專利名稱：用于質(zhì)譜法檢測的底物和內(nèi)標的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析試劑和基于質(zhì)譜法的方法，所述方法使用這些試劑來同時量化樣品中的蛋白質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明涉及使用質(zhì)譜法量化溶酶體酶活性的多元分析和試劑。
背景技術(shù)：
溶酶體貯積病是一組遺傳病癥，其特征為身體內(nèi)特定酶的缺乏，這導(dǎo)致身體不能分解代謝物質(zhì)。作為一個實例，法布里病是每40，000人之一人中可見的溶酶體貯積病。其是由于α-半乳糖苷酶的缺乏，然后這導(dǎo)致身體不能分解被稱為球形三酰神經(jīng)酰胺(globotriaosylceramide)的特定脂質(zhì)。第二個實例是高歇病，由于不能分解被稱為葡糖神經(jīng)酰胺(也稱為葡糖腦苷脂)的脂物質(zhì)(fatty substance)或脂質(zhì)(lipids)引起的溶酶體貯積病?；加懈咝〉膫€體不能制造葡糖腦苷脂酶，一種分解這些脂質(zhì)所需要的酶。然后，這些脂質(zhì)聚集在肝、脾和骨髓的細胞內(nèi)。第三個實例是蓬珀病，由于被需要用來分解某些被稱為糖原的糖的酶一酸性α-葡糖苷酶一的缺乏引起的溶酶體貯積病。當酶一酸性α -葡糖苷酶一缺少時，糖原在身體內(nèi)的多種組織和器官中聚集。這些疾病大部分是兒科疾病。在大多數(shù)患者中，患者在出生時是正常的，在過后的一些時間里漸進地開始神經(jīng)學(xué)上惡化。在一些患者中，該疾病在成年期表現(xiàn)。臨床表型取決于生化缺陷的類型和嚴重性。這些溶酶體缺陷癥的一些例如蓬珀病和克臘比病，主要表現(xiàn)在嬰兒期。因此，已經(jīng)正在努力開發(fā)在臨床癥狀開始前檢測這些病癥的方法，以便可以開始治療介入。 在過去的十年內(nèi)，檢測代謝性疾病的實驗室已經(jīng)將串聯(lián)質(zhì)譜法引入其新生兒篩查計劃。串聯(lián)質(zhì)譜法在臨床繼續(xù)得到流行，因為該技術(shù)允許在單一樣品中分析多種代謝物。例如，該技術(shù)已被作為檢測在新生兒中遺傳代謝性疾病的常規(guī)臨床實踐，在該技術(shù)中使用干血斑樣品(Schulze A等，Pediatrics 2003; 111: 1399-406) 盡管溶酶體酶活性可使用串聯(lián)質(zhì)譜法量化(Gelb MH 等，Clinical Chemistry 50:10，1785-1796，2004)，但是發(fā)表的分析方法不容易適用于臨床情況，這是因為麻煩的過程和苛刻的分析成分例如氯仿。因此，繼續(xù)需要改進用于檢測溶酶體缺陷癥的方法和組合物。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的實施方式，提供使用質(zhì)譜法檢測酶反應(yīng)的改進的組合物和方法。發(fā)明的底物(substrate)具有A — (B1-B2-B3)的通式，其中A是單糖或二糖，B1是C1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-C2tl、含有N、O或S雜原子的C6-C2tl雜環(huán)；B2是
權(quán)利要求
1.用于酶的質(zhì)譜分析的底物，具有下式 A— (B1-B2-B3)(I) 其中A是D-半乳糖或二糖，B1是C1-C2tl烷基、具有取代的C6-C2tl芳基的C1-C2tl烷基、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；B2是
2.權(quán)利要求I所述的底物，其中A和(B1—B2— B3)由于所述酶的作用分開。
3.權(quán)利要求I所述的底物，其中B1是具有從環(huán)延伸的取代基的C6芳基。
4.權(quán)利要求I所述的底物，其中B1是苯基、硝基苯基或苯酯。
5.權(quán)利要求4所述的底物，其中B2是肉堿基。
6.權(quán)利要求5所述的底物，其中B3是具有以羰基存在的O的取代基的C2-C2tl烷基。
7.權(quán)利要求I所述的底物，其中A和(B1— B2 — B3)部分每一個包括元素的穩(wěn)定二級流行同位素。
8.權(quán)利要求7所述的底物，其中在每一情況中，所述穩(wěn)定二級流行同位素選自2D、13C、15Ν、170、180、31Ρ 和 34So
9.用于酶的質(zhì)譜分析的方法，包括 將所述酶與根據(jù)權(quán)利要求I的式IA — (B1-B2-B3)的所述底物接觸，以在酶反應(yīng)后產(chǎn)生具有切割產(chǎn)物分子量的切割產(chǎn)物(B1—B2 — B3)； 提供所述底物的內(nèi)標(B1—B2 — B3)’，其中(B1—B2 — B3) ’具有與所述切割產(chǎn)物分子量不同的分子量的至少一種穩(wěn)定二級流行同位素，并且(B1—B2 — B3) ’的B^B2和B3如在根據(jù)權(quán)利要求I的式I中所詳述；和 使用質(zhì)譜分析，量化所述切割產(chǎn)物和所述內(nèi)標之間的質(zhì)量/電荷比。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述酶選自酸性α—半乳糖苷酶A和半乳糖腦苷脂α 一半乳糖苷酶。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述(B1—B2— B3)的切割產(chǎn)物與所述(B1—B2 — B3) ’的內(nèi)標結(jié)構(gòu)上相同。
12.—種商業(yè)包裝，其包括根據(jù)權(quán)利要求I的式IA-(B1—B2—B3)的底物作為活性成分；具有與(B1—B2 — B3)不同的穩(wěn)定二級流行同位素分子量的(B1-B2-B3),的內(nèi)標；和用于通過質(zhì)譜分析檢測樣品中的酶活性的說明。
13.用于酶的質(zhì)譜分析的方法，包括 用同位素標記物L(fēng)I標記根據(jù)權(quán)利要求I的式IA-(B1—B2 — B3)的第一底物，以形成第一底物 L1(A)-lHB1 — B2 — B3)； 用同位素標記物L(fēng)2標記根據(jù)權(quán)利要求I的式I A — (B1-B2-B3)的第二底物，以形成第二底物12㈧一12 (B1 — B2 — B3)，其中所述同位素標記物L(fēng)2不同于所述同位素標記物L(fēng)I ；在容器中使所述第一底物u (A)—L1 (B1-B2-B3)和所述第二底物12 (A)—L2 (B1-B2-B3)與所述酶結(jié)合，其中所述第一底物L(fēng)1(A)-WB1—B2—B3)被所述酶切割形成U(A)和1HB1—B2 — B3)，其中所述第二底物12㈧一12 (B1 — B2 — B3)被所述酶切割形成12 (A)和12 (B1 — B2—B3);和 量化所述第一底物u (A)-L1 (B1-B2-B3)和所述第二底物12 (A)-L2 (B1-B2-B3)的減少，和所述u⑷、u (B1-B2-B3)、L2⑷和L2 (B1-B2-B3)的增加。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述容器是檢測試管、檢測小瓶或多孔微量培養(yǎng)板。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述測量通過質(zhì)譜法完成。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述酶選自酸性α-半乳糖苷酶A和半乳糖腦苷脂α -半乳糖苷酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求I所述的底物在制備用于檢測從個體收集的樣品中的溶酶體貯積病的試劑盒中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述檢測包括同時檢測第一和第二種溶酶體貯積病。
19.根據(jù)權(quán)利要求I所述的底物在制備用于檢測從個體收集的樣品中的溶酶體貯積病的分析試劑中的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其中所述檢測包括同時檢測第一和第二種溶酶體貯積病。
全文摘要
本發(fā)明的名稱是用于質(zhì)譜法檢測的底物和內(nèi)標。提供發(fā)明的底物，其包括式A—B1—B2—B3的底物化合物其中A是糖部分；B1是使部分A和底物的剩余結(jié)構(gòu)連接的連接部分；B2含有永久帶電元素例如季銨基團，以便為質(zhì)譜分析增加質(zhì)子親和力和離子化效率；和B3具有賦予靶酶特異性的不同碳長度。也提供的是檢測溶酶體缺陷癥的方法，這通過將樣品與發(fā)明的底物連同內(nèi)標接觸來完成，所述內(nèi)標是被該底物的靶酶切割的產(chǎn)物的同位素標記類似物。
文檔編號C12Q1/34GK102943106SQ201210407558
公開日2013年2月27日 申請日期2007年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者B·賽達 申請人:珀金埃爾默健康科學(xué)股份有限公司