分析染色體易位的方法及其系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本
【發(fā)明內(nèi)容】
涉及用于分析染色體易位的系統(tǒng)和方法，并且具體地涉及通過原位雜交對(duì)染色體易位的分析。所述方法采用5’探針、3’探針和在斷裂點(diǎn)附近結(jié)合，任選地，與該斷裂點(diǎn)重疊的探針。所述探針經(jīng)不同標(biāo)記。具體地，描述了在檢測牽涉ALK基因的易位中的用途。
【專利說明】分析染色體易位的方法及其系統(tǒng)
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本公開內(nèi)容涉及用于分析染色體易位的系統(tǒng)和方法，并且具體地涉及通過原位雜交對(duì)染色體易位的分析。
[0002]發(fā)明背景
[0003]基于對(duì)取自患病生物體的組織或細(xì)胞樣品的判讀來對(duì)疾病進(jìn)行診斷、預(yù)后和確定治療已在過去數(shù)年中急劇擴(kuò)張。除了傳統(tǒng)的組織學(xué)染色技術(shù)和免疫組化測定法外，現(xiàn)在還使用原位技術(shù)如原位雜交和原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來幫助診斷人的疾病狀態(tài)。如此，存在多種不僅能評(píng)估細(xì)胞形態(tài)學(xué)而且能評(píng)估細(xì)胞和組織內(nèi)特定大分子存在的技術(shù)。
[0004]分子細(xì)胞遺傳技術(shù)如生色原位雜交(CISH)將染色體的視覺評(píng)估(染色體組型分析)與分子技術(shù)組合。分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法基于核酸探針與其在細(xì)胞內(nèi)的互補(bǔ)核酸的雜交。針對(duì)特定染色體區(qū)域的探針會(huì)識(shí)別中期染色體上或分裂間期細(xì)胞核內(nèi)(例如組織樣品中)的其互補(bǔ)序列并與之雜交。已開發(fā)出用于多種診斷和研究目的的探針。
[0005]序列探針與特定染色體區(qū)域或基因中的單拷貝DNA序列雜交。這些是用于鑒定與感興趣的綜合征或狀況有關(guān)的染色體關(guān)鍵區(qū)域或基因的探針。在分裂中期染色體上，這類探針與每條染色單體雜交，每條染色體通常給出兩個(gè)較小的離散信號(hào)。
[0006]序列探針如重復(fù)消減探針或獨(dú)特序列探針(參見例如U.S.2011/0160076)的雜交已使得與大量疾病和綜合征有關(guān)的染色體異常的檢測成為可能，所述疾病和綜合征包括組成性遺傳異常，如微缺失綜合征(microdeletion syndrome)、染色體易位、基因擴(kuò)增和非整倍性綜合征、新生性疾病以及病原體感染。最通常地，將這些技術(shù)應(yīng)用于顯微鏡載玻片上的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞遺傳制備物。另外，這些規(guī)程可以對(duì)經(jīng)福爾馬林固定的、經(jīng)石蠟包埋的組織的載玻片、血液或骨髓涂片以及直接固定的細(xì)胞或其它核分離物使用。
[0007]可以將從這些測定法獲得的信息用于診斷患者中的疾病，確定患有疾病的患者的預(yù)后，還有用于確定患有疾病的患者的治療過程。在許多情況中，可以將特定標(biāo)志物的存在與預(yù)測的藥物功效相關(guān)聯(lián)。
[0008]非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是一種在肺組織中形成惡性(癌)細(xì)胞的疾病。NSCLC實(shí)際上是一組肺癌，其以在癌癥中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞種類以及該細(xì)胞在顯微鏡下看上去如何命名。三種主要類型的非小細(xì)胞肺癌是鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌。NSCLC是最常見的肺癌種類。
[0009]鱗狀細(xì)胞癌是一種在鱗狀細(xì)胞中開始的癌癥，所述鱗狀細(xì)胞是看上去像魚鱗的薄的、平坦的細(xì)胞。這也稱作表皮樣癌。大細(xì)胞癌是可以在數(shù)種類`型的大細(xì)胞中開始的癌癥。腺癌是一種在作為肺泡襯里并生成如粘液等物質(zhì)的細(xì)胞中開始的癌癥。其它不太常見的非小細(xì)胞肺癌類型為:多形性、類癌腫瘤、唾液腺癌和未分類的癌。
[0010]吸香煙、煙斗或雪茄是NSCLC的最常見起因。人在生命中開始吸煙越早，人吸得越頻繁和人吸得年數(shù)越長，則風(fēng)險(xiǎn)越大。如果人停止吸煙，則風(fēng)險(xiǎn)隨著歲月流逝而變低。
[0011]經(jīng)常同時(shí)進(jìn)行檢測、診斷并分期非小細(xì)胞肺癌的測試和規(guī)程。一般使用下列測試和規(guī)程:胸部X射線；CBC ;尋找癌細(xì)胞的痰測試；骨掃描；胸的CT掃描；胸的MRI ;正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)掃描；和胸腔穿刺術(shù)。在一些情況中，采用活組織檢查并分析。如果活組織檢查揭示肺癌的存在，那么將進(jìn)行更多的成像測試來確定癌癥階段。階段指腫瘤的大小和其已擴(kuò)散的程度。非小細(xì)胞肺癌被分成5個(gè)階段:0期-癌癥尚未擴(kuò)散超出肺的內(nèi)部襯里；1期-癌癥較小且還未擴(kuò)散到淋巴結(jié)；11期-癌癥已擴(kuò)散到初始腫瘤附近的一些淋巴結(jié)；ΙΠ期-癌癥已擴(kuò)散到附近組織或擴(kuò)散到遠(yuǎn)處的淋巴結(jié)；IV期-癌癥已擴(kuò)散到身體的其它器官如另一個(gè)肺、腦或肝。
[0012]有許多用于非小細(xì)胞肺癌的不同類型的治療。治療依賴于癌癥階段。外科手術(shù)經(jīng)常是對(duì)患有尚未擴(kuò)散到超出附近淋巴結(jié)的非小細(xì)胞肺癌的患者的一線治療。外科醫(yī)生可以除去:肺葉之一(葉切除術(shù))；僅肺的小部分(楔形(wedge)或段(segment)切除)；完整的肺(全肺切除術(shù))。一些患者需要化療。化療使用藥物來殺死癌細(xì)胞并使新的癌細(xì)胞停止生長。當(dāng)癌癥擴(kuò)散時(shí)(IV期)，經(jīng)常使用單獨(dú)的化療。
[0013]在一些情況中，進(jìn)行遺傳分析來確定NSCLC的最佳治療過程。例如，在EGFR基因中具有特定突變的一些患者響應(yīng)EGFR酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼(gefitinib)。另一個(gè)例子是，7%的具有EML4-ALK易位的NSCLC可以受益于在臨床試驗(yàn)中的ALK抑制劑。
[0014]已將分離(break-apart)探針系統(tǒng)用于分析來自NSCLC患者的組織。然而，由于在NSCLC中發(fā)生的染色體重排的性質(zhì)，可以有假陽性結(jié)果的問題，特別是在重排在同一染色體內(nèi)的情況下，如倒位。在這些情況中，可以不可能正確解析來自每組分離探針的信號(hào)。即使尚未發(fā)生重排，該信號(hào)也可以作為兩個(gè)分開的信號(hào)出現(xiàn)。這由于獲得不正確的結(jié)果和活組織檢查材料的缺乏兩者而可以是個(gè)一個(gè)真正的問題。已將三色系統(tǒng)用于染色體分析。參見例如 Makretsov 等，Genes, Chromosomes and Cancer, 40:152-57 (2004) ;Martin-Subero,等，Cancer Res.，66 (21): 10332-38 (2006) ; Yoshimoto 等，Neoplasia8 (6): 465-69 (2006) ; Renne等，J.Mol.Diagnost.，7(3): 352-56 (2005)。然而，這些系統(tǒng)無一已經(jīng)應(yīng)用于解決與分離探針系統(tǒng)中的假陽性結(jié)果有關(guān)的問題。解決假陽性結(jié)果問題的分離探針系統(tǒng)會(huì)為受癌癥折磨的患者提供益處。
[0015]發(fā)明概述
[0016]本公開內(nèi)容涉及用于分析染色體易位的系統(tǒng)和方法，并且具體地涉及通過原位雜交分析染色體易位。
[0017]在例示性實(shí)施方案中，用于對(duì)樣品分析與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的方法包括使所述樣品與下列探針接觸:包含配置為與位于所述斷裂點(diǎn)5’的基因組DNA雜交的第一序列的第一核酸探針、包含配置為與位于所述斷裂點(diǎn)3’的基因組DNA雜交的第二序列的第二核酸探針、和包含配置為與所述斷裂點(diǎn)附近的基因組DNA雜交的第三序列的第三核酸探針。所述方法進(jìn)一步包括建立適合于所述探針與樣品中的基因組DNA雜交的條件，并檢測所述探針的雜交，其通過檢測與第一核酸探針關(guān)聯(lián)的第一信號(hào)、與第二核酸探針關(guān)聯(lián)的第二信號(hào)、以及與第三核酸探針關(guān)聯(lián)的第三信號(hào)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括鑒定樣品次序和取向，所述樣品次序和取向?yàn)檠厝旧w縱向排布的第一信號(hào)、第二信號(hào)和第三信號(hào)的順序。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將樣品次序和取向與對(duì)照次序和取向比較。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)照次序和取向?yàn)檠厝旧w縱向排布的第一信號(hào)、第二信號(hào)和第三信號(hào)的順序，其中已知所述染色體沒有與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位。
[0018]在例示性實(shí)施方案中，所述第三序列配置為與在所述斷裂點(diǎn)5’且附近的基因組DNA雜交，并且將所述樣品次序和取向與對(duì)照次序和取向比較包括確立與對(duì)照次序和取向相比所述樣品次序和取向是否包括所述第一信號(hào)和第三信號(hào)的倒置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三序列配置為與在所述斷裂點(diǎn)3’且附近的基因組DNA雜交，并且將所述樣品次序和取向與對(duì)照次序和取向比較包括確立與對(duì)照次序和取向相比所述樣品次序和取向是否包括所述第二信號(hào)和第三信號(hào)的倒置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三序列配置為與在所述斷裂點(diǎn)附近且位于所述斷裂點(diǎn)5’和3’兩者的基因組DNA雜交，并且將所述樣品次序和取向與對(duì)照次序和取向比較包括確立與對(duì)照次序和取向相比所述樣品次序和取向是否包括所述第一信號(hào)或第二信號(hào)與第三信號(hào)的倒置。
[0019]在例示性實(shí)施方案中，所述方法包括通過分析已知沒有與所述斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的對(duì)照來測定對(duì)照次序和取向，其中測定包括使對(duì)照與下列探針接觸:包含配置為與位于所述斷裂點(diǎn)5’的基因組DNA雜交的第一序列的第一核酸探針、包含配置為與位于所述斷裂點(diǎn)3’的基因組DNA雜交的第二序列的第二核酸探針、和包含配置為與所述斷裂點(diǎn)附近的基因組DNA雜交的第三序列的第三核酸探針。所述方法進(jìn)一步包括建立適合于所述探針與所述對(duì)照中的基因組DNA雜交的條件，并檢測所述探針的雜交，其通過檢測與第一核酸探針關(guān)聯(lián)的第一信號(hào)、與第二核酸探針關(guān)聯(lián)的第二信號(hào)、以及與第三核酸探針關(guān)聯(lián)的第二號(hào)進(jìn)行。
[0020]在例示性實(shí)施方案中，所述核酸探針包含選自下組的核酸:用可檢測模塊標(biāo)記的RNA、DNA、PNA、LNA及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述可檢測模塊選自下組:半抗原、酶、熒光分子、發(fā)光分子和放射性分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可檢測模塊是半抗原，且所述第一、第二和第三核酸探針分別用不同的第一、第二和第三半抗原標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，半抗原選自下組:生物素、2，4-二硝基苯基(DNP)、熒光素衍生物、洋地黃毒苷(DIG)、5-硝基-3-吡唑碳酰胺(pyrozolecarbamide)(硝基吡唑，NP)、4，5, - 二甲氧基-2-硝基肉桂酰胺(硝基肉桂酰胺，NCA)、2-(3，4-二甲氧基苯基)-喹啉-4-碳酰胺(苯基喹諾酮，DPQ)、2，I, 3-苯并口惡-二挫(benzoxadiazole)-5-碳酰胺(苯并呋咱，BF)、3_羥基_2_喹喔
啉碳酰胺(羥基喹喔啉，HQ)、4-( 二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL)、魚藤酮異O悉唑啉(Rot)、(E) -2- (2- (2-氧-2，3- 二氫-1H-苯[b] [I, 4] 二氮雜卓(diazepin) -4-基)苯氧基(phenozy))乙酰胺(苯并二氮雜卓(benzodiazepine), BD)、7_( 二乙基氨基)-2-氧-2H-色烯-3-羧酸(香豆素343，CD0)、2_乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺(噻唑磺酰胺，TS)和對(duì)甲氧基苯基吡唑鬼臼酰胺(methoxyphenylpyrazopodophyllamide)(Podo)。
[0021]在其它例示性實(shí)施方案中，所述方法包括檢測，該檢測包括使所述樣品與對(duì)所述標(biāo)記物半抗原特異性的抗體接觸，例如分別與對(duì)所述第一、第二和第三半抗原特異性的第一、第二和/或第三抗體接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測進(jìn)一步包括利用抗半抗原識(shí)別和酶促信號(hào)放大來檢測半抗原(例如第一、第二和第三半抗原)。
[0022]在例示性實(shí)施方案中，用于對(duì)樣品分析與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的試劑盒包含具有配置為與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交的序列的第一核酸探針、具有配置為與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交的序列的第二核酸探針、和具有配置為與DNA中在所述斷裂點(diǎn)附近的一部分雜交的序列的第三核酸探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三核酸探針具有配置為與DNA中在所述斷裂點(diǎn)的5’和3’兩側(cè)接近且跨越所述斷裂點(diǎn)的一部分雜交的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一、第二和第三核酸探針用第一、第二和第三半抗原半抗原化，所述試劑盒還包含配置為使所述第一、第二和第三半抗原能夠顯現(xiàn)的檢測試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測試劑是配置為使所述第一、第二和第三半抗原能夠明視野顯現(xiàn)的生色檢測試劑。
[0023]在例示性實(shí)施方案中，用于診斷患者樣品中與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位有關(guān)的疾病的方法包括使所述患者樣品與核酸探針系列接觸，該系列選擇為使得在缺乏與所述斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的情況下，該系列依照第一次序和取向與所述患者樣品雜交，且選擇為使得在存在與所述斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的情況下，該系列依照不同的次序和取向與所述患者樣品雜交，并檢測該核酸探針系列是否依照第一次序和取向與所述患者樣品雜交，其中檢測第一次序和取向提供所述患者樣品沒有與患者樣品中斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的診斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一次序和取向是沿染色體縱向排布的3種信號(hào)的預(yù)先確定的順序。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測包括使用利用明視野成像顯現(xiàn)的生色檢測試劑。
[0024]附圖簡述
[0025]圖1是染色體的示意圖，其顯示斷裂點(diǎn)區(qū)域和配置為與其雜交的探針；
[0026]圖2 (A-D)顯示例示性檢測方案的示意圖；
[0027]圖3是染色體的示意圖，其顯示可以發(fā)生倒位染色體易位的兩個(gè)斷裂點(diǎn)位置和配置為與其雜交的探針；
[0028]圖4是顯示倒位染色體易位后圖3的染色體和所得探針定位的示意圖；
[0029]圖5 (A-B)是放大的俯視圖，其顯示對(duì)(A)野生型ALK和(B)重排的ALK報(bào)告的信號(hào)，如使用三重比色檢測和明視野成像會(huì)看到的；
[0030]圖6 (A-B)是分別對(duì)應(yīng)于圖5 (A-B)的照相圖像；
`[0031]圖7是顯示可以發(fā)生重排染色體易位的兩個(gè)斷裂點(diǎn)位置的兩條染色體的示意圖；
[0032]圖8是顯示重排染色體易位后的圖7的染色體和所得探針定位的示意圖；和
[0033]圖9 (A-B)是放大的俯視圖，其顯示對(duì)(A)野生型ALK和(B)重排的ALK報(bào)告的信號(hào)，如使用三重比色檢測和明視野成像會(huì)看到的。
[0034]定義
[0035]除非另外解釋，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員的理解具有相同的意義。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義可見于BenjaminLewin, Genes V,由 Oxford University Press 出版，1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew 等(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);和 Robert A.Meyers(ed.), Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference, 由 VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。
[0036]除非上下文另外清楚地指示，單數(shù)術(shù)語“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。類似地，除非上下文另外清楚地指示，文字“或”意圖包括“和”。術(shù)語“多個(gè)/多種”與短語“超過一個(gè)/種”同義使用，即為兩個(gè)/種或更多個(gè)/種。還應(yīng)理解，對(duì)于核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子質(zhì)量值均為近似值，并且提供用于描述。術(shù)語“包含”意為“包括”?？s寫“例如(e.g.)”自拉丁文exempli gratia衍生，并且用于本文指示非限制性例子。如此，縮寫“例如(e.g.)”與術(shù)語“例如(for example)”同義。盡管在實(shí)施或測試本公開內(nèi)容中可以使用與本文中描述的那些方法和材料類似或等同的方法和材料，但在下文描述了合適的方法和材料。
[0037]抗體:“抗體”統(tǒng)指免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子(包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其組合，和在任何脊椎動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物(如人、山羊、家兔和小鼠)中的免疫應(yīng)答期間生成的類似的分子)和特異性結(jié)合感興趣的分子(或一組高度類似的感興趣的分子)至實(shí)質(zhì)性排除對(duì)其它分子結(jié)合的抗體片段(例如，比針對(duì)生物學(xué)樣品中其它分子的結(jié)合常數(shù)具有至少大103M-1、至少大104M-1、至少大105M-1的針對(duì)感興趣分子的結(jié)合常數(shù)的抗體和抗體片段)。
[0038]更具體地，“抗體”指至少包含特異性識(shí)別并結(jié)合抗原表位的輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽配體?？贵w由重鏈和輕鏈構(gòu)成，所述重鏈和輕鏈各自具有可變區(qū)，稱作可變重(VH)區(qū)和可變輕(VL)區(qū)。VH區(qū)和VL區(qū)一起負(fù)責(zé)結(jié)合由抗體識(shí)別的抗原。[0039]這包括完整的免疫球蛋白以及本領(lǐng)域中公知的其變體和部分?？贵w片段包括蛋白水解抗體片段[如F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab’ -SH片段和Fab片段，如本領(lǐng)域中已知的]、重組抗體片段(如sFv片段、dsFv片段、雙特異性sFv片段、雙特異性dsFv片段、F(ab) ’ 2片段、單鏈Fv蛋白質(zhì)(“scFv”)、二硫化物穩(wěn)定化的Fv蛋白質(zhì)("dsFv")、雙抗體和三抗體(如本領(lǐng)域中已知的)，以及駱駝抗體(參見例如美國專利N0.6，015, 695; 6，005,079-5，874，541; 5, 840，526; 5, 800，988;和 5，759，808)。scFv 蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)由接頭結(jié)合，而在dsFv中，所述鏈已被突變以引入二硫鍵來使鏈聯(lián)合穩(wěn)定化。該術(shù)語還包括經(jīng)遺傳工程化改造的形式如嵌合抗體(例如人源化鼠抗體)、異綴合抗體(如雙特異性抗體)。亦參見Pierce Catalog andHandbook, 1994-1995 (Pierce Chemical C0., Rockford, 111.) ;Kuby, J., Immunology, 3.sup.rd Ed.，W.H.Freeman&C0.，New York, 1997。
[0040]通常，天然存在的免疫球蛋白具有由二硫鍵互連的重(H)鏈和輕(L)鏈。有兩種類型的輕鏈，拉姆達(dá)(λ )和卡帕(k)。有5種決定抗體分子的功能活性的主要重鏈種類(或同種型):IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE。
[0041]每條重鏈和輕鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)(所述區(qū)也稱為“域”)。組合地，重鏈和輕鏈可變區(qū)特異性結(jié)合抗原。輕鏈和重鏈可變區(qū)含有被3個(gè)高變區(qū)(也稱作“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“⑶R”)中斷的“框架”區(qū)。已限定框架區(qū)和⑶R的范圍(參見Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest, U.S.Department of Health and HumanServices, 1991)。Kabat數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在聯(lián)機(jī)維護(hù)。不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在物種內(nèi)相對(duì)保守?？贵w的框架區(qū)(其是組成性輕鏈和重鏈的組合框架區(qū))用來在三維空間中定位和排列CDR。
[0042]⑶R主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。每條鏈的⑶R通常稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3，從N端開始連續(xù)編號(hào)，并且通常還通過定位特定⑶R的鏈鑒定。如此，VH⑶R3位于發(fā)現(xiàn)其的抗體重鏈的可變域中，而VL CDRl是來自發(fā)現(xiàn)其的抗體輕鏈的可變域的CDR1。結(jié)合RET的抗體會(huì)具有特定的VH區(qū)和VL區(qū)序列，以及如此特定的CDR序列。具有不同特異性(即針對(duì)不同抗原的不同組合位點(diǎn))的抗體具有不同的CDR。盡管從抗體到抗體變化的正是CDRJMCDR內(nèi)僅有限數(shù)目的氨基酸位置直接牽涉抗原結(jié)合。CDR內(nèi)的這些位置稱作特異性決定殘基(SDR)。[0043]“結(jié)合或穩(wěn)定結(jié)合”指兩種物質(zhì)或分子之間的聯(lián)合，如一個(gè)核酸分子(例如結(jié)合區(qū))與另一個(gè)(或其自身)(例如祀核酸分子)的雜交。如果充足量的核酸分子與其祀核酸分子形成堿基對(duì)或與其雜交以允許檢測所述結(jié)合，那么該核酸分子結(jié)合或穩(wěn)定結(jié)合靶核酸分子。
[0044]如果兩個(gè)核酸分子共有充足數(shù)目的互補(bǔ)核苷酸，從而在鏈彼此結(jié)合(雜交)時(shí)(例如通過形成Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen堿基對(duì))形成穩(wěn)定的雙鏈體或三鏈體，那么核酸分子與另一核酸分子是“互補(bǔ)”的。當(dāng)在需要的條件下核酸分子保持與靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)可檢測結(jié)合時(shí)，發(fā)生穩(wěn)定的結(jié)合。
[0045]互補(bǔ)性是一個(gè)核酸分子(例如靶核酸探針)中的堿基與第二核酸分子(例如基因組靶核酸序列)中的堿基堿基配對(duì)的程度?；パa(bǔ)性由百分?jǐn)?shù)方便地描述，該百分?jǐn)?shù)即在兩種分子之間或在兩種分子的特定區(qū)或域內(nèi)形成堿基對(duì)的核苷酸的比例。
[0046]在本公開內(nèi)容中，“充分的互補(bǔ)性”意指在一個(gè)核酸分子或其區(qū)域與靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)之間存在充足數(shù)目的堿基對(duì)以實(shí)現(xiàn)可檢測的結(jié)合。對(duì)涉及建立結(jié)合條件的定性和定量考慮的徹底處理由Beltz等Methods Enzymol.100:266-285，1983,以及由 Sambrook 等(ed.)，Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 2nded., vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989提供。
[0047]“計(jì)算機(jī)執(zhí)行的算法”是由計(jì)算裝置在用戶命令下實(shí)施或執(zhí)行的算法或程序(計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的可執(zhí)行代碼集)。在本公開內(nèi)容的上下文中，計(jì)算機(jī)執(zhí)行的算法可用于促進(jìn)(例如自動(dòng)化)選擇具有特定特征的多核苷酸序列，如鑒定靶核酸序列的重復(fù)(或其它不想要的，例如背景生成性)核酸序列或獨(dú)特結(jié)合區(qū)。典型地，用戶通過向計(jì)算機(jī)中輸入命令、并設(shè)定一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)啟 動(dòng)算法的執(zhí)行，該計(jì)算機(jī)能夠進(jìn)入序列數(shù)據(jù)庫。序列數(shù)據(jù)庫能包含在計(jì)算機(jī)的存儲(chǔ)介質(zhì)內(nèi)或能遠(yuǎn)程存儲(chǔ)并經(jīng)由計(jì)算機(jī)和在近程或遠(yuǎn)程位置的存儲(chǔ)介質(zhì)之間的連接(經(jīng)由內(nèi)聯(lián)網(wǎng)或因特網(wǎng))進(jìn)入。在啟動(dòng)算法后，該算法或程序由計(jì)算機(jī)執(zhí)行，例如以選出一個(gè)或多個(gè)滿足選擇標(biāo)準(zhǔn)的多核苷酸序列。最普遍地，隨后顯示(例如在屏幕上)或輸出(例如以打印的形式或到計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上)選定的多核苷酸序列。
[0048]術(shù)語“綴合、聯(lián)合、鍵合或連接”指將一個(gè)分子共價(jià)連接到另一個(gè)分子以制備更大的分子。例如，將兩個(gè)多肽制備成一個(gè)連續(xù)的多肽分子，或?qū)肟乖蚱渌肿庸矁r(jià)附接到多肽如scFv抗體。在特定背景中，該術(shù)語包括指代將一種特異性結(jié)合分子如抗體聯(lián)合到信號(hào)生成模塊如半導(dǎo)體納米晶體。該連接可以是通過化學(xué)或重組手段進(jìn)行。“化學(xué)手段”指抗體模塊和效應(yīng)器分子之間的反應(yīng)從而使得在兩分子之間形成共價(jià)鍵以形成一個(gè)分子。
[0049]術(shù)語“偶聯(lián)的”在應(yīng)用于與第二原子或分子“偶聯(lián)”的第一原子或分子時(shí)可以是直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)的兩者。二抗提供間接偶聯(lián)的例子。一種間接偶聯(lián)的特定的例子是由小鼠抗家兔IgG抗體結(jié)合的家兔抗-半抗原一抗,該小鼠抗家兔IgG抗體繼而由與可檢測標(biāo)記共價(jià)連接的山羊抗小鼠IgG抗體結(jié)合。
[0050]術(shù)語“對(duì)應(yīng)”在述及第一和第二核酸(例如，結(jié)合區(qū)和靶核酸序列)中指第一和第二核酸在第一和/或第二核酸的總序列的至少一部分內(nèi)共有實(shí)質(zhì)性序列同一性或互補(bǔ)性。如此，如果結(jié)合區(qū)與靶核酸序列的至少一部分具有實(shí)質(zhì)性序列同一性或互補(bǔ)性(例如反向互補(bǔ)性)(例如如果它與該至少一部分是至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或甚至100%相同或互補(bǔ)的)，則該結(jié)合區(qū)對(duì)應(yīng)于靶核酸序列。例如，如果結(jié)合區(qū)與雙鏈靶核酸序列(例如基因組靶DNA序列)的一條鏈具有實(shí)質(zhì)性序列同一性或如果該結(jié)合區(qū)與單鏈靶核酸序列(例如RNA或RNA病毒基因組)實(shí)質(zhì)性互補(bǔ)，則該結(jié)合區(qū)可以對(duì)應(yīng)于靶核酸序列。[0051]“基因組”是生物體的總遺傳組成。在真核生物體的情況中，基因組包含在細(xì)胞染色體的單倍體組中。在原核生物體的情況中，基因組包含在單個(gè)染色體中，且在一些情況中包含在一個(gè)或多個(gè)染色體外遺傳元件如附加體(例如質(zhì)粒)中。根據(jù)具體的病毒，病毒基因組可以采取一種或多種單鏈或雙鏈DNA或RNA分子的形式。
[0052]術(shù)語“半抗原”指可以與抗體特異性組合但除與載體分子組合外通?；静荒転槊庖咴缘姆肿?通常為小分子)。
[0053]術(shù)語“分離的”就生物學(xué)組分(如核酸分子、蛋白質(zhì)或細(xì)胞)而言指已基本從該組分天然存在的生物體的細(xì)胞中的其它生物學(xué)組分如其它染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和細(xì)胞器或生物體自身分開或純化的生物學(xué)組分。已“分離的”核酸分子包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子。該術(shù)語還涵蓋通過擴(kuò)增或克隆制備的核酸以及化學(xué)合成的核酸。
[0054]“標(biāo)記物”是直接或間接綴合于另一分子以促進(jìn)對(duì)該分子的檢測的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記物的特定的非限制性例子包括熒光模塊和熒光產(chǎn)生(fluOTogenic)模塊、生色模塊、半抗原、親和標(biāo)簽和放射性同位素。標(biāo)記物可以是直接可檢測(例如光學(xué)可檢測的)或間接可檢測(例如，經(jīng)由與繼而可檢測的一種或多種別的分子的相互作用)的。下文描述了在本文中公開的探針的背景中的例示性標(biāo)記物。用于標(biāo)記核酸的方法，和在選擇可用各種目的的標(biāo)記物的指南在例如Sambrook和Russell,于Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)和 Ausubel等，in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates andWiley-1ntersciences (1987, and including updates)中論述。
[0055]術(shù)語“多重”指在期望時(shí)允許使用復(fù)數(shù)個(gè)不同綴合物基本同時(shí)或序貫檢測樣品中多種靶物的實(shí)施方案。多重化可包括個(gè)別和以任何和所有組合兩者方式鑒定和/或量化核酸(一般情況)、0嫩、1?嫩、肽、蛋白質(zhì)。多重化還可包括在細(xì)胞中在其解剖背景中檢測基因、
使和蛋白質(zhì)中的兩種或更多種。
[0056]“核酸”是單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，涵蓋以與天然存在的核苷酸類似的方式與核酸雜交的天然核苷酸的類似物。術(shù)語“核苷酸”包括但不限于包含與糖(如核糖、脫氧核糖或其合成類似物)連接的堿基(如嘧啶、嘌呤或其合成類似物)或與氨基酸連接的堿基(如在肽核酸(PNA)中)的單體。核苷酸是多核苷酸中的一個(gè)單體。核苷酸序列指多核苷酸中的堿基序列。
[0057]核酸“區(qū)段”是靶核酸分子的子部分或子序列。核酸區(qū)段可以以多種方式自靶核酸分子假定地或?qū)嶋H地衍生。例如，靶核酸分子(如基因組靶核酸分子)的區(qū)段可通過用一種或多種限制酶消化以生成作為限制性片段的核酸區(qū)段獲得。核酸區(qū)段也可以通過擴(kuò)增從靶核酸分子生成、通過雜交(例如扣除雜交)、通過人工合成、或任何其它生成在序列中對(duì)應(yīng)于靶核酸分子的一種或多種核酸的規(guī)程生成。核酸區(qū)段的一個(gè)具體的例子是結(jié)合區(qū)。
[0058]“探針”或“核酸探針”是能夠與靶核酸分子(例如基因組靶核酸分子)雜交，且在與靶物雜交時(shí)能被直接或間接檢測出來的核酸分子或核酸分子集。如此，探針允許檢測且在一些實(shí)施例中量化祀核酸分子。在具體的實(shí)施例中，探針包括多個(gè)核酸分子，該核酸分子包含自靶核酸分子衍生的且如此能夠與靶核酸分子的至少一部分特異性雜交的結(jié)合區(qū)。探針可以稱為“經(jīng)標(biāo)記的核酸探針”，其指示探針直接或間接與使探針可檢測的可檢測模塊或“標(biāo)記物”偶聯(lián)。
[0059]術(shù)語“半導(dǎo)體納米晶體”指由于量子限制而展現(xiàn)出大小依賴性電子和光學(xué)特性的納米級(jí)顆粒。半導(dǎo)體納米晶體例如由半導(dǎo)體材料(例如硒化鎘或硫化鉛)構(gòu)建并且來自微晶(經(jīng)由分子束外延生長)等。具有各種表面化學(xué)和熒光特征的多種半導(dǎo)體納米晶體可購自Life Technologies(參見例如美國專利 N0.6，815，064,6, 682596 和 6，649，138)。半導(dǎo)體納米晶體還可購自eBiosciences and Evident Technologies。其它半導(dǎo)體納米晶體包括合金半導(dǎo)體納米顆粒如 ZnSSe、ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe,ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe> CdHgSSe> CdHgSeTe> InGaAs> GaAlAs 和 InGaN 半導(dǎo)體納米顆粒(合金半導(dǎo)體納米顆粒及其制備方法披露于例如美國申請公開文本N0.2005/0012182和PCT公開文本 W02005/001889)。
[0060]“樣品”是從受試者獲得的含有基因組DNA、RNA (包括mRNA)、蛋白質(zhì)及其組合的生物學(xué)標(biāo)本。例子包括但不限于染色體制備物、外周血、尿液、唾液、組織活組織檢查、手術(shù)標(biāo)本、骨髓、羊膜穿刺樣品和尸檢材料。在一個(gè)例子中，樣品包括基因組DNA或RNA。在一些例子中，樣品是細(xì)胞遺傳制備物，例如其可置于顯微鏡載玻片上。在具體的例子中，直接使用樣品，或在使用前通過例如通過固定(例如使用福爾馬林)操作樣品。
[0061]術(shù)語“信號(hào)生成模塊”指生成通過測定法可檢測的信號(hào)的組合物或分子。
[0062]術(shù)語“特異性結(jié)合模塊”指結(jié)合對(duì)的成員。特異性結(jié)合對(duì)是分子對(duì)，其特征在于它們實(shí)質(zhì)性排除對(duì)其它分子的結(jié)合彼此結(jié)合(例如，特異性結(jié)合對(duì)可以具有比結(jié)合對(duì)兩成員任一個(gè)與生物學(xué)樣品中其它分子的結(jié)合常數(shù)至少大103M-1、大104M-1或大105M-1的結(jié)合常數(shù))。特異性結(jié)合模塊的具體的例子包括特異性結(jié)合蛋白質(zhì)(例如抗體、凝集素、親合素如鏈霉親合素和蛋白A)、核酸序列和蛋白-核酸。特異性結(jié)合模塊還可包括由這類特異性結(jié)合蛋白特異性結(jié)合的分子(或其部分)。
[0063]術(shù)語“特異性結(jié)合劑”指包含綴合于信號(hào)生成模塊的特異性結(jié)合模塊的分子。
[0064]“受試者”包括任何多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體，如人和非人哺乳動(dòng)物(例如獸醫(yī)受試者)。
[0065]“靶核酸序列或分子”是核酸分子例如基因組(如含有感興趣基因的哺乳動(dòng)物基因組DNA的基因或區(qū)域)或RNA序列的限定區(qū)域或特定序列。在靶核酸序列是靶基因組序列的一個(gè)例子中，這類靶物可通過其在染色體(例如在正常細(xì)胞中)上的位置限定，例如依照細(xì)胞遺傳命名通過參照在染色體上的具體位置；通過參照其在遺傳圖譜上的位置；通過參照假定或裝配的重疊群；通過其特定序列或功能；通過其基因或蛋白質(zhì)名稱，或通過任何其它獨(dú)特將其從基因組的其它遺傳序列中鑒定出來的手段。在一些例子中，所述靶核酸序列式哺乳動(dòng)物或病毒基因組序列。在其它例子中，所述靶核酸序列是RNA序列。
[0066]在一些例子中，靶核酸序列(例如基因組核酸序列)的變化與疾病或狀況“有關(guān)”。也就是說，靶核酸序列的檢測可用于推斷就疾病或狀況而言的樣品狀態(tài)。例如，靶核酸序列可以以兩種(或更多種)可區(qū)分形式存在，從而第一種形式與疾病或狀況的缺失關(guān)聯(lián)，而第二種(或不同)形式與該疾病或狀況的存在關(guān)聯(lián)。兩種不同形式可以是定性可區(qū)分的(如通過多核苷酸多態(tài)性實(shí)現(xiàn))，和/或兩種不同形式可以是定量可區(qū)分的(如通過存在于細(xì)胞中的靶核酸序列的拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn))。
[0067]“載體”是充當(dāng)其它(“外來”)對(duì)于載體而言非天然的核酸序列的載體的任何核酸。當(dāng)導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞中時(shí)，載體可以自身復(fù)制(及由此復(fù)制外來核酸序列)或表達(dá)該外來核酸序列的至少一部分。在一個(gè)背景中，載體是線性或環(huán)狀核酸，對(duì)其中導(dǎo)入(例如克隆)感興趣的靶核酸序列以用于復(fù)制(例如生產(chǎn))和/或使用標(biāo)準(zhǔn)重組核酸技術(shù)(例如限制性消化)進(jìn)行操作的目的。載體可包含允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，如復(fù)制起點(diǎn)。載體還可包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)志物基因和其它本領(lǐng)域中已知的遺傳元件。常用載體包括例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、噬菌粒、人工染色體(例如BAC、PAC、HAC, YAC)和摻入超過一種這些類型的載體的特征的雜合體。載體通常包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特限制性位點(diǎn)(且在一些情況中為多克隆位點(diǎn))以便于插入靶核酸序列。
[0068]發(fā)明詳述
[0069]本公開內(nèi)容涉及用于分析染色體重排的系統(tǒng)和方法，并且具體地涉及通過原位雜交對(duì)染色體重排的分析。染色體重排將基因置于新的連鎖關(guān)系中并生成沒有正常配對(duì)配偶的染色體。本公開內(nèi)容不限于分析任何特定類型的染色體重排。在一些實(shí)施方案中，染色體重排發(fā)生在同一染色體內(nèi)。此類型重排的一個(gè)例子是倒位。在一些實(shí)施方案中，所述重排是易位。在易位中，來自一條染色體的區(qū)段轉(zhuǎn)移至一條非同源染色體或轉(zhuǎn)移至同一染色體上的新位點(diǎn)。非交互易位是單向易位，其中染色體區(qū)段轉(zhuǎn)移至非同源染色體。在另一方面，交互易位牽涉來自兩條非同源染色體的區(qū)段的交換。當(dāng)重排將兩個(gè)在其它情況下分開的基因連接時(shí)，可以創(chuàng)建基因融合，其發(fā)生在癌癥中是普遍的。染色體斷裂點(diǎn)是染色體上的一個(gè)區(qū)域，在該處正常排列的染色體的雙鏈斷裂從而發(fā)生重排。易位需要兩條雙鏈斷裂。
[0070]本公開內(nèi)容提供用于檢測生物學(xué)樣品中的靶基因序列的探針和探針系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶序列是基因和傾向于重排的周圍序列(5’和3’)。根據(jù)染色體斷裂點(diǎn)，重排能導(dǎo)致正?；蚬δ艿钠茐幕蛘`調(diào)節(jié)。在許多情況中，這些分子重排被視為各種癌癥的最初起因。事實(shí)上，在過去的數(shù)十年中，臨床細(xì)胞遺傳學(xué)家已能將特定的染色體斷裂點(diǎn)與臨床限定的癌癥(包括白血病、淋巴瘤和肉`瘤的亞型)關(guān)聯(lián)起來。幾乎所有在腫瘤中觀察到的重排經(jīng)由體細(xì)胞突變發(fā)生，因此這些不是在家族中遺傳的。
[0071]對(duì)許多這些重排斷裂點(diǎn)周圍DNA序列的分析提供對(duì)癌癥的重要機(jī)械了解。在一些情況中，重排將第一基因的編碼序列置于第二基因的調(diào)節(jié)序列附近。要描述的此種類的第一重排是牽涉患有伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤的患者中的染色體8和14的重排。此具體重排將來自染色體8的MYC原癌基因置于染色體14上的有力的免疫球蛋白重鏈基因(IGH)啟動(dòng)子的控制下。正常地，MYC蛋白觸發(fā)用于細(xì)胞增殖的信號(hào)，且此重排引起淋巴樣細(xì)胞(其中IGH啟動(dòng)子通常是有活性的)中高水平的MYC過表達(dá)。
[0072]在其它癌癥中，重排將兩基因的編碼序列融合在一起以生成有力的癌基因。有歷史興趣的一個(gè)例子是費(fèi)城(Philadelphia)染色體，其最初在患有慢性骨髓性白血病(CML)的患者中被鑒定為一條微小的或小得異乎尋常的染色體。費(fèi)城染色體實(shí)際是交互易位的產(chǎn)物，該交互易位牽涉染色體9和22的q臂末端處的小區(qū)段。牽涉多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的后續(xù)分子分析揭示，易位將染色體22上BCR (斷裂點(diǎn)簇區(qū))基因的編碼序列與染色體9上的ABL基因的編碼序列融合。由該嵌合基因編碼的BCR-ABL融合蛋白是蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，其組成性激活牽涉細(xì)胞生長和增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。此特定斷裂點(diǎn)的知識(shí)已導(dǎo)致對(duì)CML的成功治療，因?yàn)檠芯空吣芾眯蛄行畔磉^表達(dá)BCR-ABL蛋白并使其結(jié)晶，這繼而導(dǎo)致開發(fā)出抑制此蛋白活性的藥物。
[0073]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述探針和探針系統(tǒng)用于原位雜交規(guī)程，例如熒光原位雜交(FISH)、比色原位雜交(CISH)和銀原位雜交(SISH)。在一些實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品包括組織切片(如通過活組織檢查獲得)或細(xì)胞學(xué)樣品(如巴氏涂片(Pap smear)或血液涂片)。可以使用公開的所述探針和探針系統(tǒng)的其它類型的測定法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易顯而易見的，且在下文論述了具體的例子。
[0074]在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針系統(tǒng)包含至少3種探針，用于分析包含染色體斷裂點(diǎn)的特定靶序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種探針優(yōu)選包含與基因組DNA的限定區(qū)域雜交的多個(gè)探針。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用生物信息學(xué)工具如人基因組瀏覽器(HumanGenome Browser)和重復(fù)掩體(Repeat Masker)設(shè)計(jì)探針集。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從探針設(shè)計(jì)消除重復(fù)元件。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程來合成探針。例如，在一些實(shí)施方案中，使用Primer3程序(在萬維網(wǎng)上primer3.sourceforge.net)來設(shè)計(jì)針對(duì)穿過染色體限定區(qū)域的獨(dú)有序列的引物。在一些實(shí)施方案中，對(duì)設(shè)計(jì)的PCR片段和引物分析與人基因組和轉(zhuǎn)錄物的相似性，例如用人BLAT和Blastnt程序(在萬維網(wǎng)上genome, ucsc.edu/cgi_bin/hgBlat)進(jìn)行。排除與其它區(qū)域(即染色體中對(duì)其設(shè)計(jì)其它探針的其它限定區(qū)域)展現(xiàn)出高度相似性的片段，并且通過測序驗(yàn)證所有PCR片段。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接PCR片段、隨機(jī)擴(kuò)增、并使用綴合于半抗原的核苷酸(例如dUTP或dCTP)通過切口平移標(biāo)記(在下文以更為詳細(xì)描述)。
[0075]現(xiàn)參照圖1，顯示了具有斷裂點(diǎn)區(qū)120的染色體100的示意圖。穿過斷裂點(diǎn)區(qū)120，第一核酸探針121、第二核酸探針123和第三核酸探針122可以配置為與斷裂點(diǎn)區(qū)120雜交。箭頭(124、125、126)是3種例示性探針配置中斷裂點(diǎn)的例示性斷裂點(diǎn)位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針(121、122、123)配置為將斷裂點(diǎn)置于探針121的5’端和探針122的3’端，如箭頭124顯示的。類似地，將斷裂點(diǎn)置于探針123的3’端和探針122的5’端的探針配置由箭頭126顯示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將斷裂點(diǎn)置于探針122的跨度內(nèi)的探針配置由箭頭125顯示。探針可配置為將斷裂點(diǎn)置于探針背景中的數(shù)個(gè)不同位置中。由箭頭(124、125、126)顯示的斷裂點(diǎn)位置僅為目前理解為有用的例示性位置。斷裂點(diǎn)在探針121或探針123內(nèi)的定位也是合理的，盡管它可能不是優(yōu)選的實(shí)施方案。在例示性實(shí)施方案中，探針配置為產(chǎn)生獨(dú)特信號(hào)。因而，圖1顯示具有獨(dú)特陰影的探針(例如探針121用垂直條紋繪出，探針122繪制為實(shí)心黑色，而探針123繪成水平條紋)。在一些實(shí)施方案中，這些探針將配置為包含標(biāo)記物，從而在視覺上將它們彼此區(qū)別開來。不限于具體的檢測辦法，圖2 (A-D)顯示在與樣品的遺傳DNA雜交后檢測獨(dú)特標(biāo)記物的例示性辦法。
[0076]現(xiàn)參照圖2 (A-D)，顯示了對(duì)樣品分析與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的例示性辦法的示意圖。斷裂點(diǎn)區(qū)27繪為被第一核酸探針21、第二核酸探針23和第三核酸探針22跨越。核酸探針是標(biāo)記的，第一標(biāo)記物顯示為菱形221、第二標(biāo)記物顯示為三角形222，而第三標(biāo)記物223顯示為五邊形。當(dāng)探針顯示為具有單一標(biāo)記物時(shí)，此表示僅為象征性的。每種探針實(shí)際上會(huì)用多個(gè)標(biāo)記物標(biāo)記。例如，第一核酸探針21可以包含缺口平移到多個(gè)更小的半抗原化寡核苷酸探針種類的700kb核酸序列。斷裂點(diǎn)的例示性位置顯示為箭頭24、25和26。圖2 (A-D)顯示用于分析樣品的例示性方法，其包括(A)使所述樣品與至少3種探針接觸并建立適合于那些探針與樣品中找到的遺傳DNA雜交的條件，(B)使所述樣品與針對(duì)經(jīng)標(biāo)記探針之一的抗體28接觸，(C)使所述樣品與同多種酶分子綴合的二抗29接觸，并(D)使樣品與檢測試劑接觸，該檢測試劑利用酶促沉積導(dǎo)致可檢測種類29沉積到探針附近。
[0077]再次參照圖2A，在例示性實(shí)施方案中，使樣品與第一核酸探針接觸包括具有配置為與位于斷裂點(diǎn)5’的基因組DNA雜交的第一序列的第一核酸探針21。三種潛在的斷裂點(diǎn)由箭頭24、25和26顯示。不管選擇哪個(gè)斷裂點(diǎn)位置，探針21保持在斷裂點(diǎn)5’。類似地，具有配置為與位于斷裂點(diǎn)3’的基因組DNA雜交的第二序列的第二核酸探針23顯示在每個(gè)斷裂點(diǎn)位置的3’位置。用于分析樣品的方法包括使樣品與第三核酸探針接觸，該第三核酸探針包含配置為與鄰近斷裂點(diǎn)的基因組DNA雜交的第三序列。配置為與鄰近斷裂點(diǎn)的基因組DNA雜交的例示性序列顯示為探針22。如由例示性斷裂點(diǎn)24、25和26指示的,探針22根據(jù)其直接相對(duì)于一側(cè)或另一側(cè)的位置(例如由箭頭24或26顯示)，或由于跨越斷裂點(diǎn)(箭頭25)而臨近該斷裂點(diǎn)。
[0078]現(xiàn)參照圖2B,顯示了使樣品與針對(duì)經(jīng)標(biāo)記探針之一的抗體28接觸的例示性步驟的示圖。例如，經(jīng)半抗原標(biāo)記的探針可通過使樣品與抗半抗原抗體接觸來檢測。圖2(A-D)顯示3種探針的例示性雜交和對(duì)那些探針之一的后續(xù)檢測?？梢允褂眯蜇灮蛲瑫r(shí)的檢測策略來檢測其它探針的雜交。也就是說，可以使特異于標(biāo)記物222和標(biāo)記物223的別的抗體與同抗體28同時(shí)或序貫地與樣品接觸。此外，由圖2C代表的使樣品與與多種酶分子綴合的二抗29接觸的步驟可以同時(shí)或序貫伴有類似步驟以檢測標(biāo)記物222和標(biāo)記物223。以同樣的方式，由圖2D代表的檢測步驟可以同時(shí)或序貫伴有類似的步驟以沉積對(duì)應(yīng)于標(biāo)記物222和標(biāo)記物223的別的可檢測種類。例示性地，用于標(biāo)記每種標(biāo)記物的可檢測種類是獨(dú)特的。
[0079]參照圖1，用不同的模式顯示探針121、122和123。類似地，參照圖2A-2D，用不同形狀顯示標(biāo)記物221、222和223。使用不同的模式和形狀意圖指示可將各種檢測策略用于檢測這些各種探針。因此，可以選擇允許區(qū)別各種探針位置的檢測化學(xué)。在例示性實(shí)施方案中，檢測探針的雜交包括檢測與第一核酸探針關(guān)聯(lián)的第一信號(hào)、與第二核酸探針關(guān)聯(lián)的第二信號(hào)、和與第三核酸探針關(guān)聯(lián)的第`三信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)是獨(dú)特的。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，用不同的可檢測模塊如半抗原來標(biāo)記第一、第二和第三探針，該不同的可檢測模塊允許分辨3種探針中每一種的雜交。
[0080]在本公開內(nèi)容的一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包含與基因組DNA中在染色體斷裂點(diǎn)5’的一部分(即基因組DNA的第一限定區(qū)域)雜交的第一核酸探針集、與在基因組DNA中染色體斷裂點(diǎn)3’的一部分(即基因組DNA的第二限定區(qū)域)雜交的第二核酸探針集、和第三核酸探針集，其包含5’部分和3’部分，且與染色體斷裂點(diǎn)區(qū)附近的5’和3’序列雜交，從而第三核酸探針在缺乏重排的情況下跨越染色體斷裂點(diǎn)區(qū)(即基因組DNA的第三限定區(qū)域)(即與跨越染色體斷裂點(diǎn)區(qū)的限定區(qū)域雜交)。會(huì)領(lǐng)會(huì)針對(duì)斷裂點(diǎn)區(qū)的探針集包含各探針中與在斷裂點(diǎn)5’的基因組DNA雜交的部分(即5’雜交部分)和各探針中與在斷裂點(diǎn)3’的基因組DNA雜交的部分(即3’雜交部分)。在斷裂點(diǎn)在基因內(nèi)的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可以包含與靶序列的5’非編碼區(qū)雜交的第一核酸探針，與靶序列的3’非編碼區(qū)雜交的第二核酸探針，以及第三核酸探針，其包含5’部分和3’部分，且其與臨近靶序列斷裂點(diǎn)的5’和3’序列雜交，從而第三核酸探針在靶序列未重排時(shí)跨越靶序列的斷裂點(diǎn)(即與跨越靶序列斷裂點(diǎn)的限定區(qū)域雜交)。
[0081]在例示性實(shí)施方案中，分析樣品的方法包括易位的檢測?，F(xiàn)參照圖3，顯示了發(fā)生在同一染色體上的易位(例如EML4-ALK融合基因)。現(xiàn)參照圖7，其顯示在不同染色體之間發(fā)生的易位(例如KIF5B-ALK融合或TFG-ALK融合)。再參照圖3，顯示了用于對(duì)樣品分析與斷裂點(diǎn)有關(guān)的染色體易位的例示性方法和系統(tǒng)應(yīng)用。顯示的是染色體210，與ALK基因20有關(guān)的斷裂點(diǎn)區(qū)，和與EML4基因30有關(guān)的斷裂點(diǎn)區(qū)的表示。對(duì)于EML4和ALK基因，基因之間的距離11為約12Mb，ALK位于2p23，而EML4位于2p21?？缭脚cALK基因20有關(guān)的斷裂點(diǎn)區(qū)，3種探針已配置為具有與ALK基因的獨(dú)有區(qū)域互補(bǔ)的序列。第一探針321與斷裂點(diǎn)3’的序列互補(bǔ)，第二探針323與斷裂點(diǎn)5’的序列互補(bǔ)，而第三探針322與跨越斷裂點(diǎn)的序列互補(bǔ)。染色體210以其無易位的野生型顯示于圖3。圖4顯示染色體2410，其包含與ALK-EML4融合基因有關(guān)的倒位。倒位對(duì)探針定位的影響由探針321、322和323的定位指示。也即，染色體易位可通過探針與遺傳DNA雜交的獨(dú)特方式鑒定?，F(xiàn)參照圖5 (A-B),顯示了示意圖，其顯示依照本文中描述的方法，具有野生型基因配置(圖5A)的染色體伸展500可以與具有ALK-EML4融合基因(圖5B)的染色體伸展501區(qū)分的方式。具體地，圖5A對(duì)應(yīng)于圖3中顯示的示意圖；標(biāo)記的順序以321、322和323的次序?，F(xiàn)參照圖6A，顯示了一個(gè)實(shí)施方案，其中用紅色色原體檢測探針321，用藍(lán)色色原體檢測探針322，以及用黃色色原體檢測探針323。因而，如圖6A中繪圖顯示和圖5A中示意性顯示的，探針的次序和取向生成具有沿染色體長度縱向排布的紅色、藍(lán)色和黃色次序和取向的信號(hào)。在圖6A中，紅色、藍(lán)色和黃色信號(hào)用標(biāo)記為“R”(紅色信號(hào))、“B”(藍(lán)色信號(hào))或“Y”(黃色信號(hào))的箭頭指示。類似地，圖5B對(duì)應(yīng)于圖4中顯示的示意圖；標(biāo)記的順序是321、322、323的次序,且322以兩個(gè)分開的簇排布?，F(xiàn)參照圖6B，顯示了一個(gè)實(shí)施方案，其中用紅色色原體檢測探針321，用藍(lán)色色原體檢測探針322，以及用黃色色原體檢測探針323。因而，如圖6B中繪圖顯示和圖5B中示意性顯示的，探針的次序生成具有紅色、藍(lán)色、黃色的次序和取向的信號(hào)，且藍(lán)色以兩個(gè)信號(hào)簇排布，一個(gè) 包含紅色和藍(lán)色，另一個(gè)包含黃色和藍(lán)色。在圖6B中，紅色、藍(lán)色和黃色信號(hào)用標(biāo)記為“R”(紅色信號(hào))、“B”(藍(lán)色信號(hào))或“Y”(黃色信號(hào))的箭頭指示。在圖5B中，可以看到一個(gè)基因 拷貝保持為野生型配置，但第二基因拷貝顯示倒位ISH信號(hào)。該倒位ISH信號(hào)包含跨越斷裂點(diǎn)的探針322的兩分，因此有兩個(gè)信號(hào)(在圖6B和5B中分別顯示為藍(lán)色或黑色點(diǎn))。由于相同長度的探針在兩個(gè)地方定位的實(shí)情，來自兩分探針的信號(hào)可能具有減小的強(qiáng)度。在野生型染色體中，探針配置為彼此在染色體上緊密接近，從而得到緊密成簇的ISH信號(hào)。這可以在圖5A中清楚看到。對(duì)于包含易位的染色體，ISH信號(hào)展現(xiàn)出伸展，如在圖5B中顯示為雙箭頭510的。
[0082]在一個(gè)實(shí)施方案中，分析樣品的方法包括易位的檢測?，F(xiàn)參照圖7，顯示了在不同染色體之間發(fā)生的易位(例如KIF5B-ALK融合或TFG-ALK融合)。顯示染色體210 (與ALK基因20有關(guān)的斷裂點(diǎn)區(qū))的圖示，以及染色體1050和與KIF5B基因52有關(guān)的斷裂點(diǎn)的圖示。依照此易位，染色體210的區(qū)域12與依照箭頭55的染色體1050的區(qū)域512易位。此易位導(dǎo)致圖8中顯示的經(jīng)修飾的染色體，經(jīng)修飾的染色體2810和經(jīng)修飾的染色體10850。穿過與ALK基因20有關(guān)的斷裂點(diǎn)區(qū)，設(shè)計(jì)3種具有與ALK基因的獨(dú)特區(qū)域互補(bǔ)的序列的探針。第一探針321與斷裂點(diǎn)3’的序列互補(bǔ)，第二探針323與斷裂點(diǎn)5’的序列互補(bǔ)，而第三探針322與跨越斷裂點(diǎn)的序列互補(bǔ)。這些跨越與ALK基因20有關(guān)的斷裂點(diǎn)區(qū)的探針顯示于圖3。現(xiàn)參照圖9 (A-B)，該示意圖代表如下的方式，其中依照本文中描述的方法，具有野生型基因配置(圖9A)的染色體伸展900可以與具有KIF5B-ALK融合基因(圖9B)的染色體伸展901區(qū)分開來。具體地，圖9A對(duì)應(yīng)于圖7中顯示的示意圖；標(biāo)記的次序是以沿染色體長度縱向排布的處于緊密分布的簇中的321、322和323的次序和取向。如圖9A中示意性顯示的，探針的次序生成具有第一次序的信號(hào)(例如紅色、黑色和藍(lán)色)。類似地，圖9B對(duì)應(yīng)于在圖8中顯示的示意圖；標(biāo)記的順序是以321、322和323的次序和取向，且322 (例如與藍(lán)色-黑色分開的紅色-黑色)。在圖9B中，可以看到一個(gè)基因拷貝保持為野生型配置，但第二基因拷貝顯示易位的ISH信號(hào)。該易位ISH信號(hào)包含跨越斷裂點(diǎn)的探針322的兩分，因此兩個(gè)信號(hào)(在圖9B中顯示為黑色點(diǎn))以實(shí)質(zhì)性距離分開(由雙箭頭910代表)。由于相同長度的探針在兩個(gè)地方中定位的事實(shí)，來自兩分探針的信號(hào)可能具有減小的強(qiáng)度。在與圖9A中顯示的成簇信號(hào)對(duì)比時(shí)，圖9B中顯示的信號(hào)之間的距離提供了融合基因存在的證據(jù)。
[0083]在例示性實(shí)施方案中，依照本公開內(nèi)容的方法包括檢測探針的雜交，其通過檢測與第一核酸探針關(guān)聯(lián)的第一信號(hào)、與第二核酸探針關(guān)聯(lián)的第二信號(hào)和與第三核酸探針關(guān)聯(lián)的第三信號(hào)進(jìn)行。如圖5 (A-B)和9 (A-B)中顯示的，當(dāng)發(fā)生染色體重排時(shí)，生成信號(hào)，其中來自第三核酸探針的信號(hào)(例如，來自合適標(biāo)記物的比色信號(hào)、熒光測定信號(hào)或發(fā)光信號(hào)，如下文更為詳細(xì)描述的)與來自第一和第二核酸探針的每種信號(hào)分開共定位。如可以看到的，存在包含來自第一核酸探針的信號(hào)和來自第三核酸探針的信號(hào)的獨(dú)特的第一信號(hào)，以及包含來自第二核酸探針的信號(hào)和來自第三核酸探針的信號(hào)的獨(dú)特的第二信號(hào)。根據(jù)重排，第一和第二獨(dú)特信號(hào)可位于屬于相同或不同染色體(取決于重排)的基因組DNA上。在已發(fā)生重排的樣品中，對(duì)應(yīng)于斷裂點(diǎn)區(qū)的探針集是兩分的，其中探針集的分開部分與斷裂點(diǎn)側(cè)翼的5’和3’區(qū)雜交，即探針集的5’雜交部分與重排的靶序列的5’端雜交，而探針集的3’雜交部分與重排的靶序列的3’部分雜交。此雜交模式導(dǎo)致第三探針的兩分(即兩個(gè)分開的信號(hào))。當(dāng)用與前兩種探針不同的顏色標(biāo)記第三種探針時(shí)，極大增強(qiáng)測定法的分辨率和區(qū)分假陽性信號(hào)的能力。
[0084]如還在圖5 (A-B)和9 (A-B)中顯示的，當(dāng)未發(fā)生染色體易位時(shí)，生成信號(hào)，其中來自第三核酸探針的信號(hào)(例如，來自合適標(biāo)記物的比色信號(hào)、熒光測定信號(hào)或發(fā)光信號(hào)，如下文更為詳細(xì)描述的)與來自第一和第二核酸探針的每種信號(hào)共定位。如可以看到的，存在包含來自第一、第二和第三核酸的信號(hào)的單一信號(hào)。在此情況下，第一和第二探針與靶序列的5’和3’區(qū)雜交，而第三探針與靶序列雜交從而其跨越假定的斷裂點(diǎn)(即與跨越假定斷裂點(diǎn)的區(qū)域雜交)。
[0085]在本公開內(nèi)容的一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包含與基因組DNA中在染色體斷裂點(diǎn)5’的一部分(即基因組DNA的第一限定區(qū)域)雜交的第一核酸探針集、與基因組DNA中在染色體斷裂點(diǎn)3’的一部分(即基因組DNA的第二限定區(qū)域)雜交的第二核酸探針集、和第三核酸探針集，所述第三核酸探針集在缺乏重排的情況下與緊鄰染色體斷裂點(diǎn)區(qū)5’的基因組區(qū)域(即基因組DNA的第三限定區(qū)域)雜交，而且在優(yōu)選的實(shí)施方案中與靶重排基因(例如如圖3中繪出的ALK)雜交。在備選的實(shí)施方案中，第三核酸探針集在缺乏重排的情況下與緊鄰染色體斷裂點(diǎn)區(qū)3’的基因組區(qū)域(即基因組DNA的第三限定區(qū)域)雜交，而且在優(yōu)選的實(shí)施方案中與靶重排基因雜交。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，用不同的可檢測模塊如半抗原標(biāo)記第一、第二和第三探針，所述可檢測模塊允許解析3種探針中每一種的雜交。例如，當(dāng)發(fā)生染色體重排時(shí)，生成信號(hào)，其中相比于未重排的基因組DNA，來自第三核酸探針的信號(hào)(例如，來自合適標(biāo)記物的比色信號(hào)、熒光測定信號(hào)或發(fā)光信號(hào)，如下文更為詳細(xì)描述的)以改變的取向與來自5’探針的信號(hào)分開共定位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，改變的取向是倒置的取向，例如如在圖5B中繪出的。如本文中使用的，術(shù)語倒置在用于提述探針雜交模式時(shí)指與在野生型樣品中觀察到的取向相反的取向。在備選的實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)谌结樇谌狈χ嘏诺那闆r下與緊接染色體斷裂點(diǎn)區(qū)3’的基因組區(qū)域雜交時(shí)，來自第三探針集的信號(hào)與3’探針共定位。[0086]在一些實(shí)施方案中，第一、第二和第三核酸探針包含可檢測模塊。在一些實(shí)施方案中，所述可檢測模塊選自下組:半抗原、酶、突光分子、發(fā)光分子和放射性分子。在一些實(shí)施方案中，所述可檢測模塊是半抗原，且第一、第二和第三核酸探針分別用不同的第一、第二和第三半抗原標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，不同的第一、第二和第三半抗原選自下組:生物素、2，4- 二硝基苯基(DNP)、熒光素衍生物、洋地黃毒苷(DIG)、5_硝基-3-吡唑碳酰胺(pyrozolecarbamide)(硝基吡唑，NP)、4，5, - 二甲氧基-2-硝基肉桂酰胺(硝基肉桂酰胺，NCA)、2_ (3，4-二甲氧基苯基)-喹啉-4-碳酰胺(苯基喹諾酮，DPQ)、2，1，3_苯并口惡二唑(benzoxadiazole)-5-碳酰胺(苯并呋咱，BF)、3_羥基_2_喹喔啉碳酰胺(羥基喹喔啉，HQ)、4-( 二甲基氨基)偶氮苯_4’ -磺酰胺(DABSYL)、魚藤酮異0惡唑啉(Rot)、(E) ~2~ (2- (2-氧-2，3- _-氫-1H-苯[b] [I, 4] 二氣雜卓(diazepin) ~4~ 基)苯氧基)乙酰胺(苯并二氮雜卓(benzodiazepine), BD)、7_ ( 二乙基氨基)_2_氧-2H-色烯_3_羧酸(香豆素343，⑶O)、2_乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺(噻唑磺酰胺，TS)和對(duì)甲氧基苯基批唑鬼臼酰胺(methoxyphenylpyrazopodophyllamide) (Podo)。在一些實(shí)施方案中，所述檢測進(jìn)一步包括使所述樣品與分別對(duì)所述第一、第二和第三半抗原特異性的第一、第二和/或第三抗體接觸。在一些實(shí)施方案中，所述第一、第二和第三抗體與酶綴合。在一些實(shí)施方案中，所述酶選自下組:辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶、β -葡糖醛酸糖苷酶和內(nèi)酰胺酶。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使所述樣品與結(jié)合第一、第二和/或第三抗體的抗體接觸。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合第一、第二和/或第三抗體的抗體與酶綴合。在一些實(shí)施方案中，所述酶選自下組:辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖醛酸糖苷酶和β -內(nèi)酰胺酶。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合第一、第二和/或第三抗體的抗體與不同熒光分子綴合。
[0087]在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使樣品與比色檢測試劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使樣品與比色檢測試劑接觸。在一些實(shí)施方案中，所述檢測包括選自下組的方法:比色檢測、熒光測定檢測和放射性測量檢測。在一些實(shí)施方案中，染色體易位的存在由第一核酸探針部分與位于斷裂點(diǎn)5’的基因組DNA的雜交、第二核酸探針部分與位于斷裂點(diǎn)3’的基因組DNA的雜交、以及第三核酸探針5’部分與鄰近斷裂點(diǎn)的5’序列和第三核酸探針3’部分對(duì)鄰近斷裂點(diǎn)的3’序列的分開雜交指示。在一些實(shí)施方案中，染色體易位的缺失由第一核酸探針部分與位于斷裂點(diǎn)5’的基因組DNA的雜交、第二核酸探針部分與位于斷裂點(diǎn)3’的基因組DNA的雜交、以及第三核酸探針5’部分與鄰近斷裂點(diǎn)的5’序列和第三核酸探針3’部分與鄰近斷裂點(diǎn)的3’序列的雜交(從而第三探針與跨越斷裂點(diǎn)的基因組DNA的區(qū)域雜交)指示。[0088]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供用于分析懷疑具有與斷裂點(diǎn)有關(guān)的染色體易位的樣品的系統(tǒng)，其包含:與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交的第一核酸探針，與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交的第二核酸探針，和與DNA中斷裂點(diǎn)附近的一部分雜交的第三核酸探針。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針還包含5’部分和3’部分，其中5’部分與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)5’且附近的一部分雜交，而3’部分與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)3’且附近的一部分雜交，從而第三核酸探針在缺乏重排的情況下與跨越斷裂點(diǎn)的基因組DNA的區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)5’且附近的一部分雜交，從而相比于在缺乏重排的情況下對(duì)第一核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測信號(hào)的取向，在存在重排的情況下對(duì)第一核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測的信號(hào)具有倒置的取向。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)3’且附近的一部分雜交，從而相比于在缺乏重排的情況下對(duì)第二核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測信號(hào)的取向，在存在重排的情況下對(duì)第二核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測的信號(hào)具有倒置的取向。
[0089]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供用于分析懷疑具有與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的樣品的試劑盒，其包含:與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交的第一核酸探針，與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交的第二核酸探針，和與DNA中所述斷裂點(diǎn)附近的一部分雜交的第三核酸探針。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針還包含5’部分和3’部分，其中5’部分與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)5’且附近的一部分雜交，而3’部分與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)3’且附近的一部分雜交，從而使得第三核酸探針在缺乏重排的情況下與跨越斷裂點(diǎn)的基因組DNA的區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)5’且附近的一部分雜交，從而相比于在缺乏重排的情況下對(duì)第一核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測信號(hào)的取向，在存在重排的情況下對(duì)第一核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測的信號(hào)具有倒置的取向。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)3’且附近的一部分雜交，從而相比于在缺乏重排的情況下對(duì)第二核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測信號(hào)的取向，在存在重排的情況下對(duì)第二核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測的信號(hào)具有倒置的取向。
[0090]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供用于診斷與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位有關(guān)疾病的方法，其包括:`
[0091]提供來自懷疑患有與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位有關(guān)疾病的患者的樣品，并提供與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交的第一核酸探針，與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交的第二核酸探針，和與DNA中所述斷裂點(diǎn)附近的一部分雜交的第三核酸探針；將探針與樣品中的基因組DNA雜交；檢測探針與樣品中基因組DNA的雜交；利用來自該檢測的結(jié)果來提供對(duì)該患者中疾病的診斷。
[0092]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供用于對(duì)患有與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位有關(guān)疾病的患者預(yù)測結(jié)果的方法，其包括:提供來自懷疑患有與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位有關(guān)疾病的患者的樣品，并提供與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交的第一核酸探針，與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交的第二核酸探針，和與DNA中所述斷裂點(diǎn)附近的一部分雜交的第三核酸探針；將探針與樣品中的基因組DNA雜交；檢測探針與樣品中基因組DNA的雜交；利用來自該檢測的結(jié)果來提供與該患者中疾病有關(guān)的預(yù)后。[0093]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供為患有與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位有關(guān)疾病的患者確定療法的方法，其包括:提供來自懷疑患有與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位有關(guān)疾病的患者的樣品，并提供與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交的第一核酸探針，與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交的第二核酸探針，和與DNA中所述斷裂點(diǎn)附近的一部分雜交的第三核酸探針；將探針與樣品中的基因組DNA雜交；檢測探針與樣品中基因組DNA的雜交；利用來自該檢測的結(jié)果來確定用于該患者的治療性處理。
[0094] 在先前描述的兩色分離探針系統(tǒng)中，由于5’和3’分離探針之間的缺口而存在問題。依賴于5’和3’探針信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)成多少角度，即使尚未發(fā)生重排，5’和3’探針信號(hào)可以以2個(gè)分開的探針信號(hào)看到。這是假陽性信號(hào)。本系統(tǒng)通過引入第三探針解決了這些問題，該第三探針生成聯(lián)合前兩種探針的信號(hào)。此系統(tǒng)在重排以同一染色體發(fā)生的情況下(例如倒位)尤其有用，盡管該系統(tǒng)還具有當(dāng)易位發(fā)生在染色體之間時(shí)生成容易閱讀的信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)。各個(gè)實(shí)施方案在下文以更為詳細(xì)描述。
[0095]A.靶核酸探針
[0096]本公開內(nèi)容利用核酸探針。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸探針是與樣品中基因組DNA的限定區(qū)域(即靶核酸序列)結(jié)合或雜交的探針集，如上文描述的。優(yōu)選地，所述核酸探針包含任何合適的核酸，如RNA (核糖核酸)、DNA (脫氧核糖核酸)、LNA (鎖定核酸)、PNA (肽核酸)或其組合，并且可包含標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(如核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸)和核苷酸類似物兩者。
[0097]在一些實(shí)施方案中，所述核酸探針集與期望的靶核酸序列是大于80%互補(bǔ)的，優(yōu)選地與期望的靶核酸序列是大于90%互補(bǔ)的，更優(yōu)選地與期望的靶核酸序列是大于99%互補(bǔ)的，且最優(yōu)選地與期望的靶核酸序列是約100%互補(bǔ)的。一般而言，使用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)踐來完成核酸探針設(shè)計(jì)。例如，一般避免如下的序列，其具有自身互補(bǔ)性，使得所得探針會(huì)自身折疊，或者以對(duì)靶核酸的結(jié)合為代價(jià)彼此雜交。
[0098]在選擇靶探針部分的長度中的一個(gè)考慮是含有靶核酸的樣品的復(fù)雜性。例如，人基因組長度為約3X109個(gè)堿基對(duì)。任何10個(gè)核苷酸序列會(huì)在30億個(gè)堿基對(duì)中以約2，861次的頻度出現(xiàn)。此長度的靶探針部分會(huì)具有較差的與具有人基因組大小的序列的靶物內(nèi)的10個(gè)核苷酸的區(qū)獨(dú)特結(jié)合的機(jī)會(huì)。然而，如果靶序列在3kb質(zhì)粒內(nèi)，這類寡核苷酸可能具有非常合理的獨(dú)特結(jié)合的機(jī)會(huì)。通過此相同的計(jì)算，可以看到具有16個(gè)核苷酸的寡核苷酸(即16聚體)是數(shù)學(xué)上可能在3X109個(gè)堿基對(duì)中出現(xiàn)I次的序列的最小長度。此特異性水平還可由兩種或更多種更短的核酸序列提供，如果它們配置為以協(xié)同性方式結(jié)合結(jié)合的話(即，使得它們僅在兩者或全部結(jié)合至其意圖的靶序列時(shí)才能生成意圖復(fù)合物)，其中所述短序列的組合提供期望的特異性。
[0099]在選擇靶探針部分長度中的第二個(gè)考慮是預(yù)期靶探針部分會(huì)發(fā)揮功能的溫度范圍。平均堿基含量(50%G-C堿基)的16聚體會(huì)具有約41°C的計(jì)算Tm，其取決于探針及其靶物的濃度、反應(yīng)的鹽含量和核苷酸的精確次序等。作為一個(gè)實(shí)際問題，通常選擇較長的靶探針部分以增強(qiáng)雜交的特異性。例如，可以使用長度從20至25個(gè)核苷酸的靶探針部分，因?yàn)樗鼈冊谟糜谟诮咏銽m (在Tm的約5°C內(nèi))的溫度進(jìn)行的反應(yīng)中時(shí)極有可能為特異性的。
[0100]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，考慮這些考慮因素來設(shè)計(jì)核酸探針集，從而靶探針部分會(huì)在用戶限定的合適條件下與靶核酸雜交。[0101]可以手動(dòng)選擇核酸，或在計(jì)算機(jī)執(zhí)行的算法的幫助下選擇核酸，該計(jì)算機(jī)執(zhí)行的算法基于期望的參數(shù)如溫度、長度、GC含量等優(yōu)化引物選擇。經(jīng)由因特網(wǎng)或在個(gè)人計(jì)算機(jī)上使用的大量計(jì)算機(jī)執(zhí)行的算法或程序是可獲得的。例如，為了生成來自靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)的多個(gè)結(jié)合區(qū)，鑒定沒有重復(fù)(或其它不想要的，例如產(chǎn)生背景的)核酸序列的序列區(qū)域，例如手動(dòng)或通過使用計(jì)算機(jī)算法進(jìn)行。在跨越數(shù)個(gè)到數(shù)百個(gè)千堿基的靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)內(nèi)，通常鑒定出大量基本上或完全沒有重復(fù)(或其它不想要的，例如產(chǎn)生背景的) 核酸序列的結(jié)合區(qū)。
[0102]可以通過任何已知的方法合成核酸探針。在一些實(shí)施方案中，將編碼核酸探針的序列克隆到質(zhì)粒表達(dá)載體中。優(yōu)選地，用RNA聚合酶從該載體轉(zhuǎn)錄核酸探針以提供編碼該核酸探針的RNA分子。在一些實(shí)施方案中，所述核酸探針是化學(xué)合成的，例如使用亞磷酰胺(phosphoramidite)類似物進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，通過對(duì)質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增、純化和限制性消化來合成DNA探針以提供編碼靶核酸探針的DNA分子。隨后，可將雙鏈DNA熔解成單鏈以用于雜交方案。在一些實(shí)施方案中，通過不對(duì)稱PCR合成靶核酸探針。在一些實(shí)施方案中，一種引物可以是例如核酸類似物(例如LNA)。此過程生成如下的探針，其具有含有鎖定核苷酸的靶物特異性部分和從標(biāo)準(zhǔn)的dNTP制備的檢測靶物部分。在一些實(shí)施方案中，含LNA的引物含有生物素以便于純化期望的鏈。
[0103]在一些實(shí)施方案中，所述核酸探針包含一個(gè)或多個(gè)可檢測模塊。在一些實(shí)施方案中，可檢測模塊是直接可檢測的，而在其它實(shí)施方案中，可檢測模塊是間接可檢測的。在一些實(shí)施方案中，將可檢測模塊摻入檢測探針中。在一些實(shí)施方案中，可檢測模塊是生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成模塊。在一些實(shí)施方案中，所述可檢測模塊與在檢測探針的合成中使用的核苷酸或核苷酸類似物綴合。例如，經(jīng)由如本領(lǐng)域中已知的化學(xué)合成使用綴合于期望的可檢測模塊的核苷亞磷酰胺來合成檢測探針。
[0104]在一些實(shí)施方案中，間接檢測所述可檢測模塊。在一些實(shí)施方案中，可檢測模塊是結(jié)合分子系統(tǒng)的第一成員，該系統(tǒng)包含第一和第二或第一、第二和第三成員。在這些實(shí)施方案中，將與結(jié)合對(duì)第一成員綴合的核苷酸摻入檢測探針中，優(yōu)選地經(jīng)由使用與結(jié)合對(duì)的第一成員綴合的核苷亞磷酰胺進(jìn)行。然后，使樣品與包含結(jié)合對(duì)的第二成員(即特異性結(jié)合模塊)的特定結(jié)合劑接觸。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的第二成員與信號(hào)生成模塊綴合并用于經(jīng)由對(duì)結(jié)合對(duì)的第一成員的結(jié)合來檢測該檢測探針。在其它實(shí)施方案中，使樣品與結(jié)合第二結(jié)合成員的第三結(jié)合成員接觸。在這些實(shí)施方案中，第三結(jié)合成員與信號(hào)生成模塊綴合。合適的結(jié)合分子系統(tǒng)的例子包括但不限于親合素、生物素、半抗原、抗半抗原抗體和抗-抗體抗體及其組合。例如，在一些實(shí)施方案中，檢測探針的可檢測模塊部分包含一個(gè)或多個(gè)半抗原化的核苷酸。通過使用抗半抗原抗體和與信號(hào)生成模塊綴合的抗_(抗半抗原抗體)抗體來檢測這些半抗原化的核苷酸。
[0105]因而，在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供包含與結(jié)合分子系統(tǒng)的第一成員綴合的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核酸探針。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合分子系統(tǒng)的第一成員是半抗原。在一些實(shí)施方案中，檢測探針的可檢測模塊部分是核酸分子，其摻入共價(jià)附著半抗原分子(如硝基-芳香族化合物(例如二硝基苯基(DNP))、生物素、熒光素、洋地黃毒苷等)的dNTP。將半抗原和其它標(biāo)記物與dNTP綴合(例如，以幫助摻入經(jīng)標(biāo)記的探針中)的方法是本領(lǐng)域中公知的。對(duì)于規(guī)程的例子，參見例如美國專利N0.5，258，507、4，772，691、5，328，824和4，711，955。實(shí)際上，大量經(jīng)標(biāo)記的dNTP是可購自例如Invitrogen DetectionTechnologies (Molecular Probes, Eugene, Oreg.)。標(biāo)記物可在 dNTP 上的任何位置如憐酸根(例如α、β或Y磷酸根)或糖處直接或間接附接dNTP。
[0106]多種半抗原可用在核酸探針中。這類半抗原包括但不限于吡唑，特別是硝基吡唑；硝基苯基化合物；苯并呋咱；三萜；尿素和硫脲，特別是苯基脲，且甚至更特別地是苯基硫脲；魚藤酮和魚藤酮衍生物,本文中也稱為魚藤酮類化合物(rotenoid) ;口悉唑(oxazole)和噻唑，特別是P惡唑和噻唑磺酰胺；香豆素和香豆素衍生物；環(huán)木脂體，其以鬼白毒素(Podophyllotoxin)和鬼白毒素衍生物例示；以及其組合。半抗原的特定例子包括但不限于2，4- 二硝基苯基(DNP)、生物素、熒光素衍生物(FITC、TAMRA, Texas Red等)、洋地黃毒苷(DIG)、5_硝基-3-吡唑碳酰胺(pyrozolecarbamide)(硝基吡唑，NP)、4，5, - 二甲氧基-2-硝基肉桂酰胺(硝基肉桂酰胺，NCA)、2_ (3，4- 二甲氧基苯基)-喹啉-4-碳酰胺(苯基喹諾酮，DPQ)、2，1,3-苯并O惡二唑(benzoxadiazole)-5-碳酰胺(苯并呋咱，BF)、3_輕基-2-喹喔啉碳酰胺(羥基喹喔啉，HQ)、4-( 二甲基氨基)偶氮苯-4’ -磺酰胺(DABSYL)、魚藤酮異口惡唑啉(Rot)、(E)-2-(2-(2-氧-2，3-二氫-1H-苯[b] [1，4] 二氮雜卓_4_基)苯氧基)乙酰胺(苯并二氮雜卓(benzodiazepine), BD)、7_ ( 二乙基氨基)_2_氧-2H-色烯-3-羧酸(香豆素343，⑶O)、2_乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺(噻唑磺酰胺，TS)和對(duì)甲氧基苯基吡唑鬼白酰胺(Podo)。這些半抗原及其在探針中的用途更詳細(xì)記載于共同擁有的申請美國專利公開文本N0.2008/0305497, 2008/0268462和2008/0057513。
[0107]在核酸探針包含半抗原的實(shí)施方案中，優(yōu)選地，結(jié)合分子系統(tǒng)的第二成員是結(jié)合半抗原如抗原結(jié)合分子的分子。合適的抗原結(jié)合分子的例子包括但不限于抗體、免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子(包括例如但不限于包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、抗體片段如F (ab’)2片段、Fab’片段、Fab’-SH片段和Fab片段(如本領(lǐng)域中已知的)、重組抗體片段(如sFv片段、dsFv片段、雙特異性sFv片段、雙特異性dsFv片段、F (ab) ’ 2片段、單鏈Fv蛋白(〃scFv〃)、二硫化物穩(wěn) 定化的Fv蛋白(〃(1亦^)、雙抗體和三抗體(如本領(lǐng)域中已知的)、以及駱駝抗體(參見例如美國專利 N0.6，015，695; 6, 005，079-5，874，541; 5, 840，526; 5, 800，988和5，759，808)。在一些實(shí)施方案中，生成可檢測信號(hào)的可檢測模塊共價(jià)地或通過其他方式附接于抗原結(jié)合分子。合適的第二結(jié)合對(duì)成員的例子包括但不限于與生成可檢測信號(hào)的可檢測模塊綴合的抗-DNP、抗生物素、抗-FITC、抗-DIG、抗-NP、抗-NCA、抗-DPQ、抗-BF、抗-HQ、抗-DABSYL、抗-Rot、抗-BD、抗-CD0、抗-TS和抗-Podo抗體。在別的實(shí)施方案中，結(jié)合分子系統(tǒng)的第二成員是不包含可檢測模塊的抗半抗原一抗。在這些實(shí)施方案中，結(jié)合分子系統(tǒng)的第三成員是包含生成信號(hào)的可檢測模塊(用于生成可檢測信號(hào))的二抗抗-抗體(如山羊抗小鼠IgG抗體)。
[0108]如上文描述的，檢測探針可以是直接可檢測或間接可檢測的。在一些直接檢測實(shí)施方案中，檢測探針包含生成可檢測信號(hào)的可檢測模塊(例如信號(hào)生成模塊)，而在一些間接檢測實(shí)施方案中，利用包含與信號(hào)生成模塊綴合的結(jié)合分子系統(tǒng)成員(如二抗)的特異性結(jié)合劑，該信號(hào)生成模塊生成利用的可檢測信號(hào)。在這些實(shí)施方案中，可將多種生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成模塊摻入檢測探針中或與結(jié)合對(duì)的成員綴合。
[0109]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過任何已知或尚未發(fā)現(xiàn)的機(jī)制來檢測所述信號(hào)生成模塊，所述機(jī)制包括光子(包括射頻、微波頻率、紅外線頻率、可見光頻率和紫外線頻率光子)的吸收、發(fā)射和/或散射。信號(hào)生成模塊包括有色的、熒光、磷光和發(fā)光的分子和材料、將一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì)以提供可檢測差異(如通過將無色物質(zhì)轉(zhuǎn)化成有色物質(zhì)或反之亦然，或通過生成沉淀物或增加樣品濁度)的催化劑(如酶)、以及順磁性和磁性分子或材料。
[0110]信號(hào)生成模塊的具體的例子包括熒光分子(或熒光染料)。大量熒光染料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以例如從Invitrogen選擇(例如參見The Handbook—AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen DetectionTechnologies, Molecular Probes, Eugene, Oreg.)?？梢愿浇?例如化學(xué)綴合)核酸分子或蛋白質(zhì)如抗原結(jié)合分子的具體熒光團(tuán)的例子包括但不限于4-乙酰氨基-4’-異硫氰酸苗(isothiocyanatostilbene) -2, 2’ 二磺酸、卩丫唳和衍生物如卩丫卩定和卩丫唳異硫氰酸鹽、5-(2’_氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺?；?vinylsulfonyl)苯基]萘酰亞胺(naphthalimide)-3，5 二磺酸鹽 / 酯(Lucifer Yellow VS)、N_(4_ 苯胺基-1-萘基)馬來酰亞胺、鄰氨基苯甲酰胺(anthranilamide)、亮黃(Brilliant Yellow)、香豆素和衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7_氨基-4-三氟甲基香豆素(Coumaran151);焰紅染料(cyanosine) ;4’，6-二脒基-2-苯基Π引哚(DAPI)；5’，5’ ’ - 二漠連苯三酌.(dibromopyrogallol)-諷駄(sulfonephthalein)(漠連苯三酌.紅(Bromopyrogallol Red)) ;7_ 二乙基氨基_3_(4’-異硫氰酸苯基)_4_甲基香豆素；二亞乙基三氨基五乙酸鹽(diethylenetriaminepentaacetate) ;4，4’-二異硫氰酸二氫-芪(stilbene)_2，2’ - 二磺酸；4，4’ - 二異硫氰酸芪_2，2’ - 二磺酸；5_[ 二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯(dansyl chloride)) ;4_(4’- 二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL) ;4_ 二甲基氨基苯基偶氮苯基(phenylazophenyl)-4’-異硫氰酸鹽(DABITC);曙紅和衍生物如曙紅和曙紅異硫氰酸鹽；赤蘚紅(erythrosin)和衍生物如赤蘚紅B和赤蘚紅異硫氰酸鹽；溴乙非啶(ethidium);熒光素和衍生物如5-羧基熒光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪(dichlorotriazin) ~2~ 基)氨基突光素(DTAF)、2’ 7’ - 二甲氧基-4’ 5’ - 二氯-6-羧基熒光素(JOE)、熒光素、熒光素異硫氰酸鹽(FITC)、和QFITC (XRITC) ;2’，7’-二氟熒光素(OREGON GREENTM);熒胺；IR144 ；IR1446 ;孔雀石綠(Malachite Green)異硫氰酸鹽；4~ 甲基傘形酮(umbelIiferone);鄰甲酹酞(orthocresolphthalein);硝基酪氨酸；堿性副品紅；酹紅(Phenol Red) ;B_ 藻紅蛋白；鄰酞二醒(phthaldialdehyde);花(pyrene)和衍生物如花、花丁酸鹽和琥拍酰亞氨基1-花丁酸鹽；反應(yīng)性紅(Reactive Red)4(CibacronTMBrilliant Red3B_A);羅丹明和衍生物如6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺(Iissamine)羅丹明B磺酰氯、羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸鹽、羅丹明綠、磺基羅丹明B、磺基羅丹明101和磺基羅丹明101的磺酰氯衍生物(TexasRed) ;N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA);四甲基羅丹明；四甲基羅丹明異硫氰酸鹽(TRITC);核黃素；玫紅酸(rosolic acid)和鋱螯合物衍生物。
[0111] 其它合適的熒光團(tuán)包括在約617nm處發(fā)射的硫醇反應(yīng)性的銪螯合物(Heyduk和Heyduk, Analyt.Biochem.248:216-27，1997;J.Biol.Chem.274:3315-22，1999)，以及 GFP、麗絲胺.TM.、二乙基氨基香豆素、熒光素氯三嗪(chlorotriazinyl)、萘并熒光素、4，7- 二氯羅丹明和咕噸(xanthene)(如記載于Lee等的美國專利N0.5, 800, 996)及其衍生物。還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它突光團(tuán)，例如那些可購自Invitrogen DetectionTechnologies, Molecular Probes (Eugene, Oreg.)的，且包括 ALEXA FLUORTM 染料系列(例如，如記載于美國專利N0.5，696，157，6，130，101和6，716，979的)、BODIPY染料系列(二吡咯亞甲基二氟化硼(dipyrrometheneborondifluoride)染料,例如如記載于美國專利 N0.4，774，339,5, 187，288,5, 248，782,5, 274，113,5, 338，854,5, 451，663 和 5，433，896的)、級(jí)聯(lián)藍(lán)(Cascade Blue)(美國專利N0.5，132，432中描述的磺化花(sulfonatedpyrene)的胺反應(yīng)性衍生物)和Marina Blue (美國專利N0.5, 830, 912)。
[0112]除了上文描述的熒光染料外，熒光標(biāo)記物可以是熒光納米顆粒，如半導(dǎo)體納米晶體(例如 QDOT NANOCRYSTALS, Life Technologies ;亦參見美國專利 Nos.6，815，064、6，682，596和6，649，138)。半導(dǎo)體納米晶體是具有大小依賴性光學(xué)和/或電學(xué)特性的顯微鏡可見顆粒。當(dāng)用主要能量來源照射半導(dǎo)體納米晶體時(shí)，發(fā)生次級(jí)能量發(fā)射，其頻率對(duì)應(yīng)于在該半導(dǎo)體納米晶體中使用的半導(dǎo)體材料的帶隙。此發(fā)射可被檢測為具有特定波長的有色光或熒光。具有不同光譜屬性的半導(dǎo)體納米晶體記載于例如，美國專利N0.6，602，671。半導(dǎo)體納米晶體可偶聯(lián)至多種生物學(xué)分子(包括dNTP和/或核酸)或底物，其通過記載于例如 Bruchez 等(1998) Science281:2013-6，Chan 等(1998) Science281:2016-8，和美國專利N0.6，274，323 的技術(shù)。
[0113]具有各種組成的半導(dǎo)體納米晶體的形成披露于例如，美國專利N0.6，927，069; 6, 914，256; 6，855，202; 6，709，929; 6，689，338; 6，500，622; 6，306，736 ; 6，225，198; 6，207，392;6，114，038; 6, 048，616; 5，990，479; 5, 690，807; 5, 571，018; 5，505，928; 5, 262，357 和美國專利公開N0.2003/0165951以及PCT公開N0.99/26299 (1999年5月27日公開)。能夠生成半導(dǎo)體納米晶體的分別群體，可基于它們的不同光譜屬性對(duì)其鑒定。例如，能夠生成發(fā)射不同色的光(基于其組成、大小、或大小和組成)的半導(dǎo)體納米晶體。例如，可從Invitrogen獲得發(fā)射不同波長(565nm、655nm、705nm或800nm發(fā)射波長)的光的半導(dǎo)體納米晶體，其適用作本文中公開的探針中的熒光標(biāo)記物。
[0114]其它信號(hào)生成模塊包括，例如放射性同位素(如3H、35S和32P)、金屬螯合物如放射性或順磁性金屬離子如Gd3+的DOTA和DPTA螯合物，以及脂質(zhì)體。
[0115]信號(hào)生成模塊還包括酶，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖醛酸糖苷酶或β -內(nèi)酰胺酶。在可檢測標(biāo)記物包含酶的情況下，色原體、產(chǎn)熒光化合物或產(chǎn)光化合物可與酶組合使用以生成可檢測信號(hào)(大量的此類化合物可購自Life Technologies)。發(fā)色化合物的具體例子包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸鹽(pNPP)、快速紅(fast red)、溴氯吲哚基磷酸鹽(bromochloroindolylphosphate) (BCIP)、硝基藍(lán)四唑(NBT)、BCIP/NBT、快紅、AP橙、AP藍(lán)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2，2’-連氮基-二-[3_ 乙基苯并噻唑啉橫酸鹽(ethylbenzothiazoline sulphonate)](ABTS)、鄰聯(lián)二茴香胺(dianisidine)、4_ 氯萘酌.(chloronaphthol) (4-CN)、硝基苯基-β -D-半乳批喃糖苷(galactopyranoside) (ONPG)、鄰苯二胺(OPD)、5_ 溴 _4_ 氯-3- 口引哚基半乳吡喃糖苷(X-Gal)、甲基傘形基(methylumbelliferyl)β.-D-半乳吡喃糖苷(MU-Gal)、ρ-硝基苯基-a -D-半乳吡喃糖苷(PNP)、5_溴-4-氯-3-吲哚基-.β.-D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(carbazol) (AEC)Wc^I (fuchsin)、碘代硝基四唑(iodonitrotetrazolium) (INT)、四唑藍(lán)和四唑紫。
[0116]或者，酶可用在金相學(xué)檢測方案中。例如，SISH規(guī)程牽涉用于鑒定和定位雜交的基因組靶核酸序列的金相學(xué)檢測方案。金相學(xué)檢測方法包括與水溶性金屬離子和酶的氧化還原非活性底物組合使用酶，如堿性磷酸酶。酶將底物轉(zhuǎn)化成氧化還原活性劑，而氧化還原活性劑還原金屬離子，導(dǎo)致其形成可檢測沉淀物。(參見例如美國專利申請公開文本N0.2005/0100976、PCT公開文本N0.2005/003777和美國專利申請公開文本N0.2004/0265922)。金相學(xué)檢測方法包括使用酶氧化還原酶(如辣根過氧化物酶)以及水溶性金屬離子、氧化劑和還原劑，以再次形成可檢測沉淀物(參見例如美國專利N0.6，670，113)。
[0117]在一些實(shí)施方案中，所述信號(hào)生成模塊是熒光蛋白。熒光蛋白還可以用作載體，或可以與載體偶聯(lián)以便于顯現(xiàn)。例如，綠色熒光蛋白(GFP)最初從水母維多利亞水母(Aequorea victoria)的光發(fā)射器官中分離?？梢酝ㄟ^將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中來原位表達(dá)嵌合GFP融合，并且可通過適宜的靶向信號(hào)來定位到細(xì)胞內(nèi)的特定位置。已從水母GFP成功生成具有藍(lán)色、青色和微黃-綠色發(fā)射的光譜變體，但沒有一種展現(xiàn)出長于529nm的發(fā)射最大值。已從珊瑚綱(Anthozoa)(珊瑚動(dòng)物)分離出GFP樣蛋白，其顯著擴(kuò)展了可用于生物學(xué)應(yīng)用的顏色范圍。存儲(chǔ)在序列數(shù)據(jù)庫中的GFP樣蛋白的家族現(xiàn)包括約30種顯著不同的成員。熒光蛋白指可以經(jīng)由生色團(tuán)的自身催化合成變?yōu)樽园l(fā)熒光性的蛋白質(zhì)。已知在紅色或遠(yuǎn)紅外波長發(fā)熒光的蛋白(紅色熒光蛋白或RFP)。RFP可與其它在更短波長發(fā)熒光的熒光蛋白組合用于多色標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實(shí)驗(yàn)兩者。商品化RFP自兩種野生型GFP樣蛋白衍生。DsRed (drFP583)具有分別在558nm和583nm的激發(fā)和發(fā)射最大值。遠(yuǎn)紅外熒光蛋白通過對(duì)在571nm處吸收的色蛋白的誘變生成。HcRedl (Clontech)具有分別在588nm和618nm處的激發(fā)和發(fā)射最大值。以最長波長發(fā)射突光的突光蛋白(無任何引入的突變)是eqFP611,其從海葵拳頭?？?Entacmaea quadricolor)克隆。該蛋白質(zhì)在559nm吸收且在61 Inm發(fā)射。
[0118]B.探針和探針系統(tǒng)的使用
[0119]本公開內(nèi)容提供使用所公開的探針和探針系統(tǒng)的方法。例如，所述探針可用于檢測和分析祀核酸分子。在一個(gè)例子中，所`述方法包括使一種或多種公開的祀核酸探針與包含核酸分子的樣品在足以允許樣品中的核酸分子與靶核酸探針雜交的條件下接觸。然后，使該樣品與檢測探針在足以允許該檢測探針與靶核酸探針之間雜交的條件下接觸。接著，如上文描述的那樣檢測檢測探針。
[0120]本公開內(nèi)容的探針和探針系統(tǒng)可用于核酸檢測，如原位雜交規(guī)程(例如，熒光原位雜交(FISH)、生色原位雜交(CISH)和銀原位雜交(SISH))?；パa(bǔ)核酸分子之間的雜交經(jīng)由氫鍵鍵合介導(dǎo)，其包括互補(bǔ)核苷酸單元之間的Watson_Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過形成氫鍵配對(duì)的互補(bǔ)核堿基。如果在本公開內(nèi)容的探針的某個(gè)位置處的核苷酸單元能與在DNA或RNA分子(例如靶核酸序列)同一位置處的核苷酸單元?dú)滏I鍵合，那么所述寡核苷酸在該位置處彼此互補(bǔ)。探針和DNA或RNA當(dāng)每分子中充足數(shù)目的相應(yīng)位置被能彼此氫鍵鍵合的核苷酸單元占據(jù)時(shí)是彼此互補(bǔ)的，如此生成可檢測結(jié)合。探針與要特異性可雜交的其靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)不需要是100%互補(bǔ)的。然而，需要充足的互補(bǔ)性以使探針僅或基本上僅與靶核酸序列(當(dāng)該序列存在于復(fù)雜混合物(例如總細(xì)胞DNA或RNA)中時(shí))結(jié)合、形成雙鏈體或雜交。
[0121]原位雜交牽涉使含有在分裂中期或間期染色體制備(如載玻片上安放的細(xì)胞或組織樣品)背景中的靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)的樣品與對(duì)該靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)特異性可雜交或特異性的探針(即上文描述的靶核酸探針)接觸。任選地，預(yù)處理載玻片，例如以除去可以干擾一致雜交的石蠟或其它材料。同時(shí)處理染色體樣品和探針，例如通過將雙鏈核酸加熱以變性進(jìn)行。在一定條件下將探針(在合適的雜交緩沖液中配制)和樣品組合足夠的時(shí)間，所述條件和時(shí)間容許發(fā)生雜交(通常以達(dá)到平衡)。清洗染色體制備物以除去過量的靶核酸探針，并實(shí)施對(duì)染色體靶物的特定標(biāo)記的檢測。依照本公開內(nèi)容的一些實(shí)施方案，通過使檢測探針與靶核酸探針的雜交促進(jìn)檢測。可以通過直接檢測或間接檢測檢測檢測探針。
[0122]例如，在一些直接檢測實(shí)施方案中，用一種或多種熒光化合物標(biāo)記檢測探針，并通過熒光顯微術(shù)或成像來分析樣品。在一些間接的檢測實(shí)施方案中，檢測探針包含一個(gè)或多個(gè)可檢測模塊，其包含結(jié)合系統(tǒng)的第一成員(即半抗原或生物素)，所述第一成員通過使樣品與如上文描述的結(jié)合系統(tǒng)的第二或第二和第三成員接觸來檢測。對(duì)于原位雜交規(guī)程的一般性描述，參見例如美國專利N0.4，888，278。用于熒光原位雜交(FISH)、生色原位雜交(CISH)和銀原位雜交(SISH)的大量規(guī)程是本領(lǐng)域中已知的。例如，用于實(shí)施FISH的規(guī)程記載于美國專利 N0.5，447，841、5，472，842、5，427，932 和例如 Pinkel 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.83:2934-2938，1986;Pinkel 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.85:9138-9142, 1988 和Lichter 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.85:9664-9668，1988。CISH 記載于例如，Tanner 等,Am.J.Pathol.157:1467-1472，2000，和美國專利N0.6，942，970。別的檢測方法在美國專利N0.6，280, 929中提供。用于通過原位雜交檢測病毒的例示性規(guī)程可見于Poddighe等，J.Clin.Pathol.49:M340_M344, 1996。
[0123]大量試劑和檢測方案可以與FISH、CISH和SISH規(guī)程一起使用以改進(jìn)靈敏度、分辨率或其它期望的特性 。在一些實(shí)施方案中，所述檢測探針或特異性結(jié)合劑(如抗體，例如一抗、受體或其它結(jié)合劑)包含能夠?qū)晒馍苫蛏M合物轉(zhuǎn)化成可檢測熒光的、有色的或以其它方式可檢測的信號(hào)(例如，如在SISH中可檢測金屬顆粒的沉積中的)。如上文指示的，酶可以直接或經(jīng)由接頭間接附著相關(guān)探針或檢測試劑。合適的試劑(例如結(jié)合試劑)和化學(xué)(例如接頭和附接化學(xué))的例子記載于美國專利申請公開文本N0.2006/0246524;2006/0246523 和 2010/0136652。
[0124]在其它實(shí)施方案中，在實(shí)施FISH時(shí)可以直接光學(xué)檢測出用熒光團(tuán)(包括熒光染料和半導(dǎo)體納米晶體)標(biāo)記的檢測探針?；蛘撸捎梅菬晒夥肿尤绨肟乖?如以下非限制性例子:生物素、洋地黃毒苷、DNP、和各種σ惡唑、吡唑、噻唑、硝基芳基、苯并呋咱、三萜、尿素、硫脲、魚藤酮、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼白毒素、基于鬼白毒素的化合物及其組合)、配體或其它間接可檢測模塊標(biāo)記檢測探針。然后，可以通過使樣品(例如探針結(jié)合的細(xì)胞或組織樣品)與經(jīng)標(biāo)記的檢測試劑如對(duì)所選半抗原或配體特異性的抗體(或受體，或其它特異性結(jié)合配偶)接觸來檢測用這類非熒光分子標(biāo)記的檢測探針(以及其結(jié)合的靶核酸序列)。檢測試劑可用熒光團(tuán)(例如半導(dǎo)體納米晶體)或用另一種間接可檢測模塊標(biāo)記，或者可與一種或多種別的特異性結(jié)合劑(例如二抗或特異性抗體)接觸，所述別的特異性結(jié)合劑繼而可用熒光團(tuán)標(biāo)記。任選地，可檢測標(biāo)記物直接附接于抗體、受體(或其它特異性結(jié)合劑)。或者，可檢測標(biāo)記物經(jīng)由接頭，如酰肼硫醇(hydrazidethiol)接頭、聚乙二醇接頭或任何其它具有可比反應(yīng)性的柔性附接模塊附接于結(jié)合劑。例如，特異性結(jié)合劑如抗體、受體(或其它抗-配體)、親合素等可經(jīng)由異雙功能性聚亞烴基二醇接頭如異雙功能性聚乙二醇(PEG)接頭用熒光團(tuán)(或其它標(biāo)記物)共價(jià)修飾。異雙功能性接頭組合選自例如下組的兩種不同的反應(yīng)性基團(tuán):羰基反應(yīng)性基團(tuán)、氨基反應(yīng)性基團(tuán)、硫醇反應(yīng)性基團(tuán)和光反應(yīng)性基團(tuán)，其中第一種附接標(biāo)記物而第二種附接特異性結(jié)合劑。
[0125]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，通過適宜地選擇經(jīng)標(biāo)記的檢測探針和/或經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合對(duì)，可以產(chǎn)生多重檢測方案以促進(jìn)對(duì)單個(gè)測定法(例如在單一細(xì)胞或組織樣品上或在超過一個(gè)細(xì)胞或組織樣品上)中多個(gè)靶核酸序列或靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)的多個(gè)部分的檢測。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于靶序列的第一部分的第一檢測探針可用第一半抗原如DIG標(biāo)記，對(duì)應(yīng)于靶核酸序列的第二部分的第二檢測探針可用第二半抗原如DNP標(biāo)記，而對(duì)應(yīng)于靶核酸序列的第三部分的第三檢測探針可用第三半抗原如NP標(biāo)記。在樣品暴露于探針集后，結(jié)合的探針可由結(jié)合系統(tǒng)的第二或第二和第三成員檢測。標(biāo)準(zhǔn)的光或熒光顯微鏡是用于檢測摻入比色或熒光化合物的試劑和探針的便宜工具。
[0126]一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是圖3中所顯示辦法的一個(gè)例子，其顯示用于檢測ALK易位的檢測方案。圖3中的3種探針各自用不同的可檢測模塊，在此例子中為不同半抗原標(biāo)記。針對(duì)靶物的5’非編碼區(qū)的第一核酸探針用DIG標(biāo)記。針對(duì)靶物3’非編碼區(qū)的第二核酸探針用DNP標(biāo)記?？缭郊俣〝嗔腰c(diǎn)的第三核酸探針用NP標(biāo)記。雜交后，3種不同的探針可用不同的信號(hào)生成系統(tǒng)檢測，例如用比色試劑、熒光劑、半導(dǎo)體納米晶體或其它合適的信號(hào)生成模塊檢測。圖6 (A-B)顯示使用比色試劑來生成對(duì)3種探針中每種特異性的信號(hào)。在例示性系統(tǒng)中，序貫地應(yīng)用試劑。然而，用其它系統(tǒng)，在適當(dāng)時(shí)可同時(shí)添加試劑。在一個(gè)例子中，使樣品與小鼠抗NP抗體接觸。然后，使該樣品與與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠抗體接觸。然后，使樣品與用于銀檢測的試劑接觸。這生成第三核酸探針的信號(hào)。然后，使樣品與小鼠抗DIG抗體接觸。接著，使樣品與與堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠抗體接觸。然后，使樣品與用于快速藍(lán)檢測的試劑接觸。這生成第一核酸探針的信號(hào)。然后，使樣品與阻斷堿性磷酸酶活性的試劑接觸。接著，使樣品與家兔抗DNP抗體接觸，接著與同堿性磷酸酶綴合的山羊抗家兔抗體接觸。然后 ，使樣品與用于快速紅檢測的試劑接觸。這生成第二核酸探針的信號(hào)。在這些檢測步驟后，可以通過顯微術(shù)對(duì)樣品分析對(duì)上文描述的3種探針中每種特異性的信號(hào)的同時(shí)顯現(xiàn)?？梢允褂么宿k法產(chǎn)生的所得圖像在圖6 (A-B)中顯示。
[0127]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，可以用上文描述的檢測系統(tǒng)和試劑，以及本領(lǐng)域中已知的其它試劑和檢測系統(tǒng)替代這些例示性試劑。例如，備選的系統(tǒng)可使用直接標(biāo)記的核酸探針、經(jīng)標(biāo)記的第一抗體、或第一和第二抗體的不同組合。用于標(biāo)記探針或抗體的信號(hào)生成模塊可選自例如其它比色試劑、熒光分子、發(fā)光分子和半導(dǎo)體納米晶體。會(huì)領(lǐng)會(huì)有許多用于生成對(duì)所述探針系統(tǒng)中利用的3種探針中每一種特異性的可檢測信號(hào)的不同方案。
[0128]C.靶物
[0129]依照本公開內(nèi)容的靶核酸序列可以是包含涉及染色體易位事件的染色體斷裂點(diǎn)的任何序列。在具體的實(shí)施方案中，所述靶序列是基因組靶序列或基因組子序列，例如來自真核基因組如人基因組。可以生成對(duì)應(yīng)于基本上任何包含獨(dú)特的非重復(fù)DNA的至少一部分的基因組靶序列的靶核酸探針。
[0130]在一些實(shí)施方案中，所述靶核酸分子可以是與疾病有關(guān)(例如關(guān)聯(lián)、原因上牽涉等)的序列。在一些實(shí)施方案中，選擇與疾病或狀況有關(guān)的靶序列，從而雜交的檢測可以用于推斷涉及疾病或狀況的信息(如獲得樣品的受試者的診斷或預(yù)后信息)。在某些實(shí)施方案中，所選靶核酸分子是與新生性疾病(或癌癥)有關(guān)的靶核酸分子。在一些實(shí)施方案中，基因組靶序列是包含與癌癥有關(guān)的染色體易位關(guān)聯(lián)的染色體斷裂點(diǎn)的序列。這類易位的例子包括那些在 Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology (可在萬維網(wǎng)上 atlasgeneticsoncology, org//Anomalies/Anomliste 獲得)中鑒定的。
[0131]靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)可以跨越任何數(shù)目的堿基對(duì)。在一些實(shí)施方案中，所述靶核酸序列跨越至少1000個(gè)堿基對(duì)。在特定的實(shí)施例中，靶核酸序列(例如基因組靶核酸序列)長度為至少10，000、至少50，000、至少100，000、至少150，000、至少250，000或至少500，000個(gè)堿基對(duì)(如IOOkb至600kb、200kb至500kb或300kb至500kb)。在靶核酸序列來自真核基因組(如哺乳動(dòng)物基因組例如人基因組的例子中，靶序列通常代表生物體基因組的小部分(或單個(gè)染色體的小部分)(例如，生物體基因組DNA (或單個(gè)染色體)的小于20%、小于10%、小于5%、小于2%或小于1%)。
[0132]在一些實(shí)施方案中，將自分析探針與靶序列雜交得到的信息用于做出涉及癌癥結(jié)果的診斷或預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，癌癥是非小細(xì)胞肺癌且重排是ALK重排。間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因的致瘤性重排發(fā)生在一些非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中。中斷ALK基因并將其與另一基因融合的染色體重排導(dǎo)致致瘤性ALK融合基因的創(chuàng)建。繼而，這些增強(qiáng)細(xì)胞增殖和存活。在一些實(shí)施方案中，ALK融合基因是ALK-EML4。
[0133]在一些實(shí)施方案中，當(dāng)測定法指示ALK重排時(shí)，根據(jù)ALK重排的存在和類型將所述信息用于為患者選擇治療性處理。在一些實(shí)施方案中，所述治療性性處理是施用ALK抑制劑。ALK抑制劑的例子包括但不限于PF02341066 (Pfizer)。
[0134]D.試劑盒
[0135]在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供至少包含第一、第二和第三核酸探針的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，第一核酸探針與染色體中染色體斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交，第二核酸探針與染色體中染色體斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交，而第三核酸探針包含5’部分和3’部分，并且它們與染色體斷裂點(diǎn)附近的5’和3`’序列雜交，從而第三核酸探針在缺乏易位的情況中跨越染色體斷裂點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，用于原位雜交規(guī)程如FISH、CISH和/或SISH的試劑盒至少包括如本文中描述的第一、第二和第三靶核酸探針。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于與至少一種靶核酸探針一起使用的一種或多種檢測試劑。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于與第一、第二和第三核酸探針一起使用的至少一種特異性結(jié)合劑。因而，試劑盒可包含一種或多種靶核酸探針、一種或多種檢測探針、以及一種或多種特異性結(jié)合劑。
[0136]所述試劑盒還可包含一種或多種用于實(shí)施原位雜交測定法或用于生成探針的試劑。例如，試劑盒可包含至少一種核酸分子(或這類分子的群體)，以及一種或多種緩沖液、經(jīng)標(biāo)記的dNTP、標(biāo)記酶(如聚合酶)、引物、無核酸酶的水、以及用于生成經(jīng)標(biāo)記探針的用法說明書。
[0137]在一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒包含第一、第二和第三核酸探針和一種或多種特異性結(jié)合劑以及用于實(shí)施原位雜交的緩沖液和其它試劑，如石蠟預(yù)處理緩沖液、蛋白酶和蛋白酶緩沖液、預(yù)雜交緩沖液、雜交緩沖液、清洗緩沖液、復(fù)染劑、封固介質(zhì)或其組合。任選地，所述試劑盒還可包含用于評(píng)估探針的雜交和信號(hào)的對(duì)照載玻片。[0138]E.自動(dòng)化[0139]本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，本文中公開的用于使用半抗原綴合物的方法的實(shí)施方案可以是自動(dòng)化的。Ventana Medical Systems, Inc.是許多披露用于實(shí)施自動(dòng)化分析的系統(tǒng)和方法的美國專利的受讓人，所述專利包括美國專利N0.5，650，327,5, 654，200、6，296，809,6, 352，861,6, 827，901 和 6，943，029，以及美國公開的申請 N0.20030211630 和20040052685。可使用各種自動(dòng)化方法進(jìn)行聚合半抗原染色規(guī)程的具體實(shí)施方案。
[0140]關(guān)于例示性工作實(shí)施方案的更多詳情在工作實(shí)施例中提供。
實(shí)施例
[0141]實(shí)施例1
[0142]材料和方法
[0143]ALK三重探針設(shè)計(jì)
[0144]分離原位雜交(ba-1SH)測定法設(shè)計(jì)為評(píng)估ALK基因基因座的重排(ALK-EML4融合)。生成3種探針以與ALK基因的相鄰著絲粒區(qū)(770kb)和端粒區(qū)(683kb)以及ALK基因區(qū)(728Kb)雜交(圖1)。用NP半抗原標(biāo)記ALK基因探針，用DIG半抗原標(biāo)記5’ ALK探針，而用DNP半抗原標(biāo)記3’ ALK探針。
[0145]自動(dòng)化明視野分離原位雜交方案
[0146]所有針對(duì)明視野原位雜交ALK基因ba-1SH測定法的優(yōu)化和性能評(píng)估均用BenchMark? XT 自動(dòng)化載玻片處理系統(tǒng)(Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ)
進(jìn)行。創(chuàng)建ba-1SH儀軟件，從而可以不中斷進(jìn)行從烘烤到復(fù)染色的所有步驟。將載玻片在儀器上于65°C烘烤20分鐘以熔解石臘,接著是液體蓋玻片(Liquid Coverslip) (VentanaMedical Systems, Inc.)啟動(dòng)的 EZ 制備(Ventana Medical Systems, Inc.)去石臘化步驟。通過用細(xì)胞條件化2(酸性pH檸檬酸鹽緩沖液,Ventana Medical Systems, Inc.)的熱處理與用ISH蛋白酶2或ISH蛋白酶3 (Ventana Medical Systems, Inc.)的組織消化的組合來恢復(fù)DNA靶物。由于臨床樣品的不同組織固定和處理?xiàng)l件，對(duì)每份組織樣品確定適宜的蛋白酶消化時(shí)間。將5’和3’ ALK和ALK探針的混合物與Ventana雜交緩沖液中的人胎盤DNA(2mg/ml)—起配制。將探針和靶DNA在85°C共變性20分鐘，并在44°C進(jìn)行雜交達(dá)5小時(shí)。嚴(yán)格性清洗步驟在72°C用2X SSC (Ventana Medical Systems, Inc.)進(jìn)行。ISH信號(hào)檢測的順序如下實(shí)施:即I)基于辣根過氧化物酶(HRP)的銀檢測；2)基于堿性磷酸酶(AP)的藍(lán)色檢測；和3)基于AP的紅色檢測。用小鼠抗NP抗體接著是綴合有HRP的山羊抗小鼠抗體檢測NP半抗原。用乙酸銀、氫醌和H202 (ultraView SISH Detection Kit, VentanaMedical Systems, Inc.)著色HRP酶。用小鼠抗DIG抗體標(biāo)記DIG半抗原,將抗DIG抗體與綴合有AP的山羊抗小鼠抗體起反應(yīng)，并用快速藍(lán)色檢測著色AP酶。然后，將AP酶用雜交緩沖液在37°C變性30分鐘。在用2X SSC清洗載玻片后，實(shí)施第三次ISH檢測。用家兔抗DNP抗體標(biāo)記DNP半抗原，將DNP抗體與綴合有AP的山羊抗家兔抗體起反應(yīng)，并用快速紅色檢測(ultraView Red ISH Detection Kit, Ventana Medical Systems, Inc.)著色AP酶。所有載玻片均用蘇木精I(xiàn)I (Ventana Medical Systems, Inc.)和涂藍(lán)試劑(BluingReagentXVentana Medical Systems, Inc.)復(fù)染色。將復(fù)染色后的載玻片用含DAWN?(Proctor&Gamble Company, Cincinnati, OH)的蒸懼水漂洗以清潔載玻片。最后，將風(fēng)干的載玻片用TisSUe-TekA)膜蓋片機(jī)(Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan)蓋上蓋玻片。
[0147]實(shí)施例2
[0148]以下實(shí)施例描述了用于用三色分離探針系統(tǒng)來分析ALK重排的方法。將載玻片在儀器上于65°C烘烤20分鐘以熔解石蠟，接著是液體蓋玻片(Ventana MedicalSystems, Inc.)啟動(dòng)的 EZ 制備(Ventana Medical Systems, Inc.)去石臘化步驟。通過用基于檸檬酸鹽緩沖液的祀物恢復(fù)溶液CC2 (Ventana Medical Systems, Inc.)的熱處理與用ISH蛋白酶3(Ventana Medical Systems, Inc.)的組織消化的組合來恢復(fù)DNA革巴物。由于臨床樣品的不同組織固定和處理?xiàng)l件，對(duì)每份組織樣品確定適宜的蛋白酶消化時(shí)間。將3種ALK探針的混合物(經(jīng)DNP標(biāo)記的5’ ALK探針、經(jīng)熒光素標(biāo)記的內(nèi)部ALK探針和經(jīng)DIG標(biāo)記的3’ ALK探針，各12 μ g/ml)與Ventana雜交緩沖液中的魚DNA —起配制。將探針和靶DNA在85°C共變性20分鐘，并在44°C進(jìn)行雜交達(dá)5小時(shí)。嚴(yán)格性清洗步驟在72°C用2XSSC (Ventana Medical Systems, Inc.)進(jìn)行。在與小鼠抗突光素抗體，接著是綴合有HRP的山羊抗小鼠抗體一起溫育后，用DAB檢測顯現(xiàn)經(jīng)熒光素標(biāo)記的內(nèi)部ALK探針。5’ ALK探針上的DNP半抗原用家兔抗DNP抗體標(biāo)記，并將該抗DNP抗體與綴合有AP的山羊抗家兔抗體起反應(yīng)，并用快速藍(lán)色檢測著色AP酶。然后，將AP酶用雜交緩沖液在37°C變性30分鐘。在用2X SSC清洗載玻片后，實(shí)施第三次ISH檢測。3’ALK探針上的DIG半抗原用小鼠抗DIG抗體標(biāo)記，將DIG抗體與綴合有AP的山羊抗小鼠抗體起反應(yīng)，并用快速紅色檢測著色AP酶。所有載玻片均用在水中以1:3稀釋的蘇木精I(xiàn)I (Ventana Medical Systems, Inc.)和涂藍(lán)試劑(Ventan a Medical Systems, Inc.)復(fù)染色。將復(fù)染色后的載玻片用含丨)AWM?(Proctor&Gamble Company, Cincinnati, OH)的蒸懼水漂洗以清潔載玻片。最后，將風(fēng)干的載玻片用Tissue-Tek其膜蓋片機(jī)(Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan)蓋上蓋玻片。分析ba-1SH 載玻片并用裝備有 Nikon 數(shù)碼照相機(jī) DS-Fil (Nikon Instruments Inc.)的 NikonECLPSE90i 顯微鏡(Nikon Instruments Inc.，Melville, NY)照相。結(jié)果提供在圖 6 (A-B)中。
[0149]依照前述實(shí)施例，本公開內(nèi)容提供了用于分析懷疑具有與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的樣品的方法，其包括接觸與基因組DNA中位于斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交的第一核酸探針、與基因組DNA中位于斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交的第二核酸探針、和與DNA中斷裂點(diǎn)附近的一部分雜交的第三核酸探針；建立適合于探針與樣品中基因組DNA雜交的條件；并檢測探針與樣品中基因組DNA的雜交。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針還包含5’部分和3’部分，其中5’部分與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)5’且附近的一部分雜交，而3’部分與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)3’且附近的一部分雜交，從而使得第三核酸探針在缺乏重排的情況下與基因組DNA中跨越斷裂點(diǎn)的區(qū)域雜交。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)5’且附近的一部分雜交，從而相比于在缺乏重排的情況下對(duì)第一核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測信號(hào)的取向，在存在重排的情況下，對(duì)第一核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測的信號(hào)具有倒置的取向。在一些實(shí)施方案中，第三核酸探針與基因組DNA中在斷裂點(diǎn)3’且附近的一部分雜交，從而相比于在缺乏重排的情況下對(duì)第二核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測信號(hào)的取向，在存在重排的情況下，對(duì)第二核酸探針檢測的信號(hào)和對(duì)第三核酸探針檢測的信號(hào)具有倒置的取向。在一些實(shí)施方案中，所述核酸探針包含選自下組的核酸 :RNA、DNA、PNA、LNA及其組合。
【權(quán)利要求】
1.一種用于對(duì)樣品分析與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的方法，其包括: 使所述樣品與下列各項(xiàng)接觸: -第一核酸探針，其包含配置為與位于所述斷裂點(diǎn)5’的基因組DNA雜交的第一序列， -第二核酸探針，其包含配置為與位于所述斷裂點(diǎn)3’的基因組DNA雜交的第二序列，和 -第三核酸探針，其包含配置為與所述斷裂點(diǎn)附近的基因組DNA雜交的第三序列； 建立適合于所述探針與所述樣品中的所述基因組DNA雜交的條件；并檢測所述探針的雜交，其通過檢測與所述第一核酸探針關(guān)聯(lián)的第一信號(hào)、與所述第二核酸探針關(guān)聯(lián)的第二信號(hào)、以及與所述第三核酸探針關(guān)聯(lián)的第三信號(hào)進(jìn)行。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括鑒定樣品次序和取向，所述樣品次序和取向?yàn)樗龅谝恍盘?hào)、所述第二信號(hào)和所述第三信號(hào)的排布。
3.權(quán)利要求2的方法，其進(jìn)一步包括將所述樣品次序和取向與對(duì)照次序和取向比較。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述第三序列配置為與在所述斷裂點(diǎn)5’且附近的基因組DNA雜交，且將所述樣品次序和取向與對(duì)照次序和取向比較包括確立與所述對(duì)照次序和取向相比所述樣品次序和 取向是否包括所述第一信號(hào)和所述第三信號(hào)的倒置。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述第三序列配置為與在所述斷裂點(diǎn)3’且附近的基因組DNA雜交，且將所述樣品次序和取向與對(duì)照次序和取向比較包括確立與所述對(duì)照次序和取向相比所述樣品次序和取向是否包括所述第二信號(hào)和所述第三信號(hào)的倒置。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述第三序列配置為與在所述斷裂點(diǎn)附近且位于所述斷裂點(diǎn)5’和3’兩者的基因組DNA雜交，且將所述樣品次序和取向與對(duì)照次序和取向比較包括確立與所述對(duì)照次序和取向相比所述樣品次序和取向是否包括所述第一信號(hào)或所述第二信號(hào)與所述第三信號(hào)的倒置。
7.權(quán)利要求3的方法，其進(jìn)一步包括通過分析已知缺乏與所述斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的對(duì)照樣品來測定所述對(duì)照次序和取向，包括: 使所述對(duì)照樣品與下列各項(xiàng)接觸: -所述第一核酸探針，其包含所述配置為與位于所述斷裂點(diǎn)5’的基因組DNA雜交的第一序列， -所述第二核酸探針，其包含所述配置為與位于所述斷裂點(diǎn)3’的基因組DNA雜交的第二序列，和 -所述第三核酸探針，其包含所述配置為與所述斷裂點(diǎn)附近的基因組DNA雜交的第三序列； 建立適合于所述探針與所述對(duì)照中的所述基因組DNA雜交的條件；并檢測所述探針的雜交，其通過檢測與所述第一核酸探針關(guān)聯(lián)的第一信號(hào)、與所述第二核酸探針關(guān)聯(lián)的第二信號(hào)、以及與所述第三核酸探針關(guān)聯(lián)的第三信號(hào)進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1的方法，其中核酸探針包含用可檢測模塊標(biāo)記的選自下組的核酸:RNA、DNA、PNA、LNA及其組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述可檢測模塊選自下組:半抗原、酶、熒光分子、發(fā)光分子和放射性分子。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述可檢測模塊是半抗原，且所述第一、第二和第三核酸探針分別用不同的第一、第二和第三半抗原標(biāo)記。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述不同的第一、第二和第三半抗原選自下組:生物素、2，4-二硝基苯基(2，4-dintropheyl) (DNP)、突光素衍生物、洋地黃毒苷(digoxygenin)(DIG)、5_ 硝基-3-批唑碳酸胺(5-nitro-3-pyrozoIecarbamide)(硝基批唑，NP)、4，5，- 二甲氧基-2-硝基肉桂酰胺(4，5, -dimethoxy-2-nitrocinnamide)(硝基肉桂酰胺，NCA)、2_(3，4_ 二甲氧基苯基)-喹啉 _4_ 碳酸胺(2_(3, 4-dimethoxyphenyl) -quinoline-4-carbamide)(苯基喧諾麗，DPQ) >2, 1，3_ 苯并 O,f'二唑 _5_ 碳酸胺(2, I, 3-benzoxadiazole-5-carbamide)(苯并呋咱，BF)、3_ 羥基 _2_ 喹喔啉碳酸胺(3_hydroxy-2-quinoxalinecarbamide)(羥基喹喔啉，HQ)、4_( 二甲基氨基)偶氮苯_4’ _磺酰胺(4-(dimethylamino)azobenzene-4，-sulfonamide) (DABSYL)、魚藤酮異 O惡唑啉(rotenone isoxazoline)(Rot)、(E)-2-(2-(2-氧 _2，3_ 二氧-1H-苯并[b] [1，4] 二氣雜卓-4-基)苯氧基)乙酸胺((E)-2-(2-(2-oxo-2, 3-dihydro-lH-benzo[b][I, 4]diazepin-4-yl)phenozy)acetamide)(苯并二氮雜卓,BD)、7_ ( 二乙基氨基)-2-氧-2H-色烯-3-羧酸(7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid)(香?素 343, CDO)、2_ 乙酸氛基 _4_ 甲基-5-喔唑橫酸胺(2-acetamido-4-methyl-5_thiazolesulfonamide)(噻唑橫酸胺，TS)和對(duì)甲氧基苯基吡唑鬼曰酸胺(p-methoxyphenylpyrazopodophyllamide) (Podo)。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述檢測進(jìn)一步包括使所述樣品分別與對(duì)所述第一、第二和第三半抗原特異性的第一、第二和/或第三抗體接觸。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述檢測進(jìn)一步包括利用抗半抗原識(shí)別和酶促信號(hào)放大來檢測所述第一、第二和第三半抗原。
14.一種用于對(duì)樣品分析與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位的試劑盒，其包含:第一核酸探針，其具有配置為與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)5’的一部分雜交的序列， 第二核酸探針，其具有配置為與基因組DNA中位于所述斷裂點(diǎn)3’的一部分雜交的序列，和 第三核酸探針，其具有配置為與DNA中所述斷裂點(diǎn)附近的一部分雜交的序列。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述第三核酸探針具有配置為與DNA中在所述斷裂點(diǎn)的5’和3’兩側(cè)接近且跨越所述斷裂點(diǎn)的一部分雜交的序列。
16.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述第一、第二和第三核酸探針用第一、第二和第三半抗原半抗原化，所述試劑盒還包含配置為使所述第一、第二和第三半抗原能夠顯現(xiàn)的檢測試劑。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述檢測試劑是配置為使所述第一、第二和第三半抗原能夠明視野顯現(xiàn)的生色檢測試劑。
18.一種用于在患者樣品中診斷與斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的染色體易位有關(guān)的疾病的方法，其包括: 使所述患者樣品與核酸探針系列在適合于所述探針與所述患者樣品中的基因組DNA雜交的條件下接觸，該系列選擇為使得在缺乏與所述斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的所述染色體易位的情況下，該系列依照第一次序和取向與所述患者樣品中的所述基因組DNA雜交，且使得在存在與所述斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的所述染色體易位的情況下，該系列依照不同次序和取向與所述患者樣品雜交，并 檢測與所述患者樣品中的所述基因組DNA雜交的所述核酸探針系列的次序和取向，其中檢測第一次序和取向提供所述患者樣品沒有與所述患者樣品中所述斷裂點(diǎn)關(guān)聯(lián)的所述染色體易位的診斷。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述第一次序和取向是沿染色體縱向排布的3種信號(hào)的預(yù)先確定的順序。
20.權(quán)利要求18的方法`，其中檢測包括使用利用明視野成像顯現(xiàn)的生色檢測試劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103534359SQ201280023177
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月14日
【發(fā)明者】M.法雷爾, T.M.格羅甘, H.尼塔, 張文軍 申請人:文塔納醫(yī)療系統(tǒng)公司