專利名稱：一種通用植物總rna提取法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學，具體涉及植物總RNA的提取，純化方法。
背景技術(shù)：
植物不僅是整個地球生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，而且還是人類食物和工業(yè)原材料的重要來源。隨著生活水平的提高，居住環(huán)境日益惡化，有限非再生資源的逐漸耗竭，不同領(lǐng)域的研究人員在分子水平上對植物進行著深入研究，以解決當前人類所面臨的糧食、環(huán)境和能源問題。由此，各種形式的植物分子生物學研究在世界范圍內(nèi)展開。RNA是植物體內(nèi)重要生物大分子之一，參與植物結(jié)構(gòu)組成、蛋白合成、基因表達調(diào)控等，因此眾多植物分子實驗需對不同來源、不同生長期、不同處理、不同組織樣本的RNA進行分離、純化，如EST和全長cDNA文庫構(gòu)建，RT-和實時定量PCR，基因芯片分析，SAGE, RACE, Northern雜交等等。而分離、純化RNA的質(zhì)量則是這些實驗成敗的關(guān)鍵。目前市場上出售的植物RNA提取試劑及試劑盒種類很多，但這些試劑盒和試劑往往都存在提取效率低，廣譜性差，提取的總RNA有多糖、蛋白和多酚的污染，降解，價格昂貴等缺點。因此，提取植物完整的總RNA往往成為各大聞校、研究院等研究人員最頭疼的問題。解決的技術(shù)問題從各種植物材料(尤其是含多糖、多酚)的任何組織中提取完整的總RNA。

發(fā)明內(nèi)容
該方法提取液主要由兩種特殊的變性劑組成，兩種變性劑相互作用，能有效地抑制提取體系中的RNA酶活性，一種變性劑在氯仿和酚混合液存在條件下不穩(wěn)定容易沉淀，并且可以與多糖多酚形成復合物，另一種變性劑在氯仿和酚混合液存在條件下相當穩(wěn)定，但不與多糖和多酚形成復合物，優(yōu)化后的提取液使蛋白的可溶性大大降低。因此，通過樣品、提取液、氯仿和酚相互混合劇烈振蕩條件下能徹底破壞植物細胞組織，有效地去除多糖、多酚和蛋白。再在優(yōu)化后的沉淀劑的作用下特異地沉淀體系中的總RNA。提取的具體過程如下I.在I. 5ml離心管中按先后順序加入350ul Tris-飽和酚，350ul氯仿，700ul提取液.2.向離心管中加入液氮中粉碎后的植物材料< 0. lg，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈震蕩15-25min. (PVPP粉末可加可不加，加后有利于改善提取后總RNA的質(zhì)量)3. 13000rpm, 4°C離心 6_8min。4.向另一 I. 5ml離心管加350ul Tris-飽和酹和350ul氯仿。將步驟3離心后的上清液完全轉(zhuǎn)移至該離心管內(nèi)，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈震蕩5min.5. 13000rpm, 4°C離心 5min。6.取上清至另一含700ul氯仿的I. 5ml離心管中，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈充分震蕩5min.
7. 13000rpm, 4°C離心 6_8min。8.取一無RNA酶污染的I. 5ml離心管，加450ul沉淀劑。將步驟7離心后的上清液(700ul)轉(zhuǎn)移至該離心管，上下顛倒5-10次，冰浴4-8min.9. IOOOOrpm(約 9000-10000Xg)，4°C離心 IOmin010.棄上清,加Iml 75%乙醇,涮洗管壁后14000rpm, 4°C離心5min。棄乙醇,氣干后加100ulRNase-free水,充分溶解沉淀,取2ul電泳檢測。(如果需要，可加I倍體積的氯仿處理一次，去除殘余蛋白，用1/10體積乙酸鈉和3倍體積乙醇沉淀回收總RNA，260/280比值一般都能大于2. 0)。與以往技術(shù)相比有益效果該方法提取的植物總RNA無蛋白污染、多糖、多酚污染，并且不存在降解問題，0D260/0D280 一般在2. 0-2. 2之間，電泳圖譜中28S和18S rRNA條帶的亮度比值大于2。實例I提取楊樹花芽總RNA以楊樹花芽為材料提取總RNA，楊樹花芽富含多糖、多酚和黃酮類物質(zhì)，用好多商業(yè)化的試劑盒很難提取無多糖、多酚和蛋白污染的總RNA.11.在I. 5ml離心管中按先后順序加入350ul Tris-飽和酚，350ul氯仿，700ul溶液I和IOOul2-巰基乙醇.12.向離心管中加入液氮中粉碎后的楊樹花芽粉末0. 1-0. 25g，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈震蕩15-25min.(如果材料多酚含量高，可在液氮研磨過程中可加1/5質(zhì)量的PVPP粉末)13. 13000rpm，4°C離心 6_8min。14.向另一 I. 5ml離心管加350ul Tris-飽和酹和350ul氯仿。將步驟3離心后的上清液完全轉(zhuǎn)移至該離心管內(nèi)，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈震蕩5min.15. 13000rpm, 4°C離心 5min。I.取上清至另一含700ul氯仿的I. 5ml離心管中，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈充分震蕩5min.2. 13000rpm，4°C離心 6_8min。3.取一無RNA酶污染的I. 5ml離心管，加450ul溶液II。將步驟7離心后的上清液(700ul)轉(zhuǎn)移至該離心管，上下顛倒5-10次，冰浴4-8min.4. IOOOOrpm(約 9000-10000X g)，4。。離心 IOmin05.棄上清，加Iml 75%乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4°C離心5min。6.棄乙醇,氣干后加100ulRNase-free水,充分溶解沉淀,取Iul電泳檢測。實例2提取月季葉片總RNA以為月季葉片材料提取總RNA，楊樹花芽富含多糖、多酚和黃酮類物質(zhì)，用商業(yè)化的試劑盒很根本提取不出總RNA。7.在I. 5ml離心管中按先后順序加入350ul Tris-飽和酚，350ul氯仿，700ul溶液I和100ul2-巰基乙醇. 8.向離心管中加入液氮中粉碎后的月季葉片粉末0. 1-0. 25g，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈震蕩15-25min.(如果材料多酚含量高，可在液氮研磨過程中可加1/5質(zhì)量的PVPP粉末)
9. 13000rpm, 4°C離心 6_8min。10.向另一 I. 5ml離心管加350ul Tris-飽和酚和350ul氯仿。將步驟3離心后的上清液完全轉(zhuǎn)移至該離心管內(nèi)，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈震蕩5min.11. 13000rpm, 4°C離心 5min。
12.取上清至另一含700ul氯仿的I. 5ml離心管中，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈充分震蕩5min.13. 13000rpm，4°C離心 6_8min。14.取一無RNA酶污染的I. 5ml離心管，加450ul溶液II。將步驟7離心后的上清液(700ul)轉(zhuǎn)移至該離心管，上下顛倒5-10次，冰浴4-8min.15. IOOOOrpm(約 9000-10000X g)，4。。離心 IOmin016.棄上清，加Iml 75%乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4°C離心5min。17.棄乙醇,氣干后加100ulRNase-free水,充分溶解沉淀,取Iul電泳檢測。
權(quán)利要求
1.一種提取植物總RNA的方法，其特征在于包括如下步驟 1)在I.5ml離心管中按先后順序加入350ul Tris-飽和酚，350ul氯仿，700ul提取液。
2)向離心管中加入液氮中粉碎后的植物材料<0. lg，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈震蕩15-25min. (PVPP粉末可加可不加，加后有利于改善提取后總RNA的質(zhì)量。3)13000rpm, 4°C 離心 6_8min。
4)向另一I. 5ml離心管加350ul Tris-飽和酚和350ul氯仿。將步驟3離心后的上清液完全轉(zhuǎn)移至該離心管內(nèi)，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈震蕩5min.。5)13000rpm, 4°C 離心 5min。
6)取上清至另一含700ul氯仿的I.5ml離心管中，蓋緊蓋后迅速在震蕩器上劇烈充分震蕩5min。7)13000rpm, 4°C 離心 6_8min。
8)取一無RNA酶污染的I.5ml離心管，加450ul沉淀劑。將步驟7離心后的上清液(700ul)轉(zhuǎn)移至該離心管，上下顛倒5-10次，冰浴4_8min。9) IOOOOrpm(約9000-10000Xg)，4°C離心 lOmin。10)棄上清，加 Iml 75% 乙醇，涮洗管壁后 14000rpm，4°C離心5min。棄乙醇,氣干后加100ulRNase-free水,充分溶解沉淀,取2ul電泳檢測。(如果需要，可加I倍體積的氯仿處理一次，去除殘余蛋白，用1/10體積乙酸鈉和3倍體積乙醇沉淀回收總RNA，260/280比值一般都能大于2. O。
2.按照權(quán)利要求I的方法，提取液提取液包含的物質(zhì)及濃度范圍SDS 2. 5% -10% CHAPS :0. 1-2% NaCl :0. 25M-1. 5M KAc :0. 25-1. 5MK2HPO4 :0. 25M KH2PO4 :0. 25M PEG4000 :0. 01-10% (NH4)2S04 :0. I-IMGlycerol :0. 5% -5% 其中=K2HPO4, KH2PO4 為緩沖劑 pH 7. 5。
3.按照權(quán)利要求I的方法，提取液中沉淀劑包含的物質(zhì)及濃度范圍LiCl 4-10M 乙醇5-50% PEG8000 1% -20%。
4.按照權(quán)利要求I的方法，提取RNA的材料來源于植物。
5.按照權(quán)利要求I的方法，提取0.I克植物組織中的RNA需要提取液數(shù)量0. 5-lml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通用的植物總RNA提取的方法。RNA樣品中不含有破壞RNA和抑制逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應的因子。該方法廣泛的適用于各類植物總RNA的提取、純化及制備之用。而且可以對不同來源、不同生長期、不同處理、不同組織樣本的RNA進行分離、純化。尤其是普通方法難以提取的富含多糖、多酚的植物的總RNA的理想提取方法。
文檔編號C12N15/10GK102628039SQ20121010381
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者張冰玉, 張香華, 王大海, 蘇曉華, 黃秦軍 申請人:中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所, 張冰玉, 張香華, 王大海, 蘇曉華, 黃秦軍