非限制性的示例性優(yōu)點是不需要將生物打印機與先前沉積的生物墨水元件對齊。連續(xù)生物打印還有利于從大型生物墨水儲存器打印較大的組織，任選地使用注射器機構。
[0056]在各個實施方案中，連續(xù)生物打印中的方法包括:獨立地或相對于彼此優(yōu)化和/或平衡諸如打印高度、泵速、機撲速度或其組合的參數(shù)。在一個實例中，用于沉積的生物打印機頭速度為3mm/s,第一層的分配高度為0.5mm,而后面每個層的分配高度增加0.4mm0在一些實施方案中，該分配高度與生物打印機分配末端的直徑基本相等。不受限制地，適宜的和/或最佳的分配距離不會導致材料變平或附著到分配針上。在各個實施方案中，生物打印機分配末端具有約 20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100(^111或更大的內徑，包括其中的增量。在各個實施方案中，生物打印機的生物墨水儲存器具有約 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 、75、80、85、90、95、100立方厘米或更大的容積，包括其中的增量。在一些實施方案中，當系統(tǒng)中的殘余壓力積累較低時，該泵速是適宜的或最佳的。在一些實施方案中，有利的泵速取決于儲存器的橫截面積與分配針之間的比例，該比例越大，則需要越低的泵速。在一些實施方案中，適宜的和/或最佳的打印速度使得能夠沉積均勻的線，而不影響材料的機械完整性。
[0057]本文中公開的發(fā)明包括商業(yè)方法。在一些實施方案中，本文中公開的技術和方法的速度和可放大性用來設計、構建和操作用于生產(chǎn)供植入使用的工程化組織和/或器官的工業(yè)和/或商業(yè)設施。在進一步的實施方案中，工程化的組織和/或器官例如作為用于體內用途(例如組織損傷、組織疾病和/或器官衰竭的醫(yī)學治療)的材料、工具和試劑盒進行生產(chǎn)、儲存、分發(fā)、上市、宣傳并銷售。在其它實施方案中，工程化的組織和/或器官例如作為用于體外用途(例如，科學和/或醫(yī)學研究)的材料、工具和試劑盒進行生產(chǎn)、儲存、分發(fā)、上市、宣傳并銷售。在進一步的實施方案中，工程化的組織和/或器官被保持在細胞培養(yǎng)環(huán)境中并在科學和/或醫(yī)學研究中使用。
工程化的組織和器官
[0058]在某些實施方案中，本文公開了包含一個或多個層的、工程化的可植入組織和/或器官，其中至少一個層包含肌細胞。在一些實施方案中，該一個或多個層的特征在于其在使用時、在生物打印(本文描述的技術)時或在使用和生物打印時基本無支架。在進一步的實施方案中，該一個或多個層和/或該工程化組織或器官基本上由細胞材料組成。在一些實施方案中，該一個或多個層適合于在充分成熟后植入脊椎動物受試者中。在一些實施方案中，該一個或多個層成熟到針對脊椎動物受試者的植入就緒狀態(tài)。
[0059]在一些實施方案中，該工程化的組織和器官基本上由細胞材料組成。在各個進一步的實施方案中，該工程化組織和器官的包含細胞的部分在構建時由30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5,99.9 和 100% (包括其中的增量)的細胞材料組成。在其它各個實施方案中，該工程化組織和器官的包含細胞的部分在使用時由30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5、99.9 和 100% (包括其中
的增量)的細胞材料組成。在一些實施方案中，該工程化組織是凝聚和/或粘附的細胞聚集體。在一些實施方案中，使用前去除非細胞組分。在進一步的實施方案中，通過物理、化學或酶的手段去除非細胞組分。在一些實施方案中，一部分非細胞組分在使用時仍與細胞組分相關聯(lián)。在一些實施方案中，非細胞組分選自:水凝膠、表面活性劑多元醇、熱響應性聚合物、透明質酸鹽、藻酸鹽、膠原蛋白或其它生物相容性天然或合成聚合物。
[0060]該工程化組織任選地模擬任何人或哺乳動物組織。示例性組織包括上皮組織、結締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織等。在一些實施方案中，該工程化器官是加入結構單元中以發(fā)揮共同功能的組織的集合。該器官適當?shù)啬M任何天然的人或哺乳動物器官。作為非限制性的實例，示例性器官包括氣管、支氣管、食道、胃、腸、結腸、膽囊、子宮、輸卵管、輸尿管、膀胱、尿道、淋巴管等，包括它們的部分。
[0061]在一些實施方案中，該工程化的組織和器官是可植入的。在進一步的實施方案中，可植入的組織和器官是生物相容的，這意味著它們對所接觸的生物體造成的傷害或毒性風險有限。在一些實施方案中，植入包括將組織或器官插入或移植到受試者中。在進一步的實施方案中，插入和/或移植通過手術進行。在其它實施方案中，植入包括將組織或器官附著到受試者中。適當?shù)刂踩氡疚乃_的組織和器官持續(xù)不同時間。在一些實施方案中，適當?shù)刂踩朐摻M織和/或器官，作為非限制性的實例，暫時、半永久和永久地植入。在一些實施方案中，植入的組織和/或器官隨時間推移被吸收、并入或溶解。在其它實施方案中，植入的組織和/或器官保留獨特的形式持續(xù)一段時間。
[0062]該工程化的組織和器官適合于植入任何有需要的脊椎動物受試者。在各個實施方案中，作為非限制性的實例，脊椎動物受試者包括人類受試者、脊椎動物獸醫(yī)學受試者和那些被歸類為哺乳綱(哺乳動物)、鳥綱(鳥類)、爬行綱(爬行動物)、兩棲綱(兩棲動物)、硬骨魚綱(硬骨魚類)、軟骨魚綱(軟骨魚類)、無顎類脊椎動物(無顎魚類)等的受試者。
[0063]在各個實施方案中，工程化的組織和器官適合于植入任何需要例如創(chuàng)傷修復、組織修復、組織增大、組織置換和/或器官置換的脊椎動物受試者中。在一些實施方案中，該工程化組織用于創(chuàng)傷修復或組織修復。例如，工程化的片用于暫時或永久地修復因受傷而受損的人皮膚。在一些實施方案中，該工程化組織用于組織增大。例如，工程化的片用于暫時或永久地修補或修復人膀胱或胃的肌肉壁中的缺陷。在一些實施方案中，該工程化組織用于組織置換。例如，工程化的片或管用于暫時或永久地修復或置換一段人小腸的壁。在一些實施方案中，該工程化器官用于器官置換。例如，工程化的管用于暫時或永久地置換因異位妊娠而受損的人輸卵管。在一些實施方案中，工程化的管狀結構用于創(chuàng)建與器官系統(tǒng)的新的連接；例如，含平滑肌的管可用于從胃腸系統(tǒng)或腎臟穿過體壁延伸連接，以使得能夠在某些疾病狀態(tài)下收集廢物。在其它實施方案中，工程化的管狀結構用于延伸某些天然組織(例如，食道、腸、結腸等)的長度，以消除或減輕本質上是先天性的特定疾病(例如，短腸綜合征等)或由于其它疾病或損傷而發(fā)生的特定疾病。
[0064]在各個實施方案中，該工程化的可植入組織和器官是任何合適的形狀。在一些實施方案中，選擇形狀以模擬特定的天然組織或器官。
[0065]在一些實施方案中，含肌細胞層或整個工程化組織或器官基本為片的形式或包含片的形式。在進一步的實施方案中，片是基本平面的形式，其具有一系列合適的幾何形狀，作為非限制性的實例，包括平面正方形、矩形、多邊形、圓形、橢圓形或不規(guī)則形。生物打印的片具有廣泛的合適的尺寸。在一些實施方案中，選擇尺寸以有助于特定用途，作為非限制性的實例，包括創(chuàng)傷修復、組織修復、組織增大、組織置換和工程化器官構建。在進一步的實施方案中，選擇尺寸以有助于在特定受試者中的特定用途。例如，在一個實施方案中，生物打印出片以修復特定人類受試者的含肌肉的組織中的特定缺陷。
[0066]在各個實施方案中，該工程化的可植入組織和器官是任何合適的大小。在一些實施方案中，工程化的組織和器官(包括生物打印的那些)的大小隨時間推移而變化。在進一步的實施方案中，生物打印的組織或器官在生物打印之后由于例如細胞遷移、細胞死亡、細胞粘附介導的壓縮或其它形式的收縮而收縮或壓縮。在其它實施方案中，生物打印的組織或器官在生物打印之后由于例如細胞遷移、細胞生長和增殖、細胞成熟或其它形式的擴張而生長或擴張。
[0067]在一些實施方案中，生物打印的片在生物打印時為至少150μπι厚。在各個實施方案中，生物打印的片為約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μπι 厚或更厚，包括其中的增量。在進一步的各個實施方案中，生物打印的片的特征在于其長度、寬度或二者為約 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950UOOOym或更多，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，生物打印的片的特征在于其長度、寬度或二者為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mm或更多，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，生物打印的片的特征在于其長度、寬度或二者為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOcm 或更多，包括其中的增量。參見例如，實施例6 (和圖1)、實施例7 (和圖2)、實施例9 (和圖3a和3b)、實施例10(和圖4a和4b) ο
[0068] 在一些實施方案中，含肌細胞層或整個工程化組織或器官基本為管的形式或包含管的形式。在進一步的實施方案中，管基本是軋制板或中空圓柱體。在一些實施方案中，生物打印的管用于構建工程化的器官。在進一步的實施方案中，生物打印的管用于構建工程化的輸尿管、泌尿導管、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、尿道、腸、結腸、食道或其一部分。在進一步的實施方案中，本文所公開的管不是血管(blood vessel)或血管(vasculartube)。生物打印的管具有廣泛合適的尺寸。在一些實施方案中，選擇尺寸以有助于特定用途，作為非限制性的實例，包括創(chuàng)傷修復、組織修復、組織增大、組織置換、工程化器官的構建和器官置換。在進一步的實施方案中，選擇尺寸以有助于在特定受試者中的特定用途。例如，在一個實施方案中，生物打印出管以修復特定人類受試者的淋巴管的特定段。在一些實施方案中，生物打印的管的特征在于其在生物打印時具有至少150 μ m厚的管壁。在各個實施方案中，生物打印的管的壁為約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μπι厚或更厚，包括其中的增量。在一些實施方案中，該生物打印的管的特征在于在生物打印時具有至少約250 μ m的內徑。在各個實施方案中，生物打印的管的內徑為約50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000 μ m或更多，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，生物打印的管的內徑為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30mm或更多，包括其中的增量。在一些實施方案中，生物打印的管的長度為約1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30mm或更多，包括其中的增量。在其它實施方案中，生物打印的管的長度為約1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30cm 或更多，包括其中的增量。參加例如實施例13(和圖6)。
[0069]在一些實施方案中，含肌細胞層或整個工程化組織或器官基本為囊的形式或包含囊的形式。在進一步的實施方案中，囊基本是具有至少一個封閉端的軋制板或中空圓柱體(例如，袋子、杯子、中空體、氣囊等)。在一些實施方案中，囊是旨在用于容納攝入材料、胚胎及相關流體、體液或身體廢物的可擴張結構，并且具有至少一個用于輸入的開口以及至少一個用于輸出的開口。在一些實施方案中，生物打印的囊用于增大現(xiàn)有的器官或組織。在其它實施方案中，生物打印的囊用于置換現(xiàn)有的器官或組織。在進一步的實施方案中，生物打印的囊用于構建工程化的胃、膀胱、子宮、膽囊或其一部分。生物打印的囊具有廣泛合適的尺寸。在一些實施方案中，選擇尺寸以有助于特定用途，作為非限制性的實例，包括創(chuàng)傷修復、組織修復、組織增大、組織置換、工程化器官的構建和器官置換。在進一步的實施方案中，選擇尺寸以有 助于在特定受試者中的特定用途。例如，在一個實施方案中，生物打印出囊以增大或置換特定人類受試者的膀胱。在一些實施方案中，生物打印的囊的特征在于在生物打印時具有至少150 μ m厚的壁。在各個實施方案中，生物打印的囊的壁是約10、15、
20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111厚或更厚，包括其中的增量。
[0070]在一些實施方案中，可植入組織或器官用于科學和/或醫(yī)學研究。合適的科學和/或醫(yī)學研究包括體內和體外研究。在進一步的實施方案中，本文所述的工程化組織和/或器官用于體外研究用途，作為非限制性的實例，包括疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和藥物篩選。
MM
[0071]在一些實施方案中，本文公開了包含一種或多種細胞類型的工程化的可植入組織和器官。在一些實施方案中，該工程化的組織和器官包括至少一個含肌細胞層。因此，在一些實施方案中，該細胞包括肌細胞(例如，平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞)。在進一步的實施方案中，該含肌細胞層還包括其它細胞類型，如本文所公開的那些細胞類型(例如，成纖維細胞、內皮細胞等)。在一些實施方案中，該工程化的組織和器官包括被分配到含肌細胞層的至少一個表面上的、除肌細胞以外的細胞。在進一步的實施方案中，作為非限制性的實例，被分配到含肌細胞層的至少一個表面上的細胞包括內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞及其組合。
[0072]在一些實施方案中，任何脊椎動物細胞適合于包括在該工程化的可植入組織和器官中。在進一步的實施方案中，作為非限制性的實例，該細胞是:收縮或肌肉細胞(例如，骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞和成肌細胞)、結締組織細胞(例如，骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞以及分化為成骨細胞、軟骨細胞或淋巴組織的細胞)、骨髓細胞、內皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳腺細胞、血管細胞、血細胞、淋巴細胞、神經(jīng)細胞、許旺細胞、胃腸細胞、肝細胞、胰細胞、肺細胞、氣管細胞、角膜細胞、泌尿生殖細胞、腎細胞、生殖細胞、脂肪細胞、實質細胞、周細胞、間皮細胞、基質細胞、未分化的細胞(如胚細胞、干細胞和祖細胞)、內胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞和它們的組合。
[0073]在一個實施方案中，該細胞是平滑肌細胞。在另一個實施方案中，該細胞是平滑肌細胞與至少一種其它細胞類型的組合。在一些實施方案中，該其它細胞類型是成纖維細胞。在一些實施方案中，該成纖維細胞為該工程化的組織提供結構和生物支撐。在又另一個實施方案中，該其它細胞類型是內皮細胞。在一些實施方案中，該內皮細胞有助于該工程化組織的血管化和/或微血管化。在再一個實施方案中，該細胞是平滑肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞。在包括超過一種細胞類型的實施方案中，所述細胞類型以多種合適的比例存在，其實例如本文所述。
[0074]在一些實施方案中，該細胞是成體的、分化的細胞。在進一步的實施方案中，“分化的細胞”是在分離時具有與例如肌細胞、成纖維細胞或內皮細胞一致的組織特異性表型的細胞，其中從分離時到使用時都保持著組織特異性表型(或顯示該表型的潛能)。在其它實施方案中，該細胞是成體的、未分化的細胞。在進一步的實施方案中，“未分化的細胞”是不具有或已經(jīng)喪失例如肌細胞、成纖維細胞或內皮細胞的明確組織特異性性狀的細胞。在一些實施方案中，未分化的細胞包括干細胞。在進一步的實施方案中，“干細胞”是表現(xiàn)出潛能和自我更新的細胞。干細胞包括但不限于:全能干細胞、多能干細胞、多潛能細胞、寡能細胞、單能細胞和祖細胞。在各個實施方案中，干細胞是胚胎干細胞、成體干細胞、羊膜干細胞和誘導性多能干 細胞。在其它實施方案中，該細胞是成體的分化細胞與成體的未分化細胞的混合物。
[0075]在一些實施方案中，該平滑肌細胞是人類平滑肌細胞。在一些實施方案中，作為非限制性的實例，合適的平滑肌細胞來源于包括以下組織的組織:血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實施方案中，其它(非平滑肌)細胞組分源自感興趣的靶組織。在其它實施方案中，其它(非平滑肌)細胞組分源自除感興趣的靶組織以外的組織。在進一步的實施方案中，一些或所有的細胞是由哺乳動物脂肪抽吸物的基質血管部分培養(yǎng)的。參見實施例1。
[0076]在各個實施方案中，基于特定的目的或目標來選擇、配置、處理或調整細胞的細胞類型和/或來源。在一些實施方案中，一種或多種特定的細胞類型來源于兩個或更多個不同的人供體。在一些實施方案中，一種或多種特定的細胞類型來源于特定的脊椎動物受試者。在進一步的實施方案中，一種或多種特定的細胞類型來源于特定的哺乳動物受試者。在更進一步的實施方案中，一種或多種特定的細胞類型來源于特定的人類受試者。
培養(yǎng)細胞的方法
[0077]在本發(fā)明的工程化組織中使用的細胞類型以本領域已知的任何方式適當?shù)嘏囵B(yǎng)。細胞和組織培養(yǎng)方法是本領域已知的，并且例如描述在Freshney, R.，Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Techniques, Wiley (1987)中，為了這些信息通過引用將其內容并入本文。在 Doyle, A.，Griffiths, J.B.，Newell, D.G.，(編)Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures, Wiley (1998)中也描述了適合與本發(fā)明一起使用的普通哺乳動物細胞培養(yǎng)技術、細胞系和細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，為了這些信息通過引用將其內容并入本文。[0078]適合于培養(yǎng)中的哺乳動物細胞的生長條件是本領域公知的。例如參見實施例1。細胞培養(yǎng)基通常包括必需營養(yǎng)物和任選的附加成分，例如生長因子、鹽、礦物質、維生素等，它們是根據(jù)所培養(yǎng)的細胞類型而選擇的。任選地選擇特定的成分來加強細胞生長、分化和特異性蛋白質的分泌等。通常，標準的生長培養(yǎng)基包括Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，低葡萄糖及110mg/L丙酮酸鹽和谷氨酰胺，補充1-20%的胎牛血清(FBS)、牛血清或人血清和100U/mL青霉素、0.lmg/mL鏈霉素是適當?shù)?，如同本領域技術人員公知的各種其它標準培養(yǎng)基。優(yōu)選地，細胞在無菌條件下、在1-21% O2和優(yōu)選3-5% CO2的氣氛中、在接近或達到細胞來源動物體溫的溫度下培養(yǎng)。例如，人類細胞優(yōu)選在約37°C下培養(yǎng)。
[0079]細胞任選地與細胞分化劑一起培養(yǎng)，以誘導細胞沿著期望的路線分化。例如，細胞任選地與生長因子、細胞因子等一起培養(yǎng)。在一些實施方案中，術語“生長因子”指蛋白質、多肽或多肽的復合物，包括細胞因子，它們是由細胞產(chǎn)生的，并且影響其自身和/或多種相鄰的或遠處的其它細胞。一般而言，生長因子或者發(fā)育性地或者響應于眾多生理學或環(huán)境刺激影響特定類型的細胞的生長和/或分化。一些但不是全部生長因子是激素。示例性的生長因子是胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、角質形成細胞生長因子(KGF)、成纖維細胞生長因子(FGFs，包括堿性FGF(bFGF))、血小板衍生生長因子O3DGFs,包括TOGF-AA和TOGF-AB)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子α (TGF-α)、轉化生長因子β (TGF-β，包括TGFβ I和TGFβ 3)、表皮生長因子(EGF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、白細胞介素-6 (IL-6)、IL-8 等。除了其它地方外，在Molecular Cell Biology, Scientific AmericanBooks, Darnell 等人編，1986 !Principles of Tissue Engineering,第二版，Lanza 等人編，Academic Press, 2000中討論了生長因子。本領域技術人員將會理解:在本文描述的條件培養(yǎng)基中的任何及所有培養(yǎng)物衍生的生長因子都在本發(fā)明的范圍內。
生物墨水和多細胞聚集體
[0080]在某些實施方案中，本文公開了包含一個或多個層的、工程化的可植入組織和/或器官，其中至少一個層包含肌細胞。在一些實施方案中，該一個或多個層和/或該工程化組織或器官基本上由細胞材料組成。在進一步的實施方案中，除肌細胞以外的細胞被分配到該一個或多個層的至少一個表面上。在一些實施方案中，該一個或多個層在使用時基本無支架。
[0081]在一些實施方案中，通過從生物打印機沉積或擠出生物墨水來生物打印細胞和/或層。在一些實施方案中，“生物墨水”包括包含多個細胞的液體、半固體或固體組合物。在一些實施方案中，生物墨水包含液體或半固體的細胞溶液、細胞懸浮液或細胞濃縮物。在進一步的實施方案中，細胞溶液、懸浮液或濃縮物包含液體或半固體(例如粘性的)支持物和多個細胞。在更進一步的實施方案中，該支持物是合適的細胞營養(yǎng)培養(yǎng)基，例如本文中描述的那些。在一些實施方案中，生物墨水包含半固體或固體的多細胞聚集體或多細胞體。在進一步的實施方案中，通過如下步驟產(chǎn)生生物墨水:1)以預先確定的比例，將多個細胞或細胞聚集體與生物相容性液體或凝膠混合，以形成生物墨水；和2)使該生物墨水致密化，以產(chǎn)生具有期望的細胞密度和粘度的生物墨水。在一些實施方案中，通過離心作用、切向流過濾(“TFF”)或其組合來實現(xiàn)生物墨水的致密化。在一些實施方案中，生物墨水的致密化產(chǎn)生了可擠出的組合物，從而允許形成多細胞聚集體或多細胞體。在一些實施方案中，“可擠出的”是指能夠通過被迫(例如在壓力下)穿過噴嘴或孔口(例如，一個或多個洞或管)而成形。在一些實施方案中，生物墨水的致密化是由細胞生長到合適的密度而引起的。該生物墨水所需的細胞密度會隨著所使用的細胞和要產(chǎn)生的組織或器官而改變。在一些實施方案中，該生物墨水的細胞是凝聚和/或粘附的。在一些實施方案中，“凝聚(cohere) ”、“凝聚的(cohered) ”和“凝聚(cohesion) ”指將細胞、多細胞聚集體、多細胞體和/或它們的層結合起來的細胞-細胞粘附性質。在一些實施方案中，該術語可以與“融合(fuse)”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互換使用。在一些實施方案中，該生物墨水另外包含支持材料、細胞培養(yǎng)基(或其補充物)、細胞外基質(或其組分)、細胞粘著劑、細胞死亡抑制劑、抗凋亡劑、抗氧化劑、擠出化合物和它們的組合。
[0082]在各個實施方案中，該細胞是任何合適的細胞。在進一步的各個實施方案中，該細胞是脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、人類細胞或它們的組合。在一些實施方案中，在本文公開的方法中使用的細胞類型取決于要產(chǎn)生的構建體或組織的類型。在一些實施方案中，該生物墨水包含一種類型的細胞(也被稱為“均質”或“單型”生物墨水)。在一些實施方案中，該生物墨水包含超過一種類型的細胞(也被稱為“異質”或“多型”生物墨水)。
[0083]在各個實施方案中，生物墨水在制備該生物墨水時包含30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5,99.9 和 100% (包括其中的增量)的細胞材料。在各個實施方案中，生物墨水在將該生物墨水用于生物打印時包含30、35、40、45、50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5、99.9 和 100% (包括其中的增量)的細胞材料。
細胞培養(yǎng)基
[0084]在一些實施方案中，該生物墨水包含細胞培養(yǎng)基。該細胞培養(yǎng)基是任何合適的培養(yǎng)基。在各個實施方案中，作為非限制性的實例，合適的細胞培養(yǎng)基包括:DulbeCC0磷酸鹽緩沖鹽水、Earle平衡鹽、Hanks平衡鹽、Tyrode鹽、Alsever溶液、Gey平衡鹽溶液、Kreb' s-Henseleit改良緩沖系、Kreb’ s-Ringer碳酸氫鹽緩沖系、Puck鹽水、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基/營養(yǎng)F_12Ham、營養(yǎng)混合物F_10Ham(Ham’ sF-10)、培養(yǎng)基199、基本必需培養(yǎng)基Eagle、RPM1-1640培養(yǎng)基、Ames培養(yǎng)基、BGJb培養(yǎng)基(Fitton-Jackson 改良)、Click 培養(yǎng)基、CMRL-1066 培養(yǎng)基、Fischer 培養(yǎng)基、Glascow 基本必需培養(yǎng)基(GMEM)、Iscove 改良 Dulbecco 培養(yǎng)基(IMDM)、L-15 培養(yǎng)基(Leibovitz)、McCoy5A改良培養(yǎng)基、NCTC培養(yǎng)基、Swim S-77培養(yǎng)基、Waymouth培養(yǎng)基、WiIIiam培養(yǎng)基E或它們的組合。在一些實施方案中，該細胞培養(yǎng)基得到改良或補充。在一些實施方案中，該細胞培養(yǎng)基進一步包含白蛋白、硒、轉鐵蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、維生素、生長因子、細胞因子、激素、抗生素、脂質、脂質載體、環(huán)糊精、富血小板血漿或它們的組合。
細胞外基質
[0085]在一些實施方案中，該生物墨水進一步包含細胞外基質或其衍生物的一種或多種組分。在一些實施方案中，“細胞外基質”包括由細胞產(chǎn)生并從細胞中轉運到細胞外隙內的蛋白質，在細胞外隙中它們作為支持物將組織保持在一起、提供拉伸強度和/或促進細胞信號傳導。細胞外基質組分的實例包括但不限于:膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、透明質酸鹽、彈性蛋白和蛋白聚糖。例如，在某些情況下，該多細胞聚集體含有多種ECM蛋白質(例如，明膠、纖維蛋白原、纖維蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖)。在一些實施方案中，ECM組分或ECM組分的衍生物被加入到用于形成多細胞聚集體的細胞漿料中。在進一步的實施方案中，加入到細胞漿料中的ECM組分或ECM組分的衍生物是從人類或動物源純化的，或者通過本領域已知的重組方法產(chǎn)生的?；蛘?，該ECM組分或ECM組分的衍生物是由細長細胞體內的細胞自然分泌的，或者用于形成該細長細胞體的細胞通過任何本領域已知的合適方法進行遺傳操作，以改變一種或多種ECM組分或ECM組分的衍生物和/或一種或多種細胞粘附分子或細胞-基底粘附分子(例如，選擇素、整合素、免疫球蛋白和粘附素)的表達水平。在一些實施方案中，ECM組分或ECM組分的衍生物促進細胞在多細胞聚集體中的凝聚。例如，在一些實施方案中，將明膠和/或纖維蛋白原適當?shù)丶尤氲郊毎麧{料中，該漿料用于形成多細胞聚集體。在進一步的實施方案中，通過加入凝血酶將纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白。
[0086]在一些實施方案中，該生物墨水進一步包含促進細胞粘附的試劑。
[0087]在一些實施方案中，該生物墨水進一步包含抑制細胞死亡(例如，壞死、凋亡或自體吞噬)的試劑。在一些實施方案中，該生物墨水進一步包含抗凋亡劑。抑制細胞死亡的試劑包括但不限于:小分子、抗體、肽、肽體或它們的組合。在一些實施方案中，抑制細胞死亡的試劑選自:抗-TNF試劑、抑制白細胞介素活性的試劑、抑制干擾素活性的試劑、抑制GCSF(粒細胞集落刺激因子)活性的試劑、抑制巨噬細胞炎性蛋白活性的試劑、抑制TGF-B(轉化生長因子B)活性的試劑、抑制MMP(基質金屬蛋白酶)活性的試劑、抑制胱天蛋白酶活性的試劑、抑制MAPK/JNK信號級聯(lián)活性的試劑、抑制Src激酶活性的試劑、抑制JAK(Janus激酶) 活性的試劑或它們的組合。在一些實施方案中，該生物墨水包含抗氧化劑。
擠出化合物
[0088]在一些實施方案中，該生物墨水進一步包含擠出化合物(即，改變生物墨水的擠出性質的化合物)。擠出化合物的實例包括但不限于:凝膠、水凝膠、肽水凝膠、基于氨基酸的凝膠、表面活性劑多元醇(例如Pluronic F-127或PF-127)、熱響應性聚合物、透明質酸鹽、藻酸鹽、細胞外基質組分(及其衍生物)、膠原、其它生物相容性天然或合成聚合物、納米纖維和自組裝的納米纖維。
[0089]已經(jīng)以各種方式定義了凝膠，有時被稱作膠狀物。例如，《美國藥典》將凝膠定義為由小無機粒子組成的懸浮液或被液體互相滲透的大有機分子組成的半固體體系。凝膠包括單相或兩相體系。單相凝膠由均勻分布在整個液體中的有機大分子組成，其分布方式使得在分散的大分子和液體之間不存在明顯的邊界。某些單相凝膠是由合成大分子(例如卡波姆)或由天然樹膠(例如西黃蓍膠)制備的。在一些實施方案中，單相凝膠通常是水性的，但是也可以利用醇和油來制備。兩相凝膠由小離散微粒的網(wǎng)絡組成。
[0090]在某些情況下，凝膠被分類為親水的或疏水的。在某些實施方案中，疏水凝膠的基質由液體石蠟與聚乙烯，或用膠態(tài)二氧化硅，或鋁或鋅皂膠凝的脂肪油組成。相反，親水凝膠的基質一般由用合適的膠凝劑(例如，西黃蓍膠、淀粉、纖維素衍生物、羧乙烯基聚合物和硅酸鎂鋁)膠凝的水、甘油或丙二醇組成。在某些實施方案中，本文中公開的組合物或裝置的流變學是假塑性、塑性、觸變性或膨脹性的。
[0091]適宜的水凝膠包括衍生自膠原、透明質酸鹽、纖維蛋白、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖及其組合的水凝膠。在其它實施方案中，適宜的水凝膠是合成聚合物。在進一步的實施方案中，適宜的水凝膠包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(環(huán)氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其組合的水凝膠。在各個具體實施方案中，限制材料選自:水凝膠、NovoGel ?、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、Matrigel?、透明質酸、泊洛沙姆、肽水凝膠、聚(異丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羥乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、絲或它們的組合。
[0092]在一些實施方案中，基于水凝膠的擠出化合物是熱可逆凝膠(也稱為熱響應性凝膠或熱凝膠)。在一些實施方案中，合適的熱可逆水凝膠在室溫下不是液體。在具體實施方案中，合適的水凝膠的膠凝溫度(Tgel)為約10°C、1TC、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C、17 °C ,18 °C >19 °C >20 °C >21 °C >22 °C >23 °C >24 °C >25 °C >26 °C >27 °C >28 °C、29 °C、30 °C、31 °C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C，包括其中的增量。在某些實施方案中，合適的水凝膠的Tgel為約10°C至約40°C。在進一步的實施方案中，合適的水凝膠的Tgel為約20°C至約30°C。在一些實施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝膠、一種或多種細胞類型和其它添加劑等)在室溫下不是液體。在一些實施方案中，合適的熱可逆水凝膠在哺乳動物的體溫下不是液體。在具體的實施方案中，合適的水凝膠的膠凝溫度(Tgel)為約 22°C、23°C、24t:、25t:、26t:、27t:、28t:、29t:、3(rCt:、3rC、32t:、33t:、34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 V、41 °C >41 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 V、49°C、50°C、51°C、52°C，包括其中的增量。在某些實施方案中，合適的水凝膠的Tgel為約22 °C至約52 °C。在進一步的實施方案中，合適的水凝膠的TgeI為約32°C至約42°C。在一些實施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝膠、一種或多種細胞類型和其它添加劑等)在哺乳動物的體溫下不是液體。在具體的實施方案中，本文所述的生物墨水的膠凝溫度(Tgel)為約 10°C、約 151:、約201:、約251:、約301:、約351:、約401:、約451:、約501:、約55°C，包括其中的增量。在具體實施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約10°C至約15°C。在另一具體實施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約15°C至約20°C。在另一具體實施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約20°C至約25°C。在另一具體實施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約25°C至約30°C。在另一具體實施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約30°C至約35°C。在另一具體實施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約35°C至約40°C。在另一具體實施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約40°C至約45°C。在另一具體實施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約45°C至約50°C。
[0093]當并入水溶液中時，由聚氧化丙烯和聚氧化乙烯組成的聚合物形成熱可逆的凝膠。在生物打印機裝置中可以保持的溫度下，這些聚合物具有從液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)的能力。該液態(tài)至凝膠態(tài)的相變取決于聚合物的濃度和溶液中的成分。
[0094]泊洛沙姆407 (Pluronic F-127或PF-127)是由聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物組成的非離子表面活性劑。其它泊洛沙姆包括188 (F-68級)、237 (F-87級)、338 (F-108級)。泊洛沙姆的水溶液在酸、堿和金屬離子的存在下是穩(wěn)定的。PF-127是通式E106P70E106的可商購的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，具有13000的平均摩爾質量。在一些實施方案中，該聚合物采用增強聚合物的膠凝性質的合適的方法進一步純化。它含有大約70%的氧化乙烯，這解釋了它的親水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列中的一種。PF-127具有良好的增溶能力、低毒性，因此被認為是合適的擠出化合物。
[0095]在一些實施方案中，通過任何所述的手段來測量本文中提出的水凝膠和生物墨水的粘度。例如，在一些實施方案中，采用LVDV-1I+CP Cone Plate粘度計和Cone SpindleCPE-40來計算水凝膠和生物墨水的粘度。在其它實施方案中，采用Brookfield(軸和杯)粘度計來計算水凝膠和生物墨水的粘度。在一些實施方案中，本文中中提及的粘度范圍是在室溫下測量的。在其它實施方案中，本文中提及的粘度范圍是在體溫下(例如，在健康人的平均體溫下)測量的。
[0096]在進一步的實施方案中，該水凝膠和/或生物墨水的特征在于具有約500至
I,000，000 厘泊、約 750 至 I, 000，000 厘泊、約 1000 至 I, 000，000 厘泊、約 1000 至 400，000厘泊、約2000至100，000厘泊、約3000至50，000厘泊、約4000至25，000厘泊、約5000至20，000厘泊或約6000至15，000厘泊的粘度。
[0097]在一些實施方案中，該生物墨水包含細胞和適合于連續(xù)生物打印的擠出化合物。在具體實施方案中，該生物墨水具有約1500mPa.s的粘度。在一些實施方案中，PluronicF-127和細胞材料的混合物適合于連續(xù)生物打印。在進一步的實施方案中，這樣的生物墨水通過以下步驟制備:通過在冷(4°C )磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中連續(xù)混合48小時溶解Pluronic F-127粉末至30% (w/v)。Pluronic F-127也適當?shù)厝芙庠谒?。任選地采用標準無菌細胞培養(yǎng)技術將細胞培養(yǎng)和擴充。在一些實施方案中，例如將該細胞在200g下沉淀，并重懸浮在30% Pluronic F-127中。在進一步的實施方案中，將細胞抽吸到附著在生物打印機上的儲存器中，并使之在約10至約25°C的膠凝溫度下固化。在生物打印之前生物墨水的膠凝是 任選的。生物墨水，包括包含Pluronic F-127的生物墨水，任選地作為液體分配。
[0098]在各個實施方案中，Pluronic F-127的濃度是具有合適的粘度和/或細胞毒性的任意值。在一些實施方案中，Pluronic F-127的合適的濃度能夠在生物打印時支撐重量同時保持其形狀。在一些實施方案中，Pluronic F-127的濃度為約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%或約50%。在一些實施方案中，Pluronic F-127的濃度為約30%至約40%，或者約30%至約35%。
[0099]在一些實施方案中，在使用之前除去生物墨水的非細胞組分(例如，擠出化合物等)。在進一步的實施方案中，非細胞組分例如是:水凝膠、肽水凝膠、基于氨基酸的凝膠、表面活性劑多元醇、熱響應性聚合物、透明質酸鹽、藻酸鹽、膠原或其它生物相容性天然或合成聚合物。在更進一步的實施方案中，通過物理、化學或酶手段除去非細胞組分。在一些實施方案中，在使用時，一部分非細胞組分仍與細胞組分相關聯(lián)。
[0100]在一些實施方案中，預處理細胞，以增加細胞相互作用。例如，為了在生物墨水成形之前增強細胞-細胞相互作用，任選地在離心之后在離心管內培養(yǎng)細胞。進一步舉例來說，細胞任選地暴露于促進細胞-細胞間相互作用的分子或試劑，諸如調節(jié)離子平衡的那些分子或試劑。
示例性的細胞比例
[0101]在一些實施方案中，用于構建組織層的生物墨水包含多細胞體，該多細胞體進一步包含肌細胞(例如，平滑肌細胞、骨骼肌細胞和/或心肌細胞)和一種或多種其它細胞類型。在進一步的實施方案中，肌細胞與其它細胞組分的比例為任何合適的比例。在更進一步的實施方案中，肌細胞與其它細胞組分的比例為約90:10至約60:40。在具體的實施方案中，該多細胞體包含肌細胞和內皮細胞，并且肌細胞與內皮細胞的比例為約85:15。在另一具體實施方案中，該多細胞體包含平滑肌細胞和內皮細胞，并且平滑肌細胞與內皮細胞的比例為約70:30。
[0102]在一些實施方案中，用于構建組織層的生物墨水包含多細胞體，該多細胞體進一步包含肌細胞和成纖維細胞。在進一步的實施方案中，肌細胞與成纖維細胞的比例為任何合適的比例。在更進一步的實施方案中，肌細胞與成纖維細胞的比例為約90:10至約60:40。
[0103]在一些實施方案中，用于構建組織層的生物墨水包含多細胞體，該多細胞體進一步包含肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞。在進一步的實施方案中，肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞的比例為任何合適的比例。在更進一步的實施方案中，肌細胞與成纖維細胞和內皮細胞的比例為約70:25:5。
細胞的自分選(self-sorting)
[0104]在一些實施方案中，用于形成構建體或組織的多細胞聚集體包含將要包括在工程化組織或器官中的所有細胞類型(例如，肌細胞和一種或多種其它細胞類型)；在這樣的實例中，每個細胞類型遷移到合適的位置(例如，在成熟期間)，以形成工程化組織或器官。在其它的實施方案中，用于形成結構的多細胞聚集體包括比將要包括在工程化組織中的所有細胞類型要少的細胞類型。在一些實施方案中，每個類型的細胞均勻分布在多細胞聚集體中，或組織的區(qū)域或層中。在其它實施方案中，每個類型的細胞定位在多細胞聚集體內的特定區(qū)域或組織的區(qū)域或層中。
[0105]例如，在以合 適的比例(例如，85:15、70:30等)包含平滑肌細胞和內皮細胞的工程化平滑肌片的情況下，相鄰的、生物打印的凝聚多型圓柱形生物墨水單元融合在一起。在成熟期間，內皮細胞在某種程度上定位在構建體的外圍，并形成膠原。例如，參見圖l、2、3a和4b。進一步舉例來說，在以合適的比例(例如，70:25:5等)包含平滑肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞的生物打印的平滑肌補片的情況下，生物打印的多型圓柱形生物墨水單元融合在一起，并且內皮細胞在某種程度上定位在構建體的外圍。在一些實施方案中，細胞類型在構建體內的定位模擬了體內或離體哺乳動物組織的分層結構。在一些實施方案中，通過應用一個或多個細胞層加速、增強或增加了細胞的分選或自分選。例如，在一些實施方案中，用包含平滑肌細胞和其它細胞類型(如內皮細胞和/或成纖維細胞)的多型生物墨水生物打印的構建體，進一步在該構建體的一個或多個表面上施加一層第二細胞類型。在進一步的實施方案中，施加一層第二細胞類型的結果是細胞在多型生物墨水中的空間分選的增加。
預形成的支架
[0106]在一些實施方案中，本文公開了工程化的可植入組織和器官，其不含或基本不含任何預形成的支架。在進一步的實施方案中，“支架”是指合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝膠；非合成的支架，例如預形成的細胞外基質層、死細胞層和脫細胞的組織；以及任何其它類型的預形成支架，它對于工程化組織和/或器官的物理結構而言是必要的，并且不從該組織和/或器官除去。在進一步的實施方案中，脫細胞的組織支架包括脫細胞的天然組織或以任意方式由培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生的脫細胞的細胞材料；例如，使之死亡或者脫細胞的細胞層，留下它們在活著時產(chǎn)生的ECM。
[0107]在一些實施方案中，該工程化的可植入組織和器官不利用任何預形成的支架，例如，來形成該組織、該組織的任何層或者形成該組織的形狀。作為非限制性的實例，本發(fā)明的工程化組織不利用任何預形成的合成支架(例如聚合支架)、預形成的細胞外基質層或任何其它類型的預形成支架。在一些實施方案中，該工程化的組織和器官在使用時基本不含任何預形成的支架。在進一步的實施方案中，該組織和器官在使用時含有可檢測到但是痕量或微量的支架，例如，小于總組合物的約2.0%。在更進一步的實施方案中，痕量或微量的支架不足以影響該組織的長期行為或者妨礙其主要生物功能。在另外的實施方案中，在打印之后，通過物理、化學或酶方法除去支架組分，從而產(chǎn)生不含或基本不含支架組分的工程化組織。在更進一步的實施方案中，該工程化的可植入組織和器官含有基于體積多達約70%的生物相容性支架。在更進一步的實施方案中，該工程化的可植入組織和器官在使用時含有基于體積多達約50%的生物相容性支架。
[0108]在一些實施方案中，本文公開的不含或基本不含預形成支架的工程化可植入組織和器官，與用某些其它組織工程方法開發(fā)的那些形成鮮明對比，后者中第一步先形成支架材料，然后第二步將細胞接種到支架上。細胞隨后增殖，以填充并呈現(xiàn)支架的形狀。在一個方面，本文中描述的生物打印方法允許產(chǎn)生活的且有用的組織，其基本不含預形成的支架。在另一方面，在一些實施方案中，利用限制材料將本發(fā)明的細胞保持在期望的三維形狀中。該限制材料至少在以下事實上與支架是不同的:限制材料是暫時的和/或可以從細胞和/或組織除去。
含肌細胞層
[0109]在某些實施方案中，本文公開了包含一個或多個層的工程化的可植入組織和器官，其中該工程化組織或器官的至少一個層包含肌細胞。在一些實施方案中，該工程化的可植入組織和器官包含至少一層肌肉。合適的包含肌細胞和/或肌肉的層包括細胞材料。在各個實施方案中，合適的含肌細胞層在構建時具有約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5,99.9和100% (包括其中的增量)的細胞材料的組成。在其它各個實施方案中，合適的含肌細胞層在使用時具有約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5,99.9 和 100% (包括其中的增量)的細胞材料的組成。在一些實施方案中，包含肌細胞的一個或多個層包含具有三維幾何形狀的融合的細胞元件。在進一步的實施方案中，包含肌細胞的一個或多個層是生物打印的。
[0110]在一些實施方案中，含肌細胞層包括平滑肌。在一些實施方案中，含肌細胞層包括骨骼肌。在一些實施方案中，含肌細胞層包括心肌。在一些實施方案中，含肌細胞層(除肌細胞之外)還包括任何類型的哺乳動物細胞，諸如本文所述的那些。在各個進一步的實施方案中，所述層包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 種或更多種其它細胞類型。在一些實施方案中，該工程化的組織和器官包括源自一名或多名特定人類受試者的一種或多種細胞類型。在各個實施方案中，該工程化的組織和器官包括源自2、3、4、5、6、7、8、9、10名或更多名特定人類受試者的細胞類型。在其它實施方案中，一種或多種特定的細胞類型源自特定的脊椎動物受試者。在進一步的實施方案中，一種或多種特定的細胞類型源自特定的哺乳動物受試者。在再進一步的實施方案中，一種或多種特定的細胞類型源自特定的人類受試者。
[0111]在一些實施方案中，平滑肌層包括平滑肌細胞和內皮細胞。實施例3說明了由人主動脈平滑肌細胞和人主動脈內皮細胞組成的圓柱形生物墨水的制作，而實施例5說明了由從人脂肪抽吸物的基質血管組分培養(yǎng)的平滑肌細胞和內皮細胞組成的生物墨水的制作。實施例6說明了此類圓柱體的生物打印和融合，從而形成平滑肌補片。在其它實施方案中，平滑肌層包括平滑肌細胞和成纖維細胞。在又一些其它實施方案中，平滑肌層包括平滑肌細胞、內皮細胞和成纖維細胞。實施例4說明了由人主動脈平滑肌細胞、人皮膚成纖維細胞和人主動脈內皮細胞組成的多型生物墨水的制作。在一些實施方案中，平滑肌層的細胞彼此“凝聚”或“粘附”。在進一步的實施方案中，凝聚或粘附是指能使細胞、多細胞聚集體、多細胞體和/或它們的層結合在一起的細胞-細胞粘附性質。
[0112]該工程化的可植入組織和器官包括任何合適的層數(shù)。在各個實施方案中，該工程化的組織和器官包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15層或更多層。在一些實施方案中，層是生物打印的，并且具有由多細胞體(例如，細長的、圓柱狀的或帶狀體)的放置、圖案或取向所限定的取向。在進一步的實施方案中，工程化組織或器官包括超過一層，并且每一層的特征在于其相對于一個或多個其它層具有特定的取向。在各個實施方案中，一個或多個層相對于相鄰層具有包括旋轉的取向，其中該旋轉是約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180度，或其中的增量。在其它實施方案中，所有層的取向基本相似。
[0113]合適的層的特征在于具有任何合適的厚度。在各個實施方案中，合適的層在構建時的厚度為約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、 380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、750、800、850、900、950、1000μπι 或更多，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，合適的層在使用時的厚度為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、750、800、850、900、950、1000μ m 或更多，包括其中的增量。
[0114]合適的含肌細胞層的特征在于具有任何合適的厚度。在各個實施方案中，合適的含肌細胞層在構建時的厚度為約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、750、800、850、900、950、1000 μ m或更多，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，合適的含肌細胞層在使用時的厚度為約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、750、800、850、900、950、100(^111或更多，包括其中的增量。
[0115]在一些實施方案中，含肌細胞層基本為片的形式或包含片的形式。在進一步的實施方案中，生物打印的肌肉片用于構建工程化的組織或器官。在再進一步的實施方案中，生物打印的肌肉片用于手術構建全部或部分肌肉壁。在再進一步的實施方案中，生物打印的肌肉片用于手術構建全部或部分胃腸壁、泌尿道壁或氣道壁。在再進一步的實施方案中，生物打印的肌肉片用于手術構建全部或部分膀胱、胃、腸、食道、尿道、子宮、輸尿管或其一部分。在再進一步的實施方案中，生物打印的肌肉片用于手術構建全部或部分膀胱壁、胃壁、腸壁、食道壁、尿道壁、子宮壁、輸尿管壁或其一部分。
[0116]在一些實施方案中，含肌細胞層基本為管的形式或包含管的形式。在進一步的實施方案中，生物打印的肌肉管用于構建工程化的器官。在再進一步的實施方案中，生物打印的肌肉管用于構建工程化的輸尿管、泌尿導管、肝門十二指腸腸導管、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、尿道、腸、結腸、食道或其一部分。在一些實施方案中，本文所公開的管不是血管。
[0117]在一些實施方案中，含肌細胞層基本為囊的形式或包含囊的形式。在進一步的實施方案中，生物打印的肌肉囊用于構建工程化的器官。在再進一步的實施方案中，生物打印的肌肉囊用于構建工程化的胃、膀胱、子宮、膽囊或其一部分。
除肌細胞以外的細胞
[0118]在一些實施方案中，本文所公開的工程化的可植入組織和器官包括至少一個含肌細胞層。在進一步的實施方案中，本文所公開的工程化的可植入組織和器官包括至少一個含肌肉和/或肌細胞的層。在再進一步的實施方案中，本文所公開的工程化的可植入組織和器官包括至少一個含平滑肌和/或平滑肌細胞的層。在再進一步的實施方案中，本文所公開的工程化的可植入組織和器官包括至少一個含骨骼肌和/或骨骼肌細胞的層。在再進一步的實施方案中，本文所公開的工程化的可植入組織和器官包括至少一個含心肌和/或心肌細胞的層。在進一步的 實施方案中，該工程化的可植入組織和器官包括除肌細胞以外的細胞。在一些實施方案中，除肌細胞以外的細胞并入含肌細胞層中。在各個進一步的實施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種類型的細胞并入含肌細胞層中。在一些實施方案中，除肌細胞以外的細胞被分配到含肌細胞層的至少一個表面上。在各個進一步的實施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種類型的細胞被分配到含肌細胞層上。在又進一步的各個實施方案中，除肌細胞以外的細胞被分配到含肌細胞層的1、2、3、4個或更多個表面上。
[0119]在一些實施方案中，被分配到含肌細胞層的至少一個表面上的細胞包括任何類型的哺乳動物細胞，如本文所述的那些哺乳動物細胞。在一些實施方案中，被分配的細胞包括源自一名或多名特定人類受試者的一種或多種細胞類型。在各個實施方案中，被分配的細胞包括源自2、3、4、5、6、7、8、9、10名或更多名特定人類受試者的細胞類型。在其它實施方案中，一種或多種特定的細胞類型源自特定的脊椎動物受試者。在進一步的實施方案中，一種或多種特定的細胞類型源自特定的哺乳動物受試者。在再進一步的實施方案中，一種或多種特定的細胞類型源自特定的人類受試者。
[0120]在一些實施方案中，除肌細胞以外的細胞以細胞層的形式被分配到肌肉的一個或多個表面上。在進一步的實施方案中，被分配的細胞層包含細胞單層。在進一步的實施方案中，該單層是鋪滿的。在其它實施方案中，單層不是鋪滿的。在一些實施方案中，除肌細胞以外的細胞以一個或多個細胞片的形式被分配到肌肉的一個或多個表面上。在各個實施方案中，細胞片的厚度為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 個或更多個細胞，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，細胞片為約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111厚或更厚，包括其中的增量。在一些實施方案中，除肌細胞以外的細胞以融合的細胞聚集體的形式被分配到肌肉的一個或多個表面上。在進一步的實施方案中，融合之前，作為非限制性的實例，該細胞聚集體具有基本球形的、細長的、基本圓柱形的和帶狀的形狀。在各個實施方案中，融合的細胞聚集體形成約10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 μ m厚或更厚的層，包括其中的增量。
[0121]在一些實施方案中，該工程化的組織和器官包括被分配到含肌肉層的一個或多個表面上的第二種非肌細胞類型。實施例7說明了平滑肌補片的構建，包括生物打印人血管平滑肌細胞聚集體(例如，圓柱體)，隨后在SMC構建體的上表面上生物打印內皮細胞層。實施例8說明了平滑肌補片的構建，包括生物打印人主動脈平滑肌細胞聚集體(例如，圓柱體)，隨后通過向SMC構建體上沉積特異性定位的內皮細胞懸浮液的液滴，來實現(xiàn)向上表面施加一層第二細胞類型。在一些實施方案中，該工程化的組織和器官包括被分配到平滑肌層的一個或多個表面上的第三細胞類型，諸如成纖維細胞。
[0122]實施例9說明了平滑肌補片的構建，包括將人主動脈平滑肌細胞聚集體(例如，圓柱體)直接生物打印到由第二細胞類型(例如，成纖維細胞)構成的層上，隨后將第三細胞類型(例如，內皮細胞)施加到上表面上。頂部細胞層是通過向平滑肌層上沉積特異性定位的細胞懸浮液液滴而施加的。實施例9的程序產(chǎn)生包含凝聚的平滑肌細胞的組織、該平滑肌細胞的一個表面上的一層成纖維細胞和該平滑肌細胞的相對表面上的一層內皮細胞。
[0123]除肌細胞以外的細胞通過任何合適的技術被分配到一個或多個含肌細胞層之中和/或之上。合適的沉積技術包括那些能夠遞送略微受控的量或體積的細胞，而基本不對它們造成損傷的技術。在各個實施方案中，作為非限制性的實例，合適的沉積技術包括噴涂、噴墨、涂抹、浸涂、移植、接種、注射、分層、生物打印及其組合。
[0124]除肌細胞以外的細胞在制作過程中任意合適的時間被分配到一個或多個含肌細胞層上。在一些實施方案中，該細胞基本上在制作或構建肌肉的同時(例如，同時、隨即等)進行分配。在其它實施方案中，該細胞在肌肉制作或構建之后進行分配。在各個進一步的實施方案中，該細胞在肌肉制作或構建1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或更多分鐘(包括其中的增量)之后進行分配。在其它各個實施方案中，該細胞在肌肉制作或構建1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48或更多小時(包括其中的增量)之后進行分配。在又一些其它各個實施方案中，該細胞在肌肉制作或構建1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天(包括其中的增量)后進行分配。在一些實施方案中，該細胞在一個或多個含肌細胞層成熟期間進行分配。
述
[0125]在一些實施方案中，本文公開了制備包含含肌細胞層的可植入組織或器官的方法。在進一步的實施方案中，該方法包括將含肌細胞的生物墨水生物打印成形式，并且將該生物墨水融合成凝聚的細胞結構。在再進一步的實施方案中，該可植入組織或器官在使用時基本不含任何預形成的支架。在各個實施方案中，該肌細胞是平滑肌細胞、骨骼肌細胞和/或心肌細胞。在一些實施方案中，該方法生成了基本不含任何預形成的支架的、含細胞的工程化組織和器官。
[0126]制備包含肌細胞的生物墨水
[0127]在一些實施方案中，該方法包括制備包含肌細胞的生物墨水。在一些實施方案中，該方法包括制備包含肌細胞的凝聚的多細胞聚集體。在一些實施方案中，該方法包括制備進一步包含其它細胞類型的凝聚的多細胞聚集體。在進一步的實施方案中，該方法包括制備進一步包含內皮細胞的凝聚的多細胞聚集體。例如，參見實施例3和5。在一些實施方案中，該方法包括制備進一步包含成纖維細胞的凝聚的多細胞聚集體。例如，參見實施例4。
[0128]存在多種制備包含具有本文所述特性的多細胞聚集體的生物墨水的方式。在一些實施方案中，從含有多個活細胞或具有所需細胞密度和粘性的細胞漿料制造多細胞聚集體。在進一步的實施方案中，將該細胞漿料成形為所需的形狀和通過成熟(例如孵育)形成的多細胞體。在一些實施方案中，該多細胞聚集體基本上是圓柱形的。在一些實施方案中，該多細胞聚集體基本上是球形的。在其它實施方案中，該工程化組織是由具有一系列形狀的多細胞聚集體構建的。在具體實施方案中，通過將包括多個活細胞的細胞漿料成形為細長形狀(例如圓柱體)來產(chǎn)生細長的多細胞體。在進一步的實施方案中，將細胞漿料在受控環(huán)境中孵育，以使細胞彼此粘附和/或凝聚，以形成細長的多細胞體。在另一個具體實施方案中，通過在將細胞保持為三維形狀的裝置中，將包括多個活細胞的細胞漿料成形來制備多細胞體。在進一步的實施方案中，將細胞漿料在受控環(huán)境中孵育，同時將其保持為三維形狀充分的時間，以在平表面上產(chǎn)生具有足以支撐其自身的凝聚力的多細胞體。
[0129]在各個實施方案中，通過如下步驟來提供細胞漿料:(A)混合(一種或多種細胞類型的)細胞或細胞聚集體與生物相容性凝膠或液體，例如細胞培養(yǎng)基(例如，以預先確定的比例)，以產(chǎn)生細胞懸浮液；和(B)將該細胞懸浮液致密化，以產(chǎn)生具有所需細胞密度和粘度的細胞漿料。在各個實施方案中，通過多種方法來實現(xiàn)致密化，例如通過將由細胞培養(yǎng)獲得的特定細胞懸浮液濃縮，以獲得所需的細胞濃度(密度)、粘度和細胞漿料所需的稠度。在具體的實施方案中，將來自細胞培養(yǎng)的相對較稀的細胞懸浮液離心設定的時間，以獲得在能夠在模具中成形的沉淀物中的細胞濃度。切向流過濾(“TFF”)是細胞濃縮或致密化的另一個合適的方法。在一些實施方案中，將化合物與細胞懸浮液合并，以提供所需的擠出性質。作為非限制的實例，合適的化合物包括:表面活性劑多元醇、膠原、水凝膠、MatrigeI?、納米纖維、自組裝納米纖維、明膠、纖維蛋白原等。
[0130]在一些實施方案中，通過將多個活細胞與組織培養(yǎng)基混合并使活細胞致密化(例如通過離心)來產(chǎn)生細胞漿料。任選地通過如下步驟來包括一種或多種ECM組分(或ECM組分的衍生物):將細胞沉淀物重懸浮在一種或多種含有ECM組分(或ECM組分的衍生物)的生理學可接受的緩沖液中，并將所得細胞懸浮液再次離心以形成細胞漿料。
[0131]在一些實施方案中，進一步加工所需的細胞漿料的細胞密度隨著細胞類型而改變。在進一步的實施方案中，細胞之間的相互作用決定了細胞漿料的性質，并且不同的細胞類型在細胞密度與細胞-細胞相互作用之間將具有不同的關系。在更進一步的實施方案中，在細胞漿料成形之前，任選地預處理該細胞，以增加細胞相互作用。例如，為了在細胞漿料成形之前增強細胞-細胞相互作用，任選地在離心之后在離心管內培養(yǎng)細胞。
[0132]在各個實施方案中，采用多種方法來使細胞漿料成形。例如，在特定實施方案中，將細胞漿料手工模塑或壓制(例如，在濃縮/致密化之后)，以獲得所需的形狀。進一步舉例來說，將細胞漿料吸收(例如，抽吸)到儀器如微量吸液管(例如，毛細吸管)中，這使細胞漿料成形，以符合該儀器的內表面。微量吸液管(例如毛細吸管)的橫截面形狀備選地是圓形的、正方形的、矩形的、三角形的或其它非圓形的橫截面形狀。在一些實施方案中，通過沉積，使細胞漿料在預形成的模具如塑料模具、金屬模具或凝膠模具中成形。在一些實施方案中，采用離心澆鑄或連續(xù)澆鑄來使細胞漿料成形。
[0133]在一些實施方案中，單獨的或與細長細胞體結合的基本為球形的多細胞聚集體也適合于建造本文中所述的組織和器官。通過多種方法適宜地產(chǎn)生球形聚集體，包括:自組裝、使用模具和懸滴法。在進一步的實施方案中，產(chǎn)生基本為球形的多細胞聚集體的方法包括以下步驟:1)提供具有所需細胞密度和粘度的、含有多個預先選擇的細胞或細胞聚集體的細胞漿料；2)將該細胞漿料處理成圓柱形狀；3)將圓柱體切割成相等的片段；4)將該片段在旋轉搖床上放置過夜；和5)通過成熟形成基本為球形的多細胞聚集體。
[0134]在一些實施方案中，部分粘附和/或凝聚的細胞漿料從成形裝置(例如，毛細吸管)轉移到允許向細胞供應營養(yǎng)物和/或氧氣的第二成形裝置(例如，模具)，同時它們在第二成形裝置中保持額外的成熟時間。允許向細胞供應營養(yǎng)物和氧氣的合適的成形裝置的一個例子是用于制造多個多細胞聚集體(例如，基本相同的多細胞聚集體)的模具。進一步舉例來說，這樣的模具包括由抵抗細胞向基質中的遷移或向內生長并且抵抗細胞對基質的粘著的材料制成的生物相容性基質。在各個實施方案中，該基質適當?shù)赜蒚eflon?(PTFE)、不銹鋼、瓊脂糖、聚乙二醇、玻璃、金屬、塑料或凝膠材料(例如水凝膠)和類似的材料制成。在一些實施方案中，還適當?shù)嘏渲媚＞?，以允許向細胞漿料供應組織培養(yǎng)基(例如通過將組織培養(yǎng)基分配到模具的頂部上)。
[0135]因此，在使用第二成形裝置的實施方案中，將部分粘附和/或凝聚的細胞漿料從第一成形裝置(例如，毛細吸管)轉移到第二成形裝置(例如，模具)。在進一步的實施方案中，將部分粘附和/或凝聚的細胞 漿料由第一成形裝置(例如，毛細吸管)轉移到模具的凹槽中。在更進一步的實施方案中，在成熟期(其中模具與保留于其中的細胞漿料一起在受控環(huán)境中孵育，以使細胞漿料中的細胞進一步彼此粘附和/或凝聚，以形成多細胞聚集體)之后，細胞的凝聚力將足夠強大，從而允許用工具(例如，毛細吸管)拾取所得的多細胞聚集體。在更進一步的實施方案中，該毛細吸管適宜地是生物打印機或類似裝置的打印頭的一部分，其可以操作，以自動地將多細胞聚集體放置在三維構建體中。
[0136]在一些實施方案中，多細胞聚集體的橫截面形狀和尺寸基本對應于第一成形裝置和任選的用于制備該多細胞聚集體的第二成形裝置的橫截面形狀和尺寸，并且本領域技術人員將能夠選擇具有適當橫截面形狀、橫截面積、直徑和長度的適當?shù)某尚窝b置，其適合于產(chǎn)生具有以上討論的橫截面形狀、橫截面積、直徑和長度的多細胞聚集體。
[0137]在一些實施方案中，配制生物墨水，以使其能夠采用能一步成形并分配生物墨水的自動化的、計算機輔助的三維原型系統(tǒng)進行生物打印。在一些實施方案中，用于一步成形和分配的生物墨水的配制包括加入擠出化合物。
將生物墨水生物打印成形式
[0138]在一些實施方案中，該方法包括將生物墨水生物打印成形式。生物打印是本文所描述的方法。許多三維形式是合適的并且能夠通過生物打印而產(chǎn)生。在各個實施方案中，作為非限制性的實例，合適的形式包括片、管和囊，所有這些在本文中進一步描述。在一些實施方案中，生物打印出該形式，其具有適合于用工程化的可植入組織或器官來置換、部分置換或增大天然組織或器官的尺寸。在進一步的實施方案中，生物打印出該形式，其具有適合于置換、部分置換或增大特定受試者中的特定組織或器官的尺寸。
[0139]如本文所述，在各個實施方案中，生物墨水包含具有許多合適的形狀和尺寸的多細胞聚集體。在一些實施方案中，多細胞聚集體是細長的，具有數(shù)種合適的橫截面形狀中的任一種，作為非限制性的實例，包括圓形、橢圓形、正方形、三角形、多邊形和不規(guī)則形狀。在進一步的實施方案中，多細胞聚集體是細長的，并且是圓柱體的形式。在一些實施方案中，細長的多細胞聚集體具有類似的長度和/或直徑。在其它實施方案中，細長的多細胞聚集體具有不同的長度和/或直徑。在一些實施方案中，多細胞聚集體基本上是球形的。在一些實施方案中，工程化的組織包括基本為球形的多細胞聚集體，其尺寸基本上是類似的。在其它實施方案中，工程化的組織包括基本為球形的多細胞聚集體，其具有不同的尺寸。在一些實施方案中，不同形狀和尺寸的工程化組織是通過布置各種形狀和尺寸的多細胞體而形成的。
[0140]在一些實施方案中，將凝聚的多細胞聚集體放置在支持物上。在各個實施方案中，該支持物是任何合適的生物相容性表面。在更進一步的實施方案中，作為非限制性的實例，合適的生物相容性表面包括聚合材料、多孔膜、塑料、玻璃、金屬、水凝膠及其組合。在一些實施方案中，該支持物用生物相容性物質涂覆，作為非限制性的實例，該生物相容性物質包括水凝膠、蛋白質、化學品、肽、抗體、生長因子或它們的組合。在一個實施方案中，該支持物涂覆有 NovoGeItm0
[0141]在一些實施方案中，一旦完成對凝聚的多細胞聚集體的放置，就將組織培養(yǎng)基倒在該構建體的頂 部。在進一步的實施方案中，組織培養(yǎng)基進入多細胞體之間的空間，以支持多細胞體中的細胞。
[0142]在一些實施方案中，該生物打印的形式是片。在進一步的實施方案中，片是基本為平面的形式，其具有一系列合適的幾何形狀，作為非限制性的實例，包括平面正方形、矩形、多邊形、圓形、橢圓形或不規(guī)則形狀。生物打印的片具有廣泛合適的尺寸。在一些實施方案中，選擇尺寸以有助于特定用途，作為非限制性的實例，包括創(chuàng)傷修復、組織修復、組織增大、組織置換和工程化器官構建。在進一步的實施方案中，選擇尺寸以有助于在特定受試者中的特定用途。例如，在一個實施方案中，生物打印出片以修復特定人類受試者的器官或組織的肌肉壁中的特定創(chuàng)傷或缺陷。在一些實施方案中，生物打印的片在生物打印時為至少150 μ m厚。在各個實施方案中，生物打印的片是約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 μ m或更厚，包括其中的增量。在進一步的各個實施方案中，生物打印的片的特征在于其長度、寬度或二者為約50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 μ m或更多，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，生物打印的片的特征在于其長度、寬度或二者為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOmm 或更多，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，生物打印的片的特征在于其長度、寬度或二者為約1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOcm或更多，包括其中的增量。參見例如實施例6 (和圖1)、實施例7 (和圖2)、實施例9(和圖3a及3b)、實施例10(和圖4a及4b)。
[0143]在一些實施方案中，該生物打印的形式是管。在進一步的實施方案中，管基本是軋制板或中空圓柱體。在一些實施方案中，生物打印的管用于構建工程化的器官。在進一步的實施方案中，生物打印的管用于構建工程化的輸尿管、泌尿導管、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、尿道、腸、結腸或食道。在其它實施方案中，生物打印的管用于延伸諸如食道、腸、結腸或尿道的天然管狀組織的長度。在其它實施方案中，生物打印的管用于創(chuàng)建新的連接以充當導管或旁路，例如泌尿導管，或例如肝門十二指腸腸旁路。在進一步的實施方案中，本文所公開的管不是血管。生物打印的管具有廣泛合適的尺寸。在一些實施方案中，選擇尺寸以有助于特定用途，作為非限制性的實例，包括創(chuàng)傷修復、組織修復、組織增大、組織置換、工程化器官的構建和器官置換。在進一步的實施方案中，選擇尺寸以有助于在特定受試者中的特定用途。例如，在一個實施方案中，生物打印出管以修復或置換特定人類受試者的淋巴管的特定節(jié)段。在一些實施方案中，生物打印的管的特征在于其在生物打印時具有至少150 μ m厚的管壁。在各個實施方案中，生物打印的管的壁是約10、15、20、25、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111或更厚，包括其中的增量。在一些實施方案中，該生物打印的管的特征在于其在生物打印時具有至少約250 μ m的內徑。在各個實施方案中，生物打印的管的內徑為約 50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、100(^111或更多，包括其中的增量。在其它各個實施方案中，生物打印的管的內徑為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30mm或更多，包括其中的增量。在一些實施方案中，生物打印的管的長度為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30mm或更長，包括其中的增量。在其它實施方案中，生物打印的管的長度為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30cm或更長，包括其中的增量。參見例如實施例13(和圖6)。
[0144]在一些實施方案中，該生物打印的形式是囊。在進一步的實施方案中，囊基本上是具有至少一個封閉端的軋制板或中空圓柱體(例如，袋子、杯子、中空體、氣囊等)。在一些實施方案中，生物打印的囊用于增大、修復或置換包含肌肉的組織或器官。在進一步的實施方案中，生物打印的囊用于構建工程化的胃、膀胱、子宮或膽囊的全部或部分。生物打印的囊具有廣泛合適的尺寸。在一些實施方案中，選擇尺寸以有助于特定用途，作為非限制性的實例，包括創(chuàng)傷修復、組織修復、組織增大、組織置換、工程化器官的構建和器官置換。在進一步的實施方案中，選擇尺寸以有助于在特定受試者中的特定用途。例如，在一個實施方案中，生物打印出囊以置換特定人類受試者的膀胱。在一些實施方案中，生物打印的囊的特征在于其在生物打印時具有至少150 μ m厚的壁。在各個實施方案中，生物打印的囊的壁是約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111或更厚，包括其中的增量。
生物墨水的融合
[0145] 在一些實施方案中，該方法包括將生物墨水融合成凝聚的細胞結構。在進一步的實施方案中，孵育促進了包含多細胞聚集體的生物墨水的融合。在進一步的實施方案中，孵育允許多細胞聚集體粘附和/或凝聚以形成組織或器官。在一些實施方案中，在細胞培養(yǎng)環(huán)境(例如，培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)瓶、生物反應器等)中，多細胞聚集體凝聚以形成組織。在進一步的實施方案中，在具有適合于促進包括在多細胞聚集體中的細胞類型生長的條件的環(huán)境中，多細胞聚集體凝聚以形成組織。在一個實施方案中，在約37°C下，在含有約5% CO2,含有約1% -21% O2的濕潤氣氛中，在含有促進粘附和/或凝聚的因子和/或離子的細胞培養(yǎng)基的存在下，孵育多細胞聚集體。
[0146]在各個實施方案中，孵育具有任何合適的持續(xù)時間。在進一步的各個實施方案中，孵育具有約 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180 或更多分鐘的持續(xù)時間，包括其中的增量。在進一步的各個實施方案中，孵育具有約1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48 或更多小時的持續(xù)時間，包括其中的增量。在進一步的各個實施方案中，孵育具有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20或更多天的持續(xù)時間，包括其中的增量。有幾種因素影響多細胞聚集體凝聚以形成組織所需的時間，作為非限制性的實例，包括細胞類型、細胞類型的比例、培養(yǎng)條件和添加劑如生長因子的存在。
將細胞施加到生物打印的形式之中或之上
[0147]在一些實施方案中，該方法進一步包括將細胞施加到生物打印的形式之中或之上。許多方法和技術適合于施加細胞。在各個進一步的實施方案中，將細胞例如生物打印、噴涂、涂抹、浸涂、移植、接種、注射、分層或生物打印到形式之中或之上。例如，在一些實施方案中，施加細胞包括用細胞的懸浮液、片、單層或融合的聚集體來涂覆肌肉構建體的一個或多個表面。在各個實施方案中，涂覆該肌肉構建體的1、2、3、4個或更多個表面。
[0148]在一些實施方案中，施加細胞包括生物打印融合多細胞聚集體的附加層。在其它實施方案中，施加一層細胞包括生物打印、噴涂或噴墨細胞的溶液、懸浮液或液體濃縮物。在進一步的實施方案中，合適的細胞懸浮液包含約IxlO4至約IxlO6個細胞/μ L。在再進一步的實施方案中，合適的細胞懸浮液包含約IxlO5至約1.5x10s個細胞/yL。在進一步的實施方案中，施加細胞包括將細胞懸浮液以空間分布的液滴的形式直接分配到組織構建體的一個或多個表面上。在再進一步的實施方案中，施加細胞包括將細胞懸浮液以噴霧的形式直接分配到組織構建體的一個或多個表面上。在各個實施方案中，細胞層在構建過程中的任意時間進行施加。在一些實施方案中，生物打印之后立即(例如，最多10分鐘)將一個或多個細胞層施加到平滑肌構建體的一個或多個外表面。在其它實施方案中，生物打印之后(例如，10分鐘之后)施加一個或多個層。在又一些其它實施方案中，在構建體的成熟期間施加一個或多個層。
[0149]任何類型的細胞都適合于以凝聚的多細胞聚集體的形式通過生物打印進行施加。此外，任何類型的細胞都適合于以懸浮液、溶液或濃縮物的液滴的形式通過沉積進行施加，或以懸浮液、溶液或濃縮物的形式通過噴涂進行施加。在一些實施方案中，將成纖維細胞施加到平滑肌構建體的一個或多個外表面上。在其它實施方案中，將內皮細胞施加到平滑肌構建體的一個或多個外表面上。在進一步的實施方案中，將一層內皮細胞施加到平滑肌構建體的一個或多個外表面上，并且將一層成纖維細胞施加到該構建體的一個或多個獨特的表面上。
[0150]實施例7說明了用凝聚的平滑肌細胞聚集體生物打印的平滑肌構建體，該平滑肌細胞聚集體進一步涂覆有由內皮細胞濃縮物(例如，1-1.5xl05個細胞/μ I)組成的第二細胞類型。實施例7的技術產(chǎn)生包含SMC的平滑肌構建體。參見例如圖2。
[0151]實施例8說明了用凝聚的人主動脈平滑肌細胞聚集體生物打印的平滑肌構建體。進一步地，由懸浮液中的人主動脈內皮細胞組成的第二細胞類型作為2.5μ L的液滴從生物打印機分配到生物打印的平滑肌細胞層之上。
[0152]在一些實施方案中，該方法進一步包括在支持物上培養(yǎng)細胞層的步驟。在這類實施方案中，施加細胞在某些情況下包括放置平滑肌構建體的一個或多個表面使其與預先存在的細胞層直接接觸。在進一步的實施方案中，將構建體直接生物打印到培養(yǎng)的細胞層或細胞單層上。生物相容性支持物上任何類型的培養(yǎng)細胞層都是合適的。在一些實施方案中，將多細胞聚集體生物打印到內皮細胞層上。在其它實施方案中，將多細胞聚集體生物打印到成纖維細胞層上。在進一步的實施方案中，該細胞層與生物打印的構建體的多細胞聚集體粘附和/或凝聚。
[0153]實施例9說明了與實施例8相同的構建體的構建；然而，該構建體被生物打印到支持物上，該支持物上已經(jīng)預先培養(yǎng)了鋪滿的人皮膚成纖維細胞單層。實施例9的技術產(chǎn)生包含SMC的平滑肌構建體，其具有包含內皮細胞層和成纖維細胞層二者的附加層。參見例如圖3a和3bο
用于增加工程化組織的存活力的額外步驟
[0154]在一些實施方案中，該方法進一步包括在生物打印之后但在植入之前增加工程化組織或器官的存活力的步驟。在進一步的實施方案中，這些步驟包括:通過限制材料的暫時或半永久性的網(wǎng)格，提供該組織或器官與營養(yǎng)培養(yǎng)基之間的直接接觸。在一些實施方案中，該組織被束縛 在多孔或間隙材料中。該工程化組織的至少一些細胞直接接近營養(yǎng)物增加了該工程化組織的存活力。
[0155]在進一步的實施方案中，用于增加工程化組織的存活力的額外和任選的步驟包括:1)任選地在放置凝聚的多細胞聚集體之前，布置限制材料的基底層；2)任選地布置限制材料的周界；3)在限定的幾何形狀內生物打印該組織的細胞；和4)布置限制材料的細長體(例如，圓柱體、帶狀體等)，按照圖案覆蓋初生組織，該圖案在限制材料中引入間隙，例如網(wǎng)格、網(wǎng)孔或格子。例如，參見實施例12和圖5。
[0156]許多限制材料適合用于本文描述的方法中。在一些實施方案中，水凝膠是示例性的限制材料，其具有一種或多種有利的性質，包括:非附著的、生物相容的、可擠出的、可生物打印的、非細胞的、具有合適的強度以及不溶于水性條件。在一些實施方案中，適宜的水凝膠是天然聚合物。在一個實施方案中，該限制材料由NovoGel?組成。在進一步的實施方案中，合適的水凝膠包括衍生自表面活性劑多元醇的水凝膠如Pluronic F-127、膠原、透明質酸鹽、纖維蛋白、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖、它們的衍生物或組合。在其它實施方案中，合適的水凝膠是合成聚合物。在進一步的實施方案中，合適的水凝膠包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(環(huán)氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其組合的那些水凝膠。在各個具體實施方案中，該限制材料選自:水凝膠、NovoGel?、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、Matrigel?、透明質酸、泊洛沙姆、肽水凝膠、聚(異丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羥乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、絲或它們的組合。
[0157]在一些實施方案中，覆蓋圖案的間隙均勻地或基本均勻地圍繞組織的表面分布。在其它實施方案中，該間隙不均勻地分布，從而使組織的細胞不均勻地暴露于營養(yǎng)物。在不均勻的實施方案中，利用對營養(yǎng)物的差異獲取來影響組織的一種或多種性質。例如，在某些情況下，理想的是在生物打印的組織的一個表面上的細胞比在該生物打印的組織的另一表面上的細胞增殖更快。在一些實施方案中，任選地在不同的時間改變該組織的各個部分對營養(yǎng)物的暴露，以影響該組織向期望的終點的發(fā)育。
[0158]在一些實施方案中，在任何合適的時間除去限制材料，包括但不限于:生物打印之后立即(例如，在10分鐘內)、在生物打印之后(例如，10分鐘后)、在細胞基本上彼此凝聚之前、在細胞基本上彼此凝聚之后、在細胞產(chǎn)生細胞外基質之前、在細胞產(chǎn)生細胞外基質之后、恰在使用之前，等等。在各個實施方案中，通過任何合適的方法除去限制材料。例如，在一些實施方案中，將限制材料切除、從細胞上扯下、消化或溶解。
[0159]在一些實施方案中，該方法進一步包括使工程化組織在一個或多個側面上經(jīng)受由流體流動引起的剪切力的步驟。
具體的示例性實施方案
[0160]在某些實施方案中，本文公開了包含至少一個含肌細胞層的工程化組織和器官，其中該工程化組織或器官基本上由細胞材料組成并可植入脊椎動物受試者，并且其中該工程化組織或器官不是血管。在一些實施方案中，該組織或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。在一些實施方案中，肌肉層通過生物打印的細胞聚集體的融合而形成。在進一步的實施方案中，該肌肉層基本不含任何預形成的支架。在再進一步的實施方案中，該肌肉層不用預形成的支架成形。在一些實施方案中，該組織或器官基本上由能在生物打印后生成細胞外基質的細胞材料組成。在一些實施方案中，該肌肉層是平滑肌，并且在生物打印時為至少150 μ m厚。在進一步的實施方案中，該平滑肌層在生物打印時為至少約250 μ m。在進一步的實施方案中，該平滑肌層在生物打印時為至少約500 μ m厚。在一些實施方案中，該組織或器官進一步包含選自下組的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞及其組合。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞被分配到該平滑肌層的至少一個表面上。在進一步的實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞被生物打印到該平滑肌層的至少一個表面上。在再進一步的實施方案中，該細胞選自:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞及其組合。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞基本與生物打印該平滑肌層同時被分配到該平滑肌層上。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞在生物打印該平滑肌層之后被分配到該平滑肌層上。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞在該平滑肌層成熟期間被分配到該平滑肌層上。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞在該平滑肌層成熟之后被分配到該平滑肌層上。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞在生物打印該平滑肌層24小時以內被分配到該平滑肌層上。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞在生物打印該平滑肌層24小時之后被分配到該平滑肌層上。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞以一個或多個細胞層的形式被分配到該平滑肌層上。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞以小于約IOOym厚的細胞層的形式被分配到該平滑肌層上。 在其它實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞以大于約IOOym厚而小于約500 μ m厚的細胞層的形式被分配到該平滑肌層上。在一些實施方案中，成纖維細胞被分配到該平滑肌層之中或之上。在一些實施方案中，內皮細胞被分配到該平滑肌層之中或之上。在進一步的實施方案中，該內皮細胞是組織特異性的。在一些實施方案中，該平滑肌層基本是平面的。在進一步的實施方案中，該平面在生物打印時為至少150μπι厚。在再進一步的實施方案中，該組織是適用于創(chuàng)傷修復或組織增大的、包含平滑肌細胞的片或補片。在一些實施方案中，該平滑肌層為管狀。在進一步的實施方案中，該管在生物打印時具有至少約150μπι的內徑。在進一步的實施方案中，該管壁在生物打印時為至少150 μ m厚。在再進一步的實施方案中，該器官是輸尿管或輸尿管的一部分、泌尿導管或泌尿導管的一部分、膀胱或膀胱的一部分、輸卵管或輸卵管的一部分、子宮或子宮的一部分、氣管或氣管的一部分、支氣管或支氣管的一部分、淋巴管或淋巴管的一部分、尿道或尿道的一部分、腸或腸的一部分、結腸或結腸的一部分、食道或食道的一部分。在一些實施方案中，該管的內徑和外徑與相應的天然組織或器官的內徑和外徑基本相似。在一些實施方案中，該平滑肌層包含囊或囊的一部分。在進一步的實施方案中，該囊壁在生物打印時為至少150 μ m厚。在再進一步的實施方案中，該囊狀器官是胃、膀胱、子宮、膽囊。在一些實施方案中，該囊的內外尺寸與相應的天然器官的尺寸基本相似。在一些實施方案中，生物打印出平滑肌層，其具有適合于用該工程化的可植入器官置換天然器官的尺寸。在一些實施方案中，生物打印出平滑肌層，其具有適合于用該工程化的可植入器官部分地置換天然器官的尺寸。在一些實施方案中，生物打印出平滑肌層，其具有適合于用該工程化的可植入器官部分增大天然器官的尺寸。在一些實施方案中，該包含平滑肌的管、片或囊在生物打印期間由非粘附的水凝膠限制材料所支撐。在進一步的實施方案中，生物打印后該非粘附的水凝膠限制材料仍與該包含平滑肌的管、片或囊相關聯(lián)。在再進一步的實施方案中，在生物打印之后而在植入體內之前的某個時間點，該非粘附的水凝膠限制材料脫離包含平滑肌的管、片或囊。在進一步的實施方案中，非粘附性水凝膠將生物打印的細胞限制到合適的尺寸。在再進一步的實施方案中，該 非 粘附的水凝膠限制材料被配置成允許至少一些生物打印的細胞接觸營養(yǎng)培養(yǎng)基。在一些實施方案中，該細胞包括成體分化細胞。在其它實施方案中，該細胞包括成體未分化細胞。在一些實施方案中，該平滑肌細胞是組織特異性的。在進一步的實施方案中，該平滑肌細胞是人主動脈平滑肌細胞或人臍靜脈平滑肌細胞。在一些實施方案中，該平滑肌細胞源自人脂肪抽吸物。在一些實施方案中，該組織或器官包含源自人脂肪抽吸物的另外的非平滑肌細胞類型。在一些實施方案中，該細胞源自特定的脊椎動物受試者。在一些實施方案中，選擇該細胞以模擬特定的疾病狀態(tài)。在一些實施方案中，該組織或器官選自:尿道、泌尿導管、輸尿管、膀胱、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、食道、胃、膽囊、小腸、大腸和結腸。
[0161]在某些實施方案中，本文公開了工程化的組織和/或器官在脊椎動物受試者中的植入，其中該組織和器官包含至少一個平滑肌層，其中該工程化的組織或器官基本上由細胞材料組成，并且其中該工程化的組織或器官不是血管。
[0162]在某些實施方案中，本文公開了制備包含平滑肌組織的可植入組織或器官的方法，該方法包括:制備包含平滑肌細胞的生物墨水；將該生物墨水生物打印成形式；并且將該生物墨水融合成凝聚的細胞結構，其中該可植入組織或器官不是血管。在一些實施方案中，該可植入組織或器官基本不含任何預形成的支架。在一些實施方案中，該平滑肌細胞分離自哺乳動物受試者的天然平滑肌組織。在一些實施方案中，該平滑肌細胞分化自祖細胞。在一些實施方案中，該平滑肌細胞由組織樣品生成。在進一步的實施方案中，該組織樣品是脂肪抽吸物。在一些實施方案中，該形式成熟約2小時至約10天。在進一步的實施方案中，成熟發(fā)生在一段長達4周的時間內。在一些實施方案中，該形式是片。在其它實施方案中，該形式是囊。在又一些其它實施方案中，該形式是在生物打印時內徑為約0.15mm或更大的管，其中該管不是血管。在一些實施方案中，該生物墨水進一步包含選自下組的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、非血管平滑肌細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞及其組合。在一些實施方案中，該方法進一步包括將細胞生物打印、噴涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、接種、注射或分層到生物打印的形式之中或之上的步驟。在一些實施方案中，該方法進一步包括將細胞生物打印、噴涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、注射、接種或分層到凝聚的細胞結構之中或之上的步驟。在一些實施方案中，該方法進一步包括生物力學或生物化學調節(jié)生物打印的形式以使其朝目標應用方向成熟的步驟。
[0163]在某些實施方案中，本文公開了用于制備可植入的工程化器官的工程化組織，其中所述組織包含至少一個平滑肌層；其中所述至少一個平滑肌層包含具有三維幾何形狀的融合細胞元件，并且其中該組織不是血管。在一些實施方案中，該至少一個平滑肌層是生物打印的。在進一步的實施方案中，該組織基本不含任何預形成的支架。在一些實施方案中，該三維幾何形狀被非粘附性材料或模具所限制。在一些實施方案中，該組織進一步包含選自下組的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、非血管平滑肌細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞及其組合。在一些實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞被分配到該平滑肌層的至少一個表面上。在進一步的實施方案中，除平滑肌細胞以外的細胞被生物打印到該平滑肌層的至少一個表面上。在再進一步的實施方案中，該除平滑肌細胞以外的細胞選自:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、非血管平滑肌細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞及其組合。在一些實施方案中，該細胞層在生物打印時為至少150 μ m厚。在一些實施方案中，該組織附著到組織培養(yǎng)相容性表面上。在一些實施方案中，該組織適合于植入脊椎動物受試者中。在一些實施方案中，本文中公開了工程化的組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含基于細胞的三維元件和暫時的或可移除的限制材料，其中該限制材料允許細胞與培養(yǎng)基之間直接接觸。在一些實施方案中，該工程化的、基于細胞的三維元件是生物打印的。在進一步的實施方案中，該工程化的、基于細胞的三維元件不含任何預形成的支架。在一些實施方案中，該限制材料具有至少一個以下特征:基本上不粘附于細胞；是生物相容的；是可擠出的；是非細胞的；具有足夠的強度，以提供對細胞的支持；和不溶于水性條件。在進一步的實施方案中，該限制材料不是塑料，不是玻璃，且不是陶瓷。在一些實施方案中，該限制材料是水凝膠。在進一步的實施方案中，該限制材料是NovoGel?。在進一步的實施方案中，該限制材料包括如下的一種或多種:瓊脂糖、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、透明質酸、明膠、泊洛沙姆、甲基丙烯酸羥乙酯、肽水凝膠、Matrigel?、聚二甲硅氧烷、硅、絲、聚丙烯酰胺、聚乳酸、表面活性劑多元醇和藻酸鹽。在一些實施方案中，該細胞和/或限制材料的至少一種從生物打印機擠出。在進一步的實施方案中，在限制材料中存在間隙，并且其中營養(yǎng)培養(yǎng)基能夠通過該間隙接觸細胞。在更進一步的實施方案中，該間隙為約100μπι至約30mm寬。在一些實施方案中，該間隙圍繞該結構不均勻地分布，從而使該組織的細胞不均勻地暴露于營養(yǎng)物。在一些實施方案中，其中該組織至少約10%的表面積暴露于適合于與營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸的間隙。在一些實施方案中，該限制材料覆蓋在細胞上，作為至少一個細長的元件。在進一步的實施方案中，限制材料的細長元件具有約100μπι至約Imm的橫截面厚度。在一些實施方案中，在限制材料的細長元件之間存在間隙。在一些實施方案中，當從生物打印機擠出該限制材料時，在細長元件之間留下間隙。在其它實施方案中，將至少一些限制材料從系統(tǒng)中除去，以提供間隙。在一些實施方案中，限制材料的細長材料是基本上平行的，并且該間隙是細長的。在一些實施方案中，限制材料的細長元件被布置在網(wǎng)格中。在一些實施方案中，限制材料的細長元件將該結構附著在支承面上。在一些實施方案中，該系統(tǒng)適合于運送。在一些實施方案中，生物打印的細胞包含以下中的至少一種:平滑肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞和上皮細胞。在一些實施方案中，該營養(yǎng)培養(yǎng)基包含以下中的至少一種:氧(O2)、碳源、氮源、生長因子、鹽、礦物質、維生素、血清、抗生素、化學品、蛋白質、核酸、藥物化合物和抗體。
[0164]在某些實施方案中，本文中公開了工程化的活組織，其包含三維的包含細胞的元件，通過水凝膠固定在合適的位置，其中該水凝膠作為圓柱體或帶狀體被分配到所述包含細胞的元件上，在該圓柱體或帶狀體之間存在間隙，細胞通過該間隙接近營養(yǎng)物，并且其中該水凝膠可從該組織移除。
[0165]在某些實施方案中，本文中公開了用于增加工程化組織的存活力的方法，包括:通過暫時的或半永久性的網(wǎng)格，在該組織與營養(yǎng)培養(yǎng)基之間提供直接接觸，其中該組織不含任何預形成的支架。在一些實施方案中，通過暫時的或半永久性的網(wǎng)格在該組織與培養(yǎng)基之間提供直接接觸的步驟包括:將所述組織束縛在多孔或間隙材料中。在進一步的實施方案中，該孔或間隙為約100μπι至約30_寬。在進一步的實施方案中，該多孔或間隙材料是水凝膠。在更進一步的實施方案中，該多孔或間隙材料是瓊脂糖。在一些實施方案中，工程化組織的存活力在體外增加。在一些實施方案中，構成工程化組織的至少部分細胞的存活力得到延長。在進一步的實施方案，該細胞的存活力延長I天或以上。在一些實施方案中，該至少一種營養(yǎng)物選自:碳源、氮源、生長因子、鹽、礦物質、維生素、血清、抗生素、蛋白質、核酸、藥物化合物和抗體。在一些實施方案中，至少一種營養(yǎng)物是氧(O2)。在進一步的實施方案中，該多孔或間隙水凝膠限制材料旨在提供在一個或多個表面上對營養(yǎng)物的暴露具有差異的生物打印的細胞。
[0166]在某些實施方案中，本文中公開了制備組織培養(yǎng)系統(tǒng)的方法，包括如下步驟:在生物相容性基質上建立包含細胞的三維元件；并分配限制材料以覆蓋該包含細胞的三維元件，其中該覆蓋的限制材料允許該細胞的至少一部分與生長培養(yǎng)基接觸。
[0167] 在某些實施方案中，本文中公開了制備組織培養(yǎng)系統(tǒng)的方法，包括如下步驟:在表面上分配限制材料的周界；在該周界內分配細胞；并分配限制材料以覆蓋該細胞，其中該覆蓋的限制材料允許該細胞的至少一部分與生長培養(yǎng)基接觸。在一些實施方案中，限制材料的分配是通過生物打印完成的。在一些實施方案中，該方法包括或進一步包括將該系統(tǒng)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以使生物打印的細胞構建體成熟。
實施例[0168]下面的具體實施例應解釋為僅是說明性的，而不是以任何方式限制公開內容的其它部分。無需進一步詳盡說明，相信本領域技術人員基于本文的描述能夠最大限度地利用本發(fā)明。
實施例1一細胞培養(yǎng)
[0169]平滑肌細朐
[0170]將原代人主動脈平滑肌細胞(HASMC；GIBCO/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在補充有10 %胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.lmg/mL鏈霉素、0.25 μ g/mL兩性霉素B、0.01M HEPES(均來自 Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)、50mg/L 腦氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗壞血酸和3 μ g/L CuS04(全部來自Sigma, St.Louis, MO)的低葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM ；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和5% CO2下維持并擴充。在所有的研究中使用傳代4-8代的HASMC的鋪滿培養(yǎng)物。
[0171]內皮細胞
[0172]將原代人主動脈內皮細胞(HAEC;GIBC0/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在補充有10%FBS、ly g/mL氫化可的松、10ng/mL人表皮生長因子、3ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、10 μ g/mL肝素、100U/mL青霉素、0.lmg/mL鏈霉素和0.25 μ g/mL兩性霉素B(均來自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)的培養(yǎng)基 I" (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中維持并擴充。細胞在37°C和5% CO2下，在明膠(來自豬血清，Sigma, St.Louis, MO)包被的、組織培養(yǎng)物處理的燒瓶中 生長。在所有的研究中使用傳代4-8代的HAEC的鋪滿培養(yǎng)物。
[0173]成纖維細朐
[0174]將原代人皮膚成纖維細胞(HDF；GIBC0/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在補充有2 % FBS、1 μ g/mL氫化可的松、lOng/mL人表皮生長因子、3ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、10 μ g/mL肝素、100U/mL青霉素和0.lmg/mL鏈霉素(均來自InvitrogenCorp., Carlsbad, CA)的培養(yǎng)基 106 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和 5% CO2下維持并擴充。在所有的研究中使用傳代4-8代的HDF的鋪滿培養(yǎng)物。
[0175]來自人脂肪抽吸物的SVF的SMC樣細胞
[0176]從膠原酶消化脂肪抽提物后分離的細胞的附著部分產(chǎn)生SMC樣細胞。此消化產(chǎn)生了被稱作基質血管組分(SVF)的一群細胞。任選地將SVF的細胞接種到標準組織培養(yǎng)塑料上，并通過合適的培養(yǎng)條件進一步選擇貼壁細胞。將來自脂肪組織抽吸物的SVF的SMC樣細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.lmg/mL鏈霉素、0.25 μ g/mL兩性霉素 Β、0.01M HEPES(均來自 Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)、50mg/L 腦氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗壞血酸和3 μ g/L CuSO4 (均來自Sigma, St.Louis, MO)的高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM ；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和5% CO2下維持并擴充。在所有的研究中使用傳代3-8代的SVF-SMC的鋪滿培養(yǎng)物。
[0177]來自人脂肪抽吸物的SVF的EC
[0178]將來自基質血管組分(SVF)的內皮細胞在生長培養(yǎng)基中維持并擴充，該培養(yǎng)基通常用于生長真正(bona fide)內皮細胞(EC)的原代分離物。具體而言，將SVF-EC維持在補充有10%FBS、ly g/mL氫化可的松、10ng/mL人表皮生長因子、3ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、1(^8/11^肝素、10(^/1^青霉素和0.lmg/mL鏈霉素的M199中。使細胞在37°C和5%CO2下，在組織培養(yǎng)基處理的燒瓶中生長。在所有的研究中使用傳代3-8代的SVF-EC的鋪滿培養(yǎng)物。
實施例2 — NovoGel?溶液和模具
[0179]2%矛口 4% (w/v)NovoGeI11 溶液的吿l|備
[0180]將Ig 或 2g(分別對應 2%或 4% )的 NovoGeI?(Organovo, San Diego, CA)溶于5OmL Dulbecco 憐酸鹽緩沖鹽水(DPBS ;Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中。簡言之，將DPBS和NovoGel?在恒定攪拌下在加熱板上加熱到85°C,直至NovoGel?完全溶解。通過蒸汽滅菌法將NovoGel?溶液在125°C下滅菌25分鐘。NovoGel?溶液保持于液相，只要溫度維持在65.5°C以上。低于這個溫度會發(fā)生相變，NovoGel?溶液的粘度增加，并且NovoGel?形成固體凝膠。
[0181]NovoGel?模具的制備
[0182]采用適配IOcm培養(yǎng)皿的TeflonS模具，制造用于孵育圓柱形生物墨水的NovoGel?模具。簡言之，將丨erkm_模具使用70%乙醇溶液預滅菌，并使該模具經(jīng)受45分鐘紫外線照射。將滅菌的模具放在IOcm培養(yǎng)皿(VWR International LLC, WestChester, PA)的上方，并牢固地附接。將這個組裝體(Teflon:?模具+培養(yǎng)皿)垂直保持，并將45mL預加溫的無菌2% NovoGel?溶液倒入Teflon?摸具與培養(yǎng)皿之間的間隙。隨后，將該組裝體在室溫下水平放置I小時，以使NovoGel?完全膠凝。在膠凝以后，取出Teflon?印制物，并用DPBS沖洗兩次NovoGel?模具。然后，向NovoGel?模具加入17.5mL
的HASMC培養(yǎng)基，用于孵育多型圓柱形生物墨水。
實施例3 — HASMC-HAEC多型圓柱形生物墨水的制造
[0183] 為了制備多型圓柱形生物墨水，單獨收集HASMC和HAEC，隨后以預先確定的比例混合。簡言之，從鋪滿的培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基，并用DPBS(lml/15cm2生長面積)沖洗細胞。通過在胰蛋白酶(lml/15cm2生長面積；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育10分鐘，使細胞從培養(yǎng)瓶的表面上脫離。采用0.15%胰蛋白酶來分離HASMC，而采用0.1%胰蛋白酶來分離HAEC。在孵育后,將合適的培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中(2X體積,相對于胰蛋白酶體積)。將細胞懸浮液在200g下離心6分鐘，隨后完全除去上清液。將細胞沉淀物重懸浮于各自的培養(yǎng)基中，并利用血細胞計數(shù)器計數(shù)。將適當體積的HASMC和HAEC合并，以產(chǎn)生含有15% HAEC和其余85% HASMC (基于總細胞群的％)的多型細胞懸浮液。將該多型細胞懸浮液在200g下離心5分鐘，隨后完全除去上清液。將多型細胞沉淀物重懸浮于6mL的HASMC培養(yǎng)基中，并轉移到20mL玻璃小瓶(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在定軌搖床上以150rpm在37°C和5% CO2下孵育60分鐘。這使得細胞彼此聚集，并開始細胞-細胞粘附。在孵育后，將細胞懸浮液轉移到15mL離心管中，并在200g下離心5分鐘。在除去上清液培養(yǎng)基之后，將該細胞沉淀物重懸浮于400 μ I的HASMC培養(yǎng)基中，并用移液管上下吸取幾次，以確保所有的細胞簇被打破。將細胞懸浮液轉移到放置在15mL離心管中白勺 0.5mL 微量離心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在 2000g 下離心4分鐘，以形成高度致密并壓緊的細胞沉淀物。將上清液培養(yǎng)基吸出，并通過抽吸將細胞轉移到毛細管(0D1.5mm, ID0.5mm, L75mm ;Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以產(chǎn)生50mm長的圓柱形生物墨水。在37°C和5% CO2下，將毛細管中的細胞漿料在HASMC培養(yǎng)基中孵育20分鐘。隨后，使用隨毛細管提供的柱塞，將圓柱形生物墨水從毛細管中擠出到NovoGel?模具(例如，參見實施例2)(覆蓋有HASMC培養(yǎng)基)的凹槽中。將圓柱形生物墨水在37°C和5% CO2下孵育24小時。
實施例4一HASMC-HDF-HAEC多型圓柱形生物墨水的制作
[0184]為了制備多型圓柱形生物墨水，單獨收集HASMC、HDF和HAEC，隨后以預先確定的比例(例如，70:25:5的HASMC:HDF:HAEC比例)混合。簡言之，從鋪滿的培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基，并用DPBS(lmL/10cm2生長面積)沖洗細胞。通過在胰蛋白酶(lmL/15cm2生長面積；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育10分鐘,使細胞從培養(yǎng)瓶的表面上脫離。采用0.15%胰蛋白酶來分離HASMC和HDF，而采用0.1 %胰蛋白酶來分離HAEC。在孵育后，將合適的培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶(2X體積,相對于胰蛋白酶體積)中。將細胞懸浮液在200g下離心6分鐘，隨后完全除去上清液。將細胞沉淀物重懸浮于各自的培養(yǎng)基中，并利用血細胞計數(shù)器計數(shù)。將適當體積的HASMC、HDF和HAEC合并，以產(chǎn)生多型細胞懸浮液。將該多型細胞懸浮液在200g下離心5分鐘，隨后吸出上清液。將多型細胞沉淀物重懸浮于6mL的HASMC培養(yǎng)基中，并轉移到20mL玻璃小管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在定軌搖床上以150rpm在37°C和5% CO2下孵育60分鐘。這使得細胞彼此聚集，并開始細胞-細胞粘附。在孵育后，將細胞懸浮液轉移到15mL離心管中，并在200g下離心5分鐘。在除去上清液培養(yǎng)基之后，將細胞沉淀物重懸浮于400 μ I的HASMC培養(yǎng)基中，并用移液管上下吸取幾次，以確保所有的細胞簇被打破。將該細胞懸浮液轉移到放置在15mL離心管中白勺 0.5mL 微量離心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在 2000g 下離心4分鐘，以形成高度致密并壓緊的細胞沉淀物。將上清液培養(yǎng)基吸出，并通過抽吸將細胞轉移到毛細管(0D1.5mm, ID0.266mm, T,75mm ；Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以產(chǎn)生50mm長的圓柱形生物墨水。在37°C和5% CO2下，將毛細管中的細胞漿料在HASMC培養(yǎng)基中孵育20分鐘。隨后，使用 隨毛細管提供的柱塞，將圓柱形生物墨水從毛細管中擠出到NovoGel?模具(覆蓋有HASMC培養(yǎng)基)的凹槽中。將圓柱形生物墨水在37°C和5%CO2下孵育6至24小時。
實施例5 — SVF-SMC-SVF-EC多型圓柱形生物墨水的制造
[0185]為了制備多型圓柱形生物墨水，單獨收集SVF-SMC和SVF-EC，隨后以預先確定的比例混合。簡言之，從鋪滿的培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基，并用DPBS(lmL/5cm2生長面積)沖洗細胞。通過在TrypLE (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育5-10分鐘,使細胞從培養(yǎng)瓶的表面上脫離。在孵育后，將合適的培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中來猝滅酶活性。將細胞懸浮液在200g下離心6分鐘，隨后完全除去上清液。將細胞沉淀物重懸浮于各自的培養(yǎng)基中，并利用血細胞計數(shù)器計數(shù)。將適當體積的SVF-SMC和SVF-EC合并，以產(chǎn)生含有15% SVF-EC和其余85% SVF-SMC (基于總細胞群的％ )的多型細胞懸浮液。將多型細胞懸浮液在200g下離心5分鐘，隨后完全除去上清液。將多型細胞沉淀物重懸浮于6mL的SVF-SMC培養(yǎng)基中，并轉移到20mL玻璃小管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在定軌搖床上以150印111在371:和5%0)2下孵育60分鐘。這使得細胞彼此聚集，并開始細胞-細胞粘附。在孵育后，將細胞懸浮液轉移到15mL離心管中，并在200g下離心5分鐘。在除去上清液培養(yǎng)基之后，將細胞沉淀物重懸浮于400 μ I的SVF-SMC培養(yǎng)基中，并用移液管上下吸取幾次，以確保所有的細胞簇被打破。將細胞懸浮液轉移到放置在15mL離心管中的0.5mL微量離心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在 2000g 下離心 4 分鐘,以形成高度致密并壓緊的細胞沉淀物。將上清液培養(yǎng)基吸出，并通過抽吸將細胞轉移到毛細管(0D1.25mm, ID0.266mm, L75mm ;Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以產(chǎn)生50mm長的圓柱形生物墨水。在37°C和5% CO2下，將毛細管中的細胞漿料在SVF-SMC培養(yǎng)基中孵育20分鐘。隨后，使用隨毛細管提供的柱塞，將圓柱形生物墨水從毛細管中擠出到NovoGel?模具(覆蓋有SVF-SMC培養(yǎng)基)的凹槽中。將圓柱形生物墨水在37°C和5% CO2下孵育6至12小時。
實施例6—生物打印包含血管SMC和EC混合物的血管壁節(jié)段
[0186]利用NovoGen MMX Bioprinter? (Organovo, Inc.San Diego, CA),將血管壁構建體生物打印到預先用1.5mL2% (w/v) NovoGel?包被的6孔培養(yǎng)板的孔中。用人血管平滑肌細胞(SMC)和人內皮細胞(EC)的混合物(SMC:EC比例為85:15或70:30)制備細胞生物墨水圓柱體。通過將細胞沉淀物(SMC = EC)吸至內徑(ID)SOOym或266μπι的玻璃微毛細管中，來產(chǎn)生生物墨水圓柱體。隨后，將生物墨水圓柱體擠出到覆蓋有合適培養(yǎng)基的NovoGel?模具中。在生物打印之前，將圓柱形生物墨水保持6至18小時。使用含有SMC和EC混合物的圓柱體。在這些實驗中，將圓柱體內的EC分選到圓柱體的外圍，導致形成由EC覆蓋并含有富SMC構建體壁的構建體。該過程導致形成含有由SMC和EC覆蓋物組成的壁的平滑肌構建體。使用生物打印方案將該構建體生物打印在培養(yǎng)孔的中心，并且向培養(yǎng)孔填充合適的培養(yǎng)基，并將構建體返回到培養(yǎng)箱中以供成熟和評價。生物打印后，用適量的培養(yǎng)基(例如，對于6孔板的I個孔是4mL)覆蓋該構建體。總之，本實施例描述了血管SMC和EC用于在標準尺寸多孔組織培養(yǎng)板中生物打印小規(guī)模平滑肌構建體的用途。所得平滑肌構建體的特征在于一個或多個EC外層和主要包含或僅包含SMC的內壁。
實施例7—生物打印包含人血管SMC與EC覆蓋物的血管壁節(jié)段 [0187]利用NovoGen MMX Bioprinter? (Organovo, Inc.San Diego, CA),將血管壁構建體生物打印到預先用1.5mL2% (w/v) NovoGel?所覆蓋的6孔培養(yǎng)板的孔中。用人血管平滑肌細胞(SMC)制備細胞生物墨水圓柱體。通過將細胞沉淀物(SMC)吸至內徑(ID)為500 μ m或266 μ m的玻璃微毛細管中來產(chǎn)生生物墨水。隨后，將生物墨水圓柱體擠出到覆蓋有合適培養(yǎng)基的NovoGel?模具中。在生物打印之前，將該圓柱形生物墨水保持6至18小時。將EC-濃縮物(1-1.5x10s個細胞/μ I)直接生物打印到之前生物打印的SMC結構的上方。該過程導致形成含有由SMC和EC覆蓋物組成的壁的平滑肌構建體。使用生物打印方案將該構建體生物打印在培養(yǎng)孔的中心。生物打印后，用適量的培養(yǎng)基(例如，對于6孔板的I個孔是4mL)覆蓋該構建體，并將其返回到培養(yǎng)箱中用于成熟和評價?？傊?，本實施例描述了血管SMC和EC用于在標準尺寸多孔組織培養(yǎng)板塊中生物打印平滑肌構建體的用途。所得平滑肌構建體的特征在于EC的外層和主要包含或僅包含SMC的內壁。
實施例8—利用NovoGel?容納生物打印包含用HAEC層化的HASMC的血管壁節(jié)段
[0188]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?包
被的孔內或者直接向多孔板(例如6孔板)的(..:ormng# Transwelf?插入物上，生物打
印血管壁模擬節(jié)段。該過程包括下面三個階段:
[0189]HASMC圓梓體的制各
[0190]對人主動脈平滑肌細胞(HASMC)的培養(yǎng)物進行胰蛋白酶化，之后在旋轉震蕩器上搖動60分鐘。在搖動之后，將細胞收集、離心并吸至266或SOOym(ID)玻璃微毛細管中。最后，將細胞擠出到培養(yǎng)基覆蓋的NovoGel?板內，并孵育至少6小時。
[0191]用HAEC層化的HASMC補片的牛物打印
[0192]就在生物打印補片(例如，節(jié)段)之前，對人主動脈內皮細胞(HAEC)培養(yǎng)物進行胰蛋白酶化、計數(shù)，之后以IxlO6個細胞/10 μ L培養(yǎng)基的工作濃度重懸浮于HAEC培養(yǎng)基中。將HAEC懸浮液置于將要用于對生物打印的補片進行層化的生物打印機中。在打印到多孔板的孔內的NovoGel?床上的情況下,生物打印第一層NovoGel?圓柱體。然后,在它的上方，利用NovoGel?棒來生物打印箱盒，使得內部空間為8mm長xl.25毫米寬。在上述孵育期結束時將成熟的HASMC圓柱體重新抽吸到微毛細管中，并裝載到生物打印機上用于在該箱盒內打印。然后，通過生物打印機將懸浮液中的HAEC吸入干凈的微毛細管中，并分配到打印的HASMC圓柱體的上方4次，接近所打印的補片的四個角。每滴的體積為2.5yL。在繼續(xù)打印第三層之前，將該構建體孵育15-30分鐘。最后，將第三層NovoGel?圓柱體打印在第二層的上方，以在頂部創(chuàng)建網(wǎng)格/網(wǎng)孔型結構。在打印到培養(yǎng)板的孔內部的Transwdl㈤插入物上的情況下，除去前面描述的第一層NovoGel?棒。隨后，用合適的細胞培養(yǎng)基覆蓋生物打印的構建體并進行孵育。
_3] 生物打印的構建體的成熟
[0194]將生物打印的構建體孵育I至7天，以使該構建體成熟，并為HAEC提供充足的時間，以在HASMC補片的上方形成均勻的薄單層。在某些實驗中，使該三維肌細胞補片經(jīng)受剪切力(即脈動流)。
實施例9一利用NovoGel?容納向HDFa單層上生物打印包含用HAEC層化的HASMC的
血管壁節(jié)段
[0195]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),直接向多孔板(例如6孔板)的Corning? Transwell?插入物上生物打印平滑肌構建體。該過程包括以下四個階段:
[0196]HDFa? s 向TTranswellt?膜上的培養(yǎng)
[0197]以20000個細胞/cm2的密度，將人成體皮膚成纖維細胞(HDFa)接種到Transwell?,膜上,并培養(yǎng)至少6天。這使細胞附著、生長并變成在TransweU?膜上鋪滿的層。
[0198]HASMC圓梓體的制各
[0199]對人主動脈平滑肌細胞(HASMC)的培養(yǎng)物進行胰蛋白酶化，并在旋轉震蕩器上搖動60分鐘。在搖動之后，將細胞收集、離心并吸到266或500 μ m(ID)玻璃微毛細管中。隨后，將細胞擠出到培養(yǎng)基覆蓋的NovoGel?板中，并孵育至少6小時。
[0200]用HAEC層化的HASMC補片的牛物打印
[0201] 就在生物打印補片(例如，節(jié)段)之前，對人主動脈內皮細胞(HAEC)培養(yǎng)物進行胰蛋白酶化、計數(shù)，之后以IxlO6個細胞/10 μ L培養(yǎng)基的工作濃度重懸浮于HAEC培養(yǎng)基中。將HAEC懸浮液置于將要用于對生物打印的補片進行層化的生物打印機中。完全吸出具有生長在TranswelI?膜上的HDFa’s的多孔板中的培養(yǎng)基，并將該板轉移到生物打印機上。直接在該膜上的HDFa’s的上方，利用NovoGel?棒來生物打印箱盒，使得限定的空間為8mm長xl.25mm寬。在上述孵育期結束時將成熟的HASMC圓柱體重新抽吸到微毛細管中，并裝載到生物打印機上用于在該箱盒內打印。然后，通過生物打印機將懸浮液中的HAEC吸到干凈的微毛細管中，并分配到打印的HASMC圓柱體的上方4次，接近所打印的補片的四個角。每滴的體積為2.5 μ L。在繼續(xù)打印頂部NovoGel?棒層之前，將該構建體孵育15-30分鐘。最后，打印NovoGel?圓柱體的頂層，以創(chuàng)建網(wǎng)格/網(wǎng)孔型結構。隨后，用合適的細胞培養(yǎng)基覆蓋該生物打印的構建體并孵育。
[0202]生物打印的構建體的成熟
[0203]將生物打印的構建體孵育I至7天，以使該構建體成熟，并為HAEC提供充足的時間，以在HASMC補片的上方形成均勻的薄單層。
實施例10—生物打印包含HASMC和HAEC多型生物墨水的平滑肌構建體
[0204]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?底板(100mm培養(yǎng)皿尺寸)上、在NovoGel?包被的孔內或者直接向多孔板(例如6孔板)的
Corning" Transweir插入物上生物打印平滑肌構建體。該過程包括以下三個階段:
[0205]HASMC-HAEC多型牛物墨水的制各
[0206]對人主動脈平滑肌細胞(HASMC)和人主動脈內皮細胞(HAEC)的培養(yǎng)物進行胰蛋白酶化、計數(shù)，并以適當?shù)牧炕旌?，以產(chǎn)生包含85:15或70:30比例的HASMC =HAEC的圓柱體。將該多型細胞懸浮液在旋轉震蕩器上搖動60分鐘、收集并離心。將細胞吸入266或500 μ m(ID)玻璃微毛細管中，然后擠出到培養(yǎng)基覆蓋的NovoGel?板內，并孵育至少6小時。
[0207]補片/三維平滑肌片的生物打印
[0208]在向多孔板的孔中或NovoGel?底板(100mm培養(yǎng)皿尺寸)上的NovoGel?床上打印的情況下，生物打印第一層NovoGel?圓柱體。然后,在它的上方,利用NovoGel?棒來生物打印箱盒，使得內部空間為8_長X1.25_寬。在上述孵育期結束時將成熟的多型圓柱形生物墨水重新抽吸到微毛細管中，并裝載到生物打印機上用于在該箱盒內打印。最后，將第三層NovoGel?圓柱體打印在第二層的上方，其或者覆蓋細胞的全部長度或者在頂部創(chuàng)建網(wǎng)格/網(wǎng)孔型結構。在向該板的孔內部的Transwell?插入物上打印的情況下，除去前面描述的第一層NovoGel?棒。隨后，用合適的細胞培養(yǎng)基覆蓋該生物打印的構建體并孵育，在孵育期間，擠出的生物墨水的鄰接節(jié)段融合起來形成三維細胞補片。
[0209]生物打印的構建體的成熟
[0210]將包含HASMC-HAEC多型生物墨水的生物打印的構建體孵育I至7天，以使該構建體成熟，并向HAEC提供充足的時間以分選到該構建體的外圍，從而產(chǎn)生具有包含第二細胞類型(在本實施例中是內皮細胞)的層的平滑肌構建體。在一些實驗中，使該三維平滑肌補片經(jīng)受剪切力(即脈動流)，以幫助HAEC分選過程。
實施例11一生物打印包含HASMC、HAEC和HDFa多型圓柱形生物墨水的血管壁節(jié)段
[0211]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?底板(100mm培養(yǎng)皿尺寸)上、在NovoGel?包被的孔內或者直接向多孔板(例如6孔板)的
Coming? Transwe丨廣插入物上生物打印平滑肌構建體。該過程包括以下三個階段:
[0212]HASMC-HDFa-H AEC多型牛物墨水的制各
[0213]對HASMC、HAEC和HDFa的培養(yǎng)物進行胰蛋白酶化、計數(shù)，并以適當?shù)牧炕旌?，以產(chǎn)生包含70:15:15比例的HASMC =HDPa =HAEC的圓柱形生物墨水。將該多型細胞懸浮液在旋轉震蕩器上搖動60分鐘、收集并離心。將細胞吸入266或500 μ m(ID)的玻璃微毛細管中，然后擠出到培養(yǎng)基覆蓋的NovoGel?板內，并孵育至少6小時。
[0214]補片/三維細胞片的生物打印
[0215]在向多孔板的孔中或NovoGel?底板(100mm培養(yǎng)皿尺寸)上的NovoGel?床上生物打印的情況下，生物打印第一層NovoGel?圓柱體。然后，在它的上方，利用NovoGel?棒來生物打印箱盒，使得內部空間為8mm長xl.25mm寬。在上述孵育期結束時將成熟的多型圓柱形生物墨水重新抽吸到微毛細管中，并裝載到生物打印機上用于在該箱盒中打印。最后，將第三層NovoGel?圓柱體打印在第二層的上方，其或者覆蓋細胞的全部長度或者在頂部創(chuàng)建網(wǎng)格/網(wǎng)孔型結構。在向該板的孔內部的TrunswdM插入物上打印的情況下，除去前面描述的第一層NovoGel?棒。隨后，用合適的細胞培養(yǎng)基覆蓋該生物打印的構建體并孵育，在孵育期間，細胞圓柱體的鄰接節(jié)段融合起來形成三維細胞補片。
[0216]生物打印的構建體的成熟
[0217]將包含HASMC-HDFa-HAEC多型生物墨水的生物打印的構建體孵育I至7天，以使該構建體成熟，并向HAEC提供充足的時間來分選至該構建體的外圍，從而產(chǎn)生具有代表其它細胞類型(在本實施例中是內皮細胞和成纖維細胞)的層的平滑肌構建體。在一些實驗中，使該三維平滑肌構建體經(jīng)受剪切力(即脈動流)，以幫助HAEC分選過程。
實施例12—用于空間限制構建體同時允許與培養(yǎng)基直接接觸的水凝膠網(wǎng)格
[0218]利用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),穿過三維平滑肌構建體的頂面的一部分來分配圓柱形水凝膠元件。該網(wǎng)格向生物打印的組織提供空間限制，并允許該構建體與周圍培養(yǎng)基之間直接接觸。首先，分配水凝膠基底層。其次，分配限定出8mm長xl.25mm寬的空間的水凝膠窗口。第三，在該水凝膠窗口內生物打印平滑肌生物墨水，以形成三維細胞片。并且，第四，分配水凝膠網(wǎng)格結構。在各個試驗中，水凝膠元件的尺寸為直徑約100 μ m至Imm,并且兀件之間的間距為大約100 μ m至10mm。
[0219]在一些試驗中，將水凝膠元件沿著一個方向分配，以在平滑肌片的上方創(chuàng)建長的開放通道。在其它實驗中，將水凝膠元件在多個方向上分配，以在片的上方創(chuàng)建開放區(qū)域的網(wǎng)格狀圖案。水凝膠由NovoGel?組成。任選地將該網(wǎng)格結構延長通過該結構，并延長到支持表面上，以允許施加額外的材料，從而將該結構附著到打印表面上。所得網(wǎng)格用來空間限制該構建體，但允許一些細胞構建體與周圍的營養(yǎng)培養(yǎng)基直接接觸。
實施例13—不使用合成聚合物或外源性細胞外基質來生物打印可植入管、片和囊
[0220]人平滑肌細胞(SMC)從天然SMC組織來源培養(yǎng)而得，或從脂肪組織的基質血管組分(SVF) 生成，并且用于生成生物墨水。該生物墨水包含自組裝的細胞聚集體，直徑為180-500 μ m,為球形或圓柱形的形式。將該生物墨水裝載到NovoGen MMX生物打印機(Organovo, Inc., San Diego, CA)上，并用于逐層構建三維結構。在24-72小時內，生物打印的結構融合起來生成穩(wěn)定的包含SMC的管或厚片。在某些情況下，引入成纖維細胞、內皮細胞或上皮細胞與SMC混合，或作為生物打印的構建體的特定層或組分。在一些實驗中，在打印后施加內皮細胞或組織特異性上皮細胞的附加細胞層。在某些情況下，生物打印的構建體經(jīng)歷特定的生物力學或生物化學調節(jié)，以有助于構建體朝目標應用方向具體化(specification)。所得的構建體概括了人組織結構，并原位生成充足的細胞外基質，以致于它們能夠作為實體組織進行處理和操作。
實施例14 一利用連續(xù)沉積生物打印的肝組織和多層棋盤格狀幾何形狀
[0221]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),利用連續(xù)沉積機理來生物打印工程化的肝組織。該肝組織的三維結構是基于以平面幾何形狀重復的功能單元，在這種情況下是六邊形。該生物墨水由包封在擠出化合物(表面活性劑多元醇-PF-127)中的肝星形細胞和內皮細胞組成。
[0222]30% PF-127 的制各
[0223]利用PBS制備30%PF_127溶液(w/w)。利用保持在4°C下的磁力攪拌板，將PF-127粉末與冷卻的PBS混合。完全溶解發(fā)生在大約48小時內。
[0224]細朐制各和牛物打印
[0225]將由82%肝星形細胞(SC)和18%人主動脈內皮細胞(HAEC)和人成體皮膚成纖維細胞(HDFa)組成的細胞懸浮液分到15mL管中，以便獲得三個細胞濃度:50xl06個細胞/mL、100xl06個細胞/mL和200xl06個細胞/mL，接著進行離心。將每個細胞沉淀物重懸浮于30% PF-127中，并抽吸到生物打印機使用的3cc儲存器中。采用510 μ m分配末端，將包封的細胞生物打印到PDMS底板上成為單一六邊形(參見圖7A)或六邊形棋盤格狀結構(參見圖7B)。每個構建體接納大約200 μ L的培養(yǎng)基，并在室溫下孵育20分鐘，以評價構建體的完整性。
[0226]多層牛物打印
[0227]對于六邊形棋盤格狀實驗，生物打印高達(4個)連續(xù)層，結果形成具有更多細胞材料存在的更高結構。制作后，每個構建體最初接納大約200 μ L的完全培養(yǎng)基，以評價構建體的完整性。將構建體在室溫下孵育20分鐘，之后浸入到20mL的完全培養(yǎng)基中。
[0228]結果
[0229]在含有10%胎牛血清的生長培養(yǎng)基(它溶解PF127)中培養(yǎng)18小時后，在生物打印的幾何形狀內含有的細胞彼此凝聚，足以產(chǎn)生組織的完整的組織鄰接片，其保持了原始設計的幾何圖案(參見圖7D)。圖8中所示的是:在10%中性緩沖福爾馬林中固定后，棋盤格狀構建體的單個節(jié)段的H&E染色。發(fā)現(xiàn)細胞是活的、完整的，并且局限于它們原始打印的幾何形狀。
實施例15—多層生物打印的組織補片中的平面幾何形狀
[0230]如前所述使生物墨水形成圓柱形的、穩(wěn)定的細胞聚集體，通常直徑為250μπι或500 μ m。簡而言之，細胞在典型的實驗室條件下增殖，當細胞達到70% -80%匯合時，通過施加不含EDTA的0.1 %胰蛋白酶使它們從細胞培養(yǎng)表面脫離。胰蛋白酶化之后，細胞在含血清的培養(yǎng)基中洗滌一次、收集、計數(shù)并離心，以形成大細胞沉淀物。將細胞沉淀物或者抽吸到毛細管中生成均一的(即，單型的)生物墨水，或者重懸浮以創(chuàng)建使用者定義的細胞混合物(參見下面的表1)，產(chǎn)生異質的(即，多型的)復合生物墨水混合物。參見例如圖9。以這種方式創(chuàng)建的生物墨水圓柱體任選地直接用于生物打印管狀構建體。
[0231]表1
【權利要求】
1.一種包含一個或多個層的、活的三維工程化組織或器官，所述一個或多個層的特征在于以下的一項或多項:a)使用時基本無支架；和《生物打印的，所述一個或多個層適合于在充分成熟后植入脊椎動物受試者中；條件是所述工程化組織或器官的至少一個層包含肌細胞，并且所述工程化組織或器官不是血管。
2.如權利要求1所述的組織或器官，其中至少一個層包含多種細胞類型，所述細胞類型相對于彼此空間排列從而構建平面幾何形狀。
3.如權利要求2所述的組織或器官，其中至少一個層在制作時在其最小維度上為至少100 μ m 厚。
4.如權利要求1所述的組織或器官，其包含多個層，至少一個層在組成上或結構上與至少一個其它層不同，以構建層狀幾何形狀。
5.如權利要求4所述的組織或器官，其中至少一個層在制作時在其最小維度上為至少100 μ m 厚。
6.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述組織或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。
7.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述組織或器官在使用時基本不含任何預形成的支架。
8.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述組織或器官是生物打印的。
9.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述一個或多個層生成細胞外基質。
10.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述肌細胞是平滑肌細胞。
11.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述肌細胞是骨骼肌細胞。
12.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述肌細胞是心肌細胞。
13.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述肌細胞來源于能夠分化成肌細胞的干細胞或祖細胞。
14.如權利要求13所述的組織或器官，其中所述干細胞或祖細胞在制作之前、期間或之后分化成肌細胞。
15.如權利要求1所述的組織或器官，其進一步包含選自以下的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞、內胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞及其組合。
16.如權利要求1所述的組織或器官，其中除肌細胞以外的細胞被分配到所述一個或多個層的至少一個表面上。
17.如權利要求16所述的組織或器官，其中除肌細胞以外的細胞被生物打印到所述一個或多個層的至少一個表面上。
18.如權利要求16所述的組織或器官，其中所述除肌細胞以外的細胞基本在所述一個或多個層制作的同時、在所述一個或多個層制作之后、在所述一個或多個層成熟期間或在所述一個或多個層成熟之后被分配到所述一個或多個層上。
19.如權利要求16所述的組織或器官，其中除肌細胞以外的細胞作為約I至約20個細胞厚的細胞層被分配到所述一個或多個層上。
20.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述一個或多個層基本上是平面的。
21.如權利要求20所述的組織或器官，其中所述組織或器官是適用于創(chuàng)傷修復、組織置換或組織增大的含肌細胞的片或補片。
22.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述一個或多個層基本上是管狀的。
23.如權利要求22所述的組織或器官，其中所述組織或器官是輸尿管、泌尿導管、肝門十二指腸腸導管、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、尿道、腸、結腸、食道或其一部分。
24.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述一個或多個層基本上是囊。
25.如權利要求24所述的組織或器官，其中所述組織或器官是胃、膀胱、子宮或膽囊或其一部分。
26.如權利要求1所述的組織或器官，其中所述組織或器官選自:尿道、泌尿導管、肝門十二指腸腸導管、輸尿管、膀胱、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、食道、胃、膽囊、腸和結腸。
27.如權利要求1所述的組織或器官在脊椎動物中的植入。
28.如權利要求1所述的組織或器官為了研究用途在培養(yǎng)物中的維持。
29.一種用于制備包含含肌細胞層的可植入組織或器官的方法，該方法包括: a.將包含肌細胞的生物墨水生物打印成形式；和 b.將所述生物墨水融合成凝聚的細胞結構； 條件是所述組織或器官能植入到脊椎動物受試者中，并且不是血管。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述可植入的組織或器官在使用時基本不含任何預形成的支架。
31.如權利要求29所述的方法，其中所述肌細胞是平滑肌細胞。
32.如權利要求29所述的方法，其中所述肌細胞是骨骼肌細胞。
33.如權利要求29所述的方法，其中所述肌細胞是心肌細胞。
34.如權利要求29所述的方法，其中所述肌細胞分化自祖細胞。
35.如權利要求29所述的方法，其中所述肌細胞由組織樣品產(chǎn)生。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述組織樣品是脂肪抽吸物。
37.如權利要求29所述的方法，其中所述形式是囊或片。
38.如權利要求29所述的方法，其中所述形式是在生物打印時內徑為約0.15mm或更大的管，其中所述管不打算用作血管旁路移植物或動脈-靜脈分流物。
39.如權利要求29所述的方法，其中所述生物墨水進一步包含選自以下的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞、內胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞及其組合。
40.如權利要求29所述的方法，其進一步包括將權利要求39的細胞生物打印、噴涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、接種、注射或分層到權利要求29的生物打印的形式之中或之上的步驟。
41.如權利要求29所述的方法，其進一步包括將權利要求39的細胞生物打印、噴涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、注射、接種或分層到權利要求29的凝聚的細胞結構之中或之上。
42.一種包含一個或多個層的、活的三維工程化組織或器官，所述一個或多個層的特征在于以下的一項或多項:a)使用時基本無支架；和《生物打印的，所述一個或多個層成熟到針對脊椎動物受試者的植入就緒狀態(tài)；所述工程化組織或器官基本上由細胞材料組成；條件是所述工程化組織或器官的至少一個層包含肌細胞，并且所述工程化組織或器官不是血管。
43.如權利要求42所述的組織或器官，其中至少一個層包含多種細胞類型，所述細胞類型相對于彼此空間排列從而構建平面幾何形狀。
44.如權利要求43所述的組織或器官，其中至少一個層在制作時在其最小維度上為至少100 μ m厚。
45.如權利要求42所述的組織或器官，其包含多個層，至少一個層在組成上或結構上與至少一個其它層不同，以構建層狀的幾何形狀。
46.如權利要求45所 述的組織或器官，其中至少一個層在制作時在其最小維度上為至少100 μ m厚。
47.如權利要求42所述的組織或器官，其中所述組織或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。
48.如權利要求42所述的組織或器官，其中所述肌細胞是平滑肌細胞。
49.如權利要求42所述的組織或器官，其中所述肌細胞是骨骼肌細胞。
50.如權利要求42所述的組織或器官，其中所述肌細胞是心肌細胞。
51.如權利要求42所述的組織或器官，其進一步包含選自以下的細胞:內皮細胞、神經(jīng)細胞、周細胞、成纖維細胞、組織特異性上皮細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、骨來源的細胞、軟組織來源的細胞、間皮細胞、組織特異性基質細胞、干細胞、祖細胞、內胚層來源的細胞、外胚層來源的細胞、中胚層來源的細胞及其組合。
52.如權利要求51所述的組織或器官，其中細胞被分配到所述至少一個層的至少一個表面上。
53.如權利要求52所述的組織或器官，其中細胞被生物打印到所述至少一個層的至少一個表面上。
54.如權利要求42所述的組織或器官在脊椎動物中的植入。
55.如權利要求42所述的組織或器官為了研究用途在培養(yǎng)物中的維持。
【文檔編號】A61L27/54GK103930066SQ201280055554
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年9月12日 優(yōu)先權日:2011年9月12日
【發(fā)明者】基思·墨菲, 奇拉格·卡蒂瓦拉, 斯科特·多爾夫曼, 本杰明·謝佛德, 莎倫·普雷斯內爾 申請人:奧加諾沃公司