專利名稱：整合編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工業(yè)微生物和丁醇及其異構(gòu)體的發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及具有一種或多種整合多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼催化利用丙酮酸的生物合成途徑中的步驟(例如丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化)的多肽。
背景技術(shù)：
丁醇是重要的工業(yè)化學(xué)品，其用作燃料添加劑、塑料工業(yè)中的化學(xué)原料以及食品和香料工業(yè)中的食品級(jí)提取劑。每年由石油化學(xué)方法生產(chǎn)了 100至120億磅的丁醇，并且對(duì)這種通用化學(xué)品的需求還很可能會(huì)增加。2-丁酮，也被稱為甲基乙基酮(MEK)，是被廣泛使用的溶劑，并且是繼丙酮之后最重要的商品化生產(chǎn)的酮。它被用作用于漆料、樹脂和粘合劑的溶劑，以及選擇性提取劑、氧化反應(yīng)的活化劑，并且它能夠通過(guò)在催化劑的存在下與氫反應(yīng)而以化學(xué)方法被轉(zhuǎn)化為2- 丁醇(Nystrom等人，J.Am.Chem.Soc.,69:1198,1947)。2，3-丁二醇可被 用于丁烯和丁二烯(二者是重要的化工原料，目前由裂化石油獲得)的化學(xué)合成中，并且2，3- 丁二醇的酯可被用作增塑劑(Voloch等人,“FermentationDerived2, 3-Butanediol,，，！Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press Ltd.,England，第 2 卷，第 3 節(jié)，第 933-947 頁(yè)，1986)。可工程化微生物以表達(dá)用于生產(chǎn)例如2，3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和異丁醇的產(chǎn)物的生物合成途徑。美國(guó)專利7，851，188公開了用于生產(chǎn)異丁醇的工程化重組微生物。美國(guó)專利申請(qǐng)公布20070259410和20070292927公開了用于生產(chǎn)2- 丁酮或2- 丁醇的工程化重組微生物。已知多個(gè)用于異丁醇和2-丁醇的生物合成的途徑，它們?nèi)繌募?xì)胞的丙酮酸開始。丁二醇是2-丁醇途徑中的中間體，所述途徑在美國(guó)專利申請(qǐng)公布20070292927中公開。已經(jīng)改變了酵母中的丙酮酸代謝以生產(chǎn)乳酸和甘油。美國(guó)專利申請(qǐng)公布20070031950公開了帶有一種或多種丙酮酸脫羧酶或丙酮酸脫氫酶基因的破壞并且表達(dá)D-乳酸脫氫酶基因的酵母菌株，其被用于生產(chǎn)D-乳酸。Ishida等人(Biosc1.Biotech,and Biochem.，70:1148-1153，2006)描述了具有破壞的丙酮酸脫羧酶基因并表達(dá)乳酸脫氧酶的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0059136公開了沒(méi)有丙酮酸脫水酶活性的葡萄糖耐受的不依賴C2碳源(GCSI)的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脫氫酶基因。Nevoigt等人(Yeast，12:1331-1337，1996)描述了在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中降低的丙酮酸脫羧酶和提高的NAD-依賴的甘油_3_磷酸脫氫酶對(duì)甘油產(chǎn)量的影響。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)醇或其它化合物需要酵母細(xì)胞穩(wěn)定生產(chǎn)丙酮酸生物合成途徑的多核苷酸。此外還需要在重組宿主細(xì)胞如酵母中生產(chǎn)異丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮的改善方法。

發(fā)明內(nèi)容
本文提供了具有一種或多種整合多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼催化利用丙酮酸的生物合成途徑中的步驟(例如丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化)的多肽。與不具有編碼催化生物合成途徑步驟(例如丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化)的多肽的整合多核苷酸的宿主細(xì)胞相比，此類宿主細(xì)胞提供穩(wěn)定和/或增加生物合成途徑產(chǎn)物形成的方法，所述產(chǎn)物例如異丁醇、2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含編碼多肽的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化，所述多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞的染色體中。在另一方面，所述宿主細(xì)胞包含利用丙酮酸的生物合成途徑和編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞的染色體中。在另一方面，所述多核苷酸是宿主細(xì)胞異源性的。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及重組宿主細(xì)胞，其包含異丁醇生物合成途徑，其中所述途徑包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，所述多肽由整合到染色體中的異源性多核苷酸編碼，并且其中所述途徑包括由多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羥基異戊酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，所述多肽由質(zhì)粒上的多核苷酸編碼。在多個(gè)實(shí)施例中，與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的重組宿主細(xì)胞相t匕，所述異丁醇生產(chǎn)的滴度是提高的。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及重組宿主細(xì)胞，其包含2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途徑，其中所述途徑包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，所述多肽由整合到染色體中的異源性多核苷酸編碼，并且其中所述途徑包括至少一種由多肽催化的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，所述多肽由質(zhì)粒上的多核苷酸編碼。在多個(gè)實(shí)施例中，與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的重組宿主細(xì)胞相比，所述2，3- 丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生產(chǎn)的滴度是提高的。在另一方面，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞，其包含編碼第一多肽的第一異源性多核苷酸，所述第一多肽催化利用丙酮酸的生物合成途徑的轉(zhuǎn)化步驟；編碼第二多肽的第二異源性多核苷酸，所述第二多肽催化利用丙酮酸的生物合成途徑的轉(zhuǎn)化步驟；和編碼第三多肽的第三異源性多核苷酸，所述第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途徑的轉(zhuǎn)化步驟；其中所述第一和第二異源性多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞的染色體中；其中所述第三異源性多核苷酸沒(méi)有被整合到宿主細(xì)胞的染色體中；并且其中所述第一、第二、和第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途徑的不同步驟。

在另一方面，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞，其包含(a)編碼第一多肽的第一異源性多核苷酸，所述第一多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；(b)編碼第二多肽的第二異源性多核苷酸，所述第二多肽催化α-酮異戊酸至異丁醛的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；和(c)編碼第三多肽的第三異源性多核苷酸，所述第三多肽催化不是(a)或(b)的轉(zhuǎn)化步驟的異丁醇生物合成途徑轉(zhuǎn)化步驟；其中所述第一和第二異源性多核苷酸被整合到染色體中；其中所述第三異源性多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中；并且其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇。在另一方面，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞，其包含(a)編碼第一多肽的第一異源性多核苷酸，所述第一多肽催化α -酮異戊酸至異丁醛的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；和6)編碼第二多肽的第二異源性多核苷酸，所述第二多肽催化不是(a)的轉(zhuǎn)化步驟的異丁醇生物合成途徑轉(zhuǎn)化步驟；其中所述第一異源性多核苷酸被整合到染色體中；其中所述第二異源性多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中；并且其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇。在本發(fā)明的多個(gè)方面，所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌或酵母。在另一方面，宿主細(xì)胞是下列屬的成員:梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、類芽抱桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)或糖酵母屬(Saccharomyces)。在另一方面，宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)、真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、浸麻類芽抱桿菌(Paenibacillus macerans)、紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、享烏雞腸球菌(Enterococcus gallinarium)、屎腸球菌(Enterococcus faecalis)或啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在另一方面,所述宿主細(xì)胞是兼性厭氧菌。在本發(fā)明的另一方面，利用丙酮酸的生物合成途徑包含一種或多種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化途徑的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在另一方面，一種或多種多核苷酸被整合到染色體中。在另一方面，利用丙酮酸的生物合成途徑形成產(chǎn)物2，3-丁二醇、異丁醇、2-丁醇或2-丁酮。在本發(fā)明的一個(gè)方面， 利用丙酮酸的生物合成途徑是丁醇生物合成途徑。在另一方面，丁醇生物合成途徑是2- 丁醇生物合成途徑或異丁醇生物合成途徑。在另一方面，宿主細(xì)胞包含一種或多種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羥基異戊酸；(iii) 2，3- 二羥基異戊酸至α-酮異戊酸；(iv) α-酮異戊酸至異丁醛；或(V)異丁醛至異丁醇。在另一方面，(ii)、(iii )、( iv)或(V)的一種或多種多核苷酸在質(zhì)粒上。在另一方面，宿主細(xì)胞包含一種或多種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羥基異戊酸；(iii) 2，3- 二羥基異戊酸至α -酮異戊酸；(iv) α -酮異戍酸至異丁酰-CoA ； (V)異丁酰-CoA至異丁醒；或(>；0異丁醒至異丁醇。在另一方面，
(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的一種或多種多核苷酸在質(zhì)粒上。在另一方面，宿主細(xì)胞包含一種或多種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3- 二羥基異戊酸；(iii) 2，3- 二羥基異戊酸至α -酮異戊酸；(iv) α -酮異戊酸至纈氨酸；(V)纈氨酸至異丁胺；(vi)異丁胺至異丁醛；或(vii)異丁醒至異丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)或(vii)的一種或多種多核苷酸在質(zhì)粒上。在本發(fā)明的另一方面，宿主細(xì)胞包含一種或多種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3-丁二醇；或(^)2，3-丁二醇至2-丁酮。在另一方面，(ii)、(iii)或(iv)的一種或多種多核苷酸在質(zhì)粒上。在另一方面，宿主細(xì)胞包含一種或多種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3- 丁二醇；(iv)2, 3- 丁二醇至2- 丁酮；或(v)2- 丁酮至2- 丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(V)的一種或多種多核苷酸在質(zhì)粒上。在本發(fā)明的另一方面，宿主細(xì)胞包含一種或多種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii) α-乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；(iv) 3-氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；(V)或3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(V)的一種或多種多核苷酸在質(zhì)粒上。在另一方面，宿主細(xì)胞包含一種或多種編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii) α -乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；(iv) 3-氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；(V) 3-氨基-2- 丁醇磷酸至 2- 丁酮；或(>；0 2- 丁酮至 2- 丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的一種或多種多核苷酸在質(zhì)粒上。在另一方面，至少其中一種編 碼催化底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸是異源性的。在另一個(gè)實(shí)施例中，多于一種編碼催化底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸是異源性的。在另一個(gè)實(shí)施例中，所有編碼催化利用丙酮酸的生物合成途徑中每個(gè)底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸是異源性的。在本發(fā)明的一個(gè)方面，催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的多肽是乙酰乳酸合酶。在另一方面，乙酰乳酸合酶與表I所述的乙酰乳酸合酶具有至少約80%的氨基酸序列同一性。在另一方面，乙酰乳酸合酶與具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少約80%的同一性。在另一方面，催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽對(duì)應(yīng)于酶委員會(huì)編號(hào)(Enzyme Commission Number) EC2.2.1.6。在本發(fā)明的另一方面，催化乙酰乳酸至2，3-二羥基異戊酸的轉(zhuǎn)化的多肽對(duì)應(yīng)于酶委員會(huì)編號(hào)ECl.1.1.86。在另一方面，催化2，3-二羥基異戊酸至α-酮異戊酸的轉(zhuǎn)化的多肽對(duì)應(yīng)于酶委員會(huì)編號(hào)EC4.2.1.9。在另一方面，催化α -酮異戊酸至異丁醛的轉(zhuǎn)化的多肽對(duì)應(yīng)于酶委員會(huì)編號(hào)EC4.1.1.72或4.1.1.1。在另一方面，催化異丁醛至異丁醇的轉(zhuǎn)化的多肽對(duì)應(yīng)于酶委員會(huì)編號(hào)ECl.1.1.265、1.1.1.1或1.1.1.2。在一個(gè)方面，本發(fā)明的宿主細(xì)胞中丙酮酸脫羧酶的表達(dá)是降低的或基本上消除的。在另一方面，宿主細(xì)胞包含內(nèi)源性多核苷酸中的缺失、突變、和/或替換，所述內(nèi)源性多核苷酸編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽。在本發(fā)明的另一方面，一種或多種編碼催化本文所述的生物合成途徑步驟的多肽的多核苷酸在質(zhì)粒中。在另一方面，所述質(zhì)粒包含與SEQ ID NO:1至89中的一種或多種至少約 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的序列，或者與 SEQ ID NO: 129-133或它們的編碼區(qū)中的任何一個(gè)至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明的宿主細(xì)胞中甘油-3-磷酸脫氫酶的表達(dá)是降低的或基本上消除的。在另一方面，本發(fā)明的宿主細(xì)胞中FRA2的表達(dá)是降低的或基本上消除的。在另一方面，本文所述的一種或多種多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞的染色體中I3DCl-TRXl基因間區(qū)域處。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)來(lái)自本發(fā)明宿主細(xì)胞的生物合成途徑產(chǎn)物的方法。在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括(a)提供本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；以及(b)在產(chǎn)生丁醇的條件下，使所述重組宿主細(xì)胞與可發(fā)酵碳底物接觸以形成發(fā)酵液體培養(yǎng)基。在另一方面，所述方法還包括使所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基與提取劑接觸以產(chǎn)生兩相發(fā)酵混合物。在另一方面，所述提取劑包括脂肪酸。在另一方面，所述脂肪酸來(lái)源于玉米油或大豆油。在另一方面，所述提取劑包括與水不混溶的有機(jī)提取劑如C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪酰胺或C12-C22脂肪醛。在另一方面，所述方法還包括使所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基與有機(jī)酸和酶接觸，所述酶能夠用所述有機(jī)酸酯化丁醇。在另一方面，所述方法還包括蒸發(fā)所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基的至少一部分以形成包含水和丁醇的蒸氣流。在一個(gè)方面，與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的宿主細(xì)胞相比，本發(fā)明的宿主細(xì)胞的丁醇生產(chǎn)速率提高至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約2倍、至少約3倍或至少約4倍。在另一方面，與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的宿主細(xì)胞相比，本發(fā)明的宿主細(xì)胞的丁醇生產(chǎn)滴度提高至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約2倍、至少約3倍或至少約4倍。 在另一方面，本發(fā)明涉及提高非整合重組多核苷酸的拷貝數(shù)或表達(dá)的方法，所述重組多核苷酸編碼催化本文所述的生物合成途徑步驟的多肽，所述方法包括在產(chǎn)生生物合成途徑產(chǎn)物的條件下，使本發(fā)明的宿主細(xì)胞與可發(fā)酵碳底物接觸以形成發(fā)酵液體培養(yǎng)基。在另一方面，本發(fā)明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途徑的流量的方法，所述方法包括:(a)提供本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；以及(b)在提高所述宿主細(xì)胞中利用丙酮酸的生物合成途徑的流量的條件下，使所述宿主細(xì)胞與可發(fā)酵碳底物接觸以形成發(fā)酵液體培養(yǎng)基。在另一方面，本發(fā)明涉及制備重組宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括用下列多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞:(i) 一種或多種編碼催化利用丙酮酸的生物合成途徑的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸jP(ii)編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸；其中
(ii)的多核苷酸被整合到染色體中。在另一方面，本發(fā)明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途徑產(chǎn)物的形成的方法，所述方法包括:(i)提供本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；以及(ii)使所述宿主細(xì)胞在形成利用丙酮酸的途徑產(chǎn)物的條件下生長(zhǎng)，其產(chǎn)物量大于由不包含整合到染色體中的編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞形成的產(chǎn)物量。
在另一方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含(i)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；(ii) 丁醇；和
(iii)提取劑。在另一方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含(i)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；(ii)丁醇；
(iii)提取劑；和(iv)酯化酶。在另一方面，此類組合物的丁醇是異丁醇。在另一方面，本發(fā)明涉及將乙酰乳酸合酶(als)染色體整合到酵母宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括用包含SEQ ID NO: 131的整合載體轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。在另一方面，宿主細(xì)胞還包含異丁醇生物合成途徑。在另一方面，所述宿主包含至少兩個(gè)染色體整合的多核苷酸。


并入本文并成為說(shuō)明書的一部分的附圖示出了本發(fā)明，并且與說(shuō)明書一起進(jìn)一步用來(lái)解釋本發(fā)明的原理并使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠利用本發(fā)明。圖1示出利用丙酮酸的途徑和酶。圖2示出三種不同的異丁醇生物合成途徑圖3示出四種不同的2- 丁醇生物合成途徑。圖4A-4D示出乙酰乳酸合酶(als)編碼區(qū)的序列關(guān)系，所述編碼區(qū)用枯草芽孢桿菌(B.subtilis) AlsS序列的BLAST分析進(jìn)行檢索，限制為該序列的100個(gè)最近鄰居。als編碼序列通過(guò)它的來(lái)源生物進(jìn)行鑒定。圖 5 示出 PNY2204 基因座(pdcl Δ::ilvD::pUC19_kan::FBA_alsS::TRX1)0圖 6 示出 PNY2211 基因座(pdcl Δ::ilvD::FBA_alsS:: TRX1)0 認(rèn)為 pdcl-trxl 基因間區(qū)域中的alsS基因整合是“無(wú)痕”插入，因?yàn)檩d體、標(biāo)記基因和1xP序列丟失。根據(jù)下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發(fā)明，下面的詳細(xì)描述和所附的序列描述形成了本申請(qǐng)的一部分。下列序列符合37C.F.R.§ §1.821-1.825(“對(duì)含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請(qǐng)的要求一序列規(guī)則”)并且符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25 (2009)和EPO和PCT的序列表要求[規(guī)則5.2和49.5 (a-bis),以及行政性指示的208節(jié)和附錄C]。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。表1:本f渉及的編碼區(qū)和蛋白質(zhì)的序列號(hào)(SEQ ID NO)
權(quán)利要求
1.重組宿主細(xì)胞，包含異丁醇生物合成途徑，其中所述途徑包括由整合到染色體中的異源性多核苷酸編碼的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，并且其中所述途徑包括由質(zhì)粒上的多核苷酸編碼的多肽催化的乙酰乳酸至2，3- 二羥基異戊酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，并且其中與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的重組宿主細(xì)胞相比，所述異丁醇生產(chǎn)的滴度是提高的。
2.重組宿主細(xì)胞，包含2，3-丁二醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途徑，其中所述途徑包括由整合到染色體中的異源性多核苷酸編碼的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，并且其中所述途徑包括至少一種由質(zhì)粒上的多核苷酸編碼的多肽催化的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自:細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌和酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是選自下列屬的成員:梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus )、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcali genes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽抱桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和糖酵母屬(Saccharomyces)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述多肽是在所述宿主細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中表達(dá)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或3至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:2，3- 二羥基異戊酸至α -酮異戊酸；α -酮異戊酸至異丁醛；以及異丁醛至異丁醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:2，3- 二羥基異戊酸至α -酮異戊酸；α -酮異戊酸至異丁酰-CoA ;異丁酰-CoA至異丁醛；以及異丁醛至異丁醇。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:2，3- 二羥基異戊酸至α -酮異戊酸；α-酮異戊酸至纈氨酸；纈氨酸至異丁胺；異丁胺至異丁醛；以及異丁醛至異丁醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；以及2，3- 丁二醇至2- 丁酮。
13.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至·2，3- 丁二醇；2，3- 丁二醇至2- 丁酮；以及2- 丁酮至2- 丁醇。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的多肽是乙酰乳酸合酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組宿主，其中所述乙酰乳酸合酶與選自SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少約80%的同一性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中丙酮酸脫羧酶的表達(dá)是降低的或基本上消除的。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含內(nèi)源性多核苷酸中的缺失、突變、和/或替換，所述內(nèi)源性多核苷酸編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸被整合到內(nèi)源性多核苷酸中，所述多核苷酸編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽，所述內(nèi)源性多核苷酸編碼具有丙酮酸脫羧酶活性的多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中甘油-3-磷酸脫氫酶的表達(dá)是降低的或基本上消除的。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中Fra2的表達(dá)是降低的或基本上消除的。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸被整合到染色體中roc1-TRXI基因間區(qū)域處。
22.重組宿主細(xì)胞，包含:(a)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，其中所述多核苷酸被整合到染色體中；(b)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化乙酰乳酸至2，3-二羥基異戊酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，其中所述多核苷酸在質(zhì)粒上；(c)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化2，3-二羥基異戊酸至α-酮異戊酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；和(d)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化α-酮異戊酸至異丁醛的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；其中所述宿主細(xì)胞基本上不具有丙酮酸脫羧酶活性；并且其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生異丁醇。
23.方法，包括:(a)提供權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)或它們的任何組合 的重組宿主細(xì)胞；以及(b)在產(chǎn)生生物合成途徑產(chǎn)物的條件下，使所述宿主細(xì)胞與可發(fā)酵碳底物接觸以形成發(fā)酵液體培養(yǎng)基。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，還包括使所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基與提取劑接觸以產(chǎn)生兩相發(fā)酵混合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述提取劑包括脂肪酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述脂肪酸來(lái)源于玉米油或大豆油。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述提取劑包括與水不混溶的有機(jī)提取劑，所述有機(jī)提取劑選自=C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛和C12-C22脂肪酰胺。
28.根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物合成途徑產(chǎn)物是醇，并且其中所述方法還包括使所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基與有機(jī)酸和酶接觸，所述酶能夠用所述有機(jī)酸酯化所述醇。
29.根據(jù)權(quán)利要求23至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物合成途徑產(chǎn)物是醇，并且其中所述方法還包括蒸發(fā)所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基的至少一部分以形成包含水和醇的蒸氣流。
30.根據(jù)權(quán)利要求23至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物合成途徑產(chǎn)物是丁醇。
31.根據(jù)權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物合成途徑產(chǎn)物是異丁醇。
32.根據(jù)權(quán)利要求30至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的重組宿主細(xì)胞相比，所述丁醇生產(chǎn)的速率提高至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約2倍、至少約3倍或至少約4倍。
33.根據(jù)權(quán)利要求30至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中與編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的重組宿主細(xì)胞相比，所述丁醇生產(chǎn)的滴度提高至少約10%、至少 約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約2倍、至少約3倍或至少約4倍。
34.根據(jù)權(quán)利要求32至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述丁醇是異丁醇。
35.提高催化生物合成途徑步驟的非整合重組多核苷酸的拷貝數(shù)或表達(dá)的方法，包括: 在產(chǎn)生生物合成途徑產(chǎn)物的條件下，使權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的重組宿主細(xì)胞與可發(fā)酵碳底物接觸以形成發(fā)酵液體培養(yǎng)基。
36.提高利用丙酮酸的生物合成途徑的流量的方法，包括: (a)提供權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)或它們的任何組合的重組宿主細(xì)胞；以及 (b)在提高所述宿主細(xì)胞中利用丙酮酸的生物合成途徑的流量的條件下，使所述宿主細(xì)胞與可發(fā)酵碳底物接觸以形成發(fā)酵液體培養(yǎng)基。
37.提高2，3-丁二醇、異丁醇、2- 丁醇或2- 丁酮生物合成途徑產(chǎn)物的形成的方法，包括: (i)提供權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)或它們的任何組合的重組宿主細(xì)胞；以及 ( )使所述宿主細(xì)胞在形成利用丙酮酸的途徑產(chǎn)物的條件下生長(zhǎng)； 其中由所述重組宿主細(xì)胞形成的產(chǎn)物量大于由編碼催化丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化的多肽的多核苷酸沒(méi)有被整合到染色體中的宿主細(xì)胞形成的產(chǎn)物量。
38.組合物，包含: (i)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)或它們的任何組合的宿主細(xì)胞； ( ) 丁醇；和(iii)提取劑。
39.組合物，包含: (i)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)或它們的任何組合的宿主細(xì)胞； ( ) 丁醇； (iii)提取劑；和 (iv)酯化酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的組合物，其中所述提取劑包括脂肪酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述脂肪酸來(lái)源于玉米油或大豆油。
42.根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的組合物，其中所述提取劑是與水不混溶的有機(jī)提取齊U，所述有機(jī)提取劑選自=C 12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛和C12-C22脂肪醒。
43.根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的組合物，其中所述提取劑包括油醇。
44.權(quán)利要求1或3至23中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求38至43中任一項(xiàng)的組合物在生產(chǎn)異丁醇的方法中的用途。
45.權(quán)利要求1或3至23中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求38至43中任一項(xiàng)的組合物在生產(chǎn)包含異丁醇的燃料組合物的方法中的用途。
46.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；3_氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；以及3-氨基-2- 丁醇磷酸至2_ 丁酮。
47.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至3-氨基-2- 丁醇；3_氨基-2- 丁醇至3-氨基-2- 丁醇磷酸；3_氨基-2- 丁醇磷酸至2- 丁酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有至少一種整合多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼催化利用丙酮酸的生物合成途徑中的步驟(例如丙酮酸至乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化)的多肽。本發(fā)明也涉及使用此類宿主細(xì)胞提高異丁醇、2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮的生物合成產(chǎn)量的方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103080298SQ201180042345
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者L.C.安東尼, L.A.馬吉奧-霍爾, B.J.保羅 申請(qǐng)人:布特馬斯先進(jìn)生物燃料有限責(zé)任公司