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檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法及其相關(guān)引物和液相芯片的制作方法

文檔序號(hào):607200閱讀:381來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法及其相關(guān)引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領(lǐng)域,具體而言涉及耐多藥結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)。
背景技術(shù)
耐多藥結(jié)核病在全球發(fā)病率高、死亡率高,尤其發(fā)生在亞洲,特別是中國(guó)和印度?,F(xiàn)在對(duì)結(jié)核病進(jìn)行治療一般選擇藥物利福平(RIF)和異煙肼(INH),臨床上只要同時(shí)對(duì)該兩種藥物產(chǎn)生耐藥即被診斷為耐多藥結(jié)核病(MDR, Multi-drug-resistanttuberculosis)。耐多藥結(jié)核病治療十分困難,幾乎成為不治之癥。所以,醫(yī)學(xué)界把嚴(yán)重的耐多藥結(jié)核病等同于癌癥。導(dǎo)致耐多藥結(jié)合病的結(jié)合分支桿菌稱為耐多藥結(jié)核分枝桿菌。在現(xiàn)階段,廣泛采 用傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌,該方法是基于表現(xiàn)型耐藥,在含多種相關(guān)藥物的固體培養(yǎng)基上接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核桿菌,當(dāng)結(jié)核菌能在抑制結(jié)核菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度(MIC)下生長(zhǎng)時(shí)被界定為耐多藥結(jié)核分枝桿菌,該方法培養(yǎng)條件要求高、工作量大、檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢出率低,不能滿足臨床要求。近年來(lái),若干基于PCR的分子診斷技術(shù)逐漸應(yīng)用于耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中,這類方法是通過(guò)檢查的基因突變來(lái)確定耐多藥結(jié)核分枝桿菌。大多數(shù)這類方法以尼龍膜為載體進(jìn)行核酸雜交,該方法載體前處理復(fù)雜,時(shí)間較長(zhǎng),靈敏度不高,結(jié)果需人為判斷,且不易儲(chǔ)存。等位基因特異性PCR,根據(jù)Taq DNA聚合酶不能修復(fù)引物在3’末端的堿基錯(cuò)配這一原理,當(dāng)引物的3’末端核苷酸與等位基因序列完全互補(bǔ)時(shí),模板被擴(kuò)增,該技術(shù)無(wú)法判斷檢測(cè)位點(diǎn)突變成何種堿基,且結(jié)果由核酸電泳判斷,靈敏度低、容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。PCR-線性探針雜交技術(shù)(PCR-LiPA),其原理是核酸的反向雜交法,根據(jù)雜交結(jié)果判定突變存在與否。基于這一原理,目前市場(chǎng)上已經(jīng)有用于檢測(cè)耐藥基因突變的商業(yè)化診斷試劑盒,主要包括 Genotype MTBDR (Hain Lifescience, GmbH, Nehren, Germany)和INNO-LiPA Rif. TB (Innogenetics, Ghent, Belgium)兩種。這類試劑盒基本能有效地檢測(cè)出耐多藥結(jié)核分枝桿菌,但是只能對(duì)rpoB基因進(jìn)行粗篩,其數(shù)據(jù)不易儲(chǔ)存,結(jié)果受主觀因素影響較大,并且實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴,需要精密的實(shí)驗(yàn)儀器,在低收入、高發(fā)病率國(guó)家難以推廣。而且,由于對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌突變位點(diǎn)選擇的原因,這些方法檢測(cè)結(jié)果中假陽(yáng)性和/或假陰性較高。另外上市的還有一種Xpert MTB的檢測(cè)方法采用半巢式實(shí)時(shí)定量PCR方法擴(kuò)增rpoB基因一段特殊的MTB序列,該序列作為一個(gè)探針和利福平耐藥基因決定區(qū)突變的分子信標(biāo)結(jié)合從而得到檢測(cè)結(jié)果。該方法只能檢測(cè)rpoB基因的突變,且由于實(shí)驗(yàn)條件的變化包括實(shí)驗(yàn)儀器及處理?xiàng)l件如溫度時(shí)間等有變化而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定,同時(shí)該方法采用了很多先進(jìn)的硬件設(shè)備,這無(wú)疑大大的增加了檢測(cè)成本,資金的大量投入使得一些發(fā)展中國(guó)家難以承受,另外該儀器也不能用于其他方面檢測(cè)。傳統(tǒng)固相芯片,診斷結(jié)核桿菌耐藥的DNA芯片是固定在玻片、硅片、膜、高分子材料載體上固定DNA探針。為使其固定在載體上,對(duì)探針和載體都需要活化。將樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行熒光標(biāo)記,再與DNA芯片雜交。可以通過(guò)專用激光芯片掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。掃描獲得的圖像,用芯片圖像專用分析軟件分析每個(gè)基因探針位點(diǎn)的雜交信號(hào)的強(qiáng)弱,從而確定結(jié)核分支桿菌目標(biāo)DNA是否發(fā)生突變。由于該檢測(cè)環(huán)境為固相,不利于PCR產(chǎn)物與探針的結(jié)合,且檢測(cè)載體為玻片,體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于微米級(jí)別,當(dāng)樣本數(shù)量多的時(shí)候,則不能有效進(jìn)行高通量的檢測(cè)。另外,雖然該方法檢測(cè)時(shí)間短,但是對(duì)儀器及技術(shù)人員要求高,重復(fù)性差,不能有效進(jìn)行高通量檢測(cè)。因此,本領(lǐng)域中需要一種準(zhǔn)確度高、敏感性高、特異性強(qiáng)、步驟簡(jiǎn)單、快速并且高通量的檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次嘗試發(fā)現(xiàn),通過(guò)檢測(cè)katG315突變型I和/或II、rpoB526突變型I和/或II、rpoB531突變型I和/或II、inhA-15突變位點(diǎn)可以有效檢測(cè)耐多藥結(jié)核分 枝桿菌。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法,本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn),提供了用于檢測(cè)katG315突變型I和/或II、rpoB526突變型I和/或II、rpoB531突變型I和/或II、inhA-15突變位點(diǎn)的特異性引物序列,包括針對(duì)katG315野生型位點(diǎn)的SEQ ID NO. 12,針對(duì)katG315突變型I位點(diǎn)的SEQ ID NO. 13,針對(duì)katG315突變型II位點(diǎn)的SEQ ID NO. 14 ;針對(duì)rpoB526野生型位點(diǎn)的SEQ ID NO. 15,針對(duì)rpoB526突變型I位點(diǎn)的SEQ ID NO. 16,針對(duì)rpoB526突變型II位點(diǎn)的SEQ ID NO. 17 ;針對(duì)rpoB531野生型位點(diǎn)的SEQ ID NO. 18,針對(duì)rpoB531突變型I位點(diǎn)的SEQ ID NO. 19,針對(duì)rpoB531突變型II位點(diǎn)的SEQ ID NO. 20 ;針對(duì)inhA-15野生型的SEQ ID NO. 21,針對(duì)inhA-15突變型的SEQ ID NO. 22。這些該引物序列特異性強(qiáng),能夠準(zhǔn)確地區(qū)分出各種基因型,并且多位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)不存在交叉干擾。另外,本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn),還提供了擴(kuò)增含有katG315、rpoB526、rpoB531、inhA-15位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物,所述擴(kuò)增引物包括針對(duì)katG基因315密碼子位點(diǎn)的SEQ ID NO. 34和SEQ ID NO. 35,針對(duì)rpoB基因526密碼子、rpoB基因531密碼子位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 36 和 SEQ ID NO. 37,針對(duì) inhA 基因啟動(dòng)子-15 位點(diǎn)的 SEQ ID NO. 38 和 SEQID NO. 39。因此,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用上述特異性引物序列和擴(kuò)增引物檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法。在一個(gè)方面中,本發(fā)明提供了一種使用上述特異性引物序列和擴(kuò)增引物檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法,包括以下步驟I)使用擴(kuò)增引物擴(kuò)增一個(gè)樣品的DNA從而得到擴(kuò)增產(chǎn)物,并純化所述擴(kuò)增產(chǎn)物,所述擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO. 34-SEQ ID NO. 39 ;2)用特異性引物對(duì)進(jìn)行上述延伸反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行延伸,所述特異性引物為SEQ IDNO. 12-SEQ ID NO. 22,如果SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 18 不延伸,而SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 22 中至少之一延伸并且 SEQ ID NO. 16,SEQ IDNO. 17、SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20中至少之一延伸,那么所述樣品中存在耐多藥結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的液相芯片,該液相芯片可用于檢測(cè)katG基因315密碼子、rpoB基因526密碼子、rpoB基因531密碼子、inhA基因啟動(dòng)子-15位的野生基因型和已知7種常見的突變型。
在另一方面,本發(fā)明提供了一種檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的液相芯片,包括I)帶標(biāo)簽序列的特異性引物,每個(gè)帶標(biāo)簽序列的特異性引物由5’端的標(biāo)簽序列和3’端的特異性引物序列組成,所述特異性引物序列分別選自SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 22 ;所述標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 11,不同引物序列連接不同標(biāo)簽序列; 2 )分別包被有標(biāo)簽互補(bǔ)序列的微球,所述標(biāo)簽互補(bǔ)序列是I)中的標(biāo)簽序列的互補(bǔ)序列,所述標(biāo)簽互補(bǔ)序列選自SEQ ID NO. 23-SEQ ID NO. 33。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,本發(fā)明的液相芯片還包括3)用于擴(kuò)增含有katG315、rpoB526、rpoB531、inhA-15位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物,所述擴(kuò)增引物包括有針對(duì)katG基因315密碼子位點(diǎn)的SEQ ID NO. 34和SEQ ID NO. 35,針對(duì)rpoB基因526密碼子、rpoB基因531密碼子位點(diǎn)的SEQ IDN0. 36和SEQ ID NO. 37,針對(duì)inhA基因啟動(dòng)子-15位點(diǎn)的SEQ ID NO. 38和SEQ ID NO. 39。本發(fā)明的另一目的是提供一種使用上述液相芯片檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法。在一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種使用上述液相芯片檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法,包括以下步驟I)利于所述擴(kuò)增引物序列擴(kuò)增一個(gè)樣品的DNA從而得到擴(kuò)增產(chǎn)物;2)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸外切酶I和蝦堿性磷酸酶(SAP)進(jìn)行消化處理;3)用所述帶標(biāo)簽序列的特異性引物進(jìn)行延伸反應(yīng),在延伸反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行標(biāo)記;4)將所述包被有標(biāo)簽互補(bǔ)序列的微球與上述延伸反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng),不同標(biāo)簽互補(bǔ)序列包被在可相互區(qū)分的微球上;5)檢測(cè)發(fā)生雜交反應(yīng)的微球;6)通過(guò)區(qū)分微球得到通過(guò)標(biāo)簽序列和標(biāo)簽互補(bǔ)序列相互作用與微球相連的特異性引物的類型,從而確定步驟3)中發(fā)生延伸的特異性引物類型,如果SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 18 不延伸,而SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 22 中至少之一延伸并且 SEQ ID NO. 16,SEQ IDNO. 17、SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20中至少之一延伸,那么所述樣品中存在耐多藥結(jié)核分枝桿菌。例如,在一個(gè)實(shí)施方案中,在上述步驟3)中,摻入生物素標(biāo)記的dCTP,從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個(gè)生物素標(biāo)記;并且在步驟5)中,通過(guò)與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng),然后通過(guò)熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)液相芯片和檢測(cè)方法主要優(yōu)點(diǎn)在于I.準(zhǔn)確度高與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100%;2.敏感性強(qiáng)檢出限最低可能達(dá)到0. 01pg/ml,模板用量少,PCR產(chǎn)物只需2_4 y I即可完成后續(xù)檢測(cè);3.特異性強(qiáng)能夠準(zhǔn)確地區(qū)分出各位點(diǎn)的型別;
4.步驟簡(jiǎn)單一步多重PCR反應(yīng)即可完成4個(gè)具有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增;5.檢測(cè)時(shí)間短檢測(cè)過(guò)程操作時(shí)間為4. 5-5. 5小時(shí),遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于常規(guī)測(cè)序技術(shù)所需的檢測(cè)時(shí)間;6.通量高一張檢測(cè)板可同時(shí)進(jìn)行96個(gè)臨床樣本,并且可以用多個(gè)檢測(cè)板進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。本發(fā)明是分子生物學(xué)和新興的液態(tài)芯片技術(shù)的結(jié)合,通過(guò)對(duì)幾種基因PCR產(chǎn)物的等位基因特異引物延伸(ASPE)方法,結(jié)合不同標(biāo)記的微球,可在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多種耐藥基因型的檢測(cè)。首次將Luminex液態(tài)芯片的方法用于對(duì)結(jié)核桿菌耐多藥的檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
在本發(fā)明中,耐多藥結(jié)核分枝桿菌是指同時(shí)對(duì)利福平(RIF)和異煙肼(INH)產(chǎn)生 耐藥的結(jié)核分枝桿菌。在本發(fā)明中,katG315是katG基因315密碼子的縮寫,rpoB526是rpoB基因526密碼子的縮寫,rpoB531是rpoB基因531密碼子的縮寫,inhA-15是inhA基因啟動(dòng)子-15位的縮寫。在本發(fā)明中,結(jié)核分枝桿菌同時(shí)表現(xiàn)為katG315和inhA-15野生基因型,則為異煙肼敏感結(jié)核分枝桿菌,該兩檢測(cè)點(diǎn)之一或二者表現(xiàn)為突變型,則為異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌;結(jié)核分枝桿菌同時(shí)表現(xiàn)為rpoB526和rpoB531野生基因型,則為利福平敏感結(jié)核分枝桿菌,該兩檢測(cè)點(diǎn)之一或二者表現(xiàn)為突變型,則為利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌katG315和inhA-15之一或二者表現(xiàn)為突變型,并且rpoB526和rpoB531之一或二者表現(xiàn)為突變型,則為耐多藥結(jié)核分枝桿菌。行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示目前耐多藥結(jié)核分枝桿菌中90%是對(duì)利福平(RIF)和/或?qū)Ξ悷熾?INH)產(chǎn)生耐藥的,而我們所選的4個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)幾乎覆蓋了所有耐藥基因的突變。我們?cè)趯?shí)施例中證明同時(shí)檢測(cè)4點(diǎn)與檢測(cè)單點(diǎn)時(shí)數(shù)值差別無(wú)顯著性差異;但在實(shí)施例中,通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了增加檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有干擾。在本發(fā)明中使用的引物序列SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 22為針對(duì)katG315野生型位點(diǎn)的SEQ ID NO. 12,針對(duì)katG315突變型I位點(diǎn)的SEQ ID NO. 13,針對(duì)katG315突變型II位點(diǎn)的SEQ ID NO. 14 ;針對(duì)rpoB526野生型位點(diǎn)的SEQ ID NO. 15,針對(duì)rpoB526突變型I位點(diǎn)的SEQ ID NO. 16,針對(duì)rpoB526突變型II位點(diǎn)的SEQ ID NO. 17 ;針對(duì)rpoB531野生型位點(diǎn)的SEQID NO. 18,針對(duì)rpoB531突變型I位點(diǎn)的SEQ ID NO. 19,針對(duì)rpoB531突變型II位點(diǎn)SEQ ID NO. 20 ;針對(duì)inhA-15野生型的SEQ ID NO. 21,針對(duì)inhA-15突變型的SEQID NO. 22。在本發(fā)明中,擴(kuò)增含有katG315、rpoB526、rpoB531、inhA-15位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物包括針對(duì)katG基因315密碼子位點(diǎn)的SEQ ID NO. 34和SEQ ID NO. 35,針對(duì)rpoB基因526密碼子、rpoB基因531密碼子位點(diǎn)的SEQ ID NO. 36和SEQ ID NO. 37,針對(duì)inhA基因啟動(dòng)子-15位點(diǎn)的SEQ ID NO. 38和SEQ ID NO. 39。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,本發(fā)明中所述的帶標(biāo)簽序列的特異性引物分別選自針對(duì)katG基因315密碼子的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 12組成的序列,由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 13組成的序列,由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 14組成的序列;針對(duì)rpoB基因526密碼子的由序列SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 15組成的序列,由SEQ ID NO. 5和SEQ IDNO. 16組成的序列,和由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 17組成的序列;針對(duì)rpoB基因531密碼子的由序列SEQ ID NO. 7和序列SEQ ID NO. 18組成的序列,由序列SEQ ID NO. 8和序列SEQ ID NO. 19組成的序列,和由序列SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 20組成的序列;針對(duì)inhA基因啟動(dòng)子-15位的由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 21組成的序列及由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 22組成的序列。本發(fā)明中涉及的DNA擴(kuò)增方法、從樣品提取DNA的方法可以是本領(lǐng)域中的任何可用方法。所述方法可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。在本發(fā)明中,使用的液態(tài)芯片(luminex xTAG)的檢測(cè)原理如下待檢測(cè)的目的片段,經(jīng)PCR擴(kuò)增,進(jìn)行等位基因特異性延伸反應(yīng),與特異性熒光編碼微球雜交,加入親和素修飾的藻紅蛋白(SAPE)為熒光報(bào)告分子,經(jīng)雙激光系統(tǒng)檢測(cè)。該方法可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)、多基因型的突變。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,所述液相芯片技術(shù)可以是以微球?yàn)檩d體的懸浮液相芯片技術(shù)。例如,在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,該技術(shù)的核心是把直徑為5. 6iim的聚苯乙烯小球用熒光染色的方法進(jìn)行編碼,通過(guò)調(diào)節(jié)兩種熒光染料的不同配比獲得最多可達(dá)100種具有不同特征熒光譜的微球,然后將每種編碼微球共價(jià)交聯(lián)上針對(duì)特定檢測(cè)物的抗原、抗體或核酸探針等捕獲分子。應(yīng)用時(shí),先把針對(duì)不同檢測(cè)物的編碼微球混合,再加入微量待檢樣本,在懸液中靶分子與微球表面交聯(lián)的捕獲分子發(fā)生特異性結(jié)合,在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以同時(shí)完成最多達(dá)100種不同的檢測(cè)反應(yīng)。最后進(jìn)行分析,儀器通過(guò)兩束激光分別識(shí)別微球的編碼和檢測(cè)微球上報(bào)告分子的突光強(qiáng)度。在本發(fā)明中,標(biāo)簽序列和標(biāo)簽互補(bǔ)序列的選擇原則就是盡量使微球之間、微球與帶標(biāo)簽序列的特異性引物之間不發(fā)生非特異性交聯(lián);并且與物種基因組DNA之間無(wú)相似性。標(biāo)簽序列和標(biāo)簽互補(bǔ)序列的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實(shí)現(xiàn)的。另外,還可以通過(guò)市購(gòu)獲得。例如,微球?yàn)槭惺鄣?,序列是生產(chǎn)商設(shè)計(jì)的,微球表面已經(jīng)包被有標(biāo)簽互補(bǔ)序列,每種微球上的標(biāo)簽互補(bǔ)序列是特異性核苷酸序列,最大程度保證微球之間互不交聯(lián)。帶標(biāo)簽序列的特異性引物上的標(biāo)簽序列與微球上的標(biāo)簽互補(bǔ)序列互補(bǔ),過(guò)程中有一步雜交就是使特異的微球識(shí)別特異的帶標(biāo)簽序列的特異性產(chǎn)物,達(dá)到微球與序列一一對(duì)應(yīng)的目的。在本發(fā)中其中所述標(biāo)簽序列長(zhǎng)度優(yōu)選為10至50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明中,所述標(biāo)簽互補(bǔ)序列與微球連接中間可以沒(méi)有間隔序列,也可以設(shè)有間隔臂序列,間隔臂間隔在微球和標(biāo)簽互補(bǔ)序列之間。例如,所述間隔臂序列可以為5-10個(gè)T?;蛘撸鲩g隔臂序列可以來(lái)自提供微球的供應(yīng)商,例如Luminex公司。本發(fā)明的檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的液相芯片和方法可用于檢測(cè)多種來(lái)源的樣品中耐多藥結(jié)核分枝桿菌基因組,所述樣品可以來(lái)自人或動(dòng)物體的體液,例如痰液、淚液,小便;來(lái)自實(shí)驗(yàn)樣品,例如培養(yǎng)基中的耐多藥結(jié)核分枝桿菌;來(lái)自醫(yī)療用品,例如醫(yī)療物品、血液制品;來(lái)自環(huán)境,例如土壤,水;來(lái)自食品,例如污染的食品,飲料;來(lái)自動(dòng)物制品,例如動(dòng)物飼料。提出以下實(shí)施例,以便使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明,所述實(shí)施例僅出于示例性目的,并非意在限制本公開的范圍。實(shí)施例I檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的液相芯片,包括
一、帶標(biāo)簽序列的特異性引物針對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌相關(guān)位點(diǎn)katG531、rpoB526、rpoB531、inhA-15,分別設(shè)計(jì)特異性的引物序列。帶標(biāo)簽序列的特異性引物由“標(biāo)簽序列+特異性引物序列”組成。帶標(biāo)簽序列的特異性引物序列如下表所示 表I帶標(biāo)簽序列的特異性引物序列(標(biāo)簽序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的液相芯片,包括 1)帶標(biāo)簽序列的特異性引物,每個(gè)帶標(biāo)簽序列的特異性引物由5’端的標(biāo)簽序列和3’端的特異性引物序列組成,所述特異性引物序列選自SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 22,不同引物序列連接不同標(biāo)簽序列,其中所述標(biāo)簽序列長(zhǎng)度優(yōu)選為10至50個(gè)核苷酸; 2)分別包被有標(biāo)簽互補(bǔ)序列的微球,所述標(biāo)簽互補(bǔ)序列是I)中的標(biāo)簽序列的互補(bǔ)序列。
2.權(quán)利要求I的耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)液相芯片,還包括 3)擴(kuò)增引物序列,所述擴(kuò)增引物序列選自SEQID NO. 34-SEQ IDNO. 39。
3.權(quán)利要求I或2的耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)液相芯片,所述標(biāo)簽序列選自SEQIDNO. I-SEQ ID NO. 11,所述標(biāo)簽互補(bǔ)序列選自 SEQID NO. 23-SEQ ID NO. 33。
4.權(quán)利要求3的耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)液相芯片,所述帶標(biāo)簽序列的特異性引物分別選自由 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 12 組成的序列,由 SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 13組成的序列,由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 14組成的序列;由序列SEQ ID NO. 4和SEQ IDNO. 15組成的序列,由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 16組成的序列,由SEQ IDNO. 6和SEQ IDNO. 17組成的序列;由序列SEQ ID NO. 7和序列SEQID NO. 18組成的序列,由序列SEQ IDNO. 8和序列SEQ ID NO. 19組成的序列,由序列SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 20組成的序列;由 SEQID NO. 10 和 SEQ ID NO. 21 組成的序列,由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ IDNO. 22 組成的序列。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)液相芯片,所述標(biāo)簽互補(bǔ)序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列。
6.權(quán)利要求5的結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)液相芯片,其中所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
7.一種耐多藥結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)液相芯片,包括 1)帶標(biāo)簽序列的特異性引物,其選自由 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 12 組成的序列,由 SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 13 組成的序列,由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 14組成的序列;由 SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 15 組成的序列,由 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 16 組成的序列,由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 17組成的序列;由 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 18 組成的序列,由 SEQ ID NO. 8 和 SEQ ID NO. 19 組成的序列,由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 20組成的序列;由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 21 組成的序列,由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 22 組成的序列; 2)分別包被有特異性標(biāo)簽互補(bǔ)序列的微球,所述標(biāo)簽互補(bǔ)序列是I)中的標(biāo)簽序列的互補(bǔ)序列,所述標(biāo)簽互補(bǔ)序列選自SEQ ID NO. 23-SEQID NO. 33,所述的標(biāo)簽互補(bǔ)序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列; 3)擴(kuò)增引物,其選自SEQ ID NO. 34 和 SEQ ID NO. 35,SEQ ID NO. 36 和 SEQ ID NO. 37,SEQ ID NO. 38 和 SEQ ID NO. 39。
8.—種檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法,包括以下步驟 1)使用擴(kuò)增引物擴(kuò)增一個(gè)樣品的DNA從而得到PCR產(chǎn)物,并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,所述擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO. 34-SEQID NO. 39 ; 2)用所述特異性引物對(duì)進(jìn)行上述延伸反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行特異性引物延伸反應(yīng),所述特異性引物為 SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 22,如果 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 15 和 SEQ IDNO. 18 不延伸,而 SEQ IDNO. 13,SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 22 中至少之一延伸并且 SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 19和SEQID NO. 20中至少之一延伸,那么所述樣品存在耐多藥結(jié)核分枝桿菌。
9.一種使用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述液相芯片檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法,包括以下步驟 1)多重PCR擴(kuò)增一個(gè)樣品的DNA; 2)將所述PCR產(chǎn)物用核酸外切酶I和蝦堿性磷酸酶進(jìn)行消化處理; 3)用所述帶標(biāo)簽序列的特異性引物進(jìn)行延伸反應(yīng),在延伸反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行標(biāo)記,例如摻入生物素標(biāo)記的dCTP以使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個(gè)生物素標(biāo)記; 4)將所述包被有標(biāo)簽互補(bǔ)序列的微球與上述延伸反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng),不同標(biāo)簽互補(bǔ)序列包被在可相互區(qū)分的微球上; 5)檢測(cè)發(fā)生雜交反應(yīng)的微球,例如對(duì)于生物素標(biāo)記的情況,在與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)后,通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè); 6)通過(guò)區(qū)分微球得到通過(guò)標(biāo)簽序列和標(biāo)簽互補(bǔ)序列相互作用與微球相連的特異性引物的類型,從而確定步驟3)中發(fā)生延伸的特異性引物類型,如果 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 15 和 SEQ IDNO. 18 不延伸,而 SEQ IDNO. 13,SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 22 中至少之一延伸并且 SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 19和SEQID NO. 20中至少之一延伸,那么所述樣品存在耐多藥結(jié)核分枝桿菌。
10.引物序列,所述引物序列為選自以下的一種或多種SEQIDNO. 12-SEQ ID NO. 22和SEQ ID NO. 34-SEQ ID NO. 39。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的方法及和芯片。本發(fā)明的方法和芯片涉及對(duì)katG315突變型I和/或II、rpoB526突變型I和/或II、rpoB531突變型I和/或II、inhA-15突變型的檢測(cè)。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)上述突變型的引物。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102719553SQ201210245759
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者姜春來(lái), 孔維, 韓明明 申請(qǐng)人:吉林大學(xué), 長(zhǎng)春百克生物科技股份公司
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