專利名稱：淀粉酶、編碼它們的核酸及其制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子和細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)。一方面，本發(fā)明涉及具有淀粉酶活性的多肽、編碼這些多肽的多核苷酸，以及制備和使用這些多核苷酸和多肽的方法。一方面， 本發(fā)明的多肽可以被用作淀粉酶，例如a淀粉酶或葡糖淀粉酶，以便將淀粉水解為糖。一方面，本發(fā)明涉及具有熱穩(wěn)定的淀粉酶活性的多肽，如a淀粉酶或葡糖淀粉酶活性，例如 l，4_a-D-葡聚糖葡糖水解酶活性。一方面，本發(fā)明的多肽可以被用作淀粉酶，例如a淀粉酶或葡糖淀粉酶，以便將淀粉水解為糖，如葡萄糖。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核酸序列的核酸構(gòu)建物、載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的重組方法。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的淀粉酶在淀粉轉(zhuǎn)化過(guò)程中的用途，包括高果糖玉米糖漿(HFCS)、乙醇、葡萄糖和葡萄糖糖漿的產(chǎn)生。
背景技術(shù)：
淀粉是在人類飲食中常被發(fā)現(xiàn)的復(fù)合糖。淀粉的結(jié)構(gòu)是用a_l，4和a_l，6糖苷鍵連接的葡萄糖聚合物。淀粉酶是一種能催化淀粉水解為糖的酶。淀粉酶將淀粉中的內(nèi) a -1，4_糖苷鍵水解，在很大程度上是隨機(jī)水解，從而得到更小分子量的麥芽糖糊精。在消化系統(tǒng)中和在商業(yè)上，淀粉的分解是很重要的。所以淀粉酶被認(rèn)為很有商業(yè)價(jià)值，在很多場(chǎng)合得到使用淀粉加工的初始階段(液化)；濕玉米碾磨；酒精生產(chǎn)；在去污劑基料中作為清洗劑；在紡織行業(yè)用于淀粉脫漿；烘培應(yīng)用；飲料行業(yè)；在油田的鉆探工藝中；給循環(huán)紙上墨；和動(dòng)物詞料中。淀粉酶通過(guò)大量的微生物產(chǎn)生，這些微生物包括桿菌屬(Bacillus)和曲霉屬 (Aspergillus),商業(yè)上的大部分淀粉酶是產(chǎn)生自細(xì)菌來(lái)源，例如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽胞桿菌 (Bacillus subtilis)或嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)。近些年,商業(yè)應(yīng)用中的淀粉酶主要是那些來(lái)自地衣芽孢桿菌的淀粉酶，這是由于它們至少在中性和弱堿性pH下的熱穩(wěn)定性和性能。
在商業(yè)上，葡糖淀粉酶被用于進(jìn)一步水解玉米淀粉，而該玉米淀粉已經(jīng)用a -淀粉酶部分地水解。然后在該反應(yīng)中產(chǎn)生的葡萄糖可能通過(guò)葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖的混合物。該混合物，或富含果糖的混合物，便是已在世界范圍內(nèi)商業(yè)化的高果糖玉米糖漿。通常，淀粉到果糖的加工包括四個(gè)步驟顆粒狀淀粉的液化，液化的淀粉被糖化為右旋葡萄糖，純化，和異構(gòu)化為果糖。淀粉液化過(guò)程的目標(biāo)是將淀粉聚合物顆粒的濃縮懸液轉(zhuǎn)化為低粘度的可溶的鏈長(zhǎng)更短的糊精的溶液。最廣泛使用的葡糖淀粉酶是從真菌黑曲霉(Aspergillus niger)產(chǎn)生的。該酶在商業(yè)應(yīng)用中遇到的一個(gè)問(wèn)題是其熱穩(wěn)定性相對(duì)較低。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了許多其它的真菌葡糖淀粉酶，包括根霉屬(Rizopus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Thermoascus和籃狀菌屬 (Talaromyces),以及來(lái)自嗜熱真菌棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces Ianuginosus)的葡糖淀粉酶。通常，淀粉到果糖的加工包括四個(gè)步驟顆粒淀粉的液化，液化的淀粉糖化為葡萄糖，純化，和異構(gòu)化為果糖。淀粉液化步驟的目的是將淀粉聚合物顆粒的濃縮懸液轉(zhuǎn)化為低粘度的可溶性短鏈糊精溶液。該步驟對(duì)于用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備便利地處理和有效轉(zhuǎn)化為葡萄糖或其它糖是必要的。為了液化顆粒淀粉，必須通過(guò)將顆粒淀粉的溫度升高到高于大約72°c以使顆粒凝膠化(gelatinize)。加熱過(guò)程可以瞬間破壞不溶性淀粉顆粒從而產(chǎn)生水溶性淀粉溶液。然后通過(guò)淀粉酶將溶解的淀粉溶液液化。淀粉顆粒包括69-74%支鏈淀粉，26-31%直鏈淀粉，11-14%水，0. 2-0. 4% 蛋白質(zhì)，0. 5-0. 9%脂質(zhì)，0. 05-0. 1% 灰分，0. 02-0. 03%磷， 0. I %戊聚糖。大約70%的顆粒是非晶態(tài)的，30%是晶態(tài)的。常見(jiàn)的酶促液化步驟涉及通過(guò)加入氫氧化鈣、氫氧化鈉或碳酸鈉將顆粒淀粉漿料的PH值調(diào)節(jié)到6. 0到6. 5之間，這是來(lái)源于地衣芽孢桿菌的a -淀粉酶的最適pH值。力口入氫氧化鈣還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是可以提供鈣離子，已知鈣離子能夠穩(wěn)定a -淀粉酶以免其發(fā)生失活。一旦加入a-淀粉酶，就泵出懸液通過(guò)蒸氣噴嘴，這樣可以將溫度瞬間升高到 80°C到115°C之間。淀粉被立刻凝膠化，并且由于存在a-淀粉酶，通過(guò)a-淀粉酶隨機(jī)水解(1-4)糖苷鍵，其被解聚為易于抽吸的流體物質(zhì)。在液化步驟的第二種變化形式中，a -淀粉酶被加入到淀粉懸液中，該懸液被保持在80-100°C的溫度以部分地水解淀粉顆粒，然后部分水解的淀粉懸液被泵出通過(guò)噴嘴，其溫度超過(guò)大約105°C，從而徹底地凝膠化任何剩余的顆粒結(jié)構(gòu)。在冷卻凝膠化的淀粉后，再次加入a-淀粉酶，以進(jìn)一步水解淀粉。該步驟的第三種變化形式被稱作干磨方法。在干磨法中，將全粒研磨，并且與水混合。通過(guò)漂浮分離或等效的技術(shù)任選地去除胚芽。用a-淀粉酶液化所得到的混合物，該混合物含有淀粉、纖維、蛋白質(zhì)和谷物的其它成分。當(dāng)使用干磨法時(shí)，本技術(shù)領(lǐng)域通常的實(shí)踐是采取在較低溫度下進(jìn)行酶促液化。通常，在將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糊精時(shí)，認(rèn)為低溫液化比高溫液化的效率低一些。典型地，在凝膠化后，淀粉溶液在存在a-淀粉酶的條件下，被保持于提高的溫度，直到DE達(dá)到10-20，通常需要1-3小時(shí)。葡萄糖當(dāng)量值(DE)是用于量度總還原糖的濃度的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，是以基于干重量來(lái)計(jì)算的D-葡萄糖來(lái)表示。未水解的顆粒淀粉的DE實(shí)質(zhì)上為零，而D-葡萄糖的DE被定義為100。
玉米濕磨是一種產(chǎn)生玉米油、谷蛋白粉、谷蛋白飼料和淀粉的方法。堿性淀粉酶被用于淀粉的液化中，葡糖淀粉酶被用于糖化中，從而產(chǎn)生葡萄糖。玉米是一種包括外種皮 (纖維)、淀粉、淀粉和葡萄糖的結(jié)合物和內(nèi)胚芽的谷粒，對(duì)其進(jìn)行四步驟加工，該四步驟加工方法導(dǎo)致產(chǎn)生淀粉。玉米被浸泡，去胚芽，去纖維，最后谷蛋白被分離。在浸泡過(guò)程中，去除可溶性物質(zhì)。去掉可溶性物質(zhì)后剩余的產(chǎn)物被去胚芽,這樣導(dǎo)致產(chǎn)生了玉米油并且產(chǎn)生了油渣，油渣被加入到來(lái)自浸泡步驟的可溶物中。剩余產(chǎn)物被去纖維，然后纖維固體被加入到油渣/可溶物混合物中。纖維固體、油渣和可溶物的混合物形成了谷蛋白飼料。在去纖維后，對(duì)剩余產(chǎn)物進(jìn)行谷蛋白分離。由該分離產(chǎn)生了谷蛋白粉和淀粉。然后將淀粉進(jìn)行液化和糖化，產(chǎn)生葡萄糖。
烘烤產(chǎn)品(如面包)的不新鮮化(staling)已經(jīng)被認(rèn)為是隨著面包產(chǎn)品的生產(chǎn)時(shí)刻和消費(fèi)時(shí)刻之間的時(shí)間變長(zhǎng)而會(huì)變得越來(lái)越嚴(yán)重的一個(gè)問(wèn)題。術(shù)語(yǔ)不新鮮化被用于描述面包產(chǎn)品在離開(kāi)烤箱后，不受消費(fèi)者歡迎的性質(zhì)變化，如面包屑硬度的增加、面包屑彈性的降低、面包皮發(fā)生變化，變得堅(jiān)韌嚼不動(dòng)。面包屑的硬度在儲(chǔ)存過(guò)程中進(jìn)一步增加到一個(gè)被認(rèn)為是被拒絕的水平。面包屑硬度的增加被認(rèn)為是不新鮮化的最重要方面，這是可被消費(fèi)者辨認(rèn)的，而且是在面包產(chǎn)品變得不適合消費(fèi)之前的很長(zhǎng)一段時(shí)間就發(fā)生。在該行業(yè)中存在著鑒定和優(yōu)化對(duì)于多種應(yīng)用有用的淀粉酶的需求，所述應(yīng)用包括商業(yè)化的玉米淀粉液化過(guò)程。例如，相對(duì)于來(lái)自地衣芽孢桿菌的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)酶而言，這些第二代酸性淀粉酶將提供改進(jìn)的生產(chǎn)和/或功能特性。也存在著鑒別和優(yōu)化在自動(dòng)洗碗(ADW)產(chǎn)品和洗衣去污劑中有用的淀粉酶的需求。在ADW產(chǎn)品中，淀粉酶將在存在鈣螯合劑和氧化條件的情況下，在pHlO-11和45-60°C 發(fā)揮作用。對(duì)于洗衣，將要求在適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┗现?，在pH 9-10和40°C時(shí)有活性。淀粉酶也在織物脫漿、釀造工藝、造紙和紙漿行業(yè)中的淀粉改性以及本技術(shù)領(lǐng)域的其它工藝中有用。淀粉酶可以在商業(yè)上應(yīng)用于淀粉加工的初始階段(液化)；濕玉米碾磨；酒精生產(chǎn)；在去污劑基料中作為清洗劑；在紡織行業(yè)用于淀粉脫漿；烘培應(yīng)用；飲料行業(yè)；油田的鉆探工藝；給循環(huán)紙上墨；和動(dòng)物飼料中。淀粉酶也在織物脫漿、釀造工藝、紙和紙漿工業(yè)中的淀粉改性以及其它過(guò)程中有用。本文中討論的出版物被提供出來(lái)，僅僅是因?yàn)樗鼈兊墓_(kāi)是在本申請(qǐng)的提交日期之前。此處沒(méi)有任何內(nèi)容可以被解釋為承認(rèn)基于優(yōu)先發(fā)明，本發(fā)明沒(méi)有資格居先擁有這些公開(kāi)內(nèi)容。發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的或重組的核酸，包括與本發(fā)明的核酸例如本發(fā)明的示例性核酸在至少大約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、 1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或更多個(gè)殘基的區(qū)域內(nèi)，具有至少大約 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的核酸序列。一方面，該核酸編碼至少一個(gè)具有淀粉酶活性的多肽，所述序列同一性通過(guò)運(yùn)用了序列比較算法的分析或通過(guò)視覺(jué)觀察來(lái)確定。另一方面，本發(fā)明提供了可用作探針的核酸、抑制性分子(例如反義分子、iRNAs)、轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控，等等。本發(fā)明的示例性核酸包括，含有如下序列中所示的核酸序列的分離的或重組的核酸SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO 21, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :39, SEQ ID NO :41, SEQ ID NO :43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO :49, SEQ ID NO :51, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO :59, SEQ ID NO :61, SEQ ID NO :63, SEQ ID NO :65, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO :69, SEQ ID NO :71, SEQ ID NO :73, SEQ ID NO :75, SEQ I D NO :77, SEQ ID NO 79, SEQ ID NO :81, SEQ ID NO :83, SEQ ID NO :85, SEQ ID NO :87, SEQ ID NO :89, SEQ ID NO91,SEQ ID NO :93,SEQ ID NO :95,SEQ ID NO :97,SEQ ID NO :99,SEQ ID NO 101, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 105, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 109, SEQ ID NO : 111， SEQ ID NO 113,SEQ ID NO 115,SEQ ID NO 117,SEQ ID NO 119,SEQ ID NO: 121，SEQ ID NO 123, SEQ ID NO :125, SEQ ID NO :127, SEQ ID NO :129, SEQ ID NO 131, SEQ ID NO: 133，SEQ ID NO 135, SEQ ID NO 137, SEQ ID NO 139, SEQ ID NO 141, SEQ ID NO 143, SEQ ID NO 145, SEQ ID NO: 147，SEQ ID NO: 149，SEQ ID NO: 151，SEQ ID NO: 153，SEQ ID NO 155, SEQ ID NO :157, SEQ ID NO 159, SEQ ID NO 161, SEQ ID NO 163, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO :167, SEQ ID NO :189, SEQ ID NO 191, SEQ ID NO :193, SEQ ID NO 203, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 207, SEQ ID NO 209, SEQ ID NO 211,SEQ ID NO 322, SEQ ID NO 324, SEQ ID NO 326, SEQ ID NO 328, SEQ ID NO 330, SEQ ID NO 332, SEQ ID NO 334，SEQ ID NO 336, SEQ ID NO 338, SEQ ID NO 340, SEQ ID NO 342, SEQ ID NO 344, SEQ ID NO 346, SEQ ID NO 348, SEQ ID NO 350, SEQ ID NO 352, SEQ ID NO :354，SEQ ID NO 356, SEQ ID NO 358, SEQ ID NO 360, SEQ ID NO 362, SEQ ID NO 364, SEQ ID NO 366，SEQ ID NO 368, SEQ ID NO 370, SEQ ID NO 372, SEQ ID NO 374, SEQ ID NO 376, SEQ ID NO 378, SEQ ID NO 380, SEQ ID NO 382, SEQ ID NO 384, SEQ ID NO 386, SEQ ID NO 388, SEQ ID NO 390, SEQ ID NO 392, SEQ ID NO 394, SEQ ID NO 396, SEQ ID NO 398，SEQ ID NO 400, SEQ ID NO 402, SEQ ID NO 404, SEQ ID NO 406, SEQ ID NO 408, SEQ ID NO 410,SEQ ID NO 412,SEQ ID NO 414,SEQ ID NO 416,SEQ ID NO 418,SEQ ID NO 420, SEQ ID NO 422, SEQ ID NO 424, SEQ ID NO 426, SEQ ID NO 428, SEQ ID NO 430，SEQ ID NO 432,SEQ ID NO 434,SEQ ID NO 436,SEQ ID NO 438,SEQ ID NO 440,SEQ ID NO 442,SEQ ID NO 444,SEQ ID NO 446,SEQ ID NO 448,SEQ ID NO 450,SEQ ID NO: 452，SEQ ID NO 454, SEQ ID NO 456, SEQ ID NO 458, SEQ ID NO 460, SEQ ID NO 460, SEQ ID NO 462, SEQ ID NO 465, SEQ ID NO 467, SEQ ID NO 473, SEQ ID NO 475, SEQ ID NO 478, SEQ ID NO 480, SEQ ID NO 484, SEQ ID NO 486, SEQ ID NO 492, SEQ ID NO 494, SEQ ID NO 498,SEQ ID NO 500,SEQ ID NO 509,SEQ ID NO 511,SEQ ID NO 515,SEQ ID NO 517, SEQ ID NO 517, SEQ ID NO 519, SEQ ID NO 522, SEQ ID NO 524, SEQ ID NO 527，SEQ ID NO 529, SEQ ID NO 532, SEQ ID NO 534, SEQ ID NO 539, SEQ ID NO :541， SEQ ID NO 544, SEQ ID NO 546, SEQ ID NO 552, SEQ ID NO 554, SEQ ID NO 558, SEQ ID NO 560, SEQ ID NO 565, SEQ ID NO 567, SEQ ID NO 569, SEQ ID NO 571,SEQ ID NO 573,SEQ ID NO 575, SEQ ID NO: 577，SEQ ID NO: 579，SEQ ID NO: 581，SEQ ID NO: 583，SEQ ID NO 585, SEQ ID NO :587, SEQ ID NO :593, SEQ ID NO :603, SEQ ID NO :605, SEQ ID NO 607, SEQ ID NO :609, SEQ ID NO 611, SEQ ID NO :613, SEQ ID NO 615, SEQ ID NO 617, SEQ ID NO :619 或 SEQ ID NO :621，及其子序列，例如長(zhǎng)度至少大約 10、15、20、25、30、35、40、 45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500 或更多殘基，或者基因或轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的示例性核酸也包括，編碼本發(fā)明的多肽的分離的或重組的核酸，本發(fā)明的多肽例如具有如下序列中所示序列的示例性多肽SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO 32, SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :36，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO -AO, SEQ ID NO :42， SEQ ID NO 44, SEQ ID NO :46，SEQ ID NO :48，SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO 54，SEQ ID NO :56，SEQ ID NO :58，SEQ ID NO :60，SEQ ID NO :62，SEQ ID NO :64，SEQ ID NO 66, SEQ ID NO :68，SEQ ID NO :70，SEQ ID NO :72，SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :76, SEQ ID NO 78, SEQ ID NO :80，SEQ ID NO :82，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :88， SEQ ID NO90,SEQ ID NO :92，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO :96，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO :104, SEQ ID NO :106，SEQ ID NO :108，SEQ ID NO :110， SEQ ID NO: 112，SEQ ID NO: 114，SEQ ID NO: 116，SEQ ID NO: 118，SEQ ID NO: 120，SEQ ID NO 122, SEQ ID NO : 124，SEQ ID NO 126, SEQ ID NO : 128，SEQ ID NO 130, SEQ ID NO: 132，SEQ ID NO :134，SEQ ID NO :136，SEQ ID NO :138，SEQ ID NO :140，SEQ ID NO :142， SEQ ID NO: 144，SEQ ID NO: 146，SEQ ID NO: 148，SEQ ID NO 150, SEQ ID NO: 152，SEQ ID NO 154, SEQ ID NO :156, SEQ ID NO :158，SEQ ID NO :160, SEQ ID NO :162，SEQ ID NO 164，SEQ ID NO :166，SEQ ID NO :168，SEQ ID NO :190，SEQ ID NO :192，SEQ ID NO :194， SEQ ID NO 204,SEQ ID NO 206,SEQ ID NO 208,SEQ ID NO 210,SEQ ID NO 212,SEQ ID NO 323, SEQ ID NO :325, SEQ ID NO :327, SEQ ID NO :329, SEQ ID NO :331，SEQ ID NO 333，SEQ ID NO 335, SEQ ID NO 337, SEQ ID NO 339, SEQ ID NO 341, SEQ ID NO 343, SEQ ID NO 345,SEQ ID NO 347,SEQ ID NO 349,SEQ ID NO 351,SEQ ID NO 353,SEQ ID NO 355, SEQ ID NO :357, SEQ ID NO :359, SEQ ID NO :361，SEQ ID NO :363, SEQ ID NO 365, SEQ ID NO :367, SEQ ID NO :369, SEQ ID NO 371, SEQ ID NO :373, SEQ ID NO 375, SEQ ID NO 377, SEQ ID NO :379, SEQ ID NO :381，SEQ ID NO :383, SEQ ID NO :385, SEQ ID NO 387,SEQ ID NO 389,SEQ ID NO 391,SEQ ID NO 393,SEQ ID NO 395,SEQ ID NO: 397，SEQ ID NO 399, SEQ ID NO :401，SEQ ID NO 403, SEQ ID NO 405, SEQ ID NO 407, SEQ ID NO 409,SEQ ID NO 411,SEQ ID NO 413,SEQ ID NO 415,SEQ ID NO 417,SEQ ID NO 419, SEQ ID NO :421，SEQ ID NO 423, SEQ ID NO 425, SEQ ID NO 427, SEQ ID NO 429，SEQ ID NO :431，SEQ ID NO 433, SEQ ID NO 435, SEQ ID NO 437, SEQ ID NO 439, SEQ ID NO 441,SEQ ID NO 443,SEQ ID NO 445,SEQ ID NO 447,SEQ ID NO 449,SEQ ID NO 451, SEQ ID NO 453, SEQ ID NO 455, SEQ ID NO 457, SEQ ID NO 459, SEQ ID NO 461，SEQ ID NO :461，SEQ ID NO 463, SEQ ID NO 464, SEQ ID NO 466, SEQ ID NO 468,SEQ ID NO 469, SEQ ID NO 470, SEQ ID NO 471,SEQ ID NO 472, SEQ ID NO 474, SEQ ID NO 476, SEQ ID NO 477, SEQ ID NO 479, SEQ ID NO :481，SEQ ID NO 482, SEQ ID NO 483，SEQ ID NO 485, SEQ ID NO 487, SEQ ID NO 488, SEQ ID NO 489, SEQ ID NO 490, SEQ ID NO 491,SEQ ID NO 493,SEQ ID NO 495,SEQ ID NO 496,SEQ ID NO 497,SEQ ID NO 499, SEQ ID NO :501，SEQ ID NO 502, SEQ ID NO 503, SEQ ID NO 504, SEQ ID NO 505, SEQ ID NO :506, SEQ ID NO :507, SEQ ID NO :508, SEQ ID NO 510, SEQ ID NO 512, SEQ ID NO 513,SEQ ID NO 514,SEQ ID NO 516,SEQ ID NO 518,SEQ ID NO 518,SEQ ID NO 520, SEQ ID NO :521，SEQ ID NO :523, SEQ ID NO :525, SEQ ID NO :526, SEQ ID NO 528, SEQ ID NO :530, SEQ ID NO :531, SEQ ID NO :533, SEQ ID NO :535, SEQ ID NO 536, SEQ ID NO 537, SEQ ID NO 538, SEQ ID NO 540, SEQ ID NO 542, SEQ ID NO 543, SEQ ID NO 545, SEQ ID NO 547, SEQ ID NO 548, SEQ ID NO 549, SEQ ID NO 550, SEQ ID NO 551,SEQ ID NO 553,SEQ ID NO 555,SEQ ID NO 556,SEQ ID NO 557,SEQ ID NO 559,SEQ ID NO 561,SEQ ID NO 562,SEQ ID NO 563,SEQ ID NO 564,SEQ ID NO 566,SEQ ID NO: 568，SEQ ID NO 570, SEQ ID NO 572, SEQ ID NO 574, SEQ ID NO 576, SEQ ID NO 578, SEQ ID NO 580, SEQ ID NO 582, SEQ ID NO :584，SEQ ID NO 586, SEQ ID NO 588, SEQ ID NO 589,SEQ ID NO 590,SEQ ID NO 591,SEQ ID NO 592,SEQ ID NO 594,SEQ ID NO :604， SEQ ID NO 606,SEQ ID NO 608,SEQ ID NO 610,SEQ ID NO 612,SEQ ID NO 614,SEQ ID NO 616, SEQ ID NO 618, SEQ ID NO :620 或 SEQ ID NO :622，及其子序列和其變體，以及與本發(fā)明的示例性多肽具有至少大約50% (或更多，正如下面所描述的)序列同一性的多肽。 一方面，該多 肽具有淀粉酶活性，例如a淀粉酶或葡糖淀粉酶活性(下面進(jìn)一步描述了可選擇的淀粉酶活性)。一方面，該多肽作為免疫原或表位(epitope)發(fā)揮作用。一方面，本發(fā)明也提供了編碼淀粉酶的核酸，其共同的新穎性在于它們來(lái)源于混合培養(yǎng)物。本發(fā)明提供了從混合培養(yǎng)物分離的編碼淀粉酶的核酸，所述核酸包括在至少大約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、150、200、250、300、350、400、450、 500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、I100、I150、1200、1250、1300、 1350、1400、1450、1500、1550或更多殘基的區(qū)域內(nèi)，與本發(fā)明的示例性核酸具有至少大約 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%, 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的核酸序列，其中該核酸編碼至少一個(gè)具有淀粉酶活性的多肽，所述序列同一性通過(guò)運(yùn)用了序列比較算法的分析或通過(guò)視覺(jué)觀察來(lái)確定。一方面，本發(fā)明提供了分離自混合培養(yǎng)物的編碼淀粉酶的核酸， 所述核酸包括本發(fā)明的核酸，例如本發(fā)明的示例性核酸，例如SEQ ID N0U SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11等中所示的序列，及其子序列，例如長(zhǎng)度為至少大約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、 1450、1500或更多殘基，或基因或轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)范圍內(nèi)；或者，編碼本發(fā)明的多肽的核酸。一方面，本發(fā)明也提供了編碼淀粉酶的核酸，其共同的新穎性在于它們來(lái)源于環(huán)境來(lái)源，例如混合的環(huán)境來(lái)源。一方面，本發(fā)明也提供了從環(huán)境來(lái)源例如混合的環(huán)境來(lái)源分離的編碼淀粉酶的核酸，所述核酸包括在至少大約50、75、100、150、200、250、300、350、400、 450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、 1300、1350、1400、1450、1500、1550或更多殘基的區(qū)域內(nèi)，與本發(fā)明的示例性核酸具有至少大約 50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 %、62%、63%、 64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%, 79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的核酸序列，其中該核酸編碼至少一個(gè)具有淀粉酶活性的多肽，所述序列同一性通過(guò)運(yùn)用了序列比較算法的分析或通過(guò)視覺(jué)觀察來(lái)確定。一方面，本發(fā)明提供了分離自環(huán)境來(lái)源例如混合的環(huán)境來(lái)源的編碼淀粉酶的核酸，所述核酸包括本發(fā)明的核酸，例如本發(fā)明的示例性核酸，如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 11 等、SEQ ID NO :583、SEQ ID NO :585所示的核酸序列，及其子序列，例如長(zhǎng)度為至少大約10、15、20、25、30、35、40、 45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500 或更多殘基，或基因的全長(zhǎng)或轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)的范圍內(nèi)；或者，編碼本發(fā)明的多肽的核酸。一方面，本發(fā)明也提供了淀粉酶和編碼淀粉酶的核酸，其共同的新穎性在于它們來(lái)源于古細(xì)菌來(lái)源，包括SEQ ID NO :80(由SEQ ID NO :79編碼)、SEQ ID NO :82(由SEQ ID NO 81 編碼)、SEQ ID NO :116(由 SEQ ID NO :115 編碼)、SEQ ID NO :323(由 SEQ ID NO :322編碼)、SEQ ID NO :570(由SEQ ID NO :169編碼)的古細(xì)菌來(lái)源的淀粉酶。一方面，序列比較算法是BLAST 2. 2. 2版本算法，其中過(guò)濾設(shè)置(filtering setting)被設(shè)置為blastall-p blastp-d “nr pataa” _FF,所有其它選項(xiàng)被設(shè)置為缺省。本發(fā)明的另一個(gè)方面是分離的或重組的核酸，其包括本發(fā)明的核酸序列、與其基本上同一的序列、與其互補(bǔ)的序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基。一方面，淀粉酶活性包括a-淀粉酶活性，包括水解淀粉中的內(nèi)a-l，4_糖苷鍵， 從而產(chǎn)生更小分子量的麥芽糊精(malto-dextrins)的能力。一方面，a -淀粉酶活性包括隨機(jī)地水解淀粉中的內(nèi)部a-l，4_糖苷鍵。淀粉酶活性可以包括a-淀粉酶活性、￠-淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、1，4_ a-D-葡聚糖葡糖水解酶活性、外切淀粉酶活性、葡聚糖 a -麥芽四糖水解酶活性、麥芽糖酶活性、異麥芽糖酶活性、葡聚糖1，4，a -葡糖苷酶活性、 a -葡糖苷酶活性、蔗糖酶活性或瓊脂糖酶活性(例如3 -瓊脂糖酶活性)。淀粉酶活性可以包括水解糖苷鍵。一方面，糖苷鍵包括a-l，4_糖苷鍵。另一方面，糖苷鍵包括a-l，6_糖苷鍵。一方面,淀粉酶活性包括水解淀粉中的糖苷鍵,所述淀粉例如液化的淀粉。淀粉酶活性可以進(jìn)一步包括將糖苷鍵水解為麥芽糊精。一方面，淀粉酶活性包括從淀粉的非還原末端切割麥芽糖或D-葡萄糖單元。一方面，分離的或重組的核酸編碼具有淀粉酶活性的多肽，該多肽是熱穩(wěn)定的。 該多肽在如下溫度下可以保持淀粉酶活性從大約0°c到大約37°C或從大約37°C到大約 95°C或更高溫度——例如98°C、100°C或更高——之間的任何溫度范圍內(nèi)；大約55°C到大約85°C之間、大約70°C到大約95°C之間，或大約90°C到大約95°C之間。例如，具有如SEQ ID NO :437中所示序列的示例性多肽是熱穩(wěn)定的，在不加入鈣的情況下在100°C保持25分鐘后可以保留50%的活性。
另一方面，分離的或重組的核酸編碼具有淀粉酶活性的多肽，該多肽是耐熱的。該多肽在暴露于如下溫度后可以保持淀粉酶活性從大于37°C到大約95°C的范圍內(nèi)，或從大于55°C到大約85°C之間的任何溫度。一方面,該多肽在暴露于從大于90°C到大約95°C的溫度范圍內(nèi)的溫度和PH 4. 5后可以保留住淀粉酶活性。
本發(fā)明提供了分離的或重組的核酸，其包括在嚴(yán)緊(stringent)條件下與本發(fā)明的核酸例如本發(fā)明的示例性核酸雜交的序列，所述的示例性核酸包括如下序列中所示的序列SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :11，SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :31, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :35, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO :39, SEQ ID NO :41, SEQ ID NO :43, SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO :51, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO :55, SEQ ID NO :57, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO :61, SEQ ID NO :63, SEQ ID NO :65, SEQ ID NO :67, SEQ ID NO :69, SEQ ID NO 71, SEQ ID NO :73, SEQ ID NO :75, SEQ ID NO :77, SEQ ID NO :79, SEQ ID NO :81, SEQ ID NO 83, SEQ ID NO :85, SEQ ID NO :87, SEQ ID NO :89, SEQ ID NO :91, SEQ ID NO :93, SEQ ID NO 95,SEQ ID NO 97,SEQ ID NO 99,SEQ ID NO 101,SEQ ID NO 103,SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 109, SEQ ID NO 111,SEQ ID NO 113, SEQ ID NO 115, SEQ ID NO: 117，SEQ ID NO: 119，SEQ ID NO: 121，SEQ ID NO: 123，SEQ ID NO: 125，SEQ ID NO: 127,SEQ ID NO 129,SEQ ID NO 131,SEQ ID NO 133,SEQ ID NO 135,SEQ ID NO 137,SEQ ID NO 139, SEQ ID NO: 141，SEQ ID NO 143, SEQ ID NO: 145，SEQ ID NO: 147，SEQ ID NO: 149，SEQ ID NO :151，SEQ ID NO :153，SEQ ID NO :155，SEQ ID NO :157，SEQ ID NO :159， SEQ ID NO: 161，SEQ ID NO: 163，SEQ ID NO: 165，SEQ ID NO: 167，SEQ ID NO: 189，SEQ ID NO 191, SEQ ID NO :193, SEQ ID NO :203, SEQ ID NO :205, SEQ ID NO :207, SEQ ID NO: 209，SEQ ID NO :211，SEQ ID NO :322，SEQ ID NO :324，SEQ ID NO :326，SEQ ID NO :328， SEQ ID NO 330, SEQ ID NO :332，SEQ ID NO :334，SEQ ID NO :336，SEQ ID NO :338，SEQ ID NO 340,SEQ ID NO 342,SEQ ID NO 344,SEQ ID NO 346,SEQ ID NO 348,SEQ ID NO: 350，SEQ ID NO :352，SEQ ID NO :354，SEQ ID NO :356，SEQ ID NO :358，SEQ ID NO :360， SEQ ID NO 362, SEQ ID NO 364, SEQ ID NO 366, SEQ ID NO 368, SEQ ID NO 370, SEQ ID NO 372, SEQ ID NO :374，SEQ ID NO :376，SEQ ID NO :378，SEQ ID NO :380，SEQ ID NO 382，SEQ ID NO :384，SEQ ID NO :386，SEQ ID NO :388，SEQ ID NO :390，SEQ ID NO :392， SEQ ID NO 394, SEQ ID NO 396, SEQ ID NO 398, SEQ ID NO 400, SEQ ID NO 402, SEQ ID NO 404, SEQ ID NO :406，SEQ ID NO :408，SEQ ID NO :410，SEQ ID NO :412，SEQ ID NO 414，SEQ ID NO :416，SEQ ID NO :418，SEQ ID NO :420，SEQ ID NO :422，SEQ ID NO :424， SEQ ID NO 426,SEQ ID NO 428,SEQ ID NO 430,SEQ ID NO 432,SEQ ID NO 434,SEQ ID NO 436, SEQ ID NO 438, SEQ ID NO 440, SEQ ID NO 442, SEQ ID NO 444, SEQ ID NO 446，SEQ ID NO 448, SEQ ID NO 450, SEQ ID NO 452, SEQ ID NO 454, SEQ ID NO 456, SEQ ID NO 458, SEQ ID NO 460, SEQ ID NO 460, SEQ ID NO 462, SEQ ID NO 465, SEQ ID NO 467, SEQ ID NO 473, SEQ ID NO 475, SEQ ID NO 478, SEQ ID NO 480, SEQ ID NO 484，SEQ ID NO 486, SEQ ID NO 492, SEQ ID NO 494, SEQ ID NO 498, SEQ ID NO 500, SEQ ID NO 509,SEQ ID NO 511,SEQ ID NO 515,SEQ ID NO 517,SEQ ID NO 517,SEQ IDNO 519, SEQ ID NO 522, SEQ ID NO 524, SEQ ID NO 527, SEQ ID NO 529, SEQ ID NO 532，SEQ ID NO 534, SEQ ID NO 539, SEQ ID NO :541，SEQ ID NO 544, SEQ ID NO 546, SEQ ID NO 552, SEQ ID NO 554, SEQ ID NO 558, SEQ ID NO 560, SEQ ID NO 565, SEQ ID NO 567, SEQ ID NO :569, SEQ ID NO 571, SEQ ID NO :573, SEQ ID NO :575, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO :579, SEQ ID NO :581, SEQ ID NO :583, SEQ ID NO :585, SEQ ID NO 587, SEQ ID NO 593, SEQ ID NO 603, SEQ ID NO 605, SEQ ID NO 607, SEQ ID NO 609, SEQ ID NO 611, SEQ ID NO 613, SEQ ID NO 615, SEQ ID NO 617, SEQ ID NO :619 或 SEQ ID NO 621，或其片段或其子序列。一方面，該核酸編碼具有淀粉酶活性的多肽。該核酸的長(zhǎng)度可以是至少大約 50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、 850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、150 0 或更多殘基， 或基因的全長(zhǎng)或轉(zhuǎn)錄物的全長(zhǎng)。一方面，嚴(yán)緊條件包括洗滌步驟，包括在0.2X SSC中在大約65 °C的溫度洗滌大約15分鐘。本發(fā)明提供了核酸探針，用于鑒定編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸，其中所述探針含有核酸序列的至少大約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、 1000或更多個(gè)連續(xù)堿基，所述核酸序列包括本發(fā)明的序列或其片段或其子序列，其中所述探針通過(guò)結(jié)合或雜交來(lái)鑒定核酸。該探針可以包括寡核苷酸，該寡核苷酸含有核酸序列的至少大約10到50、大約20到60、大約30到70、大約40到80或大約60到100個(gè)連續(xù)堿基，所述核酸序列包括本發(fā)明的序列或其片段或其子序列。本發(fā)明提供了核酸探針，用于鑒定編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸，其中所述探針包括含有與本發(fā)明的核酸在至少大約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、 850、900、950、1000或更多殘基的區(qū)域內(nèi)具有至少大約50%,51 %,52%,53%,54%,55%, 56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高或完全的(100% )序列同一性的序列的核酸，其中序列同一性通過(guò)運(yùn)用序列比較算法的分析或通過(guò)視覺(jué)觀察來(lái)確定。該探針可以包括寡核苷酸，該寡核苷酸含有本發(fā)明的核酸序列或其子序列的至少大約10到50、大約20到60、大約30到70、大約40到80或大約60到100個(gè)連續(xù)堿基。本發(fā)明提供了擴(kuò)增引物序列對(duì)，用于擴(kuò)增編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸，其中該引物對(duì)能夠擴(kuò)增含有本發(fā)明的序列或其片段或子序列的核酸。擴(kuò)增引物序列對(duì)的一個(gè)或每一個(gè)成員可以包括寡核苷酸，該寡核苷酸包括該序列的至少大約10到50個(gè)連續(xù)堿基。本發(fā)明提供了擴(kuò)增核酸的方法，其中所述核酸編碼具有淀粉酶活性的多肽，所述方法包括用能擴(kuò)增本發(fā)明的核酸序列或其片段或子序列的擴(kuò)增引物序列對(duì)擴(kuò)增模板核酸。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸或其子序列的表達(dá)序列盒。一方面，表達(dá)序列盒可以包含可操作地連接到啟動(dòng)子上的核酸。啟動(dòng)子可以是病毒、細(xì)菌、哺乳動(dòng)物或植物啟動(dòng)子。一方面，植物啟動(dòng)子可以是馬鈴薯、稻、玉米、小麥、煙草或大麥啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子可以包括CaMV35S。另一方面，啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。一方面，啟動(dòng)子可以是組織特異性啟動(dòng)子或環(huán)境調(diào)節(jié)型或發(fā)育調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。因此，啟動(dòng)子可以是，例如種子特異性、葉特異性、根特異性、莖特異性或脫落誘導(dǎo)啟動(dòng)子。一方面，表達(dá)序列盒可以進(jìn)一步包括植物或植物病毒表達(dá)載體。本發(fā)明提供了克隆媒介物，包括本發(fā)明的表達(dá)序列盒(例如載體)或本發(fā)明的核酸?？寺≥d體可以是病毒載體、質(zhì)粒、曬菌體(phage)、卩遼粒、粘粒(cosmid)、fos_質(zhì)粒 (fosmid)、細(xì)菌曬菌體(bacteriophage)或人工染色體。病毒載體可以包括腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺相關(guān)病毒載體。克隆載體可以包括細(xì)菌人工染色體(BAC)、質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體Pl衍生載體(PAC)、酵母人工染色體(YAC)或哺乳動(dòng)物人工染色體(MAC)。
本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述核酸或本發(fā)明所述表達(dá)序列盒(例如載體)或本發(fā)明所述克隆載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一方面，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、 酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或植物細(xì)胞。一方面，植物細(xì)胞可以是馬鈴薯、小麥、稻、玉米、煙草或大麥細(xì)胞。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述核酸或本發(fā)明所述表達(dá)序列盒(例如載體)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。一方面，該動(dòng)物是小鼠。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述核酸或本發(fā)明所述表達(dá)序列盒(例如載體)的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物可以是玉米植物、馬鈴薯植物、番茄植物、小麥植物、含油種子植物、油菜籽植物、大豆植物、水稻植物、大麥植物或煙草植物。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述核酸或本發(fā)明所述表達(dá)序列盒(例如載體)的轉(zhuǎn)基因種子。轉(zhuǎn)基因種子可以是玉米種子、小麥粒、含油種子、油菜籽、大豆種子、棕櫚核、向日葵種子、芝麻種子、花生或煙草植物種子。本發(fā)明提供了包含與本發(fā)明的核酸互補(bǔ)的核酸序列或能與本發(fā)明的核酸在嚴(yán)緊條件下雜交的核酸序列的反義寡核苷酸。本發(fā)明提供了抑制淀粉酶信息在細(xì)胞中翻譯的方法，該方法包括給細(xì)胞施用反義寡核苷酸或在細(xì)胞中表達(dá)反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸包括與本發(fā)明的核酸互補(bǔ)的核酸序列或能與本發(fā)明的核酸在嚴(yán)緊條件下雜交的核酸序列。本發(fā)明提供了分離的或重組的多肽，其包括在至少大約10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、 1450、1500、1550或更多個(gè)殘基的區(qū)域內(nèi)或者在多肽的全長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)，與本發(fā)明的示例性多肽或肽具有至少大約 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%, 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%, 77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的氨基酸序列，序列同一性通過(guò)運(yùn)用序列比較算法的分析或通過(guò)視覺(jué)觀察來(lái)確定。本發(fā)明的示例性多肽或肽序列包括 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO etc C C V-ZiV VJ..L etc _■ C V_/i\L C h etc C C V_/i\L C h etc Ce < V-ZiV VJ..L etc C C V-ZiV VJ..L etc
^81 ON S OMgl^ool § SafMg^001 § SafMg0^001 § SafMg 工001 § S OMg "ON S ss^z 寸=on S SS^ZI on S Ssjzion S SSdZION Sofas 二卜寸"on S 53S0Z10N S 53S^9^.0N S 53soo^9^.0N S 53^9910 S 53S^910N S 53s^9 寸 ON S OMg -0.. § S OMg -0.. § S OMg § S OMg - § S OMgl^LOl §
2afMs^LOION S 5MS 二loion S QI i-3" QI 53sl^3"0N S OMg S寸寸=§ ai Ms a 寸寸=§ ai Ms § ai 03s § ai 03s Gs 寸=§ ai 03s dco寸 ON S OMg 工Co= § S OMg -§ § S OMg § S OMg § S OMg §
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QI SS^OO^.ON S SS^OO^.ON S ssl^oo^.ON S SS^OO^.ON S SSaSS=ON S OMg a^z" .ON S OMg § S OMg § S OMg § S §00工卜工 § S OMg -I =ON S OMg -s.. O^ S OMg " O^ S OMOO~2" .§ S oMg 工 gco"§ S oMg^Loco"^ QIafMs^LO^.ON S ssi^lo^.on SafMs^LOcoJN S SSaSS=ON S i-i" O^ QI 5MS ^寸工 ON S OMg § S OMg § S OMg § S OMgo^coco" § S OMg <coco ON S OMgl^co" .§ S OMgo^co" .§ S OMg 工Co" .§ S OMg § S OMg - § QI SSGZC=ON S SSlSC=ON S SS^T^.ON S 53S0T70N S 53soo^0^.0N S OMg ON qhhomoos.. § qhhomoo§ qhhomood2" § qhhomoo02" § QHHOMOO00^2 =ON OHHOMOOd2"§qhhomooi2"§ OHHOMOOd2"§ OHHOMOO02" § OHHOMOOoo^s" § ai 53^991" ON S ss^LOr ON SafMso^LOT" ON S ssoLOr ON S SSSH" ON S OMg
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ai 53S 59= § ai 53S 69= § ai 5MS ^9= § ai 5MS <9= § ai 5MS09= § ai 5MSOO^LO X62/TT V SLO8T9ST zo572，SEQ ID NO 574, SEQ ID NO 576, SEQ ID NO 578, SEQ ID NO 580, SEQ ID NO 582, SEQ ID NO 584, SEQ ID NO 586, SEQ ID NO 588, SEQ ID NO 589, SEQ ID NO 590, SEQ ID NO 591, SEQ ID NO 592, SEQ ID NO 594, SEQ ID NO 604, SEQ ID NO 606, SEQ ID NO 608, SEQ ID NO 610, SEQ ID NO 612, SEQ ID NO 614, SEQ ID NO 616, SEQ ID NO 618, SEQ ID NO :620或SEQ ID NO :622，及其子序列和其變體，例如長(zhǎng)度為至少大約10、15、20、 25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550 或更多個(gè)殘基，或者為酶的全長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)。本發(fā)明的示例性多肽或肽序列包括由本發(fā)明的核酸編碼的序列。本發(fā)明的示例性多肽或肽序列包括由本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合的多肽或肽。 一方面，本發(fā)明的多肽具有至少一種淀粉酶活性，例如a淀粉酶活性。本發(fā)明的另一方面是分離的或重組的多肽或肽，包括本發(fā)明的多肽或肽序列、與其基本上同一的序列、與其互補(bǔ)的序列的至少10個(gè)連續(xù)堿基。一方面，本發(fā)明的多肽或肽的淀粉酶活性包括a -淀粉酶活性，包括水解淀粉中的內(nèi)a-1，4-糖苷鍵，以產(chǎn)生更小分子量的麥芽糊精的能力。一方面，a-淀粉酶活性包括隨機(jī)地水解淀粉中的內(nèi)部a-l，4_糖苷鍵。淀粉酶活性可以包括葡糖淀粉酶活性、1， 4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶活性、a -淀粉酶活性、外切淀粉酶活性或P -淀粉酶活性。淀粉酶活性可以包括水解糖苷鍵。一方面，糖苷鍵包括a-l，4-糖苷鍵。另一方面，糖苷鍵包括a -1,6-糖苷鍵。一方面,淀粉酶活性包括水解淀粉中的糖苷鍵,所述淀粉例如液化的淀粉。淀粉酶活性可以進(jìn)一步包括將糖苷鍵水解為麥芽糊精。一方面，淀粉酶活性包括從淀粉的非還原末端切割麥芽糖或D-葡萄糖單元。
一方面，本發(fā)明的淀粉酶活性包括葡糖淀粉酶活性，包括催化糖苷鍵的水解。本發(fā)明的葡糖淀粉酶活性可以包括催化D-葡萄糖從淀粉或其它相關(guān)糊精的非還原末端逐步水解釋放。葡糖淀粉酶活性可以包括1，4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶活性。葡糖淀粉酶活性可以包括催化導(dǎo)致產(chǎn)生游離葡萄糖的麥芽糊精水解。葡糖淀粉酶活性可以包括外切淀粉酶活性。葡糖淀粉酶活性可以包括a-淀粉酶或3 -淀粉酶活性。被水解的糖苷鍵可以包括 ^，^糖苷鍵或^^-糖苷鍵。葡糖淀粉酶活性可以包括水解淀粉中的糖苷鍵。葡糖淀粉酶活性可以進(jìn)一步包括水解淀粉中的糖苷鍵，以產(chǎn)生麥芽糊精。葡糖淀粉酶活性可以包括從淀粉的非還原末端切割出麥芽糖或D-葡萄糖單元。一方面，淀粉酶活性可以是熱穩(wěn)定的。該多肽在如下溫度可以保持淀粉酶活性從大約37 °C到大約95 °C之間、大約55 °C到大約85 °C之間、大約70 °C到大約95 °C之間、或大約 90°C到大約95°C之間的溫度。另一方面，淀粉酶活性可以是耐熱的。該多肽在暴露于從大于37°C到大約95°C的范圍內(nèi)或從大于55°C到大約85°C的范圍內(nèi)的溫度后可以保持淀粉酶活性。一方面，該多肽在暴露于大于90°C到大約95°C的范圍內(nèi)的溫度和pH 4. 5后可以保持淀粉酶活性。一方面，分離的或重組的多肽可以包括本發(fā)明的缺少信號(hào)序列的多肽。一方面，分離的或重組的多肽可以包括本發(fā)明的含有異源信號(hào)序列的多肽，所述異源信號(hào)序列例如異源淀粉酶或非淀粉酶信號(hào)序列。一方面，本發(fā)明提供了包括在表3中所示的肽的信號(hào)序列。一方面，本發(fā)明提供了由在表3中所示的肽組成的信號(hào)序列。一方面，本發(fā)明提供了嵌合蛋白，其包括含有本發(fā)明的信號(hào)序列的第一結(jié)構(gòu)域和至少第二結(jié)構(gòu)域。該蛋白可以是融合蛋白。第二結(jié)構(gòu)域可以包括酶。該酶可以是淀粉酶(例如本發(fā)明的淀粉酶或者其它的淀粉酶)。一方面，淀粉酶活性包括在大約37°C每毫克蛋白大約10到大約10，000單位，或每毫克蛋白大約100到大約1000單位的范圍內(nèi)的比活性。另一方面，淀粉酶活性包括每毫克蛋白從大約500到大約750單位的比活性?？梢赃x擇地，淀粉酶活性包括在37°C每毫克蛋白從大約500到大約1200單位的范圍內(nèi)的比活性。一方面，淀粉酶活性包括在37°C每毫克蛋白從大約750到大約1000單位的范圍內(nèi)的比活性。另一方面，耐熱性包括在被加熱到高溫后，保持在37°C時(shí)淀粉酶比活性的至少一半的比活性?？梢赃x擇地，耐熱性可以包括在被加熱到高溫后，保持在37°C的每毫克蛋白從大約500到大約1200單位的范圍內(nèi)的比活性。本發(fā)明提供了本發(fā)明的分離的或重組的多肽，其中所述多肽包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。一方面，糖基化可以是N-連接糖基化。一方面,多肽可以在畢赤酵母(P.pastoris) 或裂 變酵母(S.pombe)中被表達(dá)后被糖基化。本發(fā)明也提供了將糖基化加入到多肽的方法，或者通過(guò)翻譯后加工或者通過(guò)化學(xué)方法，從而改變多肽的性質(zhì)，例如其熱穩(wěn)定性、可溶性、聚集的傾向以及類似性質(zhì)。一方面，多肽可以在包括大約pH 6. 5,pH 6、pH 5. 5,pH 5、pH 4. 5或pH 4的條件下保持淀粉酶活性。另一方面，多肽可以在包括大約pH 7、pH 7. 5、pH 8.0, pH 8. 5、pH 9、 pH 9. 5、pH 10、pH 10. 5或pH 11的條件下保持淀粉酶活性。本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的多肽的蛋白制劑，其中該蛋白制劑包括液體、固體或凝膠。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽和第二結(jié)構(gòu)域的異二聚體。一方面，第二域結(jié)構(gòu)可以是多肽，異源二聚體可以是融合蛋白。一方面，第二結(jié)構(gòu)域可以是表位(epitope)或標(biāo)記物。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的同型二聚體。本發(fā)明提供了具有淀粉酶活性的固定化多肽，其中所述多肽包括本發(fā)明的多肽、 由本發(fā)明的核酸編碼的多肽、或含有本發(fā)明的多肽和第二結(jié)構(gòu)域的多肽。一方面，多肽可以被固定在細(xì)胞、金屬、樹(shù)脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微電極、石墨顆粒、珠子、凝膠、平板、陣列或毛細(xì)管上。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的固定化核酸的陣列。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗體的陣列。本發(fā)明提供了分離的或重組的抗體，其與本發(fā)明的多肽或與由本發(fā)明的核酸編碼的多肽特異性結(jié)合。該抗體可以是單克隆或多克隆抗體。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗體的雜交瘤，所述抗體例如，與本發(fā)明的多肽或與由本發(fā)明的核酸編碼的多肽特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的用于動(dòng)物的食物添加劑，所述多肽例如由本發(fā)明的核酸編碼的多肽。一方面，食物添加劑中的多肽可以是糖基化的。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的可食用的酶?jìng)鬟f基質(zhì)(enzyme delivery matrices),所述多肽例如由本發(fā)明的核酸編碼的多肽。一方面，傳遞基質(zhì)包括顆粒狀物。一方面，多肽可以被糖基化。一方面，淀粉酶活性是耐熱的。另一方面，淀粉酶活性是熱穩(wěn)定的。本發(fā)明提供了分離或鑒定具有淀粉酶活性的多肽的方法，該方法包括如下步驟
(a)提供本發(fā)明的抗體；(b)提供包含多肽的樣品；和(C)將步驟(b)的樣品與步驟(a)的抗體在該抗體能與多肽特異性結(jié)合的條件下接觸，從而分離或鑒定具有淀粉酶活性的多肽。本發(fā)明提供了制備抗淀粉酶抗體的方法，該方法包括以足夠的量向非人動(dòng)物施用本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的多肽或其子序列，所述的量足以產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，由此制備抗淀粉酶抗體。本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗淀粉酶免疫的方法，該方法包括以足夠的量向非人動(dòng)物施用本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的多肽或其子序列，所述量足以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供了產(chǎn)生重組多肽的方法，包括如下步驟(a)提供與啟動(dòng)子可操作地連接的本發(fā)明的核酸；和(b)在允許多肽表達(dá)的條件下表達(dá)步驟(a)的核酸，從而產(chǎn)生重組多肽。一方面，該方法進(jìn)一步包括用步驟(a)的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，隨后表達(dá)步驟(a)的核酸，從而在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中產(chǎn)生重組多肽。本發(fā)明提供了用于鑒定具有淀粉酶活性的多肽的方法，該方法包括如下步驟 (a)提供本發(fā)明的多肽；或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽；(b)提供淀粉酶底物；和 (C)用步驟(b)的底物接觸步驟(a)的多肽或其片段或其變體，并且檢測(cè)底物量的降低或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加，其中底物量的降低或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加檢測(cè)出具有淀粉酶活性的多肽。 一方面，底物可以是淀粉，例如液化的淀粉。本發(fā)明提供了用于鑒定淀粉酶底物的方法，包括如下步驟(a)提供本發(fā)明的多肽；或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽；(b)提供測(cè)試底物；和(C)用步驟(b)的測(cè)試底物接觸步驟(a)的多肽，并且檢測(cè)底物量的降低或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加，其中底物量的降低或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加檢測(cè)出作為淀粉酶底物的測(cè)試底物。本發(fā)明提供了確定測(cè)試化合物是否與多肽特異性結(jié)合的方法，包括如下步驟(a) 在允許核酸翻譯為多肽的條件下表達(dá)核酸或包含核酸的載體，其中所述核酸包括本發(fā)明的核酸，或提供本發(fā)明的多肽；(b)提供測(cè)試化合物；(c)用測(cè)試化合物接觸多肽；和(d)確定步驟(b)的測(cè)試化合物是否與多肽特異性結(jié)合。本發(fā)明提供了用于鑒定淀粉酶活性的調(diào)節(jié)劑的方法，包括如下步驟(a)提供本發(fā)明的多肽，或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽；(b)提供測(cè)試化合物；和(C)用步驟(b)的測(cè)試化合物接觸步驟(a)的多肽，并測(cè)定淀粉酶的活性，其中在存在測(cè)試化合物的情況下測(cè)定的淀粉酶活性與不存在測(cè)試化合物的情況下測(cè)定的活性相比的變化，提供了該測(cè)試化合物調(diào)節(jié)淀粉酶活性的測(cè)定法。一方面，淀粉酶活性可以通過(guò)提供淀粉酶底物并檢測(cè)底物量的降低或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加，或底物量的增加或反應(yīng)產(chǎn)物量的降低來(lái)測(cè)量。與沒(méi)有測(cè)試化合物時(shí)底物或反應(yīng)產(chǎn)物的量相比，有測(cè)試化合物時(shí)底物量的降低或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加鑒定出作為淀粉酶活性的激活劑的測(cè)試化合物。與沒(méi)有測(cè)試化合物時(shí)底物或反應(yīng)產(chǎn)物量相比， 有測(cè)試化合物時(shí)底物量的增加或反應(yīng)產(chǎn)物量的降低鑒定出作為淀粉酶活性的抑制劑的測(cè)試化合物。本發(fā)明提供了計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括處理器和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備，其中所述數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備上已經(jīng)存儲(chǔ)了本發(fā)明的多肽序列或核酸序列(例如由本發(fā)明的核酸編碼的多肽)。 一方面，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括序列比較算法和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備，其中數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備上已經(jīng)存儲(chǔ)了至少一個(gè)參考序列。另一方面，序列比較算法包括可指出多態(tài)現(xiàn)象的計(jì)算機(jī)程序。一方面，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括在所述序列中鑒定一個(gè)或多個(gè)特征的鑒定器 (identifier)。本發(fā)明提供了計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其上已經(jīng)存儲(chǔ)了本發(fā)明的多肽序列或核酸序列。本發(fā)明提供了用于鑒定序列中的特征的方法，包括如下步驟(a)使用可鑒定序列中的一個(gè)或多個(gè)特征的計(jì)算機(jī)程序讀取序列，其中所述序列包括本發(fā)明的多肽序列或核酸序列；和(b)用所述計(jì)算機(jī)程序鑒定序列中的一個(gè)或多個(gè)特征。本發(fā)明提供了將第一個(gè)序列與第二個(gè)序列進(jìn)行比較的方法，包括如下步驟(a)通過(guò)使用可比較序列的計(jì)算機(jī)程序讀取第一個(gè)序列和第二個(gè)序列，其中第一個(gè)序列包括本發(fā)明的多肽序列或核酸序列；和(b) 用所述計(jì)算機(jī)程序確定第一個(gè)序列和第二個(gè)序列之間的差異。確定第一個(gè)序列和第二個(gè)序列之間差異的步驟可以進(jìn)一步包括鑒定多態(tài)性的步驟。一方面，該方法可以進(jìn)一步包括可鑒定序列中的一個(gè)或多個(gè)特征的鑒定器。另一 方面，該方法可以包括使用計(jì)算機(jī)程序讀取第一個(gè)序列，并鑒定該序列的一個(gè)或多個(gè)特征。本發(fā)明提供了從環(huán)境樣品中分離或回收核酸的方法，所述核酸編碼具有淀粉酶活性的多肽，該方法包括如下步驟(a)提供用于擴(kuò)增編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸的擴(kuò)增引物序列對(duì)，其中所述引物對(duì)能擴(kuò)增本發(fā)明的核酸；(b)從環(huán)境樣品中分離核酸，或處理環(huán)境樣品，以便樣品中的核酸易于與擴(kuò)增引物對(duì)雜交；和(C)將步驟(a)的擴(kuò)增引物對(duì)與步驟(b)的核酸結(jié)合，并從環(huán)境樣品中擴(kuò)增核酸，從而從環(huán)境樣品中分離或回收編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸。擴(kuò)增引物對(duì)的一個(gè)或每一成員可以包括寡核苷酸，該寡核苷酸包含本發(fā)明的序列的至少大約10到50個(gè)連續(xù)堿基。本發(fā)明提供了從環(huán)境樣品中分離或回收核酸的方法，所述核酸編碼具有淀粉酶活性的多肽，該方法包括如下步驟(a)提供包含本發(fā)明的核酸或其子序列的多核苷酸探針； (b)從環(huán)境樣品分離核酸，或處理環(huán)境樣品，以便樣品中的核酸易于與步驟(a)的多核苷酸探針雜交；(C)將步驟(a)的多核苷酸探針與步驟(b)的分離的核酸或處理的環(huán)境樣品結(jié)合；和(d)分離與步驟(a)的多核苷酸探針特異性雜交的核酸，從而從環(huán)境樣品中分離或回收編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸。環(huán)境樣品可以包括水樣品、液體樣品、土壤樣品、空氣樣品或生物樣品。一方面，生物樣品可以來(lái)源于細(xì)菌細(xì)胞、原生動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明提供了產(chǎn)生編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸變體的方法，該方法包括如下步驟(a)提供包括本發(fā)明的核酸的模板核酸；和(b)在模板序列中修飾、刪除或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，或進(jìn)行修飾、刪除和添加的組合，以產(chǎn)生模板核酸的變體。一方面，該方法可以進(jìn)一步包括表達(dá)變體核酸，以產(chǎn)生變體淀粉酶多肽。修飾、添加或刪除通過(guò)包括如下方法中的方法來(lái)引入易錯(cuò)PCR、重排(shuffling)、寡核苷酸誘導(dǎo)的定向突變、裝配PCR、 有性PCR誘變、體內(nèi)誘變、盒式誘變、遞歸整體誘變(recursive ensemble mutagenesis)、 指數(shù)整體誘變、位點(diǎn)特異性誘變、基因再裝配、基因位點(diǎn)飽和誘變(GSSM)、合成連接重裝配 (SLR)或其組合。另一方面，修飾、添加或刪除通過(guò)如下方法的方法引入包括重組、遞歸序列重組、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、含尿卩密唳模板誘變、缺口雙重誘變(gapped duplex mutagenesis)、點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)誘變、修復(fù)缺陷型宿主株誘變、化學(xué)誘變、放射誘變、缺失誘變、 限制選擇誘變、限制純化誘變、人工基因合成、整體誘變、嵌合核酸多聚體生成及其組合。一方面，該方法可以被反復(fù)重復(fù)，直到產(chǎn)生與模板核酸編碼的多肽相比具有改變的或不同的活性或者改變的或不同的穩(wěn)定性的淀粉酶。一方面，變體淀粉酶多肽是耐熱的， 在暴露于增高的溫度之后可以保持一些活性。另一方面，與模板核酸編碼的淀粉酶相比，變體淀粉酶多肽具有增加的糖基化。可以選擇地，變體淀粉酶多肽在高溫下具有淀粉酶活性，而由模板核酸編碼的淀粉酶在高溫下沒(méi)有活性。一方面，該方法可以被反復(fù)重復(fù)，直到產(chǎn)生具有與模板核酸的密碼子使用有所不同的密碼子使用的淀粉酶編碼序列。另一方面，該方法可以被反復(fù)重復(fù)，直到產(chǎn)生具有比模板核酸的信息表達(dá)或穩(wěn)定性更高或更低水平的信息表達(dá)或穩(wěn)定性的淀粉酶基因。本發(fā)明提供了在編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸中修飾密碼子以增加其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的方法，該方法包括如下步驟(a)提供編碼具有淀粉酶活性的多肽的本發(fā)明的核酸；和(b)鑒定步驟(a)的核酸中非優(yōu)選或較不優(yōu)選的密碼子，用優(yōu)選的或中度使用(neutrally used)的密碼子來(lái)代替,所述優(yōu)選或中度使用的密碼子編碼與被取代的密碼子相同的氨基酸，其中優(yōu)選密碼子是在宿主細(xì)胞的基因的編碼序列中過(guò)度表現(xiàn)的密碼子， 非優(yōu)選或較不優(yōu)選密碼子是在宿主細(xì)胞的基因的編碼序列中表現(xiàn)不足的密碼子，從而修飾核酸以增加其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明提供了在編碼具有 淀粉酶活性的多肽的核酸中修飾密碼子的方法，該方法包括如下步驟(a)提供本發(fā)明的核酸；和(b)鑒定步驟(a)的核酸中的密碼子，并用不同的密碼子來(lái)代替，所述不同的密碼子編碼與被取代的密碼子相同的氨基酸，從而修飾在編碼淀粉酶的核酸中的密碼子。本發(fā)明提供了在編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸中修飾密碼子以增加其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的方法，該方法包括如下步驟(a)提供編碼淀粉酶多肽的本發(fā)明核酸；和
(b)鑒定步驟(a)的核酸中的非優(yōu)選或較不優(yōu)選密碼子，并用優(yōu)選的或中度使用的密碼子來(lái)代替，所述優(yōu)選或中度使用的密碼子編碼與被取代的密碼子相同的氨基酸，其中優(yōu)選密碼子是在宿主細(xì)胞的基因的編碼序列中過(guò)度表現(xiàn)的密碼子，非優(yōu)選或較不優(yōu)選密碼子是在宿主細(xì)胞的基因的編碼序列中表現(xiàn)不足的密碼子，從而修飾核酸以增加其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明提供了在編碼具有淀粉酶活性的多肽的核酸中修飾密碼子以降低其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的方法，該方法包括如下步驟(a)提供本發(fā)明的核酸；和(b)鑒定步驟 (a)的核酸中的至少一個(gè)優(yōu)選密碼子，并用非優(yōu)選的或較不優(yōu)選的密碼子來(lái)代替，所述非優(yōu)選或較不優(yōu)選的密碼子編碼與被取代的密碼子相同的氨基酸，其中優(yōu)選密碼子是在宿主細(xì)胞的基因的編碼序列中過(guò)度表現(xiàn)的密碼子，非優(yōu)選或較不優(yōu)選的密碼子是在宿主細(xì)胞的基因的編碼序列中表現(xiàn)不足的密碼子，從而修飾核酸以降低其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。一方面， 宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生核酸文庫(kù)的方法，所述核酸編碼一系列的被修飾的淀粉酶活性位點(diǎn)或底物結(jié)合位點(diǎn)，其中被修飾的活性位點(diǎn)或底物結(jié)合位點(diǎn)來(lái)源于第一核酸，所述第一核酸包含編碼第一活性位點(diǎn)或第一底物結(jié)合位點(diǎn)的序列，該方法包括如下步驟
(a)提供第一核酸，其編碼第一活性位點(diǎn)或第一底物結(jié)合位點(diǎn)，其中第一核酸序列包括在嚴(yán)緊條件下與本發(fā)明的核酸雜交的序列，所述核酸編碼淀粉酶活性位點(diǎn)或淀粉酶底物結(jié)合位點(diǎn)；(b)提供一組誘變寡核苷酸，其在第一核酸的多個(gè)目標(biāo)密碼子處編碼天然發(fā)生的氨基酸變體；和(c)使用該組誘變寡核苷酸，產(chǎn)生一組編碼活性位點(diǎn)或編碼底物結(jié)合位點(diǎn)的變體核酸，其在被誘變的每一氨基酸密碼子處編碼一定范圍的氨基酸變化，從而產(chǎn)生編碼多個(gè)被修飾的淀粉酶活性位點(diǎn)或底物結(jié)合位點(diǎn)的核酸文庫(kù)。一方面，該方法包括通過(guò)包括如下方法中的方法誘變步驟(a)的第一核酸優(yōu)化的定向進(jìn)化系統(tǒng)、基因位點(diǎn)飽和誘變(GSSM)、合成連接重裝配(SLR)、易錯(cuò)PCR、重排、寡核苷酸誘導(dǎo)的定向突變、裝配PCR、有性PCR誘變、體內(nèi)誘變、盒式誘變、遞歸整體誘變、指數(shù)整體誘變、位點(diǎn)特異性誘變、基因再裝配、基因位點(diǎn)飽和誘變(GSSM)、合成連接重裝配(SLR)及其組合。另一方面，該方法包括通過(guò)如下方法中的方法誘變步驟(a)的第一核酸或變體重組、遞歸序列重組、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、含尿嘧啶模板誘變、缺口雙重誘變、點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)誘變、修復(fù)缺陷型宿主株誘變、化學(xué)誘變、放射誘變、缺失誘變、限制選擇誘變、限制純化誘變、人工基因合成、整體誘變、嵌合核酸多聚體生成及其組合。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生小分子的方法，包括如下步驟(a)提供多個(gè)能合成或修飾小分子的生物合成酶，其中這些酶中的一種酶包括由本發(fā)明的核酸編碼的淀粉酶；(b)為步驟(a)的至少一種酶提供底物；和(C)將步驟(b)的底物與這些酶在能促進(jìn)多個(gè)生物催化反應(yīng)的條件下通過(guò)一系列生物催化反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)，以產(chǎn)生小分子。本發(fā)明提供了修飾小分子的方法，包括如下步驟(a)提供淀粉酶，其中該酶包括本發(fā)明的多肽，或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽，或其子序列；(b)提供小分子；和(C)將步驟(b)的小分子與步驟(a)的酶在能促進(jìn)由淀粉酶催化的酶促反應(yīng)的條件下進(jìn)行反應(yīng)，從而通過(guò)淀粉酶酶促反應(yīng)修飾小分子。一方面，該方法可以包括為步驟(a)的酶提供多個(gè)小分子底物，從而產(chǎn)生由淀粉酶催化的至少一種酶促反應(yīng)產(chǎn)生的被修飾小分子的文庫(kù)。一方面，該方法可以包括多個(gè)其它的酶， 在有助于這些酶介導(dǎo)的多個(gè)生物催化反應(yīng)的條件下使用這些酶，以形成由多個(gè)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的被修飾小分子的文庫(kù)。另一方面，該方法可以進(jìn)一步包括測(cè)試該文庫(kù)以確定該文庫(kù)中是否存在表現(xiàn)出期望活性的特定被修飾小分子的步驟。測(cè)試該文庫(kù)的步驟可以進(jìn)一步包括系統(tǒng)地去除所有但保留一個(gè)用于產(chǎn)生文庫(kù)中多個(gè)被修飾小分子中的一部分的生物催化反應(yīng)，方法是通過(guò)測(cè)試被修飾小分子的所述部分中存在或不存在具有期望活性的特定被修飾小分子，鑒定出產(chǎn)生具有期望活性的特定修飾小分子的至少一個(gè)特異性生物催化反應(yīng)。本發(fā)明提供了確定淀粉酶的功能片段的方法，包括如下步驟(a)提供淀粉酶，其中該酶包括本發(fā)明的多肽、或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽、或其子序列；和(b)從步驟(a) 的序列刪除多個(gè)氨基酸殘基，并測(cè)試剩余的子序列的淀粉酶活性，從而確定淀粉酶的功能片段。一方面，淀粉酶活性通過(guò)提供淀粉酶底物并檢測(cè)底物量的降低或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加來(lái)測(cè)量。本發(fā)明提供了通過(guò)使用實(shí)時(shí)代謝流量(real-time metabolic flux)分析進(jìn)行新的或修飾的表現(xiàn)型的全細(xì)胞工程的方法，該方法包括如下步驟(a)通過(guò)修飾細(xì)胞的遺傳組成產(chǎn)生修飾的細(xì)胞，其中遺傳組成通過(guò)將本發(fā)明的核酸加入到細(xì)胞來(lái)修飾；(b)培養(yǎng)修飾的細(xì)胞以產(chǎn)生多個(gè)修飾的細(xì)胞；(C)通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控步驟(b)的細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)測(cè)量該細(xì)胞的至少一個(gè)代謝參數(shù)；和(d)分析步驟(c)的數(shù)據(jù)，以確定被測(cè)量的參數(shù)是否與在類似條件下未修飾細(xì)胞中的參照測(cè)量值不同，從而使用實(shí)時(shí)代謝流量分析鑒定細(xì)胞中的工程表現(xiàn)型。一方面，細(xì)胞的遺傳組成可以通過(guò)包括在細(xì)胞中刪除一個(gè)序列或修飾一個(gè)序列，或敲除基因的表達(dá)的方法來(lái)修飾。一方面，該方法可以進(jìn)一步包括選擇含有新的工程表現(xiàn)型的細(xì)胞。另一方面，該方法可以包括培養(yǎng)被選擇的細(xì)胞，從而產(chǎn)生包含新的工程表型的新細(xì)胞株。本發(fā)明提供了水解淀粉的方法，包括如下步驟(a)提供具有淀粉酶活性的多肽， 其中所述多肽包括本發(fā)明的多肽；(b)提供包含淀粉的組合物；和(C)用步驟(b)的組合物在所述多肽可水解淀粉的條件下接觸步驟(a)的多肽。一方面，含有淀粉的組合物包括 a-I，4-糖苷鍵或a-I，6-糖苷鍵。一方面，淀粉酶活性是a-淀粉酶活性。一方面，a-淀粉酶活性水解淀粉或其它多糖中的內(nèi)部鍵。本發(fā)明提供了從組合物中液化或去除淀粉的方法，包括如下步驟(a)提供具有淀粉酶活性的多肽，其中所述多肽包括本發(fā)明的多肽；(b)提供包含有淀粉的組合物；和 (C)用步驟(b)的組合物在該多肽可去除或液化淀粉的條件下接觸步驟(a)的多肽。本發(fā)明提供了增加淀粉酶多肽的耐熱性或熱穩(wěn)定性的方法，該方法包括糖基化淀粉酶多肽，其中該多肽包括本發(fā)明的多肽或由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽的至少三十個(gè)連續(xù)氨基酸，從而增加淀粉酶多肽的耐熱性或熱穩(wěn)定性。一方面，淀粉酶比活性可以在大于大約37°C到大約95°C的溫度范圍內(nèi)是熱穩(wěn)定的或耐熱的。本發(fā)明提供了在細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)重組淀粉酶多肽的方法，該方法包括表達(dá)含有核酸的載體，該核酸包括本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的核酸序列，其中序列同一性通過(guò)使用序列比較算法的分析或通過(guò)視覺(jué)觀察來(lái)確定，其中過(guò)度表達(dá)通過(guò)使用高活性啟動(dòng)子、雙順?lè)醋?(dicistronic)載體或通過(guò)該載體的基因擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽的去污劑組合物， 其中所述多肽包括淀粉酶活性。一方面，淀粉酶可以是非表面活性淀粉酶。另一方面，淀粉酶可以是表面活性淀粉酶。本發(fā)明提供了洗滌目標(biāo)物體的方法，該方法包括如下步驟(a)提供包含具有淀粉酶活性的多肽的組合物，其中所述多肽包括本發(fā)明的多肽或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽；(b)提供目標(biāo)物體；和(C)在組合物可以洗滌目標(biāo)物體的條件下用步驟(b)的目標(biāo)物體接觸步驟(a)的多肽。本發(fā)明提供了在被動(dòng)物食用之前水解淀粉的方法，例如水解在飼料或食品中的淀粉，該方法包括如下步驟(a)獲得包含淀粉的組合物，例如飼料材料，其中多肽包括本發(fā)明的多肽或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽；和(b)在足夠長(zhǎng)的時(shí)間期間將足量步驟(a)的多肽加入到組合物，例如飼料或食物材料中，以導(dǎo)致淀粉的水解，從而水解淀粉。一方面，食物或飼料包括稻、玉米、大麥、小麥、豆類或馬鈴薯。本發(fā)明提供了用于織物脫漿的方法，該方法包括如下步驟(a)提供具有淀粉酶活性的多肽，其中該多肽包括本發(fā)明的多肽或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽；(b)提供織物； 和(C)在淀粉酶可以使織物脫漿的條件下用步驟(b)的織物接觸步驟(a)的多肽。本發(fā)明提供了用于紙或纖維的脫墨的方法，該方法包括如下步驟(a)提供具有淀粉酶活性的多肽，其中該多肽包括本發(fā)明的多肽；(b)提供含有紙或纖維的組合物；和 (C)在多肽可以使紙或纖維脫墨的條件下用步驟(b)的組合物接觸步驟(a)的多肽。本發(fā)明提供了處理木素纖維素纖維的方法，該方法包括如下步驟(a)提供具有淀粉酶活性的多肽，其中該多肽包括本發(fā)明的多肽；(b)提供木素纖維素纖維；和(C)在多肽可以處理纖維的條件下用步驟(b)的纖維接觸步驟(a)的多肽，從而改進(jìn)纖維性質(zhì)。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生高麥芽糖或高葡萄糖糖漿的方法，該方法包括如下步驟(a) 提供具有淀粉酶活性的多肽，其中該多肽包括本發(fā)明的酶；(b)提供含有淀粉的組合物；和 (C)在步驟(a)的多肽可以液化步驟(b)的組合物從而產(chǎn)生可溶的淀粉水解產(chǎn)物，并且可以將可溶的淀粉水解產(chǎn)物糖化從而產(chǎn)生糖漿的條件下，用步驟(b)的組合物接觸步驟(a)的多肽。一方面，淀粉可以來(lái)自稻、玉米、大麥、小麥、豆類、馬鈴薯或甘薯。本發(fā)明提供了改進(jìn)含淀粉的生產(chǎn)流體(production fluids)的流動(dòng)的方法,該方法包括如下步驟(a)提供具有淀粉酶活性的多肽，其中該多肽包括本發(fā)明的多肽；(b)提供生產(chǎn)流體；和(C)在淀粉酶可以水解生產(chǎn)流體中的淀粉從而通過(guò)降低其密度來(lái)改進(jìn)其流動(dòng)的條件下，將步驟(a)的多肽與步驟(b)的生產(chǎn)流體接觸。一方面，生產(chǎn)流體可以來(lái)自于地下形成(subterannean formation)。本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的多肽或由本發(fā)明的核酸編碼的多肽的抗不新鮮化 (anti-staling)的組合物。本發(fā)明提供了防止焙烤產(chǎn)品變得不新鮮的方法，該方法包括如下步驟(a)提 供具有淀粉酶活性的多肽，其中該多肽包括本發(fā)明的多肽；(b)提供用于焙烤的含淀粉組合物；和(C)在多肽可以水解用于焙烤的組合物中的淀粉，從而防止焙烤產(chǎn)品變得不新鮮的條件下，將步驟(a)的多肽與步驟(b)的組合物組合。一方面，焙烤產(chǎn)品可以是面包。本發(fā)明提供了在釀造或酒精生產(chǎn)中使用淀粉酶的方法，該方法包括如下步驟(a)提供具有淀粉酶活性的多肽，其中該多肽包括本發(fā)明的多肽；(b)提供在釀造或酒精生產(chǎn)中使用的含淀粉的組合物；和(C)在其中多肽可以水解用于釀造或酒精生產(chǎn)的組合物中的淀粉的條件下，將步驟(a)的多肽與步驟(b)的組合物組合。一方面，含淀粉的組合物可以是啤酒。本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括如下步驟(a)將異源核酸序列引入細(xì)胞中，其中異源核酸序列包括本發(fā)明的核酸序列，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和
(b)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。一方面，步驟(a)可以進(jìn)一步包括通過(guò)植物細(xì)胞原生質(zhì)體的電穿孔或顯微注射引入異源核酸序列。另一方面，步驟(a)可以進(jìn)一步包括通過(guò)DNA 微粒轟擊(DNA particle bombardment)將異源核酸序列直接引入植物組織中?？梢赃x擇地，步驟(a)可以進(jìn)一步包括使用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主將異源核酸序列引入植物細(xì)胞DNA中。一方面，植物細(xì)胞可以是馬鈴薯、玉米、稻、小麥、煙草或大麥細(xì)胞。本發(fā)明提供了在植物細(xì)胞中表達(dá)異源核酸序列的方法，該方法包括如下步驟(a) 用與啟動(dòng)子可操作地連接的的異源核酸序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中異源核酸序列包括本發(fā)明的核酸；(b)在異源核酸序列可在植物細(xì)胞中被表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物。本發(fā)明也提供了用于制備面團(tuán)或由該面團(tuán)制備的焙烤產(chǎn)品的方法，該方法包括以可有效地延遲面包變得不新鮮的用量，在面團(tuán)中加入本發(fā)明的淀粉酶。本發(fā)明也提供了含有所述淀粉酶的面團(tuán)，和含有面粉以及所述淀粉酶的預(yù)混合物。最后，本發(fā)明提供了酶促焙烤添加劑，其含有所述淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的淀粉酶的應(yīng)用提供了改良的抗不新鮮化效果， 所述的效果例如表現(xiàn)為更少的面包屑變硬、被保持的面包屑彈性、改進(jìn)的切片能力(例如更少的面包屑、非粘性面包屑)、改良的口味或香味。本發(fā)明提供了延遲釋放(“控釋(controlled release)”)組合物,該組合物含有被膠乳聚合物(或等價(jià)的)包衣涂覆的期望成分。一方面，所述期望成分包括酶，例如本發(fā)明的酶。一方面，所述期望成分包括小分子、藥物、多糖、脂質(zhì)、核酸、維生素、抗生素或殺蟲(chóng)齊U。一方面，所述期望成分包括顆粒狀物或基質(zhì)，例如含有可食用材料的顆粒狀物或基質(zhì) (例如作為動(dòng)物食品或飼料或補(bǔ)充劑或藥劑)。本發(fā)明也提供了用于組合物的“控釋”或“延遲釋放”的方法，其中該組合物用膠乳聚合物(或等價(jià)的)包衣來(lái)涂覆。一方面，膠乳聚合物包衣包括膠乳顏料或等價(jià)物。膠乳聚合物涂層(包衣)可以包括甲基丙烯酸酯、乙酸乙烯、苯乙烯、乙烯、氯乙烯、丁二烯、偏二氯乙烯、叔羧酸乙烯(vinyl versatate)、乙烯基丙酸酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯腈、氯丁橡膠、順丁烯二酸酯、反丁烯二酸酯，其等價(jià)物、其組合和/或其衍生物。 本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)如附圖和下面的詳述中所示。本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)該詳述和附圖以及權(quán)利要求而更加清楚。此處引述的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)、GenBank序列和ATCC保藏物均被特意地引入，以作為參考。附圖簡(jiǎn)述圖I是一個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的框圖。圖2是一個(gè)流程圖，該圖示意性說(shuō)明了用于將新核苷酸或蛋白序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較以確定該新序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列之間的同源性水平的過(guò)程的一個(gè)方面。圖3是一個(gè)流程圖，該圖示意性說(shuō)明了在計(jì)算機(jī)中確定兩個(gè)序列是否同源的過(guò)程的一個(gè)方面。圖4是一個(gè)流程圖，該圖示意性說(shuō)明了檢測(cè)序列中特征的存在的鑒定過(guò)程300的
一個(gè)方面。圖5是一個(gè)圖表，該圖表顯示了在實(shí)施例I中，各種淀粉酶在加熱到90°C 10分鐘后的殘余活性。圖6是一個(gè)圖表，該圖表顯示了在使用了漂白劑和鰲合劑的ADW洗滌測(cè)試中，酶濃度與被去除的淀粉的凈百分比的關(guān)系。圖7是一個(gè)圖表，該圖表說(shuō)明了在pH 8，40°C親本淀粉酶在55°C的ADW制劑中的活性。圖8是一個(gè)圖表，其顯示了關(guān)于實(shí)施例4中的新的酶的H2O2耐受的數(shù)據(jù)。圖9是一個(gè)圖表，其顯示了一群選擇的被表征的淀粉酶的pH和溫度數(shù)據(jù)。圖9A 說(shuō)明了在pH 8和40°C的數(shù)據(jù)，圖9B說(shuō)明了在pH 10和50°C的數(shù)據(jù)。

圖10描述了在酶的重裝配實(shí)驗(yàn)中所使用的序列。圖11描述了實(shí)施例5的分析中的樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖12描述了 SEQ ID NO :127的pH速度曲線，其具有中性最適pH，以及SEQ ID NO: 211的pH速度曲線，其最適pH在10左右。圖13說(shuō)明了示例性的淀粉酶與商業(yè)酶的穩(wěn)定性，正如實(shí)施例2中所討論的。圖14顯示了超嗜熱(hypothermophilic) a -淀粉酶的序列聯(lián)配，如實(shí)施例8中所述。圖14A顯示了淀粉酶序列的聯(lián)配。SEQ ID NO. 81 =環(huán)境克??；pyro =火球菌某種 (Pyrococcus sp.)(菌株K0D1)，Tachibana(1996) J. Ferment. Bioeng. 82 :224-232 ；pyro2 =激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，Appl. Environ. Microbiol. 63 (9) :3569-3576, 1997 ；Thermo =高溫球菌某種(Thermococcus sp. ) ；Thermo2 =超熱古菌(Thermococcus hydrothermal i s), Leveque，E.等人，專利France 98. 056551998 年 5 月 5 日。圖 14B 顯不了被鑒定的序列 SEQ ID NO. 81 ；pyro ；SEQ ID NO. :75 ；SEQ ID NO. :77 ；SEQ ID NO. :83 ； SEQ ID NO. 85 ；thermo2 ；SEQ ID NO. :79 ；thermo ；pyro2 ；CLONE A(克隆A) ;thermo3 的氨基酸序列聯(lián)配。圖14C說(shuō)明了與圖5和6的多肽序列相應(yīng)的核酸序列聯(lián)配。SEQ ID NO. 81 ；SEQ ID NO. :75 ；SEQ ID NO. :77 ；SEQ ID NO. :83 ；SEQ ID NO. :85 ；SEQ ID NO. :79 ;克隆 A;和 SEQ ID NO. :73。Consensus :共有序列。圖15 是棲熱菌(Thermococcales)的鄰位相連進(jìn)化樹(shù)(neighbor-joining tree)。圖16A至圖16MMMM顯示了本發(fā)明的示例性序列的序列圖17示意性說(shuō)明了用于淀粉的液化糖化的本發(fā)明的方法，正如下面詳細(xì)描述的。圖18描繪了表7，該表列出了本發(fā)明的示例性序列的相對(duì)的同一性百分比，正如下面在實(shí)施例8中描述的。圖19顯示了本發(fā)明的測(cè)試淀粉酶和商業(yè)基準(zhǔn)酶的pH曲線，正如下面在實(shí)施例15 中描述的。圖20顯示了本發(fā)明的示例性淀粉酶的溫度活性曲線，正如下面在實(shí)施例15中描述的。圖21顯示了在存在EDTA的情況下，(本發(fā)明的示例性淀粉酶的)酶活性，正如下面在實(shí)施例15中描述的。圖22顯示了在存在過(guò)氧化氫的情況下，(本發(fā)明的示例性淀粉酶的)酶活性，正如下面在實(shí)施例15中描述的。圖23顯示了在使用可溶性底物(B0DIPY-淀粉)的ADW溶液(蒸餾水、硬化溶液、 漂白劑、螯合劑、表面活性劑)中的(本發(fā)明的示例性淀粉酶的)酶活性，正如下面在實(shí)施例15中描述的。圖24顯示了使用本發(fā)明的示例性淀粉酶，在淀粉包被載片的洗滌測(cè)試中的結(jié)果， 正如下面在實(shí)施例15中描述的。圖25示意性說(shuō)明了本發(fā)明的示例性玉米濕磨過(guò)程(使用本發(fā)明的至少一種酶)。圖26、圖27和圖28示意性說(shuō)明了本發(fā)明的可供選擇的示例性淀粉加工過(guò)程，包括淀粉液化過(guò)程(使用了本發(fā)明的至少一種酶)，正如下面詳細(xì)描述的。圖29顯示的數(shù)據(jù)概括了對(duì)干磨乙醇工藝中淀粉酶SEQ ID NO :437和TERMAMYL SC(Novozymes A/S, Denmark)淀粉酶進(jìn)行比較的這些結(jié)果,正如下面在實(shí)施例I中所描述的。圖30描述了在醋酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液中的本發(fā)明示例性酶(SEQ ID NO: 594)的pH活性曲線，確定了葡糖淀粉酶在每一 pH的相對(duì)速率，正如下面在實(shí)施例16中詳細(xì)討論的。圖31描述了在醋酸鹽緩沖液中的本發(fā)明示例性酶(SEQ ID NO :594)的溫度活性曲線，正如下面在實(shí)施例16中詳細(xì)討論的。圖32描繪了本發(fā)明的示例性酶(SEQ ID NO :594)的溫度穩(wěn)定性曲線，正如下面在實(shí)施例16中詳細(xì)討論的。圖33描述了本發(fā)明的示例性酶(SEQ ID NO :594)的底物利用活性曲線，其中使用了糊精麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、潘糖(Pan)、麥芽四糖(G4)和麥芽七糖(G7)，正如下面在實(shí)施例16中詳細(xì)討論的。圖34A至E顯示了本發(fā)明的示例性的編碼葡糖淀粉酶的核酸，如SEQ ID NO :587 中所示的基因組序列。編碼序列(外顯子)用單字母氨基酸在其下面表示出來(lái)。內(nèi)含子序列下面加了下劃線。圖35A至Y是一個(gè)圖表，描述了本發(fā)明的示例性核酸和多肽的選擇的特征，正如下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的。在不同的附圖中類似的標(biāo)記符號(hào)表示類似的要素。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了淀粉酶，例如a -淀粉酶，編碼這些酶的多核苷酸，以及產(chǎn)生和應(yīng)用這些多核苷酸和多肽的方法。本發(fā)明涉及具有淀粉酶活性例如a-淀粉酶活性的多肽，編碼所述新的多肽的核酸，以及與這些新的多肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的多肽可以在多種診斷、 治療和工業(yè)環(huán)境中使用。本發(fā)明的多肽可以被使用，例如用作去污劑的添加劑、用于加工食品和用于利用逆反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)合成。此外，本發(fā)明多肽可以在織物處理、乙醇生產(chǎn)中使用， 以及用作食品或動(dòng)物飼料的添加劑。一方面，本發(fā)明的淀粉酶在高溫和/或低溫，或者在很大的溫度范圍內(nèi)具有活性。 例如，它們可以在20°C到90°C、30°C到80°C或40°C到70°C的溫度范圍內(nèi)是有活性的。本發(fā)明也提供了在堿性PH或在酸性pH例如低水酸度時(shí)具有活性的淀粉酶。在可以選擇的方面，本發(fā)明的淀粉酶可以在低至pH 5. O、pH 4. 5、pH 4.0和pH 3. 5的酸性pH下具有活性。 在可以選擇的方面，本發(fā)明的淀粉酶可以在高至pH 9. 5、pH 10.0,pH 10. 5和pH 11的堿性 pH下具有活性。一方面，本發(fā)明的淀粉酶在低水酸度(低含水量)的條件下，在大約40°C 到大約70°C的溫度范圍內(nèi)是有活性的。本發(fā)明也提供了進(jìn)一步修飾本發(fā)明的示例性淀粉酶以產(chǎn)生具有期望特性的蛋白質(zhì)的方法。例如，由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的淀粉酶可以具有改變的酶活性、熱穩(wěn)定性、pH/活性曲線、pH/穩(wěn)定性曲線(如在低pH值例如pH < 6或pH < 5或高pH值例如pH > 9時(shí)具有增加的穩(wěn)定性)、抗氧化作用的穩(wěn)定性、Ca2+依賴性、比活性和類似性質(zhì)。通過(guò)本發(fā)明可以改變?nèi)魏胃信d趣的特性。例如，該改變可以導(dǎo)致產(chǎn)生變體，該變體與親本酶相比，具有改變的酶活性、或者PH或溫度活性曲線。定義 術(shù)語(yǔ)“淀粉酶”包括催化多糖例如淀粉的水解的所有多肽，例如酶。術(shù)語(yǔ)“淀粉酶” 包括具有a -淀粉酶活性、P -淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶活性、外切淀粉酶活性、葡聚糖a -麥芽四糖水解酶活性、麥芽酶活性、異麥芽酶活性、葡聚糖1，4，a -葡糖苷酶活性、a -葡糖苷酶活性、蔗糖酶或瓊脂糖酶活性(例如0 -瓊脂糖酶活性)的多肽。例如，本發(fā)明的淀粉酶活性包括a-淀粉酶活性，包括水解淀粉中的內(nèi)部a-1，4-糖苷鍵以產(chǎn)生較小分子量的麥芽糊精的能力。一方面，a-淀粉酶活性包括隨機(jī)地水解淀粉中的內(nèi)部a -1，4_糖苷鍵。本發(fā)明的淀粉酶活性包括具有葡糖淀粉酶活性的多肽，例如水解由a-l，4_和a-1，6-糖苷鍵連接的葡萄糖聚合物的能力。一方面，本發(fā)明的多肽具有葡糖淀粉酶活性，水解內(nèi)部a-1，4-糖苷鍵以產(chǎn)生較小分子量的麥芽糊精。本發(fā)明的淀粉酶活性也包括葡聚糖1，4-a -葡糖苷酶活性、或I，4-a -D-葡聚糖葡糖水解酶， 通常稱作葡糖淀粉酶，但也稱作淀粉葡糖苷酶和？-淀粉酶，該酶在一方面從l，4-a-、l， 6-a-和l，3-a-連接的葡聚糖中釋放出0-D-葡萄糖。本發(fā)明的淀粉酶活性也包括外切淀粉酶活性。一方面，葡糖淀粉酶活性包括催化糖苷鍵的水解。葡糖淀粉酶活性可以包括催化D-葡萄糖從淀粉或其它相關(guān)糊精的非還原末端逐步地水解釋放。葡糖淀粉酶活性可以包括1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶活性。葡糖淀粉酶活性可以包括催化導(dǎo)致產(chǎn)生游離葡萄糖的麥芽糊精水解。葡糖淀粉酶活性可以包括外切淀粉酶活性。葡糖淀粉酶活性可以包括 a-淀粉酶或￠-淀粉酶活性。被水解的糖苷鍵可以包括a-l，4-糖苷鍵或a-l，6_糖苷鍵。葡糖淀粉酶活性可以包括水解淀粉中的糖苷鍵。葡糖淀粉酶活性可以進(jìn)一步包括水解淀粉酶中的糖苷鍵以產(chǎn)生麥芽糊精。葡糖淀粉酶活性可以包括從淀粉的非還原末端切割出麥芽糖或D-葡萄糖單元。本發(fā)明的淀粉酶活性也包括在高溫、低溫、堿性pH和在酸性pH條件下水解多糖， 例如淀粉。例如，一方面，本發(fā)明提供了多肽，編碼這些多肽的核酸，所述多肽具有淀粉酶活性，例如葡糖淀粉酶活性，該活性是熱穩(wěn)定的。該多肽在包括如下溫度的條件下可以保持淀粉酶活性從大約37 °C到大約95 °C之間；大約55 °C到大約85 °C之間，大約70 °C到大約95 °C 之間，或大約90°C到大約95°C之間。另一方面，本發(fā)明的多肽可以具有葡糖淀粉酶活性，該多肽是耐熱的。該多肽在暴露于如下溫度后可以保持淀粉酶活性從大于37°C到大約95°C 的范圍內(nèi)的溫度，或從大于55°C到大約85°C之間的任何溫度。一方面，該多肽在暴露于從大于90°C到大約95°C的溫度范圍內(nèi)的溫度和pH4. 5后可以保持淀粉酶活性?！暗矸勖缸凅w” 包含來(lái)源于“前體淀粉酶”的氨基酸序列的氨基酸序列。前體淀粉酶可以包括天然發(fā)生的淀粉酶和重組淀粉酶。淀粉酶變體的氨基酸序列可以“來(lái)源于”前體淀粉酶氨基酸序列，通過(guò)前體氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、刪除或插入來(lái)實(shí)現(xiàn)。 這樣的修飾可以是針對(duì)編碼前體淀粉酶的氨基酸序列的“前體DNA序列”，而不是操作前體淀粉酶本身。用于前體DNA序列的這樣的操作的合適方法包括本文公開(kāi)的方法，以及本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括肽或多肽，它們來(lái)自于或模制于(modeled after) —種或多種免疫球蛋白基因或其片段，或者實(shí)質(zhì)上由一種或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼， 該肽或多肽能特異性結(jié)合抗原或抗原決定基，例如參見(jiàn)Fundamental Immunology,第三版，ff. E. Paul 編著，Raven Press, N. Y. (1993) ；ffilson (1994) J. Immunol. Methods 175 267-273 ；Yarmush(1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25 :85_97。術(shù)語(yǔ)抗體包括抗原結(jié)合部分，即，保持有結(jié)合抗原的能力的“抗原結(jié)合位點(diǎn)”(例如片段、子序列、互補(bǔ)決定區(qū) (CDRs))，包括(1汗&13片段，一種由￥1^11、(^和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii) F (ab，)2 片段，由通過(guò)二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)Fab片段組成的二價(jià)片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(V)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341 :544-546);和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(O)R)。 單鏈抗體也被包括在術(shù)語(yǔ)“抗體”中。正如本文所用，術(shù)語(yǔ)“陣列”或“微陣列”或“生物芯片”或“芯片”是一系列的靶元件，每一靶元件包括固定到基材表面的限定區(qū)域上的確定數(shù)量的一個(gè)或多個(gè)多肽(包括抗體)或核酸，正如下面進(jìn)一步的詳細(xì)討論。正如本文所用，術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)”、“計(jì)算機(jī)程序”和“處理器”以它們?cè)谧顝V的普通語(yǔ)境中的含義被使用，包括了所有這樣的設(shè)備，例如下面所詳細(xì)描述的?！疤囟ǘ嚯幕虻鞍椎木幋a序列”或“編碼特定多肽或蛋白的序列”是指當(dāng)被置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列的控制下時(shí)可被轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽或蛋白的核酸序列。
正如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)序列盒(expression cassette) ”指能影響結(jié)構(gòu)基因 (即蛋白編碼序列，如編碼本發(fā)明的淀粉酶的序列)在與這樣的序列相容的宿主中的表達(dá)的核苷酸序列。表達(dá)序列盒包括至少一個(gè)與多肽編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子；并且任選地，可以與其它序列例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列可操作地連接。也可以使用其它的在影響表達(dá)的方面必需的或有用的因子，例如增強(qiáng)子。因此，表達(dá)序列盒也包括質(zhì)粒、表達(dá)載體、重組病毒、任何形式的重組“裸DNA”載體，以及類似物。正如此處所用，“可操作地連接(operably linked) ”是指兩個(gè)或更多個(gè)核酸(例如DNA)片段之間的功能關(guān)系。典型地，“可操作地連接”指轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列與被轉(zhuǎn)錄序列的功能關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子刺激或調(diào)節(jié)編碼序列例如本發(fā)明的核酸在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或其它表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動(dòng)子便是可操作地連接到編碼序列。通常，可操作地連接到被轉(zhuǎn)錄序列的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列與被轉(zhuǎn)錄序列是物理上相鄰的，即它們是順式作用。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如增強(qiáng)子，不需要與編碼序列物理相鄰或者位于與編碼序列接近的位置，但這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列仍能增強(qiáng)編碼序列的轉(zhuǎn)錄?！拜d體”包括可以感染、轉(zhuǎn)染、短暫或永久地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的核酸。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，載體可以是裸核酸、或與蛋白或脂質(zhì)復(fù)合的核酸。該載體任選地包含病毒或細(xì)菌核酸和/或蛋白， 和/或膜(例如細(xì)胞膜、病毒脂質(zhì)包被等等)。載體包括但不限于復(fù)制子(例如RNA復(fù)制子、細(xì)菌噬菌體)，DNA片段可以連接到這些復(fù)制子上從而可被復(fù)制。因此，載體包括但不限于RNA、自主復(fù)制環(huán)狀或線狀DNA或RNA(例如質(zhì)粒、病毒以及類似物，例如參見(jiàn)美國(guó)專利5，217，879)，并且包括表達(dá)質(zhì)粒和非表達(dá)質(zhì)粒。在重組微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物被描述為“表達(dá)載體”的宿主的情況下，該載體包括染色體外環(huán)狀或線狀DNA，它們可以已經(jīng)被整合到宿主染色體中。在載體通過(guò)宿主細(xì)胞來(lái)維持的情況下，該載體或者可以作為自主結(jié)構(gòu)在有絲分裂過(guò)程中被細(xì)胞穩(wěn)定地復(fù)制，或者被整合進(jìn)宿主的基因組中。正如本文所用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”包括所有能驅(qū)動(dòng)編碼序列在細(xì)胞例如植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的所有序列。因此，在本發(fā)明的構(gòu)建物中所用的啟動(dòng)子包括順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件和調(diào)節(jié)序列，它們涉及調(diào)節(jié)或調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)間和/或速率。例如，啟動(dòng)子可以是順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件，包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制起點(diǎn)、染色體整合序列、5’和3’非翻譯區(qū)或內(nèi)含子序列，它們均涉及轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。這些順式作用序列通常與蛋白或其它生物分子互相作用來(lái)執(zhí)行(打開(kāi)/關(guān)閉、調(diào)節(jié)、調(diào)控等等)轉(zhuǎn)錄?！敖M成型”啟動(dòng)子是那些在大部分環(huán)境條件和發(fā)育狀態(tài)或細(xì)胞分化狀態(tài)下持續(xù)地驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”或“可調(diào)控型” 啟動(dòng)子在環(huán)境條件或發(fā)育條件的影響下指導(dǎo)本發(fā)明的核酸的表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件、增高的溫度、干旱或光的存在?！敖M織特異性”啟動(dòng)子是僅僅在特定細(xì)胞或組織或器官中有活性的轉(zhuǎn)錄控制元件， 例如在植物或動(dòng)物的特定細(xì)胞或組織或器官中有活性。組織特異性調(diào)節(jié)可以通過(guò)某些內(nèi)在因子來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些內(nèi)在因子確保對(duì)給定組織特異的蛋白編碼基因被表達(dá)。這樣的因子已知存在于哺乳動(dòng)物和植物中，以便允許特異性組織的發(fā)育。
術(shù)語(yǔ)“植物”包括全植物、植物部分(例如葉、莖、花、根等等)、植物原生質(zhì)體、種子和植物細(xì)胞以及它們的后代?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法中的植物的種類很廣泛，廣泛至能用轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行處理的高等植物，包括被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)，以及裸子植物。它們包括各種倍數(shù)性水平的植物，包括多倍體、二倍體、單倍體和半合子植物。正如此處所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物”包括異源核酸序列已經(jīng)被插入到其中的植物或植物細(xì)胞，所述異源核酸序列例如本發(fā)明的核酸和各種重組構(gòu)建物(例如表達(dá)序列盒)?！百|(zhì)?！笨梢陨藤?gòu)得到，在不受限制的基礎(chǔ)上可以公開(kāi) 獲得，或可以根據(jù)已公開(kāi)的程序用可獲得的質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建。與本文描述的那些質(zhì)粒等價(jià)的質(zhì)粒在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的， 并且對(duì)于普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。術(shù)語(yǔ)“基因”包括核酸序列，包括在產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如信息)的過(guò)程中所涉及的 DNA的片段，所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物又被翻譯而產(chǎn)生多肽鏈，或者它調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、復(fù)制或穩(wěn)定性?；蚩梢园ň幋a區(qū)之前的區(qū)域和之后的區(qū)域,如前導(dǎo)區(qū)(leader)和尾區(qū)(trailer)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及在適用的情況下，可以包括各個(gè)編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。短語(yǔ)“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或者寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸中任意一種的片段，或者基因組的或合成來(lái)源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、 tRNA、iRNA)，它們可以是單鏈或雙鏈，并且可以代表正義鏈或反義鏈，還包括肽核酸(PNA) 或者天然或合成來(lái)源的任何DNA樣或RNA樣的物質(zhì)，例如包括iRNA、核糖核蛋白(例如 iRNPs)。該術(shù)語(yǔ)包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，例如寡核苷酸。該術(shù)語(yǔ)也包括具有合成骨架的核酸樣結(jié)構(gòu)，例如參見(jiàn) Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144 :189-197 ； Strauss-Soukup (1997)Biochemistry 36 :8692-8698 ；Samstag(1996)Anti sense Nucleic Acid Drug Dev 6 :153_1560“氨基酸”或“氨基酸序列”包括寡肽、肽、多肽或蛋白序列，或寡肽、肽、多肽或蛋白序列中任意一種的片段、部分或亞基，它們可以是天然發(fā)生的或合成的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”和 “蛋白”包括通過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵即肽等排物(peptide isosteres)彼此結(jié)合在一起的氨基酸，可以含有除20個(gè)由基因編碼的氨基酸之外的修飾的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“多肽”也包括肽和多肽片段、基序以及類似物。該術(shù)語(yǔ)也包括糖基化多肽。本發(fā)明的肽和多肽也包括所有 “模擬”和“肽模擬”形式，正如下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的。術(shù)語(yǔ)“分離的”包括從其原始環(huán)境中分離出的物質(zhì)，所述原始環(huán)境例如天然環(huán)境， 如果該環(huán)境是天然存在的話。例如，在活的動(dòng)物中存在的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但與該天然系統(tǒng)中的一些或所有的共存物質(zhì)分離開(kāi)的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以成為載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但它們?nèi)匀皇欠蛛x的，因?yàn)檫@樣的載體或組合物不是其天然環(huán)境的組成部分。 正如本文所用，分離的物質(zhì)或組合物也可以是“純化的”組合物，即，它并不要求絕對(duì)的純度；更正確的說(shuō)，這意味著是一個(gè)相對(duì)定義。從文庫(kù)獲得的各核酸可以按慣例純化為電泳同質(zhì)。在可選擇的方面，本發(fā)明提供了核酸，這些核酸已經(jīng)以至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)數(shù)量級(jí)的程度從基因組DNA或從文庫(kù)或其它環(huán)境中的其它序列中被純化出來(lái)。正如此處所用，術(shù)語(yǔ)“重組的”可以包括與“骨架”核酸相鄰的核酸，這些核酸在其天然環(huán)境中與該“骨架”核酸是不相鄰的。一方面，核酸表現(xiàn)為在核酸“骨架分子”群體中有5%或更多數(shù)量的帶有核酸插入物。本發(fā)明的“骨架分子”包括核酸，如表達(dá)載體、自主復(fù)制核酸、病毒、整合核酸，以及用于維持或操縱感興趣的核酸插入物的其它載體或核酸。一方面，富集的核酸則表現(xiàn)為在重組的骨架分子群體中有50 %、51 %、52 %、53 %、54 %、55 %、56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%, 71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%, 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多數(shù)量的帶有核酸插入物?！爸亟M的”多肽或蛋白是指通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽或蛋白；例如由用編碼期望多肽或蛋白的外源DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的多肽或蛋白。“合成的”多肽或蛋白是那些通過(guò)化學(xué)合成制備的多肽或蛋白，正如下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的。啟動(dòng)子序列可以“ 可操作地連接到”編碼序列上，此時(shí)RNA聚合酶可以在啟動(dòng)子處起始轉(zhuǎn)錄，將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA,正如下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的?！肮押塑账帷被蛘甙▎捂湹亩嗝撗鹾塑账?，或者包括兩個(gè)互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈，它們可以是化學(xué)合成的。這樣的合成的寡核苷酸沒(méi)有5’磷酸，因此如果不在存在激酶的情況下采用腺苷三磷酸(ATP)添加磷酸，該合成寡核苷酸便不會(huì)連接到另一個(gè)寡核苷酸上。合成的寡核苷酸可以連接到?jīng)]有被去磷酸化的片段上。短語(yǔ)“基本上相同(substantially identical) ”在用于兩個(gè)核酸或多肽時(shí)，是指當(dāng)兩個(gè)或更多個(gè)序列被比較和聯(lián)配(aligned)以尋找最大一致性(maximun correspondence)時(shí)，它們具有例如至少大約 50 %、51 %>52 %>53 %>54 %>55 %>56 %> 57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%, 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的核苷酸或氨基酸殘基(序列)同一性，所述同一性可以使用任意一種已知的序列比較算法測(cè)量， 正如下面詳細(xì)討論的，或者通過(guò)視覺(jué)觀察。在可選擇的方面，本發(fā)明提供了與本發(fā)明的示例性序列在至少大約 10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、 650、700、750、800、850、900、950、1000或更多殘基的區(qū)域內(nèi)，或從大約50個(gè)殘基到核酸或多肽的全長(zhǎng)的區(qū)域內(nèi)基本上相同的核酸和多肽序列。本發(fā)明的核酸序列可以在多肽編碼區(qū)的整個(gè)長(zhǎng)度范圍內(nèi)是基本上相同的?！盎旧舷嗤摹卑被嵝蛄幸部梢园ㄍㄟ^(guò)一個(gè)或多個(gè)保守或非保守氨基酸的取代、缺失或插入而與參考序列有所不同的序列，尤其是當(dāng)這樣的取代發(fā)生在不是分子的活性位點(diǎn)的位置時(shí)，前提是該多肽基本上保持其功能特性。保守的氨基酸取代，例如用一個(gè)氨基酸取代另一個(gè)相同類別的氨基酸(例如用一個(gè)疏水氨基酸，如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，取代另一個(gè)疏水氨基酸，或用一個(gè)極性氨基酸取代另一個(gè)極性氨基酸，例如用精氨酸取代賴氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺)?？梢詮睦绲矸勖钢袆h除一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從而形成對(duì)多肽結(jié)構(gòu)的修飾，而又不會(huì)顯著地改變其生物活性。例如，對(duì)淀粉酶活性來(lái)說(shuō)不需要的氨基或羧基末端氨基酸可以被去除。“雜交”包括這樣一個(gè)過(guò)程，S卩，通過(guò)該過(guò)程核酸鏈與互補(bǔ)鏈通過(guò)堿基配對(duì)而結(jié)合。 雜交反應(yīng)可以是靈敏的并且是選擇性的，以便感興趣的特定序列可以被鑒定，甚至在其以低濃度存在的樣品中也可以被鑒定。嚴(yán)緊條件(stringent conditions)可以通過(guò),例如預(yù)雜交和雜交溶液中鹽或甲酰胺的濃度來(lái)定義，或者通過(guò)雜交溫度來(lái)定義，這些嚴(yán)緊條件在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的。例如，嚴(yán)緊性可以通過(guò)降低鹽的濃度、增加甲酰胺的濃度、或升高雜交溫度、改變雜交時(shí)間來(lái)增加，正如下面詳細(xì)描述的。在可選擇的方面，本發(fā)明的核酸通過(guò)它們?cè)诟鞣N嚴(yán)緊條件(例如強(qiáng)、中等和低嚴(yán)緊條件)下雜交的能力來(lái)定義，正如本文所示。
“變體”包括在一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)、密碼子、內(nèi)含子、外顯子或氨基酸殘基處被(分別地)修飾的本發(fā)明的多核苷酸或多肽，然而它們?nèi)匀槐３直景l(fā)明的淀粉酶的生物活性。 變體可以通過(guò)許多種方法產(chǎn)生，包括的方法諸如，例如易錯(cuò)PCR、重排、寡核苷酸誘導(dǎo)的突變、裝配PCR、有性PCR誘變、體內(nèi)誘變、盒式誘變、遞歸整體誘變、指數(shù)整體誘變、位點(diǎn)特異性誘變、基因再裝配、GSSM及其任意組合。本文包括了用于產(chǎn)生變體淀粉酶的技術(shù)，例如， 所述變體具有活性時(shí)的PH或溫度與野生型淀粉酶的不同。術(shù)語(yǔ)“飽和誘變”或“GSSM”包括使用簡(jiǎn)并寡核苷酸引物將點(diǎn)突變引入多核苷酸的方法，正如下面詳細(xì)描述的。術(shù)語(yǔ)“優(yōu)化的定向進(jìn)化系統(tǒng)”或“優(yōu)化的定向進(jìn)化”包括用于重新裝配相關(guān)的核酸序列的片段的方法，所述的相關(guān)核酸序列例如相關(guān)的基因，下面對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)解釋。
術(shù)語(yǔ)“合成連接重裝配”或“SLR”包括以非隨機(jī)方式連接寡核苷酸片段的方法，下面進(jìn)行了詳細(xì)解釋。產(chǎn)牛和操縱核酸本發(fā)明提供了分離的或重組的核酸，其包括與本發(fā)明的示例性核酸在至少大約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、150、200、250、300、350、400、450、 500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、I150、1200、1250、1300、 1350、1400、1450、1500、1550或更多殘基的區(qū)域內(nèi)，具有至少大約50%,51 %,52%,53%, 54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%, 69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%, 84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%或更高或完全的(100%)序列同一性的核酸序列。一方面，該核酸編碼至少一個(gè)具有淀粉酶活性例如a-淀粉酶活性的多肽。例如，下面的表格描述了本發(fā)明的一些示例性的編碼淀粉酶的核酸，例如本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :474中所示的序列、具有SEQ ID NO :473中所示的示例性編碼序列的淀粉酶，一方面，該酶由基因編碼，其包括內(nèi)含子和外顯子，該基因具有SEQ ID NO :467中所示的序列(包括具有在SEQ ID NO :468,SEQ ID NO :469、SEQ ID NO :470、SEQ ID NO :471 和SEQ ID NO 472中所不的序列的外顯子):等等
權(quán)利要求
1.分離的或重組的核酸，其如下列所述(a)SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11、SEQ IDNO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQID NO 25, SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 37, SEQ ID NO :39、SEQ ID NO 4U SEQ ID NO :43、SEQ ID NO 45, SEQ ID NO:.47、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :57、SEQ IDNO 59, SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQID NO 7U SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO -JrJ、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 89, SEQ ID NO 9USEQ ID NO:.93、SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :97、SEQ ID NO :99、SEQ ID NO :101、SEQ ID NO :103、SEQID NO 105, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO :109、SEQ ID NO 11USEQ ID NO :113、SEQ ID NO:.115、SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :119、SEQ ID NO :121、SEQ ID NO :123、SEQ ID NO :125、SEQ ID NO 127,SEQ ID NO : 129、SEQ ID NO 131,SEQ ID NO : 133、SEQ ID NO 135,SEQ IDNO 137, SEQ ID NO :139、SEQ ID NO :141、SEQ ID NO :143、SEQ ID NO :145、SEQ ID NO .147、SEQ ID NO :149、SEQ ID NO :151、SEQ ID NO :153、SEQ ID NO :155、SEQ ID NO :157、SEQ ID NO 159,SEQ ID NO 161,SEQ ID NO :163、SEQ ID NO 165,SEQ ID NO :167、SEQ IDNO 189, SEQ ID NO :191、SEQ ID NO :193、SEQ ID NO :203、SEQ ID NO :205、SEQ ID NO .207、SEQ ID NO :209、SEQ ID NO :211、SEQ ID NO :322、SEQ ID NO :324、SEQ ID NO :326、SEQ ID NO 328,SEQ ID NO :330、SEQ ID NO :332、SEQ ID NO :334、SEQ ID NO :336、SEQ IDNO 338, SEQ ID NO :340、SEQ ID NO :342、SEQ ID NO :344、SEQ ID NO :346、SEQ ID NO .348、SEQ ID NO :350、SEQ ID NO :352、SEQ ID NO :354、SEQ ID NO :356、SEQ ID NO :358、SEQ ID NO 360,SEQ ID NO :362、SEQ ID NO :364、SEQ ID NO :366、SEQ ID NO :368、SEQ IDNO 370, SEQ ID NO :372、SEQ ID NO :374、SEQ ID NO :376、SEQ ID NO :378、SEQ ID NO .380、SEQ ID NO :382、SEQ ID NO :384、SEQ ID NO :386、SEQ ID NO :388、SEQ ID NO :390、SEQ ID NO 392, SEQ ID NO :394、SEQ ID NO :396、SEQ ID NO :398、SEQ ID NO :400、SEQID NO 402,SEQ ID NO :404、SEQ ID NO :406、SEQ ID NO :408、SEQ ID NO :410、SEQ ID NO:.412、SEQ ID NO :414、SEQ ID NO :416、SEQ ID NO :420、SEQ ID NO :422、SEQ ID NO :424、SEQ ID NO 426,SEQ ID NO :428、SEQ ID NO :430、SEQ ID NO :432、SEQ ID NO :434、SEQ IDNO 436, SEQ ID NO :438、SEQ ID NO :440、SEQ ID NO :442、SEQ ID NO :444、SEQ ID NO .446、SEQ ID NO :448、SEQ ID NO :450、SEQ ID NO :452、SEQ ID NO :454、SEQ ID NO :456、SEQ ID NO 458,SEQ ID NO :460、SEQ ID NO :460、SEQ ID NO :462、SEQ ID NO :465、SEQ IDNO 467, SEQ ID NO :473、SEQ ID NO :475、SEQ ID NO :478、SEQ ID NO :480、SEQ ID NO .484、SEQ ID NO :486、SEQ ID NO :492、SEQ ID NO :494、SEQ ID NO :498、SEQ ID NO :500、SEQ ID NO 509, SEQ ID NO :511、SEQ ID NO :515、SEQ ID NO :517、SEQ ID NO :517、SEQID NO 519,SEQ ID NO :522、SEQ ID NO :524、SEQ ID NO :527、SEQ ID NO :529、SEQ ID NO:.532、SEQ ID NO :534、SEQ ID NO :539、SEQ ID NO :541、SEQ ID NO :544、SEQ ID NO :546、SEQ ID NO 552,SEQ ID NO :554、SEQ ID NO :558、SEQ ID NO :560、SEQ ID NO :565、SEQ IDNO 567, SEQ ID NO :569、SEQ ID NO :571、SEQ ID NO :573、SEQ ID NO :575、SEQ ID NO .577、SEQ ID NO :579、SEQ ID NO :581、SEQ ID NO :583、SEQ ID NO :585、SEQ ID NO :587、SEQ ID NO 593,SEQ ID NO :603、SEQ ID NO :605、SEQ ID NO :607、SEQ ID NO :609、SEQ IDNO 61U SEQ ID NO :613、SEQ ID NO :615、SEQ ID NO :617、SEQ ID NO :619 或 SEQ ID NO:.621的核酸序列，其中所述核酸編碼為α-淀粉酶的多肽， (b)編碼SEQ ID NO:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 12,SEQID NO 14, SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26,SEQ ID NO28,SEQ ID NO :30、SEQ ID NO32,SEQ ID NO34,SEQ ID NO:.36、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :46、SEQ IDNO 48, SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :58、SEQID NO 60, SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO 72,SEQ ID NO74,SEQ ID NO 76,SEQ ID NO78,SEQ ID NO80,SEQ ID NO:.82、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :92、SEQ IDNO 94, SEQ ID NO :96、SEQ ID NO :98、SEQ ID NO :100、SEQ ID NO :102、SEQ ID NO :104、SEQ ID NO 106,SEQ ID NO :108、SEQ ID NO 110,SEQ ID NO :112、SEQ ID NO 114,SEQ IDNO :116、SEQ ID NO :118、SEQ ID NO :120、SEQ ID NO :122、SEQ ID NO :124、SEQ ID NO .126、SEQ ID NO :128、SEQ ID NO :130、SEQ ID NO :132、SEQ ID NO :134、SEQ ID NO :136、SEQ ID NO 138,SEQ ID NO 140,SEQ ID NO :142、SEQ ID NO 144,SEQ ID NO :146、SEQ IDNO 148, SEQ ID NO :150、SEQ ID NO :152、SEQ ID NO :154、SEQ ID NO :156、SEQ ID NO .158、SEQ ID NO :160、SEQ ID NO :162、SEQ ID NO :164、SEQ ID NO :166、SEQ ID NO :168、SEQ ID NO 190,SEQ ID NO :192、SEQ ID NO 194,SEQ ID NO :204、SEQ ID NO :206、SEQ IDNO 208,SEQ ID NO :210、SEQ ID NO :212、SEQ ID NO :323、SEQ ID NO :325、SEQ ID NO :327、SEQ ID NO: 329、SEQ ID NO :331、SEQ ID NO :333、SEQ ID NO :335、SEQ ID NO :337、SEQ IDNO 339, SEQ ID NO :341、SEQ ID NO :343、SEQ ID NO :345、SEQ ID NO :347、SEQ ID NO .349、SEQ ID NO :351、SEQ ID NO :353、SEQ ID NO :355、SEQ ID NO :357、SEQ ID NO :359、SEQ ID NO :361、SEQ ID NO :363、SEQ ID NO :365、SEQ ID NO :367、SEQ ID NO :369、SEQ IDNO :371、SEQ ID NO :373、SEQ ID NO :375、SEQ ID NO :377、SEQ ID NO :379、SEQ ID NO .38USEQ ID NO 383,SEQ ID NO :385、SEQ ID NO :387、SEQ ID NO :389、SEQ ID NO :391、SEQID NO 393,SEQ ID NO :395、SEQ ID NO :397、SEQ ID NO :399、SEQ ID NO :401、SEQ ID NO:.403、SEQ ID NO :405、SEQ ID NO :407、SEQ ID NO :409、SEQ ID NO :411、SEQ ID NO :413、SEQ ID NO 415,SEQ ID NO :417、SEQ ID NO :421、SEQ ID NO :423、SEQ ID NO :425、SEQ IDNO 427, SEQ ID NO :429、SEQ ID NO :431、SEQ ID NO :433、SEQ ID NO :435、SEQ ID NO .437、SEQ ID NO :439、SEQ ID NO :441、SEQ ID NO :443、SEQ ID NO :445、SEQ ID NO :447、SEQ ID NO 449,SEQ ID NO :451、SEQ ID NO :453、SEQ ID NO :455、SEQ ID NO :457、SEQ IDNO 459, SEQ ID NO :461、SEQ ID NO :461、SEQ ID NO :463、SEQ ID NO :464、SEQ ID NO .466、SEQ ID NO :468、SEQ ID NO :469、SEQ ID NO :470、SEQ ID NO :471、SEQ ID NO :472、SEQ ID NO 474,SEQ ID NO :476、SEQ ID NO :477、SEQ ID NO :479、SEQ ID NO :481、SEQ IDNO 482, SEQ ID NO :483、SEQ ID NO :485、SEQ ID NO :487、SEQ ID NO :488、SEQ ID NO .489、SEQ ID NO :490、SEQ ID NO :491、SEQ ID NO :493、SEQ ID NO :495、SEQ ID NO :496、SEQ ID NO 497,SEQ ID NO :499、SEQ ID NO :501、SEQ ID NO :502、SEQ ID NO :503、SEQ IDNO 504, SEQ ID NO :505、SEQ ID NO :506、SEQ ID NO :507、SEQ ID NO :508、SEQ ID NO ·510、SEQ ID NO :512、SEQ ID NO :513、SEQ ID NO :514、SEQ ID NO :516、SEQ ID NO :518、SEQ ID NO 518,SEQ ID NO :520、SEQ ID NO :521、SEQ ID NO :523、SEQ ID NO :525、SEQ IDNO 526, SEQ ID NO :528、SEQ ID NO :530、SEQ ID NO :531、SEQ ID NO :533、SEQ ID NO ·535、SEQ ID NO :536、SEQ ID NO :537、SEQ ID NO :538、SEQ ID NO :540、SEQ ID NO :542、SEQ ID NO 543,SEQ ID NO :545、SEQ ID NO :547、SEQ ID NO :548、SEQ ID NO :549、SEQ IDNO 550, SEQ ID NO :551、SEQ ID NO :553、SEQ ID NO :555、SEQ ID NO :556、SEQ ID NO ·557、SEQ ID NO :559、SEQ ID NO :561、SEQ ID NO :562、SEQ ID NO :563、SEQ ID NO :564、SEQ ID NO 566,SEQ ID NO :568、SEQ ID NO :570、SEQ ID NO :572、SEQ ID NO :574、SEQ IDNO 576, SEQ ID NO :578、SEQ ID NO :580、SEQ ID NO :582、SEQ ID NO :584、SEQ ID NO ·586、SEQ ID NO :588、SEQ ID NO :589、SEQ ID NO :590、SEQ ID NO :591、SEQ ID NO :592、SEQ ID NO 594,SEQ ID NO :604、SEQ ID NO :606、SEQ ID NO :608、SEQ ID NO :610、SEQ IDNO 612, SEQ ID NO :614、SEQ ID NO :616、SEQ ID NO :618、SEQ ID NO :620 或 SEQ ID NO:·622所述的多肽的核酸序列，其中所述多肽是α -淀粉酶。
2.表達(dá)序列盒、載體或克隆載體,其包括權(quán)利要求I中所述的核酸序列。
3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其包括權(quán)利要求I中所述的序列。
4.分離的、合成的或重組的多肽，其為如下列所述的α-淀粉酶(a) SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ IDNO 14, SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQID NO 26, SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO38,SEQ ID NO40,SEQ ID NO42,SEQ ID NO :44、SEQ ID NO46,SEQ ID NO:·48、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :58、SEQ IDNO 60, SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :70、SEQID NO 72, SEQ ID NO :74、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO84,SEQ ID NO86,SEQ ID NO88,SEQ ID NO 90,SEQ ID NO92,SEQ ID NO:·94、SEQ ID NO :96、SEQ ID NO :98、SEQ ID NO :100、SEQ ID NO :102、SEQ ID NO :104、SEQID NO 106,SEQ ID NO :108、SEQ ID NO 110,SEQ ID NO :112、SEQ ID NO 114,SEQ ID NO:·116,SEQ ID NO:118、SEQ ID NO :120、SEQ ID NO :122、SEQ ID NO : 124、SEQ ID NO : 126、SEQID NO 128,SEQ ID NO 130,SEQ ID NO : 132、SEQ ID NO 134,SEQ ID NO : 136、SEQ ID NO:·138、SEQ ID NO :140、SEQ ID NO :142、SEQ ID NO :144、SEQ ID NO :146、SEQ ID NO :148、SEQ ID NO 150,SEQ ID NO : 152、SEQ ID NO 154,SEQ ID NO : 156、SEQ ID NO 158,SEQ IDNO 160, SEQ ID NO :162、SEQ ID NO :164、SEQ ID NO :166、SEQ ID NO :168、SEQ ID NO ·190、SEQ ID NO :192、SEQ ID NO :194、SEQ ID NO :204、SEQ ID NO :206、SEQ ID NO :208、SEQ ID NO 210,SEQ ID NO :212、SEQ ID NO :323、SEQ ID NO :325、SEQ ID NO :327、SEQ IDNO 329, SEQ ID NO :331、SEQ ID NO :333、SEQ ID NO :335、SEQ ID NO :337、SEQ ID NO ·339、SEQ ID NO :341、SEQ ID NO :343、SEQ ID NO :345、SEQ ID NO :347、SEQ ID NO :349、SEQ ID NO :351、SEQ ID NO :353、SEQ ID NO :355、SEQ ID NO :357、SEQ ID NO :359、SEQ IDNO :361、SEQ ID NO :363、SEQ ID NO :365、SEQ ID NO :367、SEQ ID NO :369、SEQ ID NO ·37USEQ ID NO:373、SEQ ID NO :375、SEQ ID NO :377、SEQ IDNO :379、SEQ ID NO :381、SEQID NO 383,SEQ ID NO :385、SEQ ID NO :387、SEQ ID NO :389、SEQ ID NO :391、SEQ ID NO:.393、SEQ ID NO :395、SEQ ID NO :397、SEQ ID NO :399、SEQ ID NO :401、SEQ ID NO :403、SEQ ID NO 405,SEQ ID NO :407、SEQ ID NO :409、SEQ ID NO :411、SEQ ID NO :413、SEQ IDNO 415, SEQ ID NO :417、SEQ ID NO :421、SEQ ID NO :423、SEQ ID NO :425、SEQ ID NO .427、SEQ ID NO :429、SEQ ID NO :431、SEQ ID NO :433、SEQ ID NO :435、SEQ ID NO :437、SEQ ID NO 439,SEQ ID NO :441、SEQ ID NO :443、SEQ ID NO :445、SEQ ID NO :447、SEQ IDNO 449, SEQ ID NO :451、SEQ ID NO :453、SEQ ID NO :455、SEQ ID NO :457、SEQ ID NO .459、SEQ ID NO :461、SEQ ID NO :461、SEQ ID NO :463、SEQ ID NO :464、SEQ ID NO :466、SEQ ID NO 468,SEQ ID NO :469、SEQ ID NO :470、SEQ ID NO :471、SEQ ID NO :472、SEQ IDNO 474, SEQ ID NO :476、SEQ ID NO :477、SEQ ID NO :479、SEQ ID NO :481、SEQ ID NO .482、SEQ ID NO :483、SEQ ID NO :485、SEQ ID NO :487、SEQ ID NO :488、SEQ ID NO :489、SEQ ID NO 490,SEQ ID NO :491、SEQ ID NO :493、SEQ ID NO :495、SEQ ID NO :496、SEQ IDNO 497, SEQ ID NO :499、SEQ ID NO :501、SEQ ID NO :502、SEQ ID NO :503、SEQ ID NO .504、SEQ ID NO :505、SEQ ID NO :506、SEQ ID NO :507、SEQ ID NO :508、SEQ ID NO :510、SEQ ID NO 512,SEQ ID NO :513、SEQ ID NO :514、SEQ ID NO :516、SEQ ID NO :518、SEQ IDNO 518, SEQ ID NO :520、SEQ ID NO :521、SEQ ID NO :523、SEQ ID NO :525、SEQ ID NO .526、SEQ ID NO :528、SEQ ID NO :530、SEQ ID NO :531、SEQ ID NO :533、SEQ ID NO :535、SEQ ID NO: 536、SEQ ID NO :537、SEQ ID NO :538、SEQ ID NO :540、SEQ ID NO :542、SEQ IDNO 543, SEQ ID NO :545、SEQ ID NO :547、SEQ ID NO :548、SEQ ID NO :549、SEQ ID NO .550、SEQ ID NO :551、SEQ ID NO :553、SEQ ID NO :555、SEQ ID NO :556、SEQ ID NO :557、SEQ ID NO 559,SEQ ID NO :561、SEQ ID NO :562、SEQ ID NO :563、SEQ ID NO :564、SEQ IDNO 566, SEQ ID NO :568、SEQ ID NO :570、SEQ ID NO :572、SEQ ID NO :574、SEQ ID NO .576、SEQ ID NO :578、SEQ ID NO :580、SEQ ID NO :582、SEQ ID NO :584、SEQ ID NO :586、SEQ ID NO: 588、SEQ ID NO :589、SEQ ID NO :590、SEQ ID NO :591、SEQ ID NO :592、SEQ IDNO 594,SEQ ID NO :604、SEQ ID NO :606、SEQ ID NO :608、SEQ ID NO :610、SEQ IDNO :612、SEQ ID NO 614, SEQ ID NO :616、SEQ ID N0:618、SEQ ID NO :620 或 SEQ ID NO :622 的氨基酸序列， (b)由權(quán)利要求I的核酸編碼的(a)的多肽。
5.蛋白制劑，所述蛋白制劑包含在權(quán)利要求4中所述的多肽，其中所述蛋白制劑包括液體、固體或凝膠。
6.固定化多肽，其如權(quán)利要求4中所述，其中所述多肽被固定在細(xì)胞、金屬、樹(shù)脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微電極、石墨顆粒、珠子、凝膠、平板、陣列或毛細(xì)管上。
7.用于動(dòng)物的食物、飼料、食物添加劑或飼料添加劑，可食用的材料或可食用的酶?jìng)魉突|(zhì)，其包括 (a)權(quán)利要求4中所述的多肽， (b)(a)的傳送基質(zhì)，其中所述傳送基質(zhì)包括丸狀物。
8.水解淀粉、或去除淀粉或液化淀粉的方法，包括如下步驟 (a)提供在權(quán)利要求4中所述的多肽； (b)提供包含淀粉的組合物；和 (C)用步驟(b)的組合物在其中多肽水解淀粉、或去除或液化淀粉的條件下接觸步驟(a)的多肽。
9.去污劑組合物，所述去污劑組合物包含在權(quán)利要求4中所述的多肽，其中所述多肽配制為不含水的液體組合物、澆注固體、顆粒形式、粒狀形式、壓縮片劑、凝膠形式、糊狀或漿狀形式。
10.食物添加劑、飼料添加劑、食物、或飼料，其包含在權(quán)利要求4中所述的多肽。
11.組合物，其包含淀粉，以及在權(quán)利要求4中所述的多肽。
12.織物，其包含在權(quán)利要求4中所述的多肽。
13.用于織物處理或脫漿的方法，該方法包括如下步驟 (a)提供在權(quán)利要求4中所述的多肽； (b)提供織物；和 (C)在所述多肽可處理或脫漿織物的條件下用步驟(b)的織物接觸步驟(a)的多肽。
14.紙、或紙產(chǎn)品、或紙漿，所述紙或紙產(chǎn)品或紙漿包含在權(quán)利要求4中所述的多肽。
15.用于處理紙、紙產(chǎn)品、紙漿或纖維的方法，所述方法包括如下步驟 (a)提供在權(quán)利要求4中所述的多肽； (b)提供含有紙、紙產(chǎn)品、紙漿或纖維的組合物；和 (C)在多肽可以處理紙、紙產(chǎn)品、紙漿或纖維的條件下用步驟(b)的組合物接觸步驟(a)的多肽， 其中所述方法是脫墨紙、紙產(chǎn)品、紙漿或纖維。
16.用于處理木素纖維素材料的方法，所述方法包括如下步驟 (a)提供在權(quán)利要求4中所述的多肽； (b)提供木素纖維素纖維；和 (C)在多肽可以處理材料的條件下用步驟(b)的材料接觸步驟(a)的多肽，從而改進(jìn)纖維的性質(zhì)。
17.高麥芽糖、或高葡萄糖液體、或糖漿，所述液體或糖漿包含在權(quán)利要求4中所述的多肽。
18.用于產(chǎn)生高麥芽糖或高葡萄糖糖漿的方法，所述方法包括如下步驟 (a)提供在權(quán)利要求4中所述的多肽； (b)提供含有淀粉的組合物；和 (C)在步驟(a)的多肽可以水解步驟(b)的組合物的條件下接觸步驟(a)的多肽，從而產(chǎn)生高麥芽糖或高葡萄糖糖漿， 其中所述淀粉來(lái)自稻、玉米、大麥、小麥、豆類、馬鈴薯或甘薯。
19.用于改善含淀粉的生產(chǎn)流體的流動(dòng)的方法，所述方法包括如下步驟 (a)提供在權(quán)利要求4中所述的多肽； (b)提供含有淀粉的生廣流體；和 (C)在所述多肽可以水解生產(chǎn)流體中的淀粉的條件下，將步驟(a)的多肽與步驟(b)的生產(chǎn)流體接觸，從而通過(guò)降低其密度來(lái)改善其流動(dòng)， 其中所述生產(chǎn)流體來(lái)自地下形成物。
20.在釀造或酒精生產(chǎn)中使用淀粉酶的方法，所述方法包括如下步驟 (a)提供在權(quán)利要求4中所述的多肽；(b)提供含有淀粉的在釀造或酒精生產(chǎn)中使用的組合物； (C)在其中多肽可以水解在釀造或酒精生產(chǎn)中使用的組合物中的淀粉的條件下，將步驟(a)的多肽與步驟(b)的組合物結(jié)合。
21.酒精飲料或啤酒，所述酒精飲料或啤酒包含在權(quán)利要求4中所述的多肽。
22.藥物組合物、延遲釋放或控制釋放組合物或口腔護(hù)理產(chǎn)品，所述藥物組合物、緩釋或控釋組合物或口腔護(hù)理產(chǎn)品包含在權(quán)利要求4中所述的多肽， 其中所述產(chǎn)品包括牙膏、假牙乳劑、凝膠或牙粉、牙用產(chǎn)品、漱口劑、刷洗前或刷洗后潤(rùn)洗制劑、口香糖、糖塊或糖果。
23.油井鉆探流體，所述油井鉆探流體包括在權(quán)利要求4中所述的多肽。
24.用于改變組合物的粘度的方法，所述方法包括用在權(quán)利要求4中所述的多肽處理所述組合物，其中所述組合物包括土壤。
25.用于幫助運(yùn)走鉆探泥漿的方法，所述方法包括用在權(quán)利要求4中所述的多肽處理鉆探泥漿。
26.生物漂白溶液，所述生物漂白溶液包含在權(quán)利要求4中所述的多肽。
27.對(duì)組合物進(jìn)行生物漂白的方法，所述方法包括用在權(quán)利要求4中所述的多肽處理所述組合物，其中所述組合物是紙或紙漿產(chǎn)品。
28.用于生產(chǎn)基于乙醇的燃料的方法，所述方法包括如下步驟 (a)提供在權(quán)利要求4中所述的多肽； (b)提供含有淀粉的組合物；和 (C)在所述多肽水解淀粉的條件下，用(b)的組合物接觸(a)的多肽， 其中所述醇是乙醇。
全文摘要
一方面，本發(fā)明涉及具有淀粉酶活性的多肽，編碼這些多肽的多核苷酸，以及制備和使用這些多核苷酸和多肽的方法。一方面，本發(fā)明的多肽可以被用作淀粉酶，例如α淀粉酶，以便催化淀粉水解成為糖。一方面，本發(fā)明提供了緩釋組合物，該組合物包括一種由膠乳聚合物涂層包衣的期望成分。
文檔編號(hào)A23L1/29GK102618564SQ20121002058
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2004年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月6日
發(fā)明者C·米勒, E·歐唐納古, G·弗萊, J·S·克羅夫, K·格雷, M·斯盧皮斯卡, N·巴頓, T·理查森, W·考倫 申請(qǐng)人:維萊尼姆公司