專利名稱：一種大黃歐文氏菌及其在制備低乳糖牛奶中的應(yīng)用的制作方法
一種大黃歐文氏菌及其在制備低乳糖牛奶中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)E602株,還涉及所述大黃歐文氏菌E602株的用途。
背景技術(shù)：
乳糖是一種二糖，由一分子葡萄糖和一分子半乳糖縮合而成。它在牛奶中的含量約為4. 5-5.0%。牛奶中的乳糖會(huì)導(dǎo)致人體發(fā)生乳糖不耐癥。全球有約75%成年人有乳糖不耐癥，在亞洲約有60-90%患病率，非洲國(guó)家高達(dá)90-100%，在中國(guó)成年人中的發(fā)病率達(dá)90%。由于國(guó)內(nèi)這么多的人飲用牛乳會(huì)導(dǎo)致乳糖不耐癥，該病癥已妨礙了我國(guó)乳品工業(yè)的
進(jìn)一步發(fā)展。β_半乳糖苷酶(β -galactosidase)又稱β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β -D-galactoside galacto hydrolase,EC 3· 2· I. 23),商品名為乳糖酶(Lactase),是一種重要的糖苷水解酶，它能將牛乳中的乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，因此，利用這種酶可以有效地降低牛乳中的乳糖含量，從而解決牛乳飲用人群的乳糖不耐癥問題。β_半乳糖苷酶的來(lái)源較為廣泛，其中包括來(lái)源于大多數(shù)植物、動(dòng)物和微生物等。在工業(yè)上，β_半乳糖苷酶往往來(lái)源于微生物。到目前為止，研究較多的產(chǎn)乳糖酶的微生物主要有大腸桿菌(Escherichia coli)、乳鏈球菌(Streptococcus lactis)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)等。而在工業(yè)中應(yīng)用較多的β _半乳糖苷酶主要來(lái)源于酵母和黑曲霉。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，乳品工業(yè)對(duì)乳糖酶的需求越來(lái)越多，乳糖酶的研究開發(fā)相應(yīng)增加。目前，工業(yè)上使用的β_半乳糖苷酶主要是在中溫條件下具有較高活性的中溫酶，采用中溫半乳糖苷酶對(duì)牛乳中乳糖進(jìn)行水解時(shí)，水解反應(yīng)的溫度是約37°C，因此，容易造成在牛乳水解過(guò)程中的微生物污染問題。近年來(lái)，乳糖酶的一個(gè)研究熱點(diǎn)是在較低溫度下具有較高活性的低溫乳糖酶(Cold-adaptive β-Galactosidase),這類酶適合于在較低溫度下(例如<20°C)進(jìn)行牛乳乳糖的水解，較低溫度能夠防止微生物污染，且低溫乳糖酶在牛乳巴氏殺菌溫度下能夠完全失活，因而可以保證牛乳中乳糖水解度基本一致。CN200710190755 公開了一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici) NX-5 株,還涉及利用該大黃歐文氏菌NX-5株生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶，再利用這種酶制備異麥芽酮糖。采用該菌株使蔗糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)99. 5%(W/W)，異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率達(dá)90%，轉(zhuǎn)化液中異麥芽酮糖濃度達(dá)500g/L，無(wú)水解副反應(yīng)，轉(zhuǎn)化液中幾乎不含葡萄糖和果糖，隨著反應(yīng)進(jìn)行也不會(huì)使產(chǎn)物異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化為其他成分，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)異麥芽酮糖十分有益。有關(guān)利用大黃歐文氏菌制備半乳糖苷酶及其應(yīng)用尚未見報(bào)道。因此，本發(fā)明人在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究與分析，終于完成了本發(fā)明。發(fā)明內(nèi) 容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株的用途。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株,該菌株已于2011年3月17日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4678。本發(fā)明還涉及所述的大黃歐文氏菌E602株在生產(chǎn)低乳糖牛奶中的用途。具體地，本發(fā)明涉及利用所述的大黃歐文氏菌E602株生產(chǎn)低乳糖牛奶的方法。該方法的步驟如下A、制備一級(jí)種子將大黃歐文氏菌E602株甘油凍存管中菌液劃線至含IPTG和X-Gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中在溫度24-28°C下培養(yǎng)20-28h ;從該營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面挑取藍(lán)色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602單菌落，轉(zhuǎn)移至4-6mL LB液體培養(yǎng)基中，在溫度24_28°C與轉(zhuǎn)速180-220r/min的條件下培養(yǎng)10_14h，獲得一級(jí)種子；B、制備二級(jí)種子按照以TSA液體培養(yǎng)基體積計(jì)1-4%接種量，將步驟A)得到的一級(jí)種子接種至45-55mL TSA液體培養(yǎng)基中，在溫度24_28°C與轉(zhuǎn)速180_220r/min的條件下培養(yǎng)12_18h，獲得二級(jí)種子；C、發(fā)酵培養(yǎng)按照以TSA液體培養(yǎng)基體積計(jì)1-4%接種量，將步驟B)得到的二級(jí)種子接種至4-6L TSA液體培養(yǎng)基中，在溫度24-30°C與轉(zhuǎn)速180_220r/min與不通氣的條件下發(fā)酵12-20h，然后進(jìn)行離心分離，收集含β-半乳糖苷酶的菌體；D、分離β-半乳糖苷酶收集在步驟C)得到的含β -半乳糖苷酶的菌體，在重懸于磷酸鹽緩沖液后，將得到的重懸液于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，然后進(jìn)行離心分離，收獲上清液。向得到的上清液中添加硫酸銨粉末，在其飽和度達(dá)到20-60%的硫酸銨溶液中進(jìn)行硫酸銨鹽析，再進(jìn)行離心分離，其沉淀物用磷酸鹽緩沖液重懸，接著透析除去硫酸銨，再進(jìn)行離心分離，其上清液再進(jìn)行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，于是得到純?chǔ)耞半乳糖苷酶；Ε、制備低乳糖牛奶往新鮮牛乳中加入在步驟D)得到的β -半乳糖苷酶，使牛乳中β -半乳糖苷酶的濃度達(dá)到2. 0-30. OU/mL，然后在溫度0-40°C水浴中進(jìn)行水解4-20h，得到一種低乳糖牛奶。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的超聲波破碎是在超聲波功率200-500W的條件下進(jìn)行超聲處理500-700次。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在超聲波破碎后，所述的離心分離是在18000-22000r/min與溫度0-6°C的條件下進(jìn)行離心20_40min。
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在硫酸銨鹽析后，所述的離心分離是在8000-12000r/min與溫度0-6°C的條件下進(jìn)行離心8_12min。
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在如下的條件下進(jìn)行離子交換色譜層析分離DEAE FF陰離子交換柱，流動(dòng)相A為20mmol/L Tri-HCl溶液，ρΗ7· 0-7. 5 ;流動(dòng)相B為20mmol/L Tri-HCl 和 2mol/L NaCl 的溶液，pH7. 0-7. 5，上樣流速為 2_5mL/min，洗脫流速為4-8mL/min，在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定紫外光吸收度。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在如下的條件下進(jìn)行凝膠色譜層析分離Sephacry S-100凝膠柱，流動(dòng)相為50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和0-100. Ommol/LNaCl的溶液，pH 7. 0-7. 5，上樣流速為O. 4-2. OmL/min,洗脫流速為O. 4-2. OmL/min,在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定紫外光吸收度。在步驟D)得到的β -半乳糖苷酶在ρΗ4. 0-9. O范圍內(nèi)具有良好的酶活性。β -半乳糖苷酶酶活測(cè)定方法如下將5mL 50mg/100mL鄰-硝基苯-β _D_半乳糖吡喃糖苷(ONPG)底物溶液與O. 9mL磷酸緩沖鹽溶液混合后，往其中加入O. ImL根據(jù)權(quán)利要求2所述方法制備的酶液，在水浴內(nèi)于溫度40°C的條件下反應(yīng)lOmin，然后往其中加入2mL75g/L Na2CO3溶液終止酶反應(yīng)，再在溫度25 °C的水浴中放置15min，接著在波長(zhǎng)420nm處測(cè)定吸光度，由該吸光度值根據(jù)下式計(jì)算出β-半乳糖苷酶酶活β -半乳糖苷酶酶活(U/mL) = (EXVI)/(4. 45X tXV2)式中E :反應(yīng)混合物在420nm處的吸光度，VI 反應(yīng)混合物的總體積，mL，V2 :加入該體系中的酶液體積，mL，t:反應(yīng)時(shí)間，min,4. 45-在該試驗(yàn)條件下I μ mol/mL鄰-硝基苯(ONP)的吸光度。本發(fā)明涉及采用上述方法制備得到的低乳糖牛奶，其特征在于與牛奶相比，所述低乳糖牛奶中的乳糖含量低60%以上。下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)E602株,該菌株已于2011年3月17日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4678。大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)E602菌株具有下述性質(zhì)I、菌落形態(tài)學(xué)特征在含IPTG和X-Gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在溫度26°C下培養(yǎng)24h出現(xiàn)藍(lán)色菌落，這種菌落呈圓形，表面光滑，中央突起，不透明，適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)，菌落會(huì)逐漸增大，而細(xì)胞尺寸和形狀變化卻很小。2、生理與生化特征培養(yǎng)溫度25_30°C，最適溫度為26°C。在ρΗ7· 3-7. 5范圍內(nèi)生長(zhǎng)。3、營(yíng)養(yǎng)特征在大黃歐文氏菌Ε602株的培養(yǎng)基中不需要額外添加生長(zhǎng)因子，使用有機(jī)氮作為氮源。將該菌株E602株接種于含碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水的無(wú)菌培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵，離心得到含半乳糖苷酶的細(xì)胞，通過(guò)超聲波破碎、硫酸銨鹽析、離子交換色譜層析、凝膠色譜層析等方法得到純?chǔ)耞半乳糖苷酶，進(jìn)而利用該純?chǔ)耞半乳糖苷酶進(jìn)行低乳糖牛奶的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及所述的大黃歐文氏菌Ε602株在生產(chǎn)低乳糖牛奶中的用途。具體地，本發(fā)明涉及利用所述的大黃歐文氏菌Ε602株生產(chǎn)低乳糖牛奶的方法。該方法的步驟如下 Α、制備一級(jí)種子將大黃歐文氏菌Ε602株甘油凍存管中菌液劃線至含IPTG和X-Gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中于溫度24-28°C下培養(yǎng)20-28h ;從營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面挑取藍(lán)色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602單菌落，轉(zhuǎn)移至4-6mLLB液體培養(yǎng)基中，在溫度24-28°C與轉(zhuǎn)速180-220r/min的條件下培養(yǎng)10_14h，獲得一級(jí)種子；含IPTG和X-Gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備方法如下按照20g/L蛋白胨、3g/L酵母提取物、2. 5g/L磷酸氫二鉀,5g/L氯化鈉、15g/L瓊脂稱取這些組分，再用水溶解，然后用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液將其溶液的pH調(diào)節(jié)至7. 3-7. 5,再在溫度121°C下滅菌20min,接著添加X-Gal (5-漠-4-氣-3- Π引噪-β -D-半乳糖苷)，使其終濃度達(dá)到40 μ g/mL,然后添加IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)，使其終濃度達(dá)到20 μ g/mL，然后澆鑄成含IPTG和X-Gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。LB (Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基組成如下10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化鈉，其余組分為水。TSA液體培養(yǎng)基組成如下15g/L胰蛋白胨、5g/L大豆蛋白胨、2. 5g/L磷酸氫二鉀、2. 5g/L乳糖、5g/L氯化鈉、3g/L酵母浸膏、其余組分為水，pH 7. 3-7. 5。優(yōu)選地,大黃歐文氏菌E602株在培養(yǎng)箱中在溫度26°C下培養(yǎng)26h。挑選藍(lán)色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602株單菌落接種至5mL LB液體培養(yǎng)基中，在溫度26°C與轉(zhuǎn)速200r/min的條件下培養(yǎng)12h。B、制備二級(jí)種子按照以TSA液體培養(yǎng)基體積計(jì)1-4%接種量，將步驟A)得到的一級(jí)種子接種至45-55mL TSA液體培養(yǎng)基中，在溫度24_28°C與轉(zhuǎn)速180_220r/min的條件下培養(yǎng)12_18h，獲
得二級(jí)種子。優(yōu)選地，步驟A)得到的一級(jí)種子接種量是以TSA液體培養(yǎng)基體積計(jì)2-3%。步驟A)得到的一級(jí)種子在50mL TSA液體培養(yǎng)基中在溫度26°C與轉(zhuǎn)速200r/min的條件下培養(yǎng)16h。C、發(fā)酵培養(yǎng)按照以TSA液體培養(yǎng)基體積計(jì)1-4%接種量，將步驟B)得到的二級(jí)種子接種至4-6L TSA液體培養(yǎng)基中，在溫度24-30°C與轉(zhuǎn)速180_220r/min與不通氣的條件下發(fā)酵12-20h，然后進(jìn)行離心分離，收集含β -半乳糖苷酶的菌體。優(yōu)選地，步驟B)得到的二級(jí)種子接種量是以TSA液體培養(yǎng)基體積計(jì)2-3%。步驟B)得到的二級(jí)種子在5L TSA液體培養(yǎng)基中在溫度26°C與轉(zhuǎn)速200r/min與不通氣的條件下培養(yǎng)16h。
根據(jù)本發(fā)明，所述的不通氣應(yīng)該理解是在培養(yǎng)過(guò)程中將培養(yǎng)容器封閉，不讓培養(yǎng)容器內(nèi)的環(huán)境與外部環(huán)境交流的一種封閉式不通氣培養(yǎng)。所述的離心分離是在3000-5000r/min與溫度15-30 °C的條件下進(jìn)行離心10_15minoD、分離半乳糖苷酶收集在步驟C)得到的含β -半乳糖苷酶的菌體，在重懸于磷酸鹽緩沖液后，將得到的重懸液于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，然后進(jìn)行離心分離，向得到的上清液中添加硫酸銨粉末，在硫酸銨飽和度達(dá)到20-60 %的溶液中進(jìn)行硫酸銨鹽析，再進(jìn)行離心分離，其沉淀物用磷酸鹽緩沖液重懸，接著透析除去硫酸銨，再進(jìn)行離心分離，收獲上清液；所得上清液再進(jìn)行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，于是得到純?chǔ)?半乳糖苷酶； 在步驟C)得到的菌體在重懸于磷酸鹽緩沖液后，得到的重懸液于冰浴中進(jìn)行超聲破碎。在超聲波功率200-500W的條件下進(jìn)行超聲3s，暫停8s，按照這種方式連續(xù)超聲500-700 次，共 30min。超聲波破碎是使用超聲波破碎儀通過(guò)換能器將電能轉(zhuǎn)換為超聲波,這種形式的能量在通過(guò)液體介質(zhì)時(shí)使其介質(zhì)變成一個(gè)個(gè)小氣泡，這些小氣泡會(huì)迅速炸裂，從而使細(xì)胞破碎。超聲波破碎使用的細(xì)胞超聲波破碎儀是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品，例如上海靖永實(shí)業(yè)有限公司銷售的產(chǎn)品。在超聲破碎后獲得的菌液然后進(jìn)行離心分離，移取其上清液。這種離心分離是在18000-22000r/min與溫度0-6°C的條件下進(jìn)行離心20_40min。這種離心分離使用的離心機(jī)是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品，例如德國(guó)SIGMA公司、長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。將所述的上清液置于冰浴中，在磁力攪拌器的攪拌下，加入硫酸銨粉末，在硫酸銨飽和度達(dá)到20-60%的溶液中進(jìn)行硫酸銨鹽析。所述的硫酸銨鹽析主要是使蛋白質(zhì)和酶鹽析出來(lái)。硫酸銨的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小，溶解度大，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)，還不易引起蛋白質(zhì)變性。鹽析時(shí)，硫酸銨溶液的pH通常是4. 5-5. 5。在硫酸銨鹽析后進(jìn)行離心分離所得到的沉淀物是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在通過(guò)鹽析沉淀分離后，需要將其中的鹽除去，常用的方法是透析。得到的沉淀物使用PH7. 4磷酸鹽緩沖液溶解，裝入透析袋進(jìn)行充分透析，在透析過(guò)程中需要更換磷酸鹽緩沖液2-5次，使用萘氏試劑檢測(cè)透析外液無(wú)黃色，即無(wú)NH4+為止，已無(wú)硫酸銨鹽。在硫酸銨鹽析后，所述的離心分離是在8000_12000r/min與溫度0_6°C的條件下進(jìn)行離心8-12min。這種離心分離得到的上清液再進(jìn)行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，可以得到純半乳糖苷酶。離子交換色譜層析分離在如下的條件下進(jìn)行DEAE FF陰離子交換柱，流動(dòng)相A為20mmol/L Tri-HCl 溶液，ρΗ7· 0-7. 5 ;流動(dòng)相 B 為 20mmol/LTri-HCl 和 2mol/L NaCl 的溶液，PH7. 0-7. 5，上樣流速為2-5mL/min，洗脫流速為4_8mL/min，在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定紫外光吸收度。根據(jù)測(cè)定的紫外光吸收度值曲線，收集與吸收度最大值對(duì)應(yīng)的洗脫部分。重復(fù)這個(gè)收集步驟，將這些洗脫部分合并，然后再進(jìn)行凝膠色譜層析分離。
凝膠色譜層析分離在如下的條件下進(jìn)行Sephacry S-100凝膠柱，流動(dòng)相為50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和0-100. Ommol/L NaCl的溶液，pH 7. 0-7. 5，上樣流速為O. 4-2. OmL/min，洗脫流速為O. 4-2. OmL/min，在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定紫外光吸收度。根據(jù)測(cè)定的紫外光吸收度值曲線，收集與吸收度最大值對(duì)應(yīng)的洗脫部分。重復(fù)這個(gè)收集步驟，將這些洗脫部分合并，得到純的β -半乳糖苷酶。接著測(cè)定β -半乳糖苷酶酶活，其測(cè)定方法如下將5mL 50mg/100mL鄰-硝基苯-β -D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)底物溶液與O. 9mL磷酸鹽緩沖溶液混合后，往其中加入
O.ImL本發(fā)明方法制備的β-半乳糖苷酶液，在水浴內(nèi)在溫度40°C的條件下反應(yīng)lOmin，然后往其中加入2mL 75g/L似20)3溶液終止酶反應(yīng)，再在溫度25°C的水浴中放置15min，接著在波長(zhǎng)420nm處測(cè)定吸光度，由該吸光度值根據(jù)下式計(jì)算出β _半乳糖苷酶酶活β -半乳糖苷酶酶活(U/mL) = (EXVI)/(4. 45X tXV2)式中E :反應(yīng)混合物在420nm處的吸光度，VI 反應(yīng)混合物的總體積，mL，V2 :加入該體系中的酶液體積，mL，t:反應(yīng)時(shí)間，min,4. 45-在該試驗(yàn)條件下I μ mol/mL鄰-硝基苯(ONP)的吸光度。大黃歐文氏菌E602菌株所產(chǎn)的β -半乳糖苷酶與其他來(lái)源的β -半乳糖苷酶在性質(zhì)方面進(jìn)行了比較，其結(jié)果列于表I中。表I :大黃歐文氏菌Ε602所產(chǎn)的β -半乳糖苷酶與其他來(lái)源的β -半乳糖苷酶性質(zhì)比較
權(quán)利要求
1.一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)E602株,該菌株已于2011年3月17日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4678。
2.一種利用根據(jù)權(quán)利要求I所述的大黃歐文氏菌E602生產(chǎn)低乳糖牛奶的方法，其特征在于該方法的步驟如下 A、制備一級(jí)種子 取大黃歐文氏菌E602菌株菌液劃線至含IPTG和X-Gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中于溫度24-28°C下培養(yǎng)20-28h ;從該營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面挑取藍(lán)色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602株單菌落，轉(zhuǎn)移至4-6mL LB液體培養(yǎng)基中，在溫度24_28°C與轉(zhuǎn)速180_220r/min的條件下培養(yǎng)10-14h,獲得一級(jí)種子； B、制備二級(jí)種子 按照以TSA液體培養(yǎng)基體積計(jì)1-4%接種量，將步驟A)得到的一級(jí)種子接種至45-55mLTSA液體培養(yǎng)基中，在溫度24-28°C與轉(zhuǎn)速180-220r/min的條件下培養(yǎng)12_18h，獲得二級(jí)種子； C、發(fā)酵培養(yǎng) 按照以TSA液體培養(yǎng)基體積計(jì)1-4%接種量，將步驟B)得到的二級(jí)種子接種至4-6LTSA液體培養(yǎng)基中，在溫度24-30°C、轉(zhuǎn)速180-220r/min與不通氣的條件下發(fā)酵12_20h，然后進(jìn)行離心分離，收集含β-半乳糖苷酶的菌體； D、分離β-半乳糖苷酶 收集在步驟C)得到的含β_半乳糖苷酶的菌體，在重懸于磷酸鹽緩沖液后，將得到的重懸液于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，然后進(jìn)行離心分離，收獲上清液，向所得上清液中添加硫酸銨粉末，在硫酸銨飽和度達(dá)到20-60%的溶液中進(jìn)行硫酸銨鹽析，再進(jìn)行離心分離，其沉淀物用磷酸鹽緩沖液重懸，接著透析除去硫酸銨，再進(jìn)行離心分離，收獲上清液；所得上清液再進(jìn)行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，于是得到純?chǔ)?半乳糖苷酶； Ε、制備低乳糖牛奶 向新鮮牛乳中加入在步驟D)得到的β_半乳糖苷酶，使牛乳中β_半乳糖苷酶的濃度達(dá)到2. 0-30. OU/mL，然后在溫度0_40°C水浴中進(jìn)行水解4_20h，得到一種低乳糖牛奶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的超聲波破碎是在超聲波功率200-500w的條件下進(jìn)行超聲處理500-700次。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在超聲波破碎后，所述的離心分離是在18000-22000r/min與溫度0-6°C的條件下進(jìn)行離心20_40min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在硫酸銨鹽析后，所述的離心分離是在8000-12000r/min與溫度0-6°C的條件下進(jìn)行離心8_12min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在如下的條件下進(jìn)行離子交換色譜層析分離DEAE FF陰離子交換柱，流動(dòng)相A為20mmol/L Tri-HCl溶液，ρΗ7· 0-7. 5 ;流動(dòng)相B為20mmol/L Tri-HCl 和 2mol/L NaCl 的溶液，pH7. 0-7. 5，上樣流速為 2_5mL/min，洗脫流速為4-8mL/min，在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定紫外光吸收度。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在如下的條件下進(jìn)行凝膠色譜層析分離Sephacry S-100凝膠柱，流動(dòng)相為50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和0-100. OmmoI/L NaCl的溶液，pH 7. 0-7. 5，上樣流速為O. 4-2. OmL/min,洗脫流速為O. 4-2. OmL/min,在波長(zhǎng)280nm處測(cè)定紫外光吸收度。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在步驟D)得到的β-半乳糖苷酶在ΡΗ4. 0-9. O范圍內(nèi)具有良好的酶活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于β-半乳糖苷酶酶活測(cè)定方法如下將5mL50mg/100mL鄰-硝基苯-β -D-半乳糖吡喃糖苷底物溶液與O. 9mL磷酸鹽緩沖溶液混合后，往其中加入O. ImL根據(jù)權(quán)利要求2所述方法制備的β -半乳糖苷酶液，在水浴內(nèi)在溫度40°C的條件下反應(yīng)lOmin，然后往其中加入2mL 75g/L Na2CO3溶液終止酶反應(yīng)，再在溫度25°C的水浴中放置15min，接著在波長(zhǎng)420nm處測(cè)定吸光度，由該吸光度值根據(jù)下式計(jì)算出β-半乳糖苷酶酶活 β-半乳糖苷酶酶活(U/mL) = (Ε X VI)/(4. 45 Xt XV2) 式中 E :反應(yīng)混合物在420nm處的吸光度， Vl :反應(yīng)混合物的總體積，mL， V2 :加入該體系中的酶液體積，mL， t :反應(yīng)時(shí)間，min, 4.45-在該試驗(yàn)條件下I μ mol/mL鄰-硝基苯的吸光度。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述方法制備得到的低乳糖牛奶，其特征在于與牛奶相比，所述低乳糖牛奶中的乳糖含量低60 %以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大黃歐文氏菌E602株，還涉及所述大黃歐文氏菌E602株在生產(chǎn)低乳糖牛奶中的用途。生產(chǎn)低乳糖牛奶的方法包括一級(jí)種子、二級(jí)種子制備、發(fā)酵培養(yǎng)、分離純化β-半乳糖苷酶，以及制備低乳糖牛奶等步驟。該β-半乳糖苷酶最適宜的反應(yīng)溫度為40℃，最適宜的反應(yīng)pH為7.0，在低溫下存在良好的酶活性。采用不同終濃度的β-半乳糖苷酶在溫度20℃下水解牛奶12h，使牛奶中的乳糖水解率達(dá)到60％以上，達(dá)到低乳糖牛奶的生產(chǎn)要求。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102634468SQ20121010101
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月9日
發(fā)明者夏雨 申請(qǐng)人:江南大學(xué)