專利名稱：一種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)epa的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻領(lǐng)域，確切地說是指ー種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法。
背景技術(shù)：
二十碳五烯酸(ΕΡΑ，ω-3)是ー種多不飽和脂肪酸，它具有諸多的生物學(xué)活性，受到人們的廣泛關(guān)注。最早發(fā)現(xiàn)EPA對(duì)人類健康有益的學(xué)者是丹麥的Bang和Dyerbery (1978)，隨后，眾多科學(xué)家對(duì)EPA在營養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)上的功能展開了深入的研究，發(fā)現(xiàn)EPA是前列腺素及衍生物前列環(huán)素、凝血烷、白三烯等激素類化合物的前體，具有抗血栓、降血脂、防止血小板聚結(jié)、舒張血管等功能，并對(duì)人類心腦血疾病、關(guān)節(jié)炎、腎炎等疾病有良好的防治作用，此外，EPA還能促進(jìn)腦細(xì)胞的生長發(fā)育改善大腦機(jī)能，但陸生生物中EPA含量較少，天然EPA通常在海洋生物中較為豐富，如藻類、海生魚類、某些海洋軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物等。目前，市場(chǎng)上的EPA產(chǎn)品主要來源于深海魚油，然而其產(chǎn)量僅能滿足世界需求量的60%，并且從魚油中提取EPA的エ藝復(fù)雜且收率低，獲得的EPA具有明顯的魚腥味，難以滿足人們對(duì)產(chǎn)品的要求。微藻是ー類系統(tǒng)發(fā)生各異、個(gè)體較小、通常為單細(xì)胞或群體的、能進(jìn)行光合作用的水生(或陸生、氣生、共生)低等植物，是自然界起源最早、分布最廣、種類和數(shù)量最多的生物質(zhì)資源。在已分離的產(chǎn)油的微藻中，金藻綱(Chrysophyceae)、黃藻綱(Xanthophyceae)、娃藻綱(Centricae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、綠藻綱(Chlorophyceae)和隱藻綱(Cryptophyceae)中都有富含EPA的藻類，如紫球藻(Porphyridium cruentum)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、眼點(diǎn)擬微綠球藻(Nannochloropsis oculata)、蒜頭藻(Monodus subterraneus)等。目前世界上許多學(xué)者已經(jīng)對(duì)微藻生產(chǎn)EPA進(jìn)行了大量的研究工作，主要涉及藻株篩選、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化、規(guī)模化生產(chǎn)等，然而目前大部分研究工作僅關(guān)注微藻是否具有較高的EPA含量，卻忽略了該藻株的生物量產(chǎn)量，如將其用于EPA的商業(yè)化生產(chǎn)，很難獲得成功。國內(nèi)利用微生物進(jìn)行EPA生產(chǎn)的發(fā)明專利共四項(xiàng)，它們分別是1)產(chǎn)二十碳五烯酸油脂的腐霉及該油脂的發(fā)酵制備方法(余龍江，CN101434908A)，該專利公開了ー種利用腐霉(Pythium sp.)HUST-RBB12菌種進(jìn)行EPA生產(chǎn)的方式，其EPA產(chǎn)量可達(dá)2. lg/L ；2)從緑色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯的方法(劉志禮，CN1544413A)，該專利主要保護(hù)由緑色巴夫藻中提取EPA的化學(xué)工藝；3) —種高產(chǎn)二十碳五烯酸(EPA)的希瓦氏菌基因工程菌(王風(fēng)平，CN101942409A) ；4)用于高水平生產(chǎn)二十碳五烯酸的優(yōu)化解脂耶氏酵母菌株(納幕爾杜邦公司，CN101970638A)。國外對(duì)于微藻生產(chǎn)多不飽和脂肪酸(PUFAs)同樣進(jìn)行了大量的研究工作，目前也有幾家公司已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，如Martek公司利用Nitzschia alba 進(jìn)行 EPA 的生產(chǎn)，Omega Tech 公司利用 Thtanstochytrids sp.進(jìn)行 PUFAs的生產(chǎn)，Nilssin Oilssin Oil mills 公司利用 Crythecodinium cohnii 進(jìn)行 DHA 的生產(chǎn)。從深海魚油中提取或通過微生物厭氧發(fā)酵的方式生產(chǎn)EPA，雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，然而就技木本身而言，仍然存在下述缺點(diǎn)
I)魚油的質(zhì)量會(huì)受魚的種類、捕魚季節(jié)和地點(diǎn)影響；環(huán)境污染、非目的脂肪酸及魚腥味也會(huì)影響魚油的質(zhì)量；另外，魚油還具有加工成本高、易氧化等缺點(diǎn)，隨著漁業(yè)資源的日益緊張，魚油將很難滿 足人們對(duì)EPA的市場(chǎng)需求；2)目前已分離的富含EPA的厭氧微生物種類較少，厭氧微生物生長需要豐富的培養(yǎng)基，且培養(yǎng)過程中容易受到細(xì)菌的污染，需要嚴(yán)格控制無菌化操作，増加了培養(yǎng)成本，新發(fā)現(xiàn)的生產(chǎn)EPA的厭氧微生物需要進(jìn)行詳細(xì)安全性評(píng)價(jià)；國外雖然有部分企業(yè)利用微藻進(jìn)行EPA的生產(chǎn),但其所用藻株(Nitzschia alba)需要進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)エ藝復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供ー種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法，可以實(shí)現(xiàn)EPA的高效生產(chǎn)。為了解決以上的技術(shù)問題，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法，其中類波氏真眼點(diǎn)藻的營養(yǎng)條件(I)NaNO3300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150-750mg/L ； (2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ； (5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3 · 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ；類波氏真眼點(diǎn)藻的生長溫度為15-30°C，光照強(qiáng)度為30-600yE/m2s，類波氏真眼點(diǎn)藻擴(kuò)大培養(yǎng)過程如下I)由藻種保藏室獲得藻種后，將獲得的藻種置于500mL培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)3-5天，然后轉(zhuǎn)移至IOOOml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)靜置培養(yǎng)3-5天，待藻液光密度OD75tl達(dá)到I. 5后，進(jìn)行第二步操作；2)轉(zhuǎn)移“步驟I”中的藻株至柱狀光生物反應(yīng)器中通氣培養(yǎng)，通入氣體中ニ氧化碳濃度為1_5%，培養(yǎng)光強(qiáng)為150-200 μ E/m2s。3)在“步驟2”的基礎(chǔ)上將藻株繼續(xù)進(jìn)行放大培養(yǎng)，并按接種比例20-30%，計(jì)算所
需藻液的量；4)待藻液光密度OD75tl達(dá)到2. 5后,轉(zhuǎn)入室外光生物反應(yīng)器中進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)埴；5)規(guī)?；B(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2_6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為100-600 μ E/m2s,培養(yǎng)周期 8-12 天。優(yōu)選地，在“步驟I”中，由藻種保藏室獲得藻種后，先利用顯微鏡觀察藻株是否被其他微藻、原生動(dòng)物或真菌污染，再進(jìn)行培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)首先，類波氏真眼點(diǎn)藻在正常培養(yǎng)條件下的生物量可達(dá)8. Og/L以上，對(duì)它進(jìn)行脅迫培養(yǎng)后，其總脂含量可占細(xì)胞干重的66% (大多為三酰甘油TAG)，脂肪酸組成分析發(fā)現(xiàn)，類波氏真眼點(diǎn)藻含有占細(xì)胞總脂肪酸含量8. 6%的EPA ；
其次，類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，可以通過改變環(huán)境條件或進(jìn)行相關(guān)基因的定向改造實(shí)現(xiàn)EPA的高產(chǎn)第三，利用光生物反應(yīng)器可以實(shí)現(xiàn)類波氏真眼點(diǎn)藻的規(guī)?；B(yǎng)殖，可以減少季節(jié)和地域限制；第四，從類波氏真眼點(diǎn)藻中提取EPA的エ藝較魚油中提取更為簡單，并且EPA產(chǎn)品
無臭腥味。


圖I類波氏真眼點(diǎn)藻的細(xì)胞形態(tài)；圖2為類波氏真眼點(diǎn)藻的生長曲線；圖3類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞中性脂、糖脂和磷脂含量的時(shí)相變化；圖4為類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞中脂肪酸組成和各組分百分含量。
具體實(shí)施例方式為了本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行闡述。本發(fā)明提供了ー種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法，該微藻拉丁名稱為類波氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatoscf. polyphem),已于2011年9月13日在“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”保藏成功；地址中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心；菌種保藏號(hào)CGMCCNo. 5247。類波氏真眼點(diǎn)藻屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)、真眼點(diǎn)藻目(Eustigmatales)、真眼點(diǎn)藻科(Eustigmataceae)、真眼點(diǎn)藻屬(Eustigmatos),細(xì)胞為球形或近球形，大小通常在10-11 μ m,培養(yǎng)過程中一些細(xì)胞會(huì)達(dá)到20-35 μ m,細(xì)胞中具有一個(gè)相對(duì)較大的、近球形的液泡，其中含有能振動(dòng)的顆粒物和ー個(gè)直徑在3-5 μ m的色素體，它的顏色從灰黃-褐色到紅褐色變化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長會(huì)變大變暗；細(xì)胞中有一周生深裂狀葉綠體；繁殖方式通常形成2個(gè)D形或4個(gè)四方體的似親孢子，或形成8到16個(gè)球形細(xì)胞，藻細(xì)胞主要色素組成為葉綠素a、堇菜黃素、無隔藻黃素、β-類胡蘿卜素。圖I為類波氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatoscf. polyphem)細(xì)胞形態(tài),其中A為對(duì)數(shù)前期的營養(yǎng)細(xì)胞為個(gè)體較大的細(xì)胞，具分裂葉的邊緣葉綠體，細(xì)胞中具明顯的紅色色素區(qū)及可振動(dòng)的顆粒；C為個(gè)體較大的細(xì)胞，色素區(qū)變?yōu)榘导t；D為個(gè)體較大的細(xì)胞，葉綠體片段化，細(xì)胞中積累較多的類胡蘿卜素；E為個(gè)體較大的細(xì)胞，暗紅色素分布整個(gè)細(xì)胞，并有油體形成；F為個(gè)體較大的細(xì)胞，細(xì)胞形成了許多的油體。類波氏真眼點(diǎn)藻在正常培養(yǎng)條件下的生物量可達(dá)8. Og/L以上(圖2)，對(duì)其進(jìn)行脅迫培養(yǎng)后，其總脂含量可占細(xì)胞干重的66%(大多為三酰甘油TAG)(圖3)，進(jìn)行脂肪酸組成分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)EPA含量可占總脂肪酸的8.6% (圖4)，是ー株非常有潛力的EPA生產(chǎn)藻株。通過大量的研究工作，我們提出一種通過氮源及氮濃度的調(diào)控方式，實(shí)現(xiàn)類波氏真眼點(diǎn)藻高產(chǎn)EPA的培養(yǎng)技木。類波氏真眼點(diǎn)藻可以利用的氮源形式有多種，如尿素、硝酸鈉/硝酸鉀、氯化銨等，在這些氮源形式中，尿素對(duì)類波氏真眼點(diǎn)藻的生長最有利，隨后的尿素濃度優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低尿素濃度可以獲得較高的EPA產(chǎn)率，因此我們提出一種較優(yōu)的類波氏真眼點(diǎn)藻培養(yǎng)方案，選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為 100-600 μ E/m2s，培養(yǎng)周期 8-12 天。本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻 生產(chǎn)EPA的方法，其中類波氏真眼點(diǎn)藻的營養(yǎng)條件(I)NaNO3300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150_750mg/L ； (2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ； (5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3 · 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；(12) Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ；類波氏真眼點(diǎn)藻的生長溫度為15-30°C，光照強(qiáng)度為30-600yE/m2s，類波氏真眼點(diǎn)藻擴(kuò)大培養(yǎng)過程如下I)由藻種保藏室獲得藻種后，將獲得的藻種置于500mL培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)3-5天，然后轉(zhuǎn)移至IOOOml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)靜置培養(yǎng)3-5天，待藻液光密度OD75tl達(dá)到I. 5后，進(jìn)行第二步操作；2)轉(zhuǎn)移“步驟I”中的藻株至柱狀光生物反應(yīng)器中通氣培養(yǎng)，通入氣體中ニ氧化碳濃度為1_5%，培養(yǎng)光強(qiáng)為150-200 μ E/m2s。3)在“步驟2”的基礎(chǔ)上將藻株繼續(xù)進(jìn)行放大培養(yǎng)，并按接種比例20-30 %，計(jì)算所
需藻液的量；4)待藻液光密度OD75tl達(dá)到2. 5后，轉(zhuǎn)入室外光生物反應(yīng)器中進(jìn)行規(guī)模化養(yǎng)殖；5)選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2_6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為100-600 μ E/m2s，培養(yǎng)周期8-12天。在“步驟I”中，由藻種保藏室獲得藻種后，先利用顯微鏡觀察藻株是否被其他微藻、原生動(dòng)物或真菌污染，再進(jìn)行培養(yǎng)。通過優(yōu)化培養(yǎng)體系中氮源濃度和光照強(qiáng)度可以實(shí)現(xiàn)EPA的高產(chǎn)，設(shè)置高、低兩種光照強(qiáng)度和三種氮源濃度進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如下表所示不同光強(qiáng)及氮濃度條件下類波氏真眼點(diǎn)藻細(xì)胞的脂肪酸組成表
權(quán)利要求
1.ー種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法，其特征在于，其中 類波氏真眼點(diǎn)藻的營養(yǎng)條件(I)NaNO3 300-1500mg/L 或 NH2-CO-NH2 150-750mg/L ；(2) K2HPO4 · 3H20 20-100mg/L ； (3) MgSO4 · 7H20 50_80mg/L ； (4) CaCl2 · 2H20 30_50mg/L ；(5)NaCO3 10-30mg/L ； (6)FeCl3· 6H20 2_6mg/L ； (7)Citric acid 4_8mg/L ； (8)EDTANa22-5mg/L ； (9) H3BO3 2_4mg/L ; (IO)MnCl2 · 4H20 ト2mg/L ; (I I) ZnSO4 · 7H20 0. 1-0. 3mg/L ；(12) Na2MoO4 · 2H20 0. 2-0. 4mg/L ； (13) Co (NO3)2 · 6H20 0. 02-0. 05mg/L ； (H)CuSO4 · 5H200.06-0. 09mg/L ； 類波氏真眼點(diǎn)藻的生長溫度為15-30°C，光照強(qiáng)度為30-600yE/m2s，類波氏真眼點(diǎn)藻擴(kuò)大培養(yǎng)過程如下 1)由藻種保藏室獲得藻種后，將獲得的藻種置于500mL培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)3-5天，然后轉(zhuǎn)移至IOOOml的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)靜置培養(yǎng)3-5天，待藻液光密度OD75tl達(dá)到I. 5后，進(jìn)行第二步操作； 2)轉(zhuǎn)移“步驟I”中的藻株至柱狀光生物反應(yīng)器中通氣培養(yǎng)，通入氣體中ニ氧化碳濃度為 1_5%，培養(yǎng)光強(qiáng)為 150-200 μ E/m2s。
3)在“步驟2”的基礎(chǔ)上將藻株繼續(xù)進(jìn)行放大培養(yǎng)，并按接種比例20-30%，計(jì)算所需藻液的量； 4)待藻液光密度OD75tl達(dá)到2.5時(shí),轉(zhuǎn)入戶外光生物反應(yīng)器中進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)埴； 5)規(guī)?；B(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為100-600 μ E/m2s,培養(yǎng)周期 8-12 天。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法，其特征在于，在“步驟I”中，由藻種保藏室獲得藻種后，先利用顯微鏡觀察藻株是否被其他微藻、原生動(dòng)物或真菌污染，再進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法，藻株逐步放大培養(yǎng)后，并按接種比例20-30％，計(jì)算所需藻液的量；待藻液光密度OD750達(dá)到2.5時(shí)，轉(zhuǎn)入戶外光生物反應(yīng)器中進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)殖；規(guī)模化養(yǎng)殖選用尿素或硝酸鹽為氮源，氮元素濃度為2-6mM，控制培養(yǎng)光強(qiáng)為100-600μE/m2s，培養(yǎng)周期8-12天。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的利用類波氏真眼點(diǎn)藻生產(chǎn)EPA的方法，可以實(shí)現(xiàn)EPA的高效生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/89GK102618592SQ201210109898
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者萬凌琳, 吳洪, 張成武, 李濤, 李愛芬 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)