用于測(cè)定線粒體功能的方法、組合物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本公開(kāi)內(nèi)容提供了涉及使用膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(CDC)來(lái)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)線粒體活性的方法、組合物、裝置和試劑盒。具體地，CDC(例如，產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO))用于透化質(zhì)膜，但不透化細(xì)胞內(nèi)的膜(例如，線粒體膜)。這種選擇性透化允許通過(guò)測(cè)定例如選擇性透化之細(xì)胞的外部線粒體底物和/或產(chǎn)物的攝入和/或釋放來(lái)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)線粒體活性。
【專利說(shuō)明】用于測(cè)定線粒體功能的方法、組合物和試劑盒
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)要求在2011年4月8日提交并且標(biāo)題為“Methods，Compositions and Kits for Assaying Mitochondrial Function”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61 / 473，730的優(yōu)先權(quán)，其為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及用于評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)功能以及細(xì)胞健康和活力的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]線粒體功能障礙(mitochondrial dysfunction)是許多腦肌病(encephalomyopathy)、糖尿病和癌癥的核心。構(gòu)成氧化磷酸化(OxPhos)機(jī)制的超過(guò)100種基因中的遺傳突變與人的線粒體腦肌病有關(guān)。由缺陷氧化磷酸化造成的疾病也稱為線粒體疾病或線粒體紊亂。它們通常是隨年齡逐漸發(fā)病的多系統(tǒng)致命疾病。還認(rèn)為受損的線粒體代謝在糖尿病和癌癥的病理生理學(xué)中起著關(guān)鍵作用。線粒體(mt)DNA的突變分析表明，線粒體功能障礙是普遍現(xiàn)象，其發(fā)生在幾乎所有類型的癌癥中。發(fā)現(xiàn)編碼對(duì)于氧化磷酸化必不可少之蛋白質(zhì)的mtDNA中的體細(xì)胞突變與幾乎所有類型的癌癥相關(guān)。但是，其功能相關(guān)性在大多數(shù)情況下還有待確定。
[0006]COSMIC(癌癥中體細(xì)胞突變目錄，Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer)數(shù)據(jù)庫(kù)揭示了與氧化磷酸化功能相關(guān)的核基因中的突變是常見(jiàn)的。已鑒定了與呼吸復(fù)合物I (NADH-泛醌氧化還原酶)結(jié)構(gòu)/功能相關(guān)的超過(guò)25種核基因中的體細(xì)胞突變。此外，細(xì)胞代謝由氧化代謝轉(zhuǎn)換為糖酵解(稱為代謝重編程(metabolic reprogramming))是癌癥表型的標(biāo)志之一。其原因可以是mtDNA、nDNA中的體細(xì)胞突變或者是由宿主和環(huán)境因素引起的氧化磷酸化負(fù)調(diào)節(jié)。線粒體功能障礙還涉及其他年齡相關(guān)疾病，例如帕金森病和阿爾茨海默病。因此，需要簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確的方法來(lái)評(píng)估病理生理學(xué)環(huán)境下的線粒體功能。這樣的方法可導(dǎo)致確定線粒體代謝與病理生理學(xué)之間的“因果”關(guān)系，以及治療性干預(yù)(therapeuticintervention)在恢復(fù)正常線粒體代謝中的療效。因此，用于準(zhǔn)確測(cè)量線粒體功能的方法不但對(duì)于檢測(cè)和理解這些疾病，而且對(duì)于評(píng)價(jià)影響氧化磷酸化之療法和其他治療是非常重要的。
[0007] 就細(xì)胞生物能學(xué)(cellular bioenergetic)而言,其可用于確定線粒體制造ATP的備用(空余(spare))能力(氧化磷酸化能力)及其與呼吸鏈最大氧消耗(呼吸能力)的關(guān)系，這確定了在急性/高ATP需求的條件下細(xì)胞的命運(yùn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的方面涉及可用于在細(xì)胞內(nèi)條件下準(zhǔn)確且可重現(xiàn)地測(cè)量線粒體功能的方法、組合物和裝置。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可用于在不從細(xì)胞中分離線粒體的情況下以不同條件準(zhǔn)確且可重現(xiàn)地測(cè)量線粒體功能的方法、組合物和裝置。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(cholesterol-dependent cytolysin,Q)C)(例如,產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(perfringolysin O, PFO))用于透化質(zhì)膜而不透化細(xì)胞內(nèi)的膜(如線粒體膜)。這種選擇性透化允許通過(guò)測(cè)定例如可在選擇性透化細(xì)胞的外部測(cè)量的線粒體底物和/或產(chǎn)物的攝入和/或釋放來(lái)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)線粒體活性。
[0009]與涉及將線粒體從細(xì)胞中移除的方法不同，用經(jīng)透化的細(xì)胞進(jìn)行分析提供線粒體生物或生理狀態(tài)的更準(zhǔn)確的評(píng)估，同時(shí)允許直接與包含和經(jīng)透化細(xì)胞中相同線粒體量的全細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。通常，用于分析細(xì)胞內(nèi)線粒體活性的方法包括使用損害細(xì)胞膜和線粒體膜之一或損害兩者的去污劑(detergent)或其他透化劑。去污劑通常例如使線粒體膜溶解，并且即使通過(guò)低于< 0.01%的小心滴定也難以建立維持線粒體功能的去污劑濃度。
[0010]基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，基于PF0)的方法提供了細(xì)胞膜的有效透化而不破壞線粒體膜。因此，用細(xì)胞溶素透化避免了線粒體分子向細(xì)胞內(nèi)和周圍細(xì)胞環(huán)境中的不期望的釋放。這也避免了胞漿分子進(jìn)入線粒體并干擾線粒體功能。而且，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素在創(chuàng)造適合于在細(xì)胞中測(cè)量線粒體活性的條件方面出乎意料地有效。在一些實(shí)施方案中，在多至50nM或在一些情況下更多(例如，0.1至20nM)的寬動(dòng)態(tài)范圍中的濃度下，基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，基于PF0)的方法提供了細(xì)胞膜的有效透化而不破壞線粒體膜。另外，由于細(xì)胞溶素是蛋白質(zhì)，所以通常可以不同稀釋度非常準(zhǔn)確地掌控它們。
[0011]因此，基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素的透化技術(shù)可用于評(píng)價(jià)一種或更多種線粒體活性而不破壞細(xì)胞環(huán)境，原因是當(dāng)線粒體膜暴露于如本文所述的膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，PF0)時(shí)，其大部分保持完整?？蓽y(cè)定底物攝入和/或產(chǎn)物釋放以評(píng)價(jià)一種或更多種線粒體特異性功能(例如，氧化磷酸化)。因此，基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，基于PF0)的測(cè)定結(jié)果可提供天然細(xì)胞環(huán)境下線粒體活性的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。在一些實(shí)施方案中，基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，基于PF0)的測(cè)定結(jié)果可提供從疑似患有線粒體疾病之對(duì)象得到的細(xì)胞中線粒體活性的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。
[0012]在一些實(shí)施方案中，基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，基于PF0)的細(xì)胞透化允許分析外源性試劑(例如，不滲透穿過(guò)質(zhì)膜的分子)對(duì)一種或更多種細(xì)胞內(nèi)功能的作用。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，PF0)有助于使用外源性試劑(例如，染料、熒光蛋白、標(biāo)志物或其他試劑)來(lái)探測(cè)一種或更多種細(xì)胞內(nèi)功能。例如，基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，PF0)可有助于使用外源性試劑例如離子敏感性染料(例如，鈣敏感染料、pH敏感染料等)或離子敏感性熒光蛋白來(lái)探測(cè)一種或更多種細(xì)胞內(nèi)功能。在一些實(shí)施方案中，可使用基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，PF0)以有助于用外源性核酸(例如，表達(dá)載體)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0013]在一些實(shí)施方案中，提供了基于用產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)選擇性透化質(zhì)膜的方法，所述PFO是來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的膽固醇依賴性成孔蛋白(pore forming protein)。在一些實(shí)施方案中，因?yàn)榕c細(xì)胞內(nèi)的膜相比質(zhì)膜中濃縮了相對(duì)大量的膽固醇，所以細(xì)胞內(nèi)膜仍在很大程度上不受CDC(例如，PF0)影響。在一些實(shí)施方案中，與常規(guī)的細(xì)胞透化技術(shù)(例如，采用洋地黃皂苷的那些技術(shù))相比，PFO透化細(xì)胞保持了線粒體完整性，并且在寬范圍的細(xì)胞類型和緩沖液條件中產(chǎn)生了可重現(xiàn)的結(jié)果。
[0014]在一些實(shí)施方案中，提供了利用基于PFO的細(xì)胞透化(例如，以微板形式)的方法，所述方法可用于測(cè)定`空余氧化磷酸化(OxPhos)能力和線粒體生物能學(xué)的其他特性。在一些實(shí)施方案中，所述方法允許在不從細(xì)胞中分離線粒體的情況下評(píng)估線粒體功能。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于測(cè)定α)空余氧化磷酸化能力和總氧化磷酸化能力，(ii)空余呼吸能力和總呼吸能力，(iii)電子傳遞/呼吸鏈(electron transport /respiratory chain, ETC / RC)能力的特異性缺陷，(iv)TCA循環(huán)功能和/或(V)線粒體代謝的細(xì)胞特異性特性。在一些實(shí)施方案中，基于PFO的測(cè)定可用于在單次測(cè)定中測(cè)量空余氧化磷酸化能力(SOC)和空余呼吸(ETC / RC)能力(SRC)。在一些實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)空余氧化磷酸化能力或總氧化磷酸化能力包括將充足量的ADP (例如,對(duì)于細(xì)胞為ImM,對(duì)于成肌細(xì)胞≥2mM)和Pi (例如，≥IOmM)與期望底物一起用于呼吸介質(zhì)中。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于測(cè)定空余氧化磷酸化能力和其他生物能學(xué)特性而不需要從細(xì)胞中分離線粒體。在一些實(shí)施方案中，方法可用于測(cè)定:(i)線粒體代謝的細(xì)胞特異性特性，(ii)藥物對(duì)ETC / RC功能和其他線粒體功能的直接和/或間接作用，(iii)缺陷型氧化磷酸化復(fù)合物，(iv)化合物的解偶聯(lián)活性和/或(V)可損害線粒體功能完整性的條件。
[0015]在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的方法可用于評(píng)估細(xì)胞系、原代細(xì)胞和組織中的線粒體功能和代謝。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于測(cè)定氧化磷酸化能力和呼吸鏈能力。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于測(cè)定單獨(dú)的呼吸氧化磷酸化復(fù)合物(1-V)的能力。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于評(píng)價(jià)線粒體通透性轉(zhuǎn)換。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于診斷受損的線粒體代謝(例如，由于基因突變或藥物毒性)。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于在維持線粒體功能的條件下評(píng)價(jià)細(xì)胞器(例如，線粒體、溶酶體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)功能。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于通過(guò)評(píng)估基于PFO的透化之后內(nèi)膜蛋白質(zhì)的蛋白酶敏感性來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)膜的蛋白質(zhì)拓?fù)鋵W(xué)。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于使用條件性孔形成(conditional pore-formation)來(lái)促進(jìn)大分子遞送至細(xì)胞內(nèi)。
[0016]在一些實(shí)施方案中，PFO透化細(xì)胞用于測(cè)定對(duì)于在單個(gè)添加時(shí)不同NADH底物(例如，丙酮酸/丙酮酸鹽、異檸檬酸/異檸檬酸鹽、α -酮戊二酸/ α -酮戊二酸鹽和谷氨酸/谷氨酸鹽)具有最大呼吸響應(yīng)的條件。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法可用于使用適用于臨床研究之小樣品來(lái)評(píng)估線粒體功能。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于在不破壞線粒體功能的條件下評(píng)估線粒體通透性轉(zhuǎn)換和其他細(xì)胞過(guò)程以及細(xì)胞器。
[0017]在一些實(shí)施方案中，提供了可以對(duì)線粒體功能測(cè)定使用低至0.1nM之濃度的PFO衍生物。在一些實(shí)施方案中，提供了可在DTT或其他還原劑不存在的情況下使用的PFO衍生物。在這樣的實(shí)施方案中，避免了由DTT或其他還原劑造成的O2消耗。在一些實(shí)施方案中，使用最小量的DTT(例如，≤IOOnM DTT)。在一些實(shí)施方案中，提供了適用于不同細(xì)胞(例如，β細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、原代成肌細(xì)胞/管、乳腺上皮細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞)和不同物種(例如，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和人)的細(xì)胞的基于PFO的測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，提供了 PFO的不同變體(參見(jiàn)，例如，表3和5)。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了這樣的方法，其包括使包含細(xì)胞的制備物與膽固醇依賴性細(xì)胞溶素相接觸，并且測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)功能。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)功能是細(xì)胞的代謝速率、細(xì)胞的呼吸速率、有氧呼吸與無(wú)氧呼吸之比、分子的消耗速率或分子的產(chǎn)生速率。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)功能指示細(xì)胞健康或細(xì)胞生存力。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)功能是線粒體功能。在一些實(shí)施方案中，所述方法用作凋亡(細(xì)胞死亡機(jī)制)測(cè)定。
[0019]應(yīng)理解，制備物通常包含多種細(xì)胞。這樣的制備物可包含任意類型的一種或更多種細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是原代細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞從個(gè)體獲得。細(xì)胞可以是任何的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以是任何的人細(xì)胞。細(xì)胞可選自:淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、髓樣細(xì)胞(myeloid cell)、粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多葉核嗜中性粒細(xì)胞(hypersegmented neutrophil)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞(reticulocyte)、血小板、肥大細(xì)胞、凝血細(xì)胞、巨核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、甲狀腺上皮細(xì)胞、濾泡旁細(xì)胞(parafollicular cell)、甲狀旁腺細(xì)胞、甲狀旁腺主細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、松果體細(xì)胞(pineal cell)、松果體細(xì)胞(pinealocyte)、膠質(zhì)細(xì)胞(glial cell)、成膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、大細(xì)胞神經(jīng)分泌細(xì)胞(magnocellular neurosecretory cell)、星狀細(xì)胞(stellatecell)、伯特歇爾細(xì)胞(boettcher cell);垂體細(xì)胞、促性腺細(xì)胞(gonadotrope)、促皮質(zhì)激素細(xì)胞(corticotrope)、促甲狀腺細(xì)胞(thyrotrope)、促生長(zhǎng)激素細(xì)胞(somatotrope)、催乳激素細(xì)胞(Iactotroph)、肺細(xì)胞、I型肺細(xì)胞、II型肺細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞(Clara cell)；杯狀細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、周皮細(xì)胞(pericyte)、胃細(xì)胞、胃主細(xì)胞、壁細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、帕內(nèi)特細(xì)胞(paneth cell)、G細(xì)胞、D細(xì)胞、ECL細(xì)胞、I細(xì)胞、K細(xì)胞、S細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腸嗜鉻細(xì)胞、APUD細(xì)胞、肝細(xì)胞(liver cell)、肝細(xì)胞(h印atocyte)、枯氏細(xì)胞(Kupffer cell)、骨細(xì)胞(bone cell)、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞(osteocyte)、破骨細(xì)胞、成牙質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、造釉細(xì)胞、軟骨細(xì)胞(cartilage cell)、成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞(chondrocyte)、皮膚細(xì)胞、毛發(fā)細(xì)胞、絲胞(trichocyte)、角質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、疲細(xì)胞、肌肉細(xì)胞(muscle cell)、肌細(xì)胞(myocyte)、成肌細(xì)胞、肌管、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腱細(xì)胞(tendon cell)、足細(xì)胞、球旁細(xì)胞(juxtaglomerular cell)、球內(nèi)系膜細(xì)胞(intraglomerular mesangial cell)、球外系膜細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、致密斑細(xì)胞(macula densa cell)、精細(xì)胞、塞爾托利細(xì)胞(sertoli cell)、萊氏細(xì)胞(leydig cell)、卵母細(xì)胞及其混合物。因此，細(xì)胞可以是間葉細(xì)胞、外胚層和內(nèi)胚層來(lái)源的細(xì)胞。細(xì)胞可選自臍帶血細(xì)胞、干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、祖細(xì)胞、誘導(dǎo)性祖細(xì)胞(inducedprogenitor cell)、自體細(xì)胞(autologous cell)、同種移植細(xì)胞、同種異體移植細(xì)胞、異種移植細(xì)胞和遺傳工程細(xì) 胞。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了這樣的方法，其包括使包含細(xì)胞的制備物與膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(CDC)相接觸以及測(cè)定制備物中分子的水平，其中所述分子的水平指示細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)功能。在一些實(shí)施方案中，分子的水平指示線粒體功能。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是選自表1的蛋白質(zhì)或者其變體或衍生物。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是具有對(duì)應(yīng)于表1所列GenBank登錄號(hào)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或者其變體或衍生物。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是表1所列膽固醇依賴性細(xì)胞溶素家族中成員的蛋白質(zhì)或者其變體或衍生物。
[0021]在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO) ”指產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)細(xì)菌的能夠在胞漿膜中形成孔的細(xì)胞溶素或該細(xì)胞溶素的變體、衍生物或重組形式。在一些實(shí)施方案中，PFO以膽固醇依賴方式在胞漿膜中形成孔。在一些實(shí)施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列或者其變體或衍生物。在一些實(shí)施方案中，PFO包含是如SEQ ID NO:1至12中任一所示氨基酸序列之片段的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述片段包含如SEQ ID NO:1至7中任一種所述并且不包含N端信號(hào)序列的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，N端信號(hào)序列是所示氨基酸序列的前10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 或 35 個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，PFO包含與如SEQ ID NO:1至12中任一所示序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或更高的序列同一性或序列同源性的氨基酸序列。序列同源性可使用NCBI (Bethesda,Maryland)開(kāi)發(fā)的多種公開(kāi)可得的軟件工具(例如，可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)得到)來(lái)計(jì)算。示例性工具包括可在blast, ncb1.nlm.nih.gov / Blast, cgi上在線得到的“protein blast”,其可以以其默認(rèn)設(shè)置使用。在一些實(shí)施方案中，PFO包含與如SEQ ID NO:1至12中任一所示序列相比在多至25個(gè)、多至20個(gè)、多至15個(gè)、多至10個(gè)、多至5個(gè)或多至2個(gè)位置處具有氨基酸替換的氨基酸序列。
[0022]在一些實(shí)施方案中，PFO包含具有一個(gè)或更多個(gè)保守氨基酸替換(例如與SEQ IDNO:1至12中任一個(gè)相比的一個(gè)或更多個(gè)保守氨基酸替換)的氨基酸序列。本文使用的“保守氨基酸替換”指不改變其中進(jìn)行氨基酸替換之蛋白質(zhì)的相對(duì)電荷或大小特征的氨基酸替換?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的用于改變多肽序列的方法來(lái)制備變體。氨基酸的保守替換包括對(duì)以下組中氨基酸進(jìn)行的替換:(a)M、1、L、V ； (b)F、Y、W ； (c)K、R、H ； (d)A、G ； (e)
S、T;(f)Q、N和(g)E、D。因此，保守氨基酸替換可提供蛋白質(zhì)的功能等價(jià)的變體或同源物。
[0023]在一些實(shí)施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸處由半胱氨酸替換為丙氨酸。在所述方法的一些實(shí)施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列 ，其具有氨基酸319位蘇氨酸至半胱氨酸的替換和/或氨基酸334位纈氨酸至半胱氨酸的替換。在這樣的實(shí)施方案中，利用PFO的方法還可包括將還原劑添加到制備物中。在某些實(shí)施方案中，還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇。
[0024]在一些實(shí)施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其具有氨基酸459位半胱氨酸至丙氨酸的替換以及一個(gè)或更多個(gè)其他氨基酸替換。在所述方法的一些實(shí)施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其具有氨基酸319位蘇氨酸至半胱氨酸的替換和/或氨基酸334位纈氨酸至半胱氨酸的替換以及一個(gè)或更多個(gè)其他氨基酸替換。
[0025]在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O (PFO)，其包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其在434位氨基酸處由天冬氨酸替換為絲氨酸。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)，其包含如SEQ ID N0:1或2所示的氨基酸序列，其在434位氨基酸處由天冬氨酸替換為絲氨酸以及具有一個(gè)或更多個(gè)其他氨基酸替換。
[0026]在涉及測(cè)定制備物中分子水平的方法的一些實(shí)施方案中，所述分子是02。在一些實(shí)施方案中，制備物中O2的水平指示細(xì)胞耗氧率。在一些實(shí)施方案中，所述耗氧率指示線粒體功能。在涉及測(cè)定制備物中分子水平的方法的一些實(shí)施方案中，所述分子是H+。在一些實(shí)施方案中，制備物中H+的水平指示細(xì)胞的H+產(chǎn)生速率。
[0027]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與細(xì)胞呼吸效應(yīng)物(cellular-respiration effector)相接觸。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞呼吸效應(yīng)物是核苷酸或質(zhì)子載體(protonphore)。在一些實(shí)施方案中，核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。在這樣的實(shí)施方案中，所述方法還可包括測(cè)量細(xì)胞的耗氧率，其中ADP刺激的耗氧率指示細(xì)胞中的氧化磷酸化。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)子載體是對(duì)三氟甲氧基苯腙氰化物(cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, FCCP)。在這樣的實(shí)施方案中，所述方法還可包括測(cè)量細(xì)胞的耗氧率，其中FCCP刺激的耗氧率指示細(xì)胞中電子傳遞和呼吸鏈功能。
[0028]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與谷氨酸/谷氨酸鹽、丙酮酸/丙酮酸鹽、蘋(píng)果酸/蘋(píng)果酸鹽、異檸檬酸/異檸檬酸鹽、α -酮戊二酸/ α -酮戊二酸鹽或其組合相接觸。在這樣的實(shí)施方案中，所述方法的結(jié)果可以指示細(xì)胞中復(fù)合物I(NADH-泛醌氧化還原酶)的酶活性。
[0029]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與琥珀酸/琥珀酸鹽相接觸。在這樣的實(shí)施方案中，所述方法的結(jié)果可以指示細(xì)胞中復(fù)合物II (琥珀酸/琥珀酸鹽-泛醌氧化還原酶)的酶活性。
[0030]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與甘油-3-磷酸相接觸。在這樣的實(shí)施方案中，所述方法的結(jié)果可以指示細(xì)胞中復(fù)合物III (泛醇-細(xì)胞色素C氧化還原酶)的酶活性。
[0031]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與N，N, N'，N'-四甲基對(duì)苯二胺(TMPD)和/或抗壞血酸/抗壞血酸鹽相接觸。在這樣的實(shí)施方案中，所述方法的結(jié)果可以指示細(xì)胞中復(fù)合物IV(細(xì)胞色素c氧化酶)的酶活性。
[0032]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與琥珀酸/琥珀酸鹽和ADP相接觸和/或使細(xì)胞與甘油-3-磷酸相接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與琥珀酸/琥珀酸鹽、甘油-3-磷酸和ADP相接觸。在這樣的實(shí)施方案中，所述方法的結(jié)果可以指示細(xì)胞中復(fù)合物V (ATP合酶)的酶活性。
[0033]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與呼吸鏈抑制劑、氧化磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(transport inhibitor)、離子載體(ionophore)或krebs循環(huán)(krebs cycle)抑制劑相接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與魚(yú)藤酮(rotenone)、丙二酸/丙二酸鹽、抗霉素A、KCN和寡霉素相接觸。
[0034]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使細(xì)胞與測(cè)試劑(test agent)相接觸并測(cè)定測(cè)試劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)功能(例如，線粒體功能)的作用。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試劑是候選藥物。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法提供了用于藥物篩選的測(cè)定。所述方法在一些實(shí)施方案中可用于篩選未知或已知化合物(例如，已知的生物活性化合物)的文庫(kù)，從而鑒定影響細(xì)胞內(nèi)功能(例如，解偶聯(lián)ATP合成與呼吸鏈功能)的化合物。在另一些實(shí)施方案中，所述方法可用于評(píng)價(jià)化合物的毒性。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于評(píng)價(jià)先導(dǎo)化合物。
[0035]在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括鑒定細(xì)胞中的一個(gè)或更多個(gè)基因突變。在一些實(shí)施方案中，所述方法的結(jié)果指示一個(gè)或更多個(gè)基因突變是否影響細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)功能(例如，線粒體功能)。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或更多個(gè)基因突變與線粒體疾病有關(guān)。
[0036]在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的方法，其包括使包含從對(duì)象獲得的細(xì)胞的制備物與膽固醇依賴性細(xì)胞溶素相接觸；以及測(cè)定制備物中分子的水平，其中分子的水平指示細(xì)胞中呼吸鏈缺陷存在或不存在。
[0037]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞從患有或疑似患有線粒體疾病的個(gè)體獲得。在一些實(shí)施方案中，所述方法的結(jié)果有助于診斷個(gè)體患有一種或更多種線粒體疾病。在一些實(shí)施方案中，線粒體疾病選自:肌陣攣癲癇伴破碎紅纖維(Myoclonic Epilepsy withRagged Red Fiber, MERRF);線粒體肌病、腦病、高乳酸血癥和卒中(Mitochondrial Myopathy, Encephalopathy, Lactacidosis, and Stroke, ME LAS);糖尿病和耳聾(Diabetesmellitus and deafness, DAD)組合，其在早年可由于線粒體疾??；母體遺傳糖尿病和耳聾(Maternally Inherited Diabetes and Deafness, MIDD)、萊伯遺傳性視神經(jīng)病(Leber ' s Hereditary Optic Neuropathy, LHON);慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹(chronicprogressive external ophthalmoplegia, CPEO);利氏病(Leigh Disease)；卡恩斯-賽爾綜合癥(Kearns-Sayre Syndrome, KSS);弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(Friedreich, sAtaxia, FRDA);輔酶QIO(Co-QIO)缺陷；神經(jīng)病、共濟(jì)失調(diào)、色素性視網(wǎng)膜炎及上瞼下垂(Neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis, NARP);肌神經(jīng)源性胃腸性腦病(Myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy,MNGIE);復(fù)合物 I 缺陷；復(fù)合物 II 缺陷；復(fù)合物III缺陷；復(fù)合物IV缺陷；復(fù)合物V缺陷；其他線粒體疾病和影響線粒體功能的其他肌病(myopathy)。在一些實(shí)施方案中，線粒體疾病從父母遺傳到孩子(即，遺傳病)。
[0038]在一些實(shí)施方案中，具有線粒體疾病的一種或更多種癥狀的個(gè)體可被懷疑患有線粒體疾病。線粒體疾病的癥狀包括肌無(wú)力或運(yùn)動(dòng)不耐(exercise intolerance)、心力衰竭或節(jié)律紊亂、癡呆、運(yùn)動(dòng)障礙、卒中樣發(fā)作、耳聾、失明、眼皮下垂、眼運(yùn)動(dòng)性受限、嘔吐和癲癇。在身體活動(dòng)期間，肌肉可變得容易疲勞或無(wú)力?？砂l(fā)生肌肉痙攣。惡心、頭痛和呼吸困難也與這些疾病有關(guān)。通常，線粒體疾病在年輕時(shí)發(fā)生或首次表現(xiàn)(例如，在兒童期時(shí)，20歲之前)。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于診斷或有助于診斷兒童個(gè)體中的線粒體疾病。但是，應(yīng)理解本文所公開(kāi)的診斷方法可用于任意年齡的個(gè)體。[0039]“對(duì)象”、“個(gè)體”或“患者”在本文中可互換使用，其是指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括但不限于鼠(murine)、猿(simian)、人、家畜(farm animal)、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(sport animal)和寵物。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象、個(gè)體或患者是兒童。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象、個(gè)體或患者是幼兒。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象、個(gè)體或患者是嬰兒。如本文所定義的，本文使用的術(shù)語(yǔ)“ JL童”意指超過(guò)3歲且在青春期之前的人。本文使用的術(shù)語(yǔ)“幼兒”意指年齡大于12個(gè)月至三歲的人。本文使用的術(shù)語(yǔ)“嬰兒”意指年齡不大于12個(gè)月的人。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象、個(gè)體或患者處于青春期或在青春期以后。
[0040]在一些實(shí)施方案中，提供了用外源性核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使細(xì)胞與本文公開(kāi)的膽固醇依賴性細(xì)胞溶素中的任意一種或更多種相接觸；以及使細(xì)胞與外源性核酸(例如，表達(dá)載體、克隆載體等)相接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于轉(zhuǎn)染難以用常規(guī)轉(zhuǎn)染試劑(例如，基于脂質(zhì)體的試劑)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于轉(zhuǎn)染在懸液中生長(zhǎng)的細(xì)胞，例如，造血細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于轉(zhuǎn)染干細(xì)胞或原代細(xì)胞。
[0041]在所述方法的一些實(shí)施方案中，制備物被包含在容器(例如，孔)中。在一些實(shí)施方案中，容器是多孔板中的孔。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法可以以多重形式(例如，高通量形式)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述方法使用多孔細(xì)胞外通量分析儀實(shí)施。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有膽固醇依賴性細(xì)胞溶素的容器和容納有用于評(píng)價(jià)細(xì)胞之細(xì)胞內(nèi)功能的試劑的容器。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)功能是線粒體功能。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有膽固醇依賴性細(xì)胞溶素的容器和容納有細(xì)胞呼吸效應(yīng)物的容器。[0043]在所述試劑盒的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞呼吸效應(yīng)物是核苷酸或質(zhì)子載體。在某些實(shí)施方案中，核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)子載體是對(duì)三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
[0044]在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有谷氨酸/谷氨酸鹽、丙酮酸/丙酮酸鹽、蘋(píng)果酸/蘋(píng)果酸鹽、異檸檬酸/異檸檬酸鹽、α-酮戊二酸/ α-酮戊二酸鹽或其組合的容器。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有琥珀酸/琥珀酸鹽的容器。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有甘油-3-磷酸的容器。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有Ν，Ν，Ν'，Ν'-四甲基對(duì)苯二胺(TMPD)的容器。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有抗壞血酸/抗壞血酸鹽的容器。
[0045]在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有呼吸鏈抑制劑、氧化磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、離子載體或krebs循環(huán)抑制劑的容器。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有魚(yú)藤酮、丙二酸/丙二酸鹽、抗霉素A、KCN或寡霉素的容器。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有測(cè)定緩沖液的容器。
[0046]在所述試劑盒的一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素選自表1或者其變體或衍生物。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)。在一些實(shí)施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列或者其變體或衍生物。在一些實(shí)施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸處由半胱氨酸替換為丙氨酸。在一些實(shí)施方案中，PFO包含如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，其具有氨基酸319位蘇氨酸至半胱氨酸的替換和/或氨基酸334位纈氨酸至半胱氨酸的替換。在一些實(shí)施方案中，提供了這樣的試劑盒，其包含容納有還原劑的容器。在一些實(shí)施方案中，還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇。
[0047]在所述試劑盒的一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)容器是可重復(fù)使用的容器。在所述試劑盒的一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)容器是單次使用的容器。在所述試劑盒的一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)容器是管或瓶。在所述試劑盒的一些實(shí)施方案中，管是按扣蓋(snap-top)管或螺旋蓋(screw-top)管。在所述試`劑盒的一些實(shí)施方案中，瓶是按扣蓋瓶或螺旋蓋瓶。在所述試劑盒的一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)容器是玻璃小瓶。在所述試劑盒的一些實(shí)施方案中，容器一起被容納在盒子或包裝中。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于使細(xì)胞透化的說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于在特定溫度(例如，小于(TC、室溫)下儲(chǔ)存至少一個(gè)容器的說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于使用試劑盒中提供之試劑實(shí)施本文所公開(kāi)的方法中之任一種的說(shuō)明書(shū)。
[0048]雖然在一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的試劑盒可用于研究目的，但是在另一些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的試劑盒可用于診斷目的。因此，在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含可用于診斷或有助于診斷個(gè)體患有線粒體疾病(例如，包括本文所公開(kāi)的線粒體疾病中的任一種)的方法的一種或更多種試劑或組分。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049]圖1提供了典型哺乳動(dòng)物細(xì)胞中葡萄糖代謝的非限制性概覽。示出了糖酵解、TCA循環(huán)與氧化磷酸化系統(tǒng)的關(guān)系。示出了產(chǎn)生并氧化NADH和FADH2的反應(yīng)。CC:細(xì)胞色素c ;Q:泛醌；C1-V:氧化磷酸化復(fù)合物I至V ;MAS:蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭；GPS:甘油-3-磷酸穿梭。期望細(xì)胞周邊環(huán)境中乳酸、O2和CO2水平的測(cè)量給出糖酵解、呼吸和TCA循環(huán)的速率。
[0050]圖2闡明了基于洋地黃皂苷(DIG)的細(xì)胞透化。使用XF分析儀在包含琥珀酸作為底物的不含Ca2+的緩沖液中測(cè)量INSlE的呼吸。測(cè)量基礎(chǔ)呼吸速率之后，用DIG(第一個(gè)箭頭)、然后用ADP透化細(xì)胞，添加或不添加細(xì)胞色素c (CC)(第二個(gè)箭頭)。對(duì)于組DIG、DIG+ADP和DIG+ADP+CC，第二次添加的分別是緩沖液、ADP和ADP+CC。
[0051]圖3闡明了與洋地黃皂苷性能相比的PFO性能。圖3A示出了原代胰島β細(xì)胞。圖3Β示出了中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞。如下進(jìn)行注射:“a”是在作為呼吸底物的琥珀酸存在下的具有nPF0(25nM)或洋地黃皂苷(DIG，圖3A中為0.010%，圖3B中為0.005% )的ImM八0卩+1(^]?細(xì)胞色素(3(〇7七C或CC) ;“b”是Iyg / ml寡霉素。OCR速率以絕對(duì)值(圖3A)示出或相對(duì)于第三速率歸一化(圖3B)。
[0052]圖4示出了基于PFO的測(cè)定不需要外源性細(xì)胞色素C。示出了由琥珀酸支持的ADP刺激的INSlE細(xì)胞呼吸。如下進(jìn)行注射:“a”是nPFO，“b”是具有或不具有細(xì)胞色素c的ADP。
[0053]圖5闡明了氧化磷酸化能力和呼吸(ETC/RC)能力。ADP和FCCP刺激的呼吸分別提供氧化磷酸化能力和呼吸能力。圖5A示出了中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞V79-G3中ADP和FCCP刺激的呼吸的相對(duì)水平。如下進(jìn)行注射:“a”是ImM ADP ;“b”是2 μ M FCCP。圖5B示出了與完整細(xì)胞中基礎(chǔ)呼吸的敏感性相比，經(jīng)透化的V79-G3細(xì)胞中ADP刺激的呼吸的寡霉素敏感性(偶聯(lián)測(cè)試)。如下進(jìn)行注射:“a”是ImM ADP或ADP+nPFO ;“b”是2 μ g / ml寡霉素。圖5C示出了 nPFO透化后的呼吸衰退，其是因?yàn)橛砂麧{稀釋造成的ADP限制。如下進(jìn)行注射:“a”是 5nM nPFO ;“b”是緩沖液(nPFO)或 ImM ADP (nPFO+ADP)或 ImM ADP+104M細(xì)胞色素 c (nPF0+ADP+CC)。
[0054]圖6示出了大鼠胰`島β細(xì)胞中ADP刺激的和FCCP刺激的呼吸的比較水平。圖6Α示出了大鼠胰島瘤INSlE細(xì)胞。如下進(jìn)行注射:“a”是nPFO+ADP ;“b”是FCCP。圖6B示出原代大鼠β /胰島細(xì)胞。如下進(jìn)行注射:“a”是nPF0;“b”是琥珀酸+ADP;“c”是FCCP。原代細(xì)胞中基礎(chǔ)呼吸的較低速率是因?yàn)樵谧⑸渲?箭頭“b”)進(jìn)行了預(yù)饑餓并且不存在任何外源性底物。
[0055]圖7示出了使用基于PFO之方法的用于復(fù)合物I缺陷的功能性測(cè)定。圖7A示出了對(duì)復(fù)合物I底物顯示出呼吸缺乏的復(fù)合物I突變體的結(jié)果。圖7B示出了對(duì)復(fù)合物I底物顯示出恢復(fù)呼吸的補(bǔ)充對(duì)照細(xì)胞。圖7C示出了來(lái)自B組的將箭頭“a”之前之基礎(chǔ)速率設(shè)定為“O”的數(shù)據(jù)。如下進(jìn)行注射:“a”是nPF0，“b”是琥珀酸(Suc)或谷氨酸+蘋(píng)果酸(Glu+Mal)。
[0056]圖8闡明了寡霉素處理后底物供應(yīng)至β細(xì)胞ETC/RC中的限制以及對(duì)Ca2+介導(dǎo)之線粒體通透性轉(zhuǎn)換的敏感性。用寡霉素(2yg / ml)處理所有的組，然后在>60分鐘之后，在存在或不存在nPFO的情況下用琥珀酸和/或FCCP處理。組如下。“寡霉素_緩沖液”指示僅用寡霉素處理；“寡霉素—SF”指示僅寡霉素+琥珀酸+FCCP ;“寡霉素_--”指示寡霉素+nPFO+FCCP處理，稍后添加琥珀酸；“寡霉素_PSF”指示寡霉素+nPFO+琥珀酸+FCCP ；“寡霉素_PSFCa”指示在添加nPFO+琥珀酸+FCCP之后添加寡霉素和1.3mM CaCl2。
[0057]圖9提供了 PFO純化方案的概覽。[0058]圖10提供了運(yùn)作模型的略圖，所述運(yùn)作模型示出β細(xì)胞呼吸在細(xì)胞完整時(shí)主要由氧化還原穿梭來(lái)支持。如果β細(xì)胞主要由氧化還原穿梭支持，則當(dāng)使其透化時(shí)，復(fù)合物I依賴性呼吸應(yīng)顯著降低。
[0059]圖11示出了 β細(xì)胞表現(xiàn)出低水平的復(fù)合物I依賴性呼吸。圖1lA是與對(duì)照(Con)相比，通過(guò)分別用增加濃度的魚(yú)藤酮(Rot)、噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)、抗霉素A (Ant A)測(cè)量呼吸抑制來(lái)確定復(fù)合物1、II & III依賴性呼吸。圖1lB示出了 INSlE細(xì)胞中魚(yú)藤酮、TTFA和抗霉素A的最大呼吸抑制百分比。
[0060]圖12示出了經(jīng)透化的β細(xì)胞不表現(xiàn)出復(fù)合物I依賴性呼吸:圖12Α示出來(lái)自原代β細(xì)胞的結(jié)果。圖12Β示出來(lái)自原代星形細(xì)胞的結(jié)果。圖12C示出來(lái)自CCL16肺成纖維細(xì)胞的結(jié)果。圖12D示出了在谷氨酸+蘋(píng)果酸和魚(yú)藤酮存在下分離的線粒體中的NAD(P)H水平。箭頭指示以下內(nèi)容:“a”指示細(xì)胞透化；“b”指示底物+ADP(對(duì)于圖12A、12B)或ADP(對(duì)于圖12C)。在圖12C中，在透化之前在呼吸緩沖液中添加所有底物。丙酮酸、谷氨酸、蘋(píng)果酸、異檸檬酸、α -酮戊二酸和魚(yú)藤酮分別用單字母符號(hào)P、G、Μ、1、K和R指示。
[0061]圖13示出了 β細(xì)胞的相對(duì)呼吸(ETC/RC)和氧化磷酸化(OxPhos)能力在細(xì)胞類型之間是相當(dāng)?shù)摹D13A示出了 INSlE細(xì)胞。圖13B示出了 V79中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞。圖13C示出了原代β細(xì)胞。箭頭指示以下內(nèi)容:“a”指示用ADP(對(duì)于圖13A、13B)或不用ADP (對(duì)于圖13C)進(jìn)行透化；“b”指示FCCP (對(duì)于圖13AU3B)或ADP (對(duì)于圖13C) ;“c”指示FCCP。用ADP和FCCP的最大呼吸刺激分別被當(dāng)作氧化磷酸化能力和呼吸能力的指標(biāo)。
[0062]圖14示出了當(dāng)抑制氧化磷酸化時(shí)β細(xì)胞呼吸逐漸衰退。測(cè)試了相對(duì)于呼吸鏈功能障礙的底物限制。圖14Α示出了葡萄糖(Glu)和丙酮酸(Pyr)刺激INSlE細(xì)胞中的呼吸，其在寡霉素存在下逐漸衰退。Lo & Hi指示2mM和16.7mM葡萄糖。圖14B示出了寡霉素存在下的呼吸衰退是因?yàn)榈孜锕?yīng)至呼吸鏈?zhǔn)芟?。字母P、S、F分別指示透化、琥珀酸和FCCP。
[0063]圖15示出了糖酵解、TCA循環(huán)與氧化磷酸化之間的內(nèi)在關(guān)系。重點(diǎn)是如所指示地產(chǎn)生電子供體(例如NADH和FADH2)以支持氧化磷酸化的反應(yīng)。虛線示出了產(chǎn)生NADH和FADH2的反應(yīng)，而實(shí)線示出了消耗它們的那些反應(yīng)。在兩端具有箭頭的線示出了可逆反應(yīng)。F-l, 6-BP:果糖-1，6- 二磷酸；G-3-P:甘油醛_3_磷酸；GPS:甘油-3-磷酸穿梭;MAS:蘋(píng)果酸天冬氨酸穿梭；C1-V:氧化磷酸化復(fù)合物Ι-ν ；p:質(zhì)子動(dòng)力；線粒體膜電位；pH:跨越線粒體內(nèi)膜的PH差；P1:無(wú)機(jī)磷酸-磷酸鹽:Q:泛醌。
[0064] 圖16示出了用洋地黃皂苷透化細(xì)胞測(cè)定線粒體功能的結(jié)果。β細(xì)胞如實(shí)施例8所述生長(zhǎng)。在2mM(圖16Α至16C)或15mM葡萄糖(圖16D至16F)存在下使用包含IOmM琥珀酸的不含Ca2+的LKB緩沖液。圖16A示出了對(duì)于最大呼吸的外源性Cyt C。β細(xì)胞首先用0.01%洋地黃皂苷(DIG)透化，然后單獨(dú)添加ImM ADP (ADP)或?qū)⑵渑c10 μ M CytC (ADP+CC) 一起添加(右邊箭頭)。對(duì)照組不接受ADP或Cyt C。圖16B示出了在圖16A中使用的測(cè)定條件下與ATP合成偶聯(lián)的呼吸。細(xì)胞首先在2 μ g / ml寡霉素存在(寡霉素-FCCP)或不存在(對(duì)照，寡霉素，F(xiàn)CCP)下用0.01 % DIG透化，然后進(jìn)行以下添加:“對(duì)照”，是ADP+CC ;“寡霉素”，是對(duì)照加寡霉素；“FCCP”，是對(duì)照加2 μ M FCCP 寡霉素-FCCP”，是寡霉素加2μΜ FCCP。圖16C示出了來(lái)自圖16B并且將基礎(chǔ)速率設(shè)定為100%用以比較ADP和FCCP刺激之呼吸速率的數(shù)據(jù)。圖16D至16F示出了來(lái)自原代大鼠星形細(xì)胞(圖16D)、倉(cāng)鼠B2-MWFE細(xì)胞(圖16E)和人H1080細(xì)胞(圖16F)的結(jié)果，所述細(xì)胞首先用指定濃度的洋地黃皂苷(DIG)透化，然后添加ImM ADP和10 μ M Cyt C (ADP+CC)。
[0065]圖17示出了用nPFO透化細(xì)胞測(cè)定線粒體功能的結(jié)果。如實(shí)施例8所述制備細(xì)胞，并在包含2mM葡萄糖(圖17A至17D)或15mM葡萄糖(圖17E至17F)的不含Ca2+的LKB緩沖液中進(jìn)行測(cè)定。相對(duì)于基礎(chǔ)呼吸速率(basal respiration rate,BRR)的ADP和FCCP刺激的呼吸分別指示空余氧化磷酸化能力(Spare OxPhos capacity, S0C)和空余呼吸能力(spare respiratory capacity, SRC)。圖 17A 不出了用 25nM nPFO 或 0.01 % 洋地黃阜苷(DIG)透化的原代胰島β細(xì)胞的呼吸響應(yīng)。在10 μ M Cyt C存在下在透化時(shí)添加琥珀酸和ADP(Succ+ADP)。添加I μ g / ml寡霉素(寡霉素)以測(cè)定偶聯(lián)效率。圖17B示出了使用INSlE細(xì)胞進(jìn)行nPFO滴定的結(jié)果。測(cè)定條件除不添加Cyt C之外與圖17A相同。添加ADP以及不同濃度的nPFO(OADP)和2μΜ FCCP(OFCCP)。圖17C示出了 INSlE細(xì)胞中與SRC相比的S0C。圖17D示出了 INSlE細(xì)胞中與SOC相比的nPFO濃度。圖17E示出了 V79-G3細(xì)胞中與SRC相比的S0C。圖17F示出了 V79-G3細(xì)胞中與SOC和SRC相比的nPFO濃度。
[0066]圖18A至18H示出了在nPFO透化細(xì)胞中線粒體完整性和呼吸偶聯(lián)的評(píng)估。在如實(shí)施例8所述使細(xì)胞生長(zhǎng)之后，在包含具有2mM葡萄糖(圖18A至18C)或15mM葡萄糖(圖18D至18H)的IOmM琥珀酸的不合Ca2+的LKB緩沖液中測(cè)量呼吸。β細(xì)胞首先用至少InM nPFO透化，然后在添加指定化合物之后測(cè)量呼吸速率的變化。圖18A示出了 nPFO透化INSlE細(xì)胞中的線粒體完整性(“ADP”指示單獨(dú)的ImM ADP ;“ADP+CC”指示ImM ADP+10 μ MCyt C)。圖18Β示出了 nPFO透化INSlE細(xì)胞中的呼吸偶聯(lián)(“ADP”指示單獨(dú)的ImM ADP ；“寡霉素”指示ImMADP和I μ g / ml寡霉素；“ADP+FCCP”指示ImM ADP+1 μ g / ml寡霉素+2 μ M FCCP)。圖18C示出了來(lái)自圖18B的用設(shè)定為100%的基礎(chǔ)速率歸一化以比較ADP和FCCP刺激的呼吸速率的數(shù)據(jù)。圖18D示出了 nPFO透化V79-G3細(xì)胞的完整性(“對(duì)照“指示僅緩沖液；“ADP” 指示 ImM ADP ;“ADP+CC” 指示 ImM ADP 和 10 μ M Cyt C)。圖 18Ε 示出了與寡霉素處理的完整(寡霉素)V79-G3細(xì)胞相比，nPFO透化(nPFO) V79-G3細(xì)胞中的呼吸衰退。圖18F示出了與經(jīng)透化的V79-G3細(xì)胞相比，完整V79-G3細(xì)胞中的寡霉素不敏感性呼吸(“寡霉素”指示ImM ADP后添加寡霉素；“nPF0+ADP_寡霉素”指示nPFO和ImM ADP后添加寡霉素)。圖18G和18H分別示出了 nPFO透化HEK293和SHSY-5Y細(xì)胞中的線粒體完整性(“ADP” 指示 ImM ADP ;“ADP+CC” 指示 ImM ADP+10 μ M Cyt C)。
[0067]圖19Α至19F示出了氧化磷酸化和ETC/RC的空余(備用)能力和總能力的估計(jì)。如實(shí)施例8所示使β細(xì)胞生長(zhǎng)，并且在包含15mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB (圖19A和圖19D至19F)或LPBT (圖19B和19C)緩沖液中測(cè)量測(cè)定。與ImM ADP 一起添加IOmM琥珀酸以測(cè)量空余氧化磷酸化能力(SOC)。在測(cè)量ADP刺激的呼吸之后，添加FCCP以測(cè)量空余ETC / RC能力(SRC)。在圖19A至19C中，與nPFO—起添加琥珀酸和ADP，而在圖19D至19F中，在用nPFO透化之后添加它們。圖19A示出了完整(SRCi)和透化(SRCp) HEK293細(xì)胞中的SOC和SRC。在“對(duì)照”中，向未透化細(xì)胞添加2 μ M FCCP ;在“1^?0”中，在測(cè)量經(jīng)琥珀酸+ADP刺激的呼吸之后向透化細(xì)胞中添加3μ M FCCP。圖19B示出了通過(guò)將SOC添加到基礎(chǔ)呼吸速率的寡霉素敏感性部分中來(lái)估計(jì)HEK293細(xì)胞中的總氧化磷酸化(TOC)能力。總呼吸能力通過(guò)nPFO透化細(xì)胞中的最大呼吸速率來(lái)估計(jì)(“PSA_F”指示nPFO+琥珀酸+ADP后添加FCCP) ;“0_PSAF”指示寡霉素后添加nPFO+琥珀酸+ADP+FCCP)。圖19C示出了通過(guò)監(jiān)測(cè)ADP刺激的呼吸中寡霉素敏感部分來(lái)測(cè)定HEK293細(xì)胞的偶聯(lián)效率(“PSA_0”指示nPFO+琥珀酸+ADP后添加寡霉素；“0_PSAF”指示寡霉素后添加nPFO+琥珀酸+ADP+FCCP)。圖19D至19F示出了用于在不同細(xì)胞中通過(guò)系列添加nPFO、ADP和FCCP確定TOC的策略，所述不同細(xì)胞例如HEK293 (圖19D)、SHSY_5Y(圖19E)和β細(xì)胞(圖19F)。
[0068]圖20Α至201示出了不同因素對(duì)氧化磷酸化能力的作用。實(shí)驗(yàn)條件如實(shí)施例8所述并參照?qǐng)D19。與nPF0(圖20A、20B、20C、20G、20H)同時(shí)或在其之后(圖20E、20F)添加呼吸底物(每個(gè)IOmM)和ADP(ImM)。圖20A描繪了在包含2mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB緩沖液中原代β細(xì)胞氧化磷酸化能力的底物依賴性改變(“succ”指示琥珀酸；“G+M”指示谷氨酸+蘋(píng)果酸；“G3-P”指示甘油-3-磷酸)。圖20B示出了在與圖20A相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中使用的測(cè)定條件下，β細(xì)胞中不含Ca2+對(duì)由琥珀酸支持的氧化磷酸化的作用(“對(duì)照”指示琥珀酸+ADP CaCl2”指示與琥珀酸+ADP —起添加700 μ M CaCl2)。圖20C示出了不同呼吸緩沖液對(duì)ΗΕΚ293細(xì)胞之氧化磷酸化能力的作用。在不同緩沖液(參見(jiàn)表6)中孵育細(xì)胞，然后測(cè)量ADP刺激的呼吸。添加2yg / ml寡霉素以測(cè)試偶聯(lián)效率。圖20D示出了不同緩沖液中的偶聯(lián)效率(CE)。對(duì)來(lái)自圖20C的數(shù)據(jù)繪圖。圖20E示出了磷酸鹽(KH2P04)對(duì)氧化磷酸化能力和呼吸能力的作用。對(duì)于LKB、HKB和MAS緩沖液參見(jiàn)表6。KH2PO4是用IOmM KH2PO4代替0.4mM KH2PO4的LKB。圖20F示出了來(lái)自圖20E的將基礎(chǔ)呼吸速率設(shè)定為100%之后重新繪圖的數(shù)據(jù)。圖20G示出了對(duì)于INSlE細(xì)胞的不同緩沖液中的空余氧化磷酸化能力，將LKB與LPBT進(jìn)行比較，將HKB與HPBT進(jìn)行比較。透化之前的基礎(chǔ)呼吸速率設(shè)定為100%。圖20H示出了在高Na+和高K+緩沖液中INSlE細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸速率和ADP刺激的呼吸速率的差異。示出了對(duì)于圖20G的LPBT和HPBT緩沖液中的實(shí)際呼吸速率。圖201示出了 INSlE細(xì)胞中不同緩沖液對(duì)復(fù)合物I和復(fù)合物II依賴性呼吸的作用。
[0069]圖21A至21F示出了關(guān)于線粒體功能障礙和線粒體代謝具體特征的數(shù)據(jù)。在圖21A至21C中，示出了依賴于由谷氨酸+蘋(píng)果酸(Glu+Mal)支持的呼吸的復(fù)合物I。在包含15mM葡萄糖的不含Ca2+ 的LKB緩沖液中進(jìn)行測(cè)定。用InM nPFO透化β細(xì)胞并使用指定底物測(cè)量ADP刺激的呼吸。在圖21Α中，示出了由Glu+Mal支持的呼吸的魚(yú)藤酮敏感性測(cè)試。使用2 μ M魚(yú)藤酮(Rot)抑制復(fù)合物I。在圖21Β中，示出了復(fù)合物I缺陷型CCL16-B2細(xì)胞中由Glu+Mal支持的呼吸的缺乏。圖21C示出了 B2-MWFE細(xì)胞(其是補(bǔ)充有野生型中國(guó)倉(cāng)鼠Ndufal cDNA的CCL16-B2細(xì)胞)中挽救的復(fù)合物I活性。圖21D提供了示出蘋(píng)果酸影響有效利用NADH生成底物的數(shù)據(jù)，所述底物例如丙酮酸(P)、異檸檬酸(I)、谷氨酸(G)和α-酮戊二酸(K) ( “PF”、“IF”、“GF”和“KF”分別指示與FCCP分開(kāi)添加P、1、G和K ;“PGMIKF”指示與FCCP —起添加P、1、G和K)。在所有組中最后添加蘋(píng)果酸(從左邊起第三個(gè)箭頭)，除了添加PGMIKF的組之外，該組接受蘋(píng)果酸和其他底物。圖2IE示出了原代β細(xì)胞中對(duì)于單個(gè)底物(P、G、M、1、K)的復(fù)合物I依賴性呼吸的缺乏(“PA”、“GA”、“MA”、“ΙΑ”和“KA”分別指示與ImM ADP分開(kāi)添加P、G、1、M和K)。琥珀酸支持的呼吸(SA)用作陽(yáng)性對(duì)照。SA組在第三次注射時(shí)接受2 μ M FCCP,而其他組接受IOmM琥珀酸。圖21F示出了與INSlE細(xì)胞相比的大鼠星形細(xì)胞中的復(fù)合物I依賴性呼吸。在2μ M魚(yú)藤酮存在(星形細(xì)胞_GM+R0T、INS1E_GM+R0T)和不存在(星形細(xì)胞_GM、INS1E_GM)下監(jiān)測(cè)星形細(xì)胞和ISlE細(xì)胞中的Glu+Mal支持的呼吸。
[0070]圖22A至22B示出了寡霉素處理對(duì)底物供應(yīng)至β細(xì)胞ETC/RC的作用。如實(shí)施例中所述使INSlE細(xì)胞生長(zhǎng)并饑餓。圖22k示出了在寡霉素存在下INSlE細(xì)胞中的進(jìn)行性呼吸衰退。在1.3mM CaCl2存在下將包含2mM葡萄糖的LKB緩沖液用于測(cè)定；不添加EGTA。在2mM葡萄糖中測(cè)量基礎(chǔ)呼吸速率之后，添加14.7mM葡萄糖或IOmM丙酮酸(左側(cè)箭頭)以測(cè)量呼吸刺激。隨后，在約90分鐘后，添加2ug / ml寡霉素(寡霉素)。對(duì)照組僅接受緩沖液。圖22B示出了寡霉素對(duì)INSlE細(xì)胞的ETC/RC功能的作用。具有16.7mM葡萄糖并且不添加EGTA的不含Ca2+的LKB緩沖液用于測(cè)定。在進(jìn)行測(cè)定之前，將β細(xì)胞在16.7mM葡萄糖中孵育約60分鐘。在指示時(shí)間點(diǎn)用2 μ g / ml寡霉素(寡霉素)處理所有的組,然后在土nPFO下接受IOmM琥珀酸和/或2 μ M FCCP。“對(duì)照”指示僅緩沖液；“SuCC+FCCP”指示僅琥珀酸+FCCP (無(wú) PFO) ;“nPF0+FCCP_Succ” 指示 nPFO+FCCP 之后添加琥珀酸；“nPF0+Succ+FCCP”指示一起添加nPFO+琥珀酸+FCCP。
[0071]圖23A至23B示出了使用完整細(xì)胞進(jìn)行FCCP滴定的結(jié)果。以指定細(xì)胞密度接種HEK293細(xì)胞，然后使用含有1.3M CaCl2和15mM葡萄糖而不添加EGTA的LKB緩沖液如實(shí)施例8所述地進(jìn)行呼吸測(cè)定。圖23A示出了得自于XF24分析儀的實(shí)際圖。使用部分A、B、C和D進(jìn)行I μ MFCCP的連續(xù)添加，分別導(dǎo)致1、2、3和4 μ M FCCP的累積濃度。圖23Β示出了基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率與細(xì)胞密度的線性關(guān)系。使用來(lái)自圖23Α中速率3 (無(wú)FCCP)和6(含有2μΜ FCCP)的數(shù)據(jù)。
[0072]圖24A至24B示出了與洋地黃皂苷相比的某些細(xì)胞透化劑的相對(duì)性能。如實(shí)施例8所述使INSlE細(xì)胞生長(zhǎng)并進(jìn)行測(cè)定。用指定試劑透化β細(xì)胞并在琥珀酸(IOmM)、ADP(lmM)和Cyt C(IOyM)存在下監(jiān)測(cè)呼吸。圖23A示出了與皂苷(5至25 μ g / ml SAP)透化細(xì)胞相比的洋地黃皂苷(0.01% DIG)的相對(duì)線粒體功能。圖23B示出了與丙甲甘肽(3至30 μ g / ml ALA)透化細(xì)胞相比的洋地黃皂苷(0.01% DIG)的相對(duì)線粒體功能。
[0073]圖25A至25F示出了不同PFO變體的相對(duì)性能和DTT對(duì)呼吸的作用。在不含Ca2+的LKB (圖25A)和HKB (圖25B)緩沖液中測(cè)定nPFO透化HEK293細(xì)胞和rPFO透化HEK293細(xì)胞中的呼吸速率。圖25C中示出了在將基礎(chǔ)呼吸速率設(shè)定為100%之后來(lái)自圖25A和25B組的rPFO數(shù)據(jù)。圖25D示出了使用INSlE細(xì)胞的nPFO與dbPFO的比較。在含有2mM葡萄糖的不含Ca2+的LKB中進(jìn)行測(cè)定并用`InM nPFO或InM dbPFO+ImM DTT透化細(xì)胞。圖25E示出了 ImM DTT對(duì)透化INSlE細(xì)胞之呼吸的作用。圖25F示出了 ImM DTT對(duì)完整INSlE細(xì)胞之呼吸的作用。
[0074]圖26A示出了 rPFO透化INSlE細(xì)胞。在V7培養(yǎng)板中的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)在顯微鏡下觀察用InM rPFO透化的細(xì)胞。碘化丙啶(PI)染色用于確認(rèn)完全透化(下圖)，其由細(xì)胞質(zhì)腫脹(上圖)可明顯看出。圖26B示出了 B2-MWFE細(xì)胞的經(jīng)dbPFO介導(dǎo)的透化。使用IOOnMDTT在InM dbPFO處理的細(xì)胞中誘導(dǎo)孔的形成。
[0075]圖27示出了不含半胱氨酸的PFO衍生物對(duì)于膜結(jié)合的膽固醇依賴性。使用如實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所述的固有Trp熒光來(lái)測(cè)定結(jié)合的PFO衍生物(0.1 μ M終濃度)與具有變化的膽固醇含量以及比例恒定為1:1:1的P0PC、P0PE和SM的脂質(zhì)體(0.2mM總脂質(zhì)終濃度)的分?jǐn)?shù)。示出了對(duì)于多種衍生物的膽固醇依賴結(jié)合等溫線:nPF0(PF0)(方形)、rPF0(圓形)、rPF0D434s(向上三角形)和dbPF0D434s_G459A(向下三角形)。數(shù)據(jù)點(diǎn)是至少兩次測(cè)量的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0076]圖28示出了不含半胱氨酸的PFO衍生物在線粒體功能測(cè)定中的相對(duì)性能。使用兩種不同濃度(0.1nM、1.0nM)的nPFO、rPFO和rPF0D434s (參見(jiàn)表5)透化HEK293細(xì)胞。隨后一起添加琥珀酸(Succ:10mM)和FCCP(3mM)以測(cè)量最大呼吸活性。圖28A示出了 0.1nM下的相對(duì)性能。圖28B示出了 1.0nM下的相對(duì)性能。圖28C示出了在0.1和1.0nM兩種濃度下nPFO活性的比較。圖28D示出了在兩種濃度(0.1和1.0nM)下PFO變體之中活性的比較。在LPBT緩沖液中進(jìn)行測(cè)定(參見(jiàn)表6)。
[0077]圖29示出了洋地黃皂苷介導(dǎo)的細(xì)胞透化不得到穩(wěn)定呼吸。在不同濃度的洋地黃皂苷DIG)存在下透化細(xì)胞并使用琥珀酸作為底物監(jiān)測(cè)ADP刺激的呼吸。在LKB或LPBT緩沖液中進(jìn)行測(cè)定(參見(jiàn)表6)。圖29A和29B示出了 LKB緩沖液中洋地黃皂苷濃度與呼吸活性之間的反比關(guān)系。圖29A中，在透化之前琥珀酸存在于介質(zhì)中并且在圖29B中將其與ADP—起添加。比較兩組中的箭頭ADP和Succ+ADP。對(duì)饑餓的INSlE細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。圖29C和29D示出了用于非饑餓INSlE細(xì)胞的呼吸緩沖液的作用。在所測(cè)試的所有洋地黃皂苷濃度下，LKB緩沖液(圖29C)中的呼吸衰退比LPBT (圖29D)中的呼吸衰退快。圖29E和29F示出了通過(guò)洋地黃皂苷的細(xì)胞色素c丟失與呼吸衰退有關(guān)。即使在用于LKB & LPBT緩沖液二者的最高洋地黃皂苷濃度(0.01%)下，與琥珀酸+ADP—起添加外源性細(xì)胞色素c(CC)也抑制呼吸衰退。
[0078]圖30示出了與高K+ (HPBT)緩沖液相比低K+ (LPBT緩沖液)對(duì)INSlE細(xì)胞生物能學(xué)的作用。圖30A示出了添加寡霉素(寡霉素；Iyg / ml)之后的呼吸衰退和對(duì)解偶聯(lián)劑FCCP (2 μ Μ)的響應(yīng)。圖30Β示出了在速率4下將基線設(shè)定為100%而重新繪制的圖30Α的數(shù)據(jù)。在高K+緩沖液(HPBT)中描繪了更快速的衰退并且對(duì)FCCP無(wú)響應(yīng)。
[0079]圖31示出了魚(yú)藤酮對(duì)完整細(xì)胞中總細(xì)胞呼吸和對(duì)PFO透化細(xì)胞中復(fù)合物I活性的劑量依賴性作用。圖31Α和31D示出了 LKB (圖31Α)和LPBT (圖31D)緩沖液中經(jīng)魚(yú)藤酮處理之ΗΕΚ293人細(xì)胞的基線歸一化呼吸速率(“Rot”指示在箭頭處添加0、10、20、50 &1000mM魚(yú)藤酮；“P / GM /` A”指示 InM rPFO、谷氨酸 + 蘋(píng)果酸(每個(gè) IOmM)、ImM ADP & 3 μ MFCCP succ”指示IOmM琥珀酸)。圖3IB和31E示出了分別由圖3IA和3ID的數(shù)據(jù)繪制的呼吸速率和魚(yú)藤酮濃度(“基礎(chǔ)”指示完整細(xì)胞呼吸的衰退；“Glu+Mal”指示FCCP存在下的復(fù)合物I依賴性呼吸；“succ”指示FCCP存在下的復(fù)合物II依賴性呼吸)。圖31C示出了不同魚(yú)藤酮?jiǎng)┝肯聫?fù)合物I和II依賴性呼吸的抑制百分比(“LKB-CI，CII”指示LKB緩沖液中復(fù)合物I和II的功能；“LPBT-CI，II”指示LPBT緩沖液中復(fù)合物I和II的功能)。圖31F示出了在LKB緩沖液(虛線)和LPBT緩沖液(實(shí)線)中基礎(chǔ)復(fù)合物I抑制(完整細(xì)胞中)與最大復(fù)合物I抑制(透化細(xì)胞中)之間的關(guān)系。在最大魚(yú)藤酮?jiǎng)┝?I μ Μ)下，在基礎(chǔ)和最大之間以及在緩沖液之間沒(méi)有觀察到顯著差異(參見(jiàn)圖31Β和31Ε)。
[0080]圖32示出了 NdufalS55A來(lái)源的MEF中降低的呼吸活性。圖32A至32B示出了WT和S55A MEF的基礎(chǔ)呼吸速率與最大呼吸速率之間的差異。通過(guò)使用增加劑量的FCCP (2至4μΜ)測(cè)定了最大呼吸。圖32C至32D示出了通過(guò)重組產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(rPFO)透化的細(xì)胞中的呼吸活性。通過(guò)在ADP+FCCP存在下使用特定底物測(cè)量復(fù)合物I和II的活性(“Glu+Mal”指示谷氨酸+蘋(píng)果酸并且“succ”指示琥珀酸)。在V7板中使100，000個(gè)細(xì)胞/孔旋轉(zhuǎn)減慢(spin down)并在培養(yǎng)4小時(shí)后進(jìn)行測(cè)量。
[0081]發(fā)明的某些實(shí)施方案的詳述
[0082]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方面涉及用于線粒體功能的簡(jiǎn)單且可重現(xiàn)的測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，可以以試劑盒提供一種或更多種測(cè)定組分。本發(fā)明的方面涉及這樣的出乎意料的發(fā)現(xiàn):基于細(xì)胞溶素(例如，基于產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO))的細(xì)胞透化消除了對(duì)分離線粒體的需要，并且維持了線粒體周圍的細(xì)胞微環(huán)境。這允許在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行功能測(cè)定。
[0083]根據(jù)一些方面，本發(fā)明涉及膽固醇依賴性細(xì)胞溶素。本文使用的“膽固醇依賴性細(xì)胞溶素”是以膽固醇敏感方式在基于脂質(zhì)的膜中形成孔的蛋白質(zhì)的家族成員。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是由革蘭氏陽(yáng)性菌分泌的成孔毒素(pore-formingtoxin)。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素具有特征性的β桶形結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是在靶細(xì)胞膜表面上寡聚化的單體蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素在靶細(xì)胞膜表面處形成環(huán)形孔前(pre-pore)復(fù)合物，并且將大的β桶插入膜中。在一些實(shí)施方案中，孔形成需要靶膜中存在膽固醇。在一些實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素選擇性透化胞漿膜而不損害線粒體膜。表1中提供了膽固醇依賴性細(xì)胞溶素的非限制性實(shí)例。其他實(shí)例對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。在一些具體實(shí)施方案中，膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)。
[0084]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，通過(guò)膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，PF0)選擇性透化細(xì)胞膜而不損害線粒體膜，這可用于測(cè)量線粒體代謝物的測(cè)定。許多線粒體代謝物容易穿過(guò)線粒體膜進(jìn)入胞漿和從胞漿穿過(guò)線粒體膜。但是，這些代謝物不容易穿過(guò)細(xì)胞膜。這使得在不破壞細(xì)胞的情況下和在破壞線粒體天然生理環(huán)境的過(guò)程中難以測(cè)定這些代謝物。出乎意料地，已發(fā)現(xiàn)膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，PF0)透化細(xì)胞膜足以使得線粒體代謝物能夠進(jìn)入和離開(kāi)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，這允許通過(guò)測(cè)量一種或更多種線粒體代謝物的細(xì)胞外水平來(lái)評(píng)價(jià)線粒體活性。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，由于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，PF0)使得 細(xì)胞膜對(duì)于線粒體代謝物能夠透化并且不破壞線粒體膜，所以其選擇性是有用的。在一些實(shí)施方案中，這允許在其自然細(xì)胞環(huán)境中評(píng)價(jià)線粒體的活性。
[0085]根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了基于PFO的細(xì)胞透化方法用于線粒體功能測(cè)定。所述方法通常可用于不同的細(xì)胞類型(例如，建立的細(xì)胞系和原代細(xì)胞)。本文中還提供了提供用于所述方法之試劑的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，這些試劑盒可用于測(cè)定復(fù)合物1、
I1、II1、IV和/或V、氧化磷酸化(OxPhos)能力和/或呼吸(ETC / RC)能力。因此，在一些實(shí)施方案中，提供了用于線粒體功能的簡(jiǎn)單且可重現(xiàn)的測(cè)定。在一些方面中，所述測(cè)定和試劑盒提供了用于線粒體功能障礙的診斷工具。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方面可用于理解線粒體代謝在病理生理學(xué)中的作用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方面提供了用于線粒體疾病的診斷工具。
[0086]在一些實(shí)施方案中，基于膽固醇依賴性細(xì)胞溶素(例如，基于PF0)的細(xì)胞透化消除了對(duì)分離線粒體的需要，并且維持了線粒體周圍的細(xì)胞微環(huán)境。這允許在接近生理?xiàng)l件下使用測(cè)定技術(shù)(例如使用基于微板的呼吸計(jì)量法)進(jìn)行線粒體功能測(cè)定，所述測(cè)定技術(shù)包括測(cè)量細(xì)胞代謝物(例如，線粒體代謝物)的攝入、釋放、消耗和/或產(chǎn)生。這還允許檢查不透膜試劑(membrane impermeable agent)對(duì)線粒體功能的作用。
[0087]表1:膽固醇依賴性細(xì)胞溶素的非限制性實(shí)例
[0088]
【權(quán)利要求】
1.方法，其包括: (a)使包含細(xì)胞的制備物與膽固醇依賴性細(xì)胞溶素相接觸；以及 (b)測(cè)定所述制備物中分子的水平，其中所述分子的水平指示所述細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子的水平指示線粒體功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述膽固醇依賴性細(xì)胞溶素包含選自表1的氨基酸序列。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O (PFO)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸處由半胱氨酸替換為丙氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其319位氨基酸處由蘇氨酸替換為半胱氨酸，并且334位氨基酸處由纈氨酸替換為半胱氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述氨基酸序列還在434位氨基酸處包含天冬氨酸至絲氨酸的替 換。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其還包括向所述制備物中添加還原劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子是02。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述制備物中O2的水平指示所述細(xì)胞的耗氧率。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述耗氧率指示線粒體功能。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子是H+。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述制備物中H+的水平指示所述細(xì)胞的H+產(chǎn)生速率。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與細(xì)胞呼吸效應(yīng)物相接觸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞呼吸效應(yīng)物是核苷酸或質(zhì)子載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其還包括測(cè)量所述細(xì)胞的耗氧率，其中ADP刺激的耗氧率指示所述細(xì)胞中的氧化磷酸化。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述質(zhì)子載體是對(duì)三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其還包括測(cè)量所述細(xì)胞的耗氧率，其中FCCP刺激的耗氧率指示所述細(xì)胞中的電子傳遞和呼吸鏈功能。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與谷氨酸/谷氨酸鹽、丙酮酸/丙酮酸鹽、蘋(píng)果酸/蘋(píng)果酸鹽、異檸檬酸/異檸檬酸鹽、α -酮戊二酸/ α -酮戊二酸鹽或其組合相接觸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述方法的結(jié)果指示所述細(xì)胞中復(fù)合物I (NADH-泛醌氧化還原酶)的酶活性。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與琥珀酸/琥珀酸鹽相接觸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述方法的結(jié)果指示所述細(xì)胞中復(fù)合物II(琥珀酸-泛醌氧化還原酶)的酶活性。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與甘油-3-磷酸相接觸。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述方法的結(jié)果指示所述細(xì)胞中復(fù)合物III(泛醇-細(xì)胞色素c氧化還原酶)的酶活性。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與N，N，N'，N'-四甲基對(duì)苯二胺(TMPD)和/或抗壞血酸/抗壞血酸鹽相接觸。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述方法的結(jié)果還指示所述細(xì)胞中復(fù)合物IV(細(xì)胞色素c氧化酶)的酶活性。
30.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與琥珀酸/琥珀酸鹽和ADP相接觸。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與甘油-3-磷酸相接觸。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，其中所述方法的結(jié)果還指示所述細(xì)胞中復(fù)合物V (ATP合酶)的酶活性。`
33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與呼吸鏈抑制劑、氧化磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、離子載體或krebs循環(huán)抑制劑相接觸。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述抑制劑是魚(yú)藤酮、丙二酸/丙二酸鹽、抗霉素A、KCN和寡霉素。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與測(cè)試劑相接觸以及測(cè)定所述測(cè)試劑對(duì)所述細(xì)胞內(nèi)功能的作用。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述測(cè)試劑是候選藥物。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括鑒定所述細(xì)胞中的一個(gè)或更多個(gè)基因突變，其中所述方法的結(jié)果指示所述一個(gè)或更多個(gè)基因突變是否影響所述細(xì)胞的所述細(xì)胞內(nèi)功能。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞從患有或疑似患有線粒體疾病的個(gè)體獲得。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述方法的結(jié)果有助于將所述個(gè)體診斷為患有所述線粒體疾病。
40.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述制備物被包含在孔中。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述孔位于多孔板中。
42.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
43.方法，其包括: (a)使包含細(xì)胞的制備物與膽固醇依賴性細(xì)胞溶素相接觸；以及 (b)測(cè)量所述細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)功能。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)功能是所述細(xì)胞的代謝速率、所述細(xì)胞的呼吸速率、有氧呼吸與無(wú)氧呼吸的比例、分子的消耗速率或分子的產(chǎn)生速率。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)功能指示細(xì)胞健康或細(xì)胞生存力。
46.根據(jù)前述權(quán)利要求43至45中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)功能是線粒體功倉(cāng)泛。
47.根據(jù)前述權(quán)利要求43至46中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)。
48.根據(jù)前述權(quán)利要求43至47中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與細(xì)胞呼吸效應(yīng)物相接觸。
49.根據(jù)前述權(quán)利要求43至48中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括使所述細(xì)胞與測(cè)試劑相接觸以及測(cè)定所述測(cè)試劑對(duì)所述細(xì)胞內(nèi)功能的作用。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述測(cè)試劑是候選藥物。
51.根據(jù)前述權(quán)利要求43至50中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括鑒定所述細(xì)胞中的一個(gè)或更多個(gè)基因突變，其中所述方法的結(jié)果指示所述一個(gè)或更多個(gè)基因突變是否影響所述細(xì)胞的所述細(xì)胞內(nèi)功能。
52.根據(jù)前述權(quán)利要求43至51中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞得自于患有或疑似患有線粒體疾病的個(gè)體。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述方法的結(jié)果有助于將所述個(gè)體診斷為患有所述線粒體疾病。
54.根據(jù)前述權(quán)利要求43至53中任一項(xiàng)所述的方法，其中包含所述細(xì)胞的所述制備物處于多孔板的孔中。
55.試劑盒，其包含: 容納有膽固醇依賴性細(xì)胞溶素的容器；和 容納有用于評(píng)價(jià)細(xì)胞之細(xì)胞內(nèi)功能的試劑的容器。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的試劑盒，其中所述細(xì)胞內(nèi)功能是線粒體功能。
57.試劑盒，其包含: 容納有膽固醇依賴性細(xì)胞溶素的容器；和 容納有細(xì)胞呼吸效應(yīng)物的容器。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的試劑盒，其中所述細(xì)胞呼吸效應(yīng)物是核苷酸或質(zhì)子載體。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的試劑盒，其中所述核苷酸是二磷酸腺苷(ADP)。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的試劑盒，其中所述質(zhì)子載體是對(duì)三氟甲氧基苯腙氰化物(FCCP)。
61.根據(jù)前述權(quán)利要求55至60中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含容納有谷氨酸/谷氨酸鹽、丙酮酸/丙酮酸鹽、蘋(píng)果酸/蘋(píng)果酸鹽、異檸檬酸/異檸檬酸鹽、α -酮戊二酸/α-酮戊二酸鹽或其組合的容器。
62.根據(jù)前述權(quán)利要求55至61中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含容納有琥珀酸/琥珀酸鹽的容器。
63.根據(jù)前述權(quán)利要求55至62中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含容納有甘油-3-磷酸的容器。
64.根據(jù)前述權(quán)利要求55至63中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含容納有N，N,Ni，N'-四甲基對(duì)苯二胺(TMPD)的容器。
65.根據(jù)前述權(quán)利要求55至64中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含容納有抗壞血酸/抗壞血酸鹽的容器。
66.根據(jù)前述權(quán)利要求55至65中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含容納有呼吸鏈抑制劑、氧化磷酸化抑制劑、解偶聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、離子載體或krebs循環(huán)抑制劑的容器。
67.根據(jù)前述權(quán)利要求55至66中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含容納有魚(yú)藤酮、丙二酸/丙二酸鹽、抗霉素A、KCN或寡霉素的容器。
68.根據(jù)前述權(quán)利要求55至67中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含容納有測(cè)定緩沖劑的容器。
69.根據(jù)前述權(quán)利要求55至68中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述膽固醇依賴性細(xì)胞溶素選自表1。
70.根據(jù)前述權(quán)利要求55至69中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的試劑盒，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列。
72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的試劑盒，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸處由半胱氨酸替換為丙氨酸。
73.根據(jù)權(quán)利要求70所述的試劑盒，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其319位氨基酸處由蘇氨酸替換為半胱氨酸，并且334位氨基酸處由纈氨酸替換為半胱氨酸。
74.根據(jù)權(quán)利要求71至73中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述PFO還在434位氨基酸處包含天冬氨酸至絲氨酸的替換。
75.根據(jù)權(quán)利要求73所述的試劑盒，其還包含容納有還原劑的容器。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的試劑盒，其中所述還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇。
77.根據(jù)前述權(quán)利要求55至76中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中至少一個(gè)容器是可重復(fù)使用的容器。
78.根據(jù)前述權(quán)利要求55至77中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中至少一個(gè)容器是單次使用的容器。
79.根據(jù)前述權(quán)利要求55至78中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中至少一個(gè)容器是管或瓶。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的試劑盒，其中所述管或瓶是按扣蓋的管或瓶或者螺旋蓋的管或瓶。
81.根據(jù)前述權(quán)利要求55至80中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中至少一個(gè)容器是玻璃小瓶。
82.根據(jù)前述權(quán)利要求55至81中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述容器一起被容納在盒子或包裝中。
83.根據(jù)前述權(quán)利要求55至82中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含用于使細(xì)胞透化的說(shuō)明書(shū)。
84.根據(jù)前述權(quán)利要求55至83中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含用于在使用前將至少一個(gè)容器保存在低于0°C的溫度的說(shuō)明書(shū)。
85.根據(jù)前述權(quán)利要求55至84中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含用于診斷用途的說(shuō)明書(shū)。
86.根據(jù)前述權(quán)利要求55至85中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求I至42中任一項(xiàng)所述之方法的說(shuō)明書(shū)。
87.分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)，其包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其434位氨基酸處由天冬氨酸替換為絲氨酸。
88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的分離的PF0，其還在319位氨基酸處包含蘇氨酸至半胱氨酸的替換。
89.根據(jù)權(quán)利要求87或88所述的分離的PF0，其還在334位氨基酸處包含纈氨酸至半胱氨酸的替換。
90.根據(jù)權(quán)利要求87至89中任一項(xiàng)所述的分離的PF0，其還在459位氨基酸處包含半胱氨酸至丙氨酸的替換。
91.分離的PF0，其包含如SEQID NO:8至12中任一所示的氨基酸序列。
92.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求87至91中任一項(xiàng)所述的分離的PFO以及載體。
93.試劑盒，其包含容納有根據(jù)權(quán)利要求87至91中任一項(xiàng)所述的分離的PFO或容納有根據(jù)權(quán)利要求92所述之組合物的容器。
94.用外源性核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，所述方法包括: (a)使所述細(xì)胞與膽固醇依賴性細(xì)胞溶素相接觸；以及 (b)使所述細(xì)胞與所述外源性核酸相接觸。
95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中步驟(a)在步驟(b)之前進(jìn)行。
96.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中步驟(a)和(b)同時(shí)進(jìn)行。
97.根據(jù)權(quán)利要求94至96中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述膽固醇依賴性細(xì)胞溶素是產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O(PFO)。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1至12中任一所示的氨基酸序列。
99.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其459位氨基酸處由半胱氨酸替換為丙氨酸。
100.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述PFO包含如SEQID NO:1或2所示的氨基酸序列，其319位氨基酸處由蘇氨酸替換為半胱氨酸，并且334位氨基酸處由纈氨酸替換為半胱氨酸。
101.根據(jù)權(quán)利要求99或100所述的方法，其中所述氨基酸序列還在434位氨基酸處包含天冬氨酸至絲氨酸的替換。
102.方法，其包括: 使包含從對(duì)象得到之細(xì)胞的制備物與膽固醇依賴性細(xì)胞溶素相接觸；以及 測(cè)定所述制備物中分子的水平，其中所述分子的水平指示所述細(xì)胞中呼吸鏈缺陷的存在與否。
103.根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其中所述細(xì)胞中所述呼吸鏈缺陷的存在指示所述對(duì)象患有線粒體疾病。
104.根據(jù)權(quán)利要求103所述的方法，其中所述線粒體疾病選自:肌陣攣癲癇伴破碎紅纖維(MERRF);線粒體肌病、腦病、高乳酸血癥和卒中(MELAS);糖尿病和耳聾(DAD);母體遺傳糖尿病和耳聾(MIDD);萊伯遺傳性視神經(jīng)病(LHON);慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹(CPEO)；利氏?。豢ǘ魉?賽爾綜合癥(KSS);弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(FRDA);輔酶QIO(Co-QIO)缺陷；神經(jīng)病、共濟(jì)失調(diào)、色素性視網(wǎng)膜炎及上瞼下垂(NARP);肌神經(jīng)源性胃腸性腦病(MNGIE)；復(fù)合物I缺陷；復(fù)合物II缺陷；復(fù)合物III缺陷；復(fù)合物IV缺陷；復(fù)合物V缺陷；其他線粒體疾??；以及影響線粒 體功能的其他肌病。
【文檔編號(hào)】C12Q1/26GK103687959SQ201280027623
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日
【發(fā)明者】納根德拉·亞達(dá)瓦, 金澈, 亞歷杭德羅·帕布洛·霍伊克 申請(qǐng)人:貝斯泰醫(yī)學(xué)中心公司, 馬薩諸塞大學(xué)