包含參見序列表的淀粉酶變體的清潔組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含α淀粉酶的變體的清潔組合物，和用包含此類組合物的含水的液體處理表面如織物的方法，尤其是在低的溫度下。
【專利說明】包含參見序列表的淀粉酶變體的清潔組合物
[0001]本專利申請包含計算機可讀形式的序列表。所述計算機可讀形式以引用方式并入本文。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及包含α -淀粉酶的變體的清潔組合物，所α _淀粉酶的變體相對于其親本淀粉酶具有改善的在冷水表面處理過程中的清潔性能。
【背景技術】
[0003]α -淀粉酶(α -1, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε.C.3.2.1.1)構成一組酶，它們催化淀粉與其他直鏈和支鏈1，4-葡糖苷低聚-和多糖的水解。
[0004]所使用的第一細菌α -淀粉酶之一是來自地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)的α-淀粉酶，也稱為特妙淀粉酶，其已經(jīng)被廣泛的表征并且已經(jīng)測定了這種酶的晶體結構。堿性淀粉酶如來源于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的α -淀粉酶在W095/26397中公開，它們構成一組在洗滌劑中使用的特殊α-淀粉酶。多種這些已知的細菌淀粉酶已經(jīng)經(jīng)修飾已改善它們在特定應用中的功能。
[0005]提高α -淀粉酶的熱穩(wěn)定性的方法已被很好地研究。Suzuki等人(1989)公開了嵌合的α -淀粉酶，在其中解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) α-淀粉酶的特定區(qū)域被地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis) α -淀粉酶的相應區(qū)域替換。構建上述嵌合的α-淀粉酶的目的是鑒定負責熱穩(wěn)定性的區(qū)域。此類區(qū)域被發(fā)現(xiàn)包括解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) α -淀粉酶的氨基酸殘基177-186和氨基酸殘基255-270。Igarashi等人(1998)顯示,通過從環(huán)(F178至Α184)刪除R179-G180 (AmyS計數(shù))兩個氨基酸殘基，能夠提高AmyS-型 淀粉酶的熱穩(wěn)定性。然而，Shiau等人(2003)顯示，就玉米淀粉在高溫度的水解而言，在相同的環(huán)中具有缺失的AmyS酶具有比親本酶更低的特異性活性，否定了 AmyS淀粉酶的主要優(yōu)勢之一。
[0006]出于環(huán)保原因，降低洗滌、盤碟洗滌和/或清潔過程中的溫度已經(jīng)越來越重要。然而，包括淀粉酶在內(nèi)的大多數(shù)酶具有高于低溫洗滌中通常使用的溫度的最佳溫度。α -淀粉酶是用于洗滌劑組合物中的關鍵酶，并且就含淀粉的污潰在衣物洗滌或盤碟洗滌過程中的去除而言，其使用已變得日益重要。因此，找到當溫度降低時保持了它們的洗滌性能、去污效果和/或活性的α-淀粉酶是重要的。然而，無論當前的洗滌劑酶組合物的效率如何，有許多污潰難以被徹底地除去。低(例如，冷水)洗滌溫度和更短的洗滌周期的使用的增加使這些問題更加復雜化。因此，希望擁有能夠在低溫下發(fā)揮作用并且同時保持或提高其他合乎期望的性能如特異性活性(淀粉分解活性)、穩(wěn)定性和/或洗滌性能的淀粉分解酶。
[0007]因此，提供包含能夠在低溫如5_35°C的溫度下的洗滌、盤碟洗滌和/或清潔過程中使用的α-淀粉酶變體的清潔組合物，是本發(fā)明的一個目的。提供與親本α-淀粉酶相比或與任何SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12的α -淀粉酶相比，具有改善的在低溫下的洗滌性能的α -淀粉酶變體，是本發(fā)明的另一個目的。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]在本發(fā)明的第一個方面，提供了清潔組合物，其包含:
[0009](a)親本α淀粉酶的變體，所述變體包含在對應于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置 G304、W140、W189、D134、Ε260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和 G477 的兩個或更多個(若干個)位置處的改變，其中每一改變獨立地是替換、缺失或插入，并且其中所述變體與任何SEQ ID N01、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12的成熟多肽具有至少80%、或至少87%，但小于100%的序列同一性，并且其中所述變體具有α淀粉酶活性；
[0010](b)和清潔助劑，優(yōu)選其量為0.01至99.9重量％。
[0011]本發(fā)明還提供了處理表面(優(yōu)選織物)的方法，所述方法包括(i)形成含水的洗滌液體，所述洗滌液體包含水和清潔組合物，所述清潔組合物包含:
[0012];并且
[0013](a)親本α淀粉酶的變體，所述變體包含在對應于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置 G304、W140、W189、D134、Ε260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和 G477 的兩個或更多個(若干個)位置處的改變，其中每一改變獨立地是替換、缺失或插入，并且其中所述變體與任何SEQ ID N01、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12的成熟多肽具有至少80%、或至少87%，但小于100%的序列同一性，并且其中所述變體具有α淀粉酶活性；以及
[0014](b)清潔助劑，優(yōu)選其量為0.01至99.9重量％ ；
[0015](ii)優(yōu)選在40°C或更低的溫度，或更優(yōu)選在30°C或更低的溫度，最優(yōu)選在20°C或更低的溫度，用所述含水的洗滌液體處理所述表面；和(iii)沖洗所述表面。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了清潔組合物，所述清潔組合物包含:親本α淀粉酶的變體，所述變體包含在對應于SEQ ID Ν0:1的成熟多肽的位置G304、W140、W189、D134、Ε260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和 G477 的兩個或更多個(若干個)位置處的改變，其中每一改變獨立地是替換、缺失或插入，并且其中所述變體與任何SEQ ID NOU2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的成熟多肽具有至少80%、或至少87%，但小于100%的序列同一性，并且其中所述變體具有α淀粉酶活性；和清潔助劑，優(yōu)選其量為0.01至99.9重量％。
[0017]本發(fā)明還提供了處理表面(優(yōu)選織物)的方法，所述方法包括:
[0018](i)形成包含水和此類清潔組合物的含水的洗滌液體，
[0019](ii)優(yōu)選在40°C或更低的溫度下，或更優(yōu)選在30°C或更低的溫度下，最優(yōu)選在20°C或更低的溫度下，用所述含水的洗滌液體處理所述表面；以及
[0020](iii)沖洗所述表面。
【具體實施方式】
[0021]本發(fā)明提供了清潔組合物，所述清潔組合物包含:
[0022](a)親本α淀粉酶的變體，所述變體包含在對應于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置 G304、W140、W189、D134、Ε260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和 G477 的兩個或更多個(若干個)位置處的改變，其中每一改變獨立地是替換、缺失或插入，并且其中所述變體與任何SEQ ID N01、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12的成熟多肽具有至少80%、或至少87%，但小于100%的序列同一性，并且其中所述變體具有α淀粉酶活性；并且[0023](b)清潔助劑，優(yōu)選其量為0.01至99.9重量％。
[0024]定義
[0025]α -淀粉酶活性:術語“ α -淀粉酶活性”是指α _1，4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶的活性，Ε.C.3.2.1.1，其構成一組酶，它們催化淀粉與其他直鏈和支鏈1，4-葡糖苷低聚糖和多糖的水解。
[0026]變體:術語“變體”是指在一個或多個(若干個)位置包含改變(即替換、插入、和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。替換是指占據(jù)一個位置的氨基酸被不同的氨基酸的替代；缺失是指占據(jù)一個位置的氨基酸的移除；而插入是指在鄰近占據(jù)一個位置的氨基酸處添加1-3個氨基酸。
[0027]突變體:術語“突變體”是指編碼變體的多核苷酸。
[0028]野生型酶:術語“野生型” α -淀粉酶是指由天然存在的微生物例如天然存在的細菌、酵母或絲狀真菌表達的α-淀粉酶。
[0029]親本或親本α-淀粉酶:術語“親本”或“親本α-淀粉酶”是指對其進行修改以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的α-淀粉酶。親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體。
[0030]分離的變體:術語“分離的變體”是指經(jīng)人工修改的變體。在一個方面，所述變體是至少1%純的，例如，至少5%純、至少10%純、至少20%純、至少40%純、至少60%純、至少80%純、和至少90%純的，如通過SDS-PAGE所測定的。
[0031]基本上純的變體:術語“基本上純的變體”是指按重量計包含至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至 多3%、至多2%、至多1%、和至多0.5%的其他多肽物質(zhì)的制劑，所述多肽物質(zhì)是與其天然地或重組地相關聯(lián)的。優(yōu)選地，所述變體按所述制劑中存在的總多肽物質(zhì)的重量計是至少92%純的，例如，至少94%純、至少95%純、至少96%純、至少97%純、至少98%純、至少99%、至少99.5%純、和100%純的。本發(fā)明的變體優(yōu)選地為基本上純的形式。這能夠通過例如為人們所熟知的重組方法或經(jīng)典的純化方法制備變體來實現(xiàn)。
[0032]成熟多肽:術語“成熟多肽”是指處于其在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等之后最終形式的多肽。
[0033]成熟多肽編碼序列:術語“成熟多肽編碼序列”是指編碼具有α -淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
[0034]序列同一性:兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性，這種相關性用參數(shù)“序列同一性”描述。
[0035]就本發(fā)明的目的而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)如 EMBOSS軟件包在 Needle 程序中執(zhí)行的(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite, Rice 等人，2000, Trends Genet.16276-277)來確定，優(yōu)選 3.0.0 或更新的版本。所用的任選參數(shù)是，為10的空位罰分，為0.5的空位延伸罰分，和EBL0SUM62(EMBOSS版的BL0SUM62)替換矩陣。使用標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并且如下計算:
[0036](相同殘基X100) / (序列長度-序列中的總空位數(shù))。
[0037]就本發(fā)明的目的而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包在Needle程序中執(zhí)行的(EMB0SS:歐洲分子生物學開放軟件包(The European Molecular Biology Open Software Suite), Rice 等人，2000,同上)Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970,同上)(優(yōu)選 3.0.0 或更新的版本)來確定。所用的任選參數(shù)是10的空位罰分，0.5的空位延伸罰分，和EDNAFULL (EMBOSS版的NCBI NUC4.4)替換矩陣。使用標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并且如下計算:
[0038](相同脫氧核糖核苷酸X100) / (序列長度-序列中的總空位數(shù))。
[0039]片段:術語“片段”是指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端刪除了一個或多個(若干個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α -淀粉酶活性。
[0040]亞序列:術語“亞序列”是指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端刪除了一個或多個(若干個)核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有α -淀粉酶活性的片段。
[0041]等位變體:術語“等位變體”指占據(jù)相同染色體座位的基因的任何兩個或更多個供選擇的替代形式。等位變體天然來源于突變，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛蔀槌聊蛔?不改變編碼的多肽)或者可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因等位變體編碼的多肽。
[0042]分離的多核苷酸:術語“分離的多核苷酸”是指經(jīng)人工修改的多核苷酸。在一個方面，分離的多核苷酸是至少1%純的，例如，至少5%純、至少10%純、至少20%純、至少40%純、至少60%純、至少80%純、至少90%純、和至少95%純的，如通過瓊脂糖電泳所測定的。多核苷酸可為基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成來源的、或它們的任何組合。
[0043]基本上純的多核苷酸:術語“基本上純的多核苷酸”指不含其他外來的或不期望的核苷酸并且其形式適用于遺傳工程的多肽制備體系的多核苷酸制劑。因此，基本上純的多核苷酸按重量計包含至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%、和至多0.5%的其他多核苷酸物質(zhì)，所述其他多核苷酸物質(zhì)是與該多核苷酸天然地或重組地相關聯(lián)的。然而基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選地，所述基本上純的多核苷酸按重量計是至少90%純的，例如，至少92%純、至少94%純、至少95%純、至少96%純、至少97%純、至少98%純、至少99%純、和99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選地為基本上純的形式。
[0044]編碼序列:術語“編碼序列”指多核苷酸，它直接確定其多肽產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框確定，它通常起始于ATG起始密碼子或供選擇的起始密碼子如GTG和TTG并終止于終止密碼子如TAA、TAG、和TGA。編碼序列可為DNA、cDNA、合成的、或重組的多核苷酸。
[0045]cDNA:術語“cDNA”是指能夠通過逆轉錄從自真核細胞獲得的成熟的、經(jīng)拼接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少可存在于相應的基因組DNA中的內(nèi)含子序列。最初的初始RNA轉錄物是mRNA的前體，其在作為成熟的經(jīng)拼接的mRNA出現(xiàn)之前，通過一系列步驟，包括拼接，被加工。
[0046]核酸構建體:術語“核酸構建體”是指單鏈或雙鏈的核酸分子，它是從天然存在的基因分離的，或者是以否則將不會天然地存在的方式經(jīng)過修改以包含核酸的片段的，或者它是合成的。當所述核酸構建體包含本發(fā)明的編碼序列的表達所需的控制序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”是同義的。
[0047]控制序列:術語“控制序列”是指編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸的表達所需的全部組件。每一控制序列可以是對編碼所述變體的多核苷酸而言天然的或外源的，或對彼此而言天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、和轉錄終止子。最低限度，控制序列包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入有助于控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)的連接的特異性限制性位點的目的，控制序列可具有接頭。
[0048]可操作地連接:術語“可操作地連接”是指一種構型，控制序列在其中被置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當位置上，使得所述控制序列指導編碼序列的表達。
[0049]表達:術語“表達”包括變體的產(chǎn)生所涉及的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。
[0050]表達載體:術語“表達載體”是指線性或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼變體多核苷酸，并且所述多核苷酸可操作地連接至提供其表達的附加的核苷酸。
[0051]宿主細胞:術語“宿主細胞”是指對用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構建體或表達載體進行的轉化、轉染、轉導等敏感的任何細胞類型。術語“宿主細胞”包括了由于在復制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不相同的親本細胞的任何子代。
[0052]淀粉去除過程:表述“淀粉去除過程”是關于淀粉在其中被去除(或轉化)的任何類型的過程，例如在淀粉在其中被從織物上去除的洗滌過程中，例如織物洗滌如衣物洗滌。淀粉去除過程也能夠是硬質(zhì)表面清潔如盤碟洗滌，或者其能夠是一般性的清潔過程如工業(yè)或公共設施清潔。該表述還包括其他淀粉去除過程或淀粉轉化、乙醇生產(chǎn)、淀粉液化、織物退漿、紙和紙漿生產(chǎn)、啤酒制造和一般性洗滌劑。
[0053]改善的性能:術語“ 改善的性能”是指與變體相關聯(lián)的與親本相比改善的特性。此類改善的性能包括但不限于熱活性、熱穩(wěn)定性、PH活性、pH穩(wěn)定性、底物/輔因子特異性、改善的表面特性、產(chǎn)物特異性、在預處理的生物質(zhì)的存在下提高的穩(wěn)定性或溶解度、在儲存條件下改善的穩(wěn)定性、和化學穩(wěn)定性。
[0054]洗滌性能:在本發(fā)明的上下文中，術語“洗滌性能”作為在例如衣物洗滌或硬質(zhì)表面清潔如盤碟洗滌期間，酶去除存在于待清潔的物體上的淀粉或包含淀粉的污潰的能力被使用。洗滌性能可通過計算在AMSA的描述中或下文的“方法”部分中的燒杯洗滌性能測試中所定義的所謂的強度值(Int)而被定量。
[0055]改善的洗滌性能:術語“改善的洗滌性能”在本文中被定義為變體酶表現(xiàn)出淀粉酶變體的洗滌性能相對于親本淀粉酶的洗滌性能、或相對于具有與所述變體相同的氨基酸序列但在所規(guī)定的位置中的一個或多個處不具有缺失的α-淀粉酶、或相對于具有SEQ IDΝ04中顯示的氨基酸序列的α -淀粉酶的活性的改變，例如，通過提高污潰的去除。術語“洗滌性能”包括一般性的清潔，例如，硬質(zhì)表面清潔如在盤碟洗滌中，以及在織物上的洗滌性能如衣物洗滌，以及工業(yè)和公共設施清潔。
[0056]低溫:“低溫”是5-35°C的溫度，優(yōu)選5_30°C，更優(yōu)選5-25°C，更優(yōu)選5_20°C，最優(yōu)選5-15°C，并且具體地為5-10°C。在一個優(yōu)選的實施例中，“低溫”是10-35°C的溫度，優(yōu)選10-30°C，更優(yōu)選10-25°C，最優(yōu)選10-20°C，并且具體地為10_15°C。
[0057]變體設計的規(guī)則
[0058]出于本發(fā)明的目的，SEQ ID NO:1中公開的成熟多肽被用于確定其他α -淀粉酶中的對應的氨基酸殘基。其他α -淀粉酶的氨基酸序列被與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6中公開的成熟多肽比對，并且基于上述比對，使用 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)如在 EMBOSS (EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等A, 2000, Trends Genet.16276-277)軟件包的Needle程序(優(yōu)選3.0.0或更新的版本)中執(zhí)行的，確定了相對于SEQ ID NO:1中公開的成熟多肽中任何氨基酸殘基的氨基酸位置編號。
[0059]其他α -淀粉酶中的對應的氨基酸殘基的鑒定能夠通過使用“ClustalW” (Larkin等人，2007，Bioinformatics23:2947-2948)對多個多肽序列的比對進行確認。
[0060]當其他的酶與SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ IDNO: 5、或SEQ ID NO: 6的成熟多肽不一致，使得常規(guī)的基于序列的比對未能檢測到它們的關聯(lián)時(Lindahl 和 Elofsson, 2000, J.Mol.Biol.295:613-615)，能夠使用其他兩兩序列比對算法。使用利用了多肽家族的概率表現(xiàn)(譜)來檢索數(shù)據(jù)庫的檢索程序能夠獲得基于序列的檢索中的更高靈敏度。例如，PS1-BLAST程序通過迭代的數(shù)據(jù)庫搜索過程來生成譜，并且能夠檢測遠緣同系物(Atschul 等人，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫中具有一個或多個代表，能夠實現(xiàn)甚至更高的敏感性。例如 GenTHREADER(Jones, 1999，J.Mol.Biol.287:797-815 ；McGuffin 和 Jones, 2003,Bioinformaticsl9:874-881)的程序利用多種來源的信息(PS1-BLAST、二級結構預測、結構比對譜和溶解能)作為預測查詢序列的結構性折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡的輸入。類似地，Gough等人，2000，J.Mol.Biol.313:903-919的方法能夠被用于將未知結構的序列與存在于SCOP數(shù)據(jù)庫中的超家族模型比對。這些比對可以繼而用于生成多肽的同源性模型，且可以使用多種為此目的開發(fā)的工具來評估這類模型的精確性。
[0061]對于已 知結構的蛋白質(zhì)，已經(jīng)有數(shù)種用于檢索和生成其結構性比對的工具和資源。例如，蛋白質(zhì)的SCOP超家族已經(jīng)過了結構性比對，并且可以獲取和下載那些比對?？梢允褂枚喾N算法來比對兩種或更多種的蛋白質(zhì)結構，例如距離比對矩陣(Holm 和 Sander, 1998, Proteins33:88-96)或組合延伸(Shindyalov 和 Bourne,1998, Protein Engineeringll: 739-747),并且還可以利用這些算法的執(zhí)行在結構數(shù)據(jù)庫中查詢所關注的結構，以發(fā)現(xiàn)可能的結構性同源物(例如，Holm和Park，2000，Bioinformaticsl6:566-567)。
[0062]在對本發(fā)明的α-淀粉酶的變體的描述中，使用下列命名法以便于參考。使用了公認的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。
[0063]皿。就氨基酸替換而言，使用以下命名:初始氨基酸，位置，替換氨基酸。因此，將在位置226上用丙氨酸替換蘇氨酸表示為“Thr226Ala”或“Τ226Α”。用加號(“ + ”)分隔多個突變，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和411處分別用精氨酸(R)替換甘氨酸(G)以及用苯丙氨酸(F)替換絲氨酸(S)。
[0064]去臉。就氨基酸缺失而言，使用以下命名:初始氨基酸，位置*。因此，將在位置195去除甘氨酸表示為“Glyl95*”或“G195*”。用加號(“ + ”)分隔多個去除，例如“Glyl95*+Ser411*，，或 “G195*+S411*，，。
[0065]通A。就氨基酸插入而言，使用以下命名:初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入氨基酸。相應地，在位置195上的甘氨酸之后插入賴氨酸被命名為“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多個氨基酸的插入被命名為[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2等等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸被表示為“Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA”。
[0066]在這類情況下，通過在插入氨基酸殘基之前的氨基酸殘基位置號上添加小寫字母，來對插入氨基酸殘基編號。如此，在上述例子中，序列將是:
[0067]
【權利要求】
1.一種清潔組合物,包含: (a)親本α淀粉酶的變體，優(yōu)選分離的變體，所述變體包含在對應于SEQID NO:1的成熟多肽的位置6304、胃140、胃189、01343260、？262、[84、胃347、胃439、胃469、6476、和 G477的兩個或更多個(若干個)位置處的改變，其中每一改變獨立地是替換、缺失或插入，并且其中所述變體與任何SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12的成熟多肽具有至少80%、或至少87%，但小于100%的序列同一性，并且其中所述變體具有α淀粉酶；以及 (b)清潔助劑，優(yōu)選其量為0.01至99.9重量％。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述改變是替換。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其中所述變體包含在選自G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和 G477 的三個位置處的替換。
4.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體包含在選自G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和 G477 的四個位置處的替換。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體包含在選自G304、W140、E260和G476的兩個、三個或四個位置處的替換。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體包含選自G304R、W140YF、W189EGT、D134E、E260GHIKNRTY、W284DFR、W439RG、G476EK、G477EKMR 的兩個或更多個(若干個)替換。
7.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體包含在選自G304R、W140YF、E260GHIKNRTY和G476EK的兩個、三個或四個位置處的替換。
8.根據(jù)權利要求7所述的組合物，其中所述變體在所述兩個、三個或四個位置處包含的替換選自 G304R、W140Y、E260G 和 G476K。
9.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體還包含選自N195F、V206Y、Y243F、G109A、G273DV、G337N、K72R、R181H、S303G 和 Y100I 的一個或多個替換。
10.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體中的改變的數(shù)量是2-20，例如，2-10 和 2-5，如 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個改變。
11.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，所述組合物與任何SEQID ΝΟ:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的成熟多肽具有至少85%、至少87%、至少90%、至少95%同一性、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，但小于100%的序列同一性，或其中所述親本α淀粉酶的變體包含選自(i)SEQ ID NO:1 ；(ii)SEQ ID NO: 2 ; (iii) SEQ ID NO:3 ；(iv)SEQ IDN0:4 ； (v) SEQ ID NO:5 ； (vi)SEQ ID NO:6 ； (vii)SEQ ID NO: 7 ； (viii)SEQ ID NO:8 ； (ix)SEQ ID NO:9 ；(x)SEQ ID NO: 10 ; (xi) SEQ ID NO: 11 ; (xii) SEQ ID NO: 12 的成熟多肽的氨基酸序列或由所述序列組成。
12.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體包含在對應于SEQIDNO:1的多肽的位置的選自下列的位置處的替換:
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
D134E+G476E, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E, W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G, W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D, Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E T51I+Y100I+G109A+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R，和 N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D。
13.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體由在對應于SEQ ID NO:1的多肽的位置的選自下列的位置處的替換組成:W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D, G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G, N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
D134E+G476E, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E, W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G, W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D, Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N, W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260GT51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K
W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R，和
N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D。
14.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體包含在對應于SEQIDNO:1的多肽的位置的選自下列的位置處的改變:
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
D183*+G184*+D134E+G476E,
D183*+G184*+ W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
D183*+G184*+W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
D183*+G184*+W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
D183*+G184*+Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
D183*+G184*+G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
D183*+G184*+T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G
D183*+G184*+T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
D183*+G184*+T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K D183料G184料W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R，和 D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D。
15.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體由在對應于SEQID NO:1的多肽的位置的選自下列的位置處的改變組成:
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,
D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,
D183*+G184*+D134E+G476E,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,
D183*+G184*+W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,
D183*+G184*+W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,
D183*+G184*+Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
D183*+G184*+G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G
D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
D183*+G184*+T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G
D183*+G184*+T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R
D183*+G184*+T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K
D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R,和 D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D。
16.還包含在對應于SEQID NO:1的位置G182*+D183*或D183*+G184*的位置處的缺失。
17.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述變體還包含在對應于SEQIDNO:1的位置N195F+V206Y+Y243F的位置處的替換。
18.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述清潔助劑包括選自下列的一種或多種:(i)香料微膠囊；(ii)織物調(diào)色劑；(iii)蛋白酶；(iv)兩親性清潔聚合物；(V)脂肪酶；或(vi)它們的混合物。
19.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物是液體衣物洗滌劑組合物或單位劑量洗滌劑組合物。
20.一種處理優(yōu)選為織物的表面的方法，包括: (i)形成 含水的洗滌液體，所述洗滌液體包含水和根據(jù)前述權利要求中任一項所述的組合物； (?)優(yōu)選在40 V或更低的溫度下，或更優(yōu)選在35°C或更低的溫度下，最優(yōu)選在30 V或更低的溫度下，用所述含水的洗滌液體處理所述表面；以及(iii)沖洗所述表面。
【文檔編號】C12N9/28GK103703126SQ201280031460
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年6月29日 優(yōu)先權日:2011年6月30日
【發(fā)明者】M·杰克遜, P·F·蘇特, L·S·比維克, S·卡斯嘉德, J·奧伯龍, S·E·拉爾森, A·斯文森, A·H·喬納森, M·肖特, C·安德森, L·布里, E·P·弗里斯, M·D·G·P·托斯卡諾, M·波爾瓦德, F·W·拉斯姆森, L·S·克里斯蒂安森 申請人:寶潔公司