一種產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法，屬于生物能源技術(shù)領(lǐng)域以及藻類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明要解決基因工程藍(lán)藻生產(chǎn)乙醇過程中針對乙醇消耗菌的生物污染控制的技術(shù)問題。本發(fā)明的方法是在產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)過程中，通過碳酸氫鈉碳源捕獲培養(yǎng)體系，控制培養(yǎng)過程中pH值逐漸升高至11.0并維持在11.0±0.5的高pH策略，抑制培養(yǎng)過程中乙醇消耗菌的繁殖和乙醇消耗。本發(fā)明將對藍(lán)藻規(guī)?；囵B(yǎng)污染控制體系提供借鑒，對于基因工程藍(lán)藻生產(chǎn)生物液體燃料具有重要意義。
【專利說明】
一種產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物能源技術(shù)領(lǐng)域以及藻類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域;具體涉及一種在產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系中針對乙醇消耗菌的污染防治方法。
【背景技術(shù)】
[0002]全球范圍內(nèi)的環(huán)境污染以及潛在的能源危機(jī)使得研發(fā)可持續(xù)綠色能源補(bǔ)充或替代日益枯竭的石化能源變得更為迫切和重要。作為最早商業(yè)化的生物液體燃料，生物乙醇因其高辛烷值，高汽化熱以及低蒸汽壓的特性被廣泛的接受并應(yīng)用于汽油或石油的替代品或輔助品(ThangaveIu，S.K.，A.Ahmed，and F.N.Ani , Review on b1ethanol asalternative fuel for spark ignit1n engines.RenewabIe&SustainabIe EnergyReviews，2016.56:p.820-835)。目前工業(yè)化生產(chǎn)的生物乙醇絕大多數(shù)是以糧食作物為原料的，從長遠(yuǎn)來看具有原料供應(yīng)不足的局限，不可持續(xù)。以木質(zhì)纖維素為原料的第二代生物乙醇，解決了原料供應(yīng)量的問題，但是其經(jīng)濟(jì)型也受限于原料預(yù)處理以及纖維素酶水解過程的成本和能源消耗。
[0003]藍(lán)藻是一種光合自養(yǎng)微生物，具有結(jié)構(gòu)簡單，光合效率高，生長速率快以及基因工程操作簡便等特性(Gudmundsson，S.and J.Nogales,Cyanobacteria as photosyntheticb1catalysts:a systems b1logy perspective.Molecular B1systems,2015.11(1):p.60-70)。利用藍(lán)藻轉(zhuǎn)化光能和二氧化碳直接生產(chǎn)乙醇是一種潛在的高效可持續(xù)性的乙醇生產(chǎn)路線。通過基因工程改造，藍(lán)藻乙醇產(chǎn)量從0.46g/L提高到5.5g/L，同時生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到212mg/L/day(Gao ZX,Zhao H,Li ZM,Tan XM,Lu XF:Photosynthetic product1n ofethanol from carbon d1xide in genetically engineered cyanobacteria.Energy&Environmental Science 2012,5(12):p.9857-9865)。目前有關(guān)藍(lán)藻乙醇的研究都集中在基因工程菌株的構(gòu)建以及實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的培養(yǎng)條件優(yōu)化，要實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻乙醇的工業(yè)化應(yīng)用，其規(guī)模遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)微生物發(fā)酵，其培養(yǎng)不可能采用與傳統(tǒng)發(fā)酵一樣的無菌體系，實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格培養(yǎng)無菌化及污染控制非常困難，且藻類培養(yǎng)過程中污染的種類和種群數(shù)量會因藻種和培養(yǎng)環(huán)境的不同而不同，甚至還會隨著培養(yǎng)階段不同而發(fā)生變化。因此，敵害污染及其控制是決定大規(guī)模工程化培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。
[0004]在產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻的放大培養(yǎng)的研究過程中，生物污染嚴(yán)重影響了培養(yǎng)過程中的產(chǎn)物乙醇的積累，甚至導(dǎo)致乙醇完全被消耗。因此，要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻大規(guī)模培養(yǎng)體系下高效穩(wěn)定的生產(chǎn)乙醇，建立嚴(yán)格的污染控制體系勢在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)生產(chǎn)乙醇的過程中消耗產(chǎn)物乙醇生物污染的技術(shù)問題;提供了一種產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系中乙醇消耗菌的污染防治方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的方法是在光反應(yīng)器內(nèi)，產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻液體培養(yǎng)過程中，初期采用碳酸氫鈉為主要碳源，當(dāng)培養(yǎng)液pH值隨著藻細(xì)胞的生長及碳源的消耗自然升高至11.0時，控制pH值維持在11.0 ± 0.5，使藻細(xì)胞生長的同時乙醇逐漸積累。
[0007]其中，所述的藍(lán)藻培養(yǎng)體系不經(jīng)滅菌處理。
[0008]所述的碳酸氫鈉初始值為(60-240)mmol/L。
[0009]所述的控制pH值維持在11.0±0.5，是通過CO2氣體通入培養(yǎng)體系調(diào)節(jié)。
[0010]本發(fā)明首次針對基因工程藍(lán)藻胞外產(chǎn)物消耗污染菌提出控制策略，抑制污染水平，恢復(fù)胞外產(chǎn)物生產(chǎn)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)不滅菌培養(yǎng)體系中藍(lán)藻的培養(yǎng)并合成有用化學(xué)品。
[0011]本發(fā)明為控制污染開發(fā)的高pH控制策略所應(yīng)用的碳酸氫鈉碳源捕獲體系是首次應(yīng)用于pH 11.0的環(huán)境中，控制pH的同時，降低碳源捕獲成本提高碳源捕獲效率。
【附圖說明】
[0012]圖1是具體實(shí)施例一室內(nèi)800ml玻璃柱式光反應(yīng)器中對照組5%⑶2條件下基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)過程曲線包括OD730值，pH值和乙醇濃度變化圖；
[0013]圖2是具體實(shí)施例一室內(nèi)800ml玻璃柱式光反應(yīng)器中高pH控制條件下基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)過程曲線包括OD73Q值，pH值和乙醇濃度變化圖；
[0014]圖3是具體實(shí)施例二室外8L薄膜掛袋式光反應(yīng)器中對照組5^^02條件下基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)過程曲線包括OD73Q值，pH值和乙醇濃度變化圖；
[0015]圖4是具體實(shí)施例二室外8L薄膜掛袋式光反應(yīng)器中高pH控制條件下基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)過程曲線包括OD73Q值，pH值和乙醇濃度(高pH控制以及5 % 0)2條件)變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例一:本實(shí)施方式中產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法是在室內(nèi)玻璃柱式光反應(yīng)器中應(yīng)用。
[0017]具體方法為在800ml玻璃柱式光反應(yīng)器中，加入600ml初始碳酸氫鈉濃度180mmol/L的BGlI培養(yǎng)基，不經(jīng)高溫滅菌直接接入基因工程集胞藻，在光強(qiáng)ΙΟΟμΕ Hf2iT1，溫度30°(:條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中PH值隨著藻細(xì)胞利用碳酸氫鈉生長逐漸升高至11.0時，通入0)2氣體調(diào)節(jié)pH值維持在11.0 ± 0.5，藻細(xì)胞生長的同時產(chǎn)物乙醇逐漸積累。
[0018]基因工程藍(lán)藻為集胞藻PCC 6803產(chǎn)乙醇突變株，所述突變株為高政緒等在2012年5月在Energy&Environmental Science雜志上發(fā)表公開的(Gao ZX,Zhao H,Li ZM,Tan XM,Lu XF:Photosynthetic product1n ofethanolfrom carbon d1xide in geneticallyengineered cyanobacteria.Energy&Environmental Science 2012，5(12):9857-9865)0
[0019]以5%C02條件為對照實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)ΙΟΟμΕ m—2s—、溫度30°C，5%⑶2通氣量為0.1vvm。由圖1可知，對照組5 %⑶2條件下，培養(yǎng)過程pH值在中性范圍內(nèi)(6.5_7.5)變化，藻細(xì)胞生長正常，但產(chǎn)物乙醇從培養(yǎng)第I天開始，逐漸下降，第4天就降至0g/L。
[0020]由圖2可知，實(shí)驗(yàn)組初始添加ISOmmol/L碳酸氫鈉，環(huán)境pH值逐漸升高至11.0并通過通入CO2維持在11.0 ± 0.5。高pH環(huán)境下的生長速率低于中性pH，但產(chǎn)物乙醇的積累未受影響，培養(yǎng)終了未發(fā)現(xiàn)被消耗降低的情況，乙醇產(chǎn)量逐漸積累至0.6g/L。這一結(jié)果證明在光強(qiáng)ΙΟΟμΕ m—2S.1，溫度30°C的室內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境下，本實(shí)施例記載的方法能夠有效控制藍(lán)藻液體培養(yǎng)體系中乙醇消耗菌的生長，使整個培養(yǎng)過程中乙醇產(chǎn)量逐漸積累。
[0021]實(shí)施例二:本實(shí)施方式中產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法是在室外薄膜掛袋式光反應(yīng)器中應(yīng)用。
[0022]在8L薄膜掛袋式光反應(yīng)器中，加入6L自來水配制不經(jīng)高溫滅菌的初始碳酸氫鈉濃度為180mmol/L的BGll培養(yǎng)基，接入基因工程藍(lán)藻，在室外自然光強(qiáng)和溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中PH值隨著藻細(xì)胞利用碳酸氫鈉作為碳源生長逐漸升高至11.0時，通入CO2氣體調(diào)節(jié)PH值維持在11.0 ± 0.5，藻細(xì)胞生長的同時產(chǎn)物乙醇逐漸積累。
[0023]基因工程藍(lán)藻和具體實(shí)施例一中相同。
[0024]以5%CO2條件為對照實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件為自然光強(qiáng)和溫度，通氣量為0.lvvm。
[0025]圖3可知，對照組5%⑶2條件下，培養(yǎng)過程pH值在中性范圍內(nèi)(7-8)變化，藻細(xì)胞生長正常，但產(chǎn)物乙醇從培養(yǎng)第5天開始，逐漸下降，最終降至0.07g/L，其中培養(yǎng)液中乙醇為Og/L，乙醇冷凝瓶中0.07g/Lo
[0026]圖4可知，實(shí)驗(yàn)組初始添加ISOmmol/L碳酸氫鈉，培養(yǎng)液環(huán)境pH值隨著藻細(xì)胞利用碳源生長逐漸升高至11.0，通過CO2調(diào)節(jié)維持在11.0 ± 0.5，高pH環(huán)境下的生長速率低于中性PH，但產(chǎn)物乙醇的積累未受影響，培養(yǎng)終了未發(fā)現(xiàn)被消耗降低的情況，乙醇產(chǎn)量逐漸積累至0.95g/L。這一結(jié)果證明在自然光強(qiáng)和自然溫度的室外培養(yǎng)環(huán)境下，本實(shí)施例記載的方法能夠有效控制培養(yǎng)體系中乙醇消耗菌的生長，使整個培養(yǎng)過程中乙醇產(chǎn)量逐漸積累。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法，其特征在于該方法是在光反應(yīng)器內(nèi)，產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)過程中，采用碳酸氫鈉碳源捕獲培養(yǎng)體系，培養(yǎng)液pH值隨著藻細(xì)胞生長及碳源消耗自然升高至11.0并控制在11.0 ± 0.5，使藻細(xì)胞生長的同時乙醇逐漸積累。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法，其特征在于培養(yǎng)體系不經(jīng)過滅菌處理。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法，其特征在于碳酸氫鈉的初始值為(60?240)mmol/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種產(chǎn)乙醇基因工程藍(lán)藻培養(yǎng)體系乙醇消耗菌的污染防治方法，其特征在于通過CO2調(diào)節(jié)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)體系pH維持在11.0 ± 0.5。
【文檔編號】C12P7/06GK105950668SQ201610580672
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】呂雪峰, 朱至, 談曉明, 欒國棟
【申請人】中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所