專利名稱：生產(chǎn)啶南平的方法
生產(chǎn)啶南平的方法
[與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用]此專利申請(qǐng)要求在2010年I月26日提交的日本專利申請(qǐng)?zhí)?4727/2010的優(yōu)先權(quán)，將其全部公開引入本文作為參考。
[發(fā)明背景]發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)唳南平(pyripyropene)的方法,更具體地,一種生產(chǎn)唳南平A, E,0等的方法。
背景技術(shù)：
如在日本專利特開公報(bào)號(hào)(Laid-Open Publication No. ) 360895/1992 (專利文件I)和Journal of Antibiotics (1993)，46 (7)，1168-9 (非專利文件I)中公開的啶南平A，具有針對(duì)ACAT(?；o酶A :膽固醇?；D(zhuǎn)移酶)的抑制活性，有望將其應(yīng)用于治療由膽固醇積累引起的疾病等等。作為產(chǎn)唳南平A的真菌，煙曲霉(Aspergillus fumigatus) FQ-1289菌株已在日本專利特開公報(bào)號(hào)360895/1992 (專利文件I)中公開;Eupenicillium reticulosporumNRRL-3446 菌株已在 Applied and Environmental Microbiology(1995),61(12),4429-35 (非專利文件2)中公開;灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)F1959菌株已在W02004/060065 (專利文件 2)中公開；和糞牛.青霉(Penicillium coprobium)PF1169 菌株已在 Journal of Technical Disclosure 500997/2008 (專利文件 3)中公開。此外，作為唳南平A的生物合成途徑,在Journal of Organic Chemistry (1996),61,882-886(非專利文件 3)和 Chemical Review (2005)，105，4559-4580 (非專利文件4)中已公開了在煙曲霉F0-1289菌株中假定的生物合成途徑。這些文件公開了在煙曲霉F0-1289菌株中，通過環(huán)化酶連接分別由聚酮合酶或異戊烯轉(zhuǎn)移酶合成的部分結(jié)構(gòu)以合成啶南平A。
[現(xiàn)有技術(shù)參考]
[專利文件]
[專利文件I]日本專利特開公報(bào)號(hào)360895/1992 [專利文件 2]W02004/060065
[專利文件 3] Journal of Technical Disclosure 500997/2008
[非專利文件]
[非專利文件 I] Journal of Antibiotics (1993), 46 (7), 1168-9.
[非專利文件2]Applied and Environmental Microbiology (1995),61 (12),4429-35.[非專利文件 3] Journal of Organic Chemistry (1996), 61,882-886.
[非專利文件 4] Chemical Review (2005)，105，4559-4580.
[發(fā)明概述]
本發(fā)明者現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，能夠通過用啶南平A生物合成所必需的中間體化合物培養(yǎng)微生物生產(chǎn)啶南平A或類似物，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重組載體。已基于這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)啶南平A的方法。此外，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)導(dǎo)入有以下(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體的微生物，并通過啶南平0分離啶南平A:
(I)分離的多核苷酸，其具有選自以下(a)至(d)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序
列
(a)SEQ ID NO :266的核苷酸序列，
(b)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與SEQID NO:266的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與SEQ ID N0:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白，
(C)SEQ ID N0:266的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與SEQ ID N0:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白，和
(d)核苷酸序列，其與SEQ ID N0:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一性，且其編碼與SEQ ID N0:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(II)分離的多核苷酸，其具有編碼選自SEQID N0:267至275的至少一個(gè)氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(III)分離的多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列
(I)在以下(a)至⑴中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從3342至5158的核苷酸序列，(b)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從5382至12777的核苷酸序列，
(c)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列，
(d)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列，
(e)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從18506至19296的核苷酸序列，
(f)SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從19779至21389的核苷酸序列，
(g)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列，
(h)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列，和
(i)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。另外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)微生物，其中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并通過啶南平E和啶南平O分離啶南平A。此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳 _2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮(4_hydroxy-6- (pyridin-3-yl)-3-((2E, 6E) -3, 7, 11-tr imethyldodeca-2, 6, 10-trienyl)-2H-pyran-2-one)的方法,其特征在于用4_氧-6-(3-卩比唳基)-a -卩比喃酮(4-oxo_6-(3_pyridyl)_a-pyrone)培養(yǎng)微生物,其中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3, 7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了上述(I)至(III)中的至少一種分離的多核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了重組載體，其選自PPP6 (用質(zhì)粒pPP6·轉(zhuǎn)化的米曲霉(Aspergillus oryzae)的登記號(hào):FERMBP-11218), pPP7 (用質(zhì)粒pPP7轉(zhuǎn)化的米曲霍的登記號(hào):FERM BP-11219)和pPP9 (用質(zhì)粒dPP9轉(zhuǎn)化的米曲霍的登記號(hào):FERMBP-11220)。此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了轉(zhuǎn)化體，其包含選自質(zhì)粒pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了上述重組載體用于生產(chǎn)啶南平A的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了上述轉(zhuǎn)化體用于生產(chǎn)啶南平A的用途。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法，能夠通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)啶南平A，E，0等等。因此本發(fā)明的生產(chǎn)方法對(duì)啶南平A，E，0等等的大量生產(chǎn)技術(shù)具有重大貢獻(xiàn)。
[附圖簡述]
[圖I]圖I顯示了 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。用于電泳，使用以下引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物M:分子量標(biāo)記(IOObp梯)，泳道I:SEQ ID N0:1和2的引物，泳道2:SEQ ID NO:239和240的引物，泳道3:SEQ ID NO:237和238的引物，泳道4:SEQ ID NO:241和242的弓丨物，泳道5:SEQ ID NO:247和248的引物，泳道6:SEQ ID NO:251和252的引物，泳道7:SEQID NO:245 和 246 的引物，泳道 8:SEQ ID NO:243 和 244 的引物，泳道 9:SEQ ID NO:249250的引物，泳道10:SEQ ID N0:235和236的引物，泳道11:SEQ IDN0:233和234的引物，泳道12:SEQ ID N0:227和228的引物，泳道13:SEQID NO:229和230的引物，泳道14:SEQID NO:231和232的引物。
[圖2]類似圖I，圖2顯示了 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。用于電泳，使用以下引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物:M:分子量標(biāo)記(IOObp梯)，泳道I: SEQID NO: 253和254的引物，泳道2: SEQID NO:257 和 258 的引物，泳道 3:SEQ ID NO:259 和 260 的引物，泳道 4:SEQ ID NO:255 和256的引物，泳道5:SEQ ID NO:261和262的引物。
[圖3]類似
圖1，圖3顯示了 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。用于電泳，使用以下引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物:泳道I:分子量標(biāo)記(IOObp梯)，泳道2: SEQ ID NO: 264 265的引物(400bp擴(kuò)增片段)。
[圖4]圖4顯示了 pUSA的質(zhì)粒圖譜。[圖5]圖5顯示了 pPP2的質(zhì)粒圖譜。
[圖6]圖6顯示了 P450-2cDNA擴(kuò)增的方案。
[圖7]圖7顯示了 pPP3的質(zhì)粒圖譜。
[圖8]圖8顯示了啶南平E在氘化乙腈中的1H-NMR譜。
[圖9]圖9顯示了用質(zhì)粒pPP2轉(zhuǎn)化的米曲霉的培養(yǎng)產(chǎn)物在氘化乙腈中的1H-NMR譜。
[圖10]圖10顯示了啶南平O在氘化乙腈中的1H-NMR譜。
[圖11]圖11顯示了顯示了用質(zhì)粒PPP3轉(zhuǎn)化的米曲霉的培養(yǎng)產(chǎn)物在氘化乙腈中的
1H-NMR 譜。
[圖12]圖12顯示了質(zhì)粒pPP6，pPP7和pPP9的質(zhì)粒圖譜。
[發(fā)明詳述]微牛物保藏
用質(zhì)粒DCCl-PPl轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(Escherichia coli)(大腸桿菌EPI 300 -TlE)已被保藏至專利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary),獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(地址日本茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6 (郵政編碼305 —8566) (AISTTsukuba Central 6,1-1-lHigashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan,305-8566)),登記號(hào)為自2008年10月9日(原始保藏日期)起的FERM BP-11133 (從登記號(hào)為FERMP-21704的國內(nèi)保藏移管)(保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)(identification reference):大腸桿菌 EPI300tm-T17dCC1-PP1)。用質(zhì)粒pPP2轉(zhuǎn)化的米曲霉已被保藏至專利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城縣筑波市東 I 丁目 I 番地I中央第6(郵政編碼305 — 8566))，登記號(hào)為自2009年6月23日起的FERM BP_11137(保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)米曲霉PP2-1)。用質(zhì)粒pPP3轉(zhuǎn)化的米曲霉已被保藏至專利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城縣筑波市東 I 丁目 I 番地I中央第6(郵政編碼305 — 8566))，登記號(hào)為自2009年7月3日起的FERM BP_11141(保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)米曲霉PP3-2)。用質(zhì)粒pPP6轉(zhuǎn)化的米曲霉已被保藏至專利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城縣筑波市東 I 丁目I番地I中央第6 (郵政編碼305 - 8566))，登記號(hào)為自2009年12月21日起的FERMBP-11218 (保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)米曲霉PP6)。用質(zhì)粒pPP7轉(zhuǎn)化的米曲霉已被保藏至專利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城縣筑波市東 I 丁目I番地I中央第6 (郵政編碼305 - 8566))，登記號(hào)為自2009年12月21日起的FERMBP-11219 (保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)米曲霉PP7)。
用質(zhì)粒pPP9轉(zhuǎn)化的激血霊已被保藏至專利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary),獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(地址日本茨城縣筑波市東 I 丁目I番地I中央第6 (郵政編碼305 - 8566))，登記號(hào)為自2009年12月21日起的FERMBP-11220 (保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)米曲霉PP9)。生產(chǎn)啶南平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)啶南平的方法，其中通過用啶南平A生物合成所必需的中間體化合物培養(yǎng)微生物得到次級(jí)代謝產(chǎn)物，在所述微生物中引入?yún)⑴c啶南平A生物合成的基因。啶南平A生物合成途徑的實(shí)例包括以下方案I。
[表I]
輔酶A, Cs.4■氣+P-吡啶基)- -吡喃義
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方案I
下面將詳細(xì)描述上述方案I的每個(gè)生物合成途徑。
1.允許煙酸與輔酶A連接酶反應(yīng)，并進(jìn)一步允許得到的產(chǎn)物與LovB樣聚酮合酶(PKS)反應(yīng)，由此產(chǎn)生5-(3-吡啶基)-3，5- 二氧戊酸。
2.允許5-(3-吡啶基)-3，5-二氧戊酸與LovB樣聚酮合酶(PKS)反應(yīng)，由此產(chǎn)生4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮。
3.允許4-氧-6-(3-吡啶基)-a -吡喃酮和法尼焦磷酸(FPP)與UbiA樣異戊烯轉(zhuǎn)移酶(UbiAPT)反應(yīng)，由此產(chǎn)生4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
4.允許4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-( (2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳 _2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮與FAD依賴性單加氧酶(FMO)反應(yīng)，并進(jìn)一步允許得到的產(chǎn)物與環(huán)化酶(IMP:整合膜蛋白(Integral membrane protein))反應(yīng)，由此產(chǎn)生去乙酰唳南平E。
5.允許去乙酰啶南平E與乙?；D(zhuǎn)移酶(AT)反應(yīng)，由此產(chǎn)生啶南平E。
6.允許啶南平E與細(xì)胞色素P450單加氧酶(I)(P450-1)反應(yīng)，由此產(chǎn)生11_去乙酰啶南平O。
7.允許11-去乙酰啶南平0與乙?；D(zhuǎn)移酶-2(AT-2)反應(yīng)，由此產(chǎn)生啶南平O。
8.允許啶南平0與細(xì)胞色素P450單加氧酶(2)(P450-2)反應(yīng)，由此產(chǎn)生7-去乙酰啶南平A。
9.允許7-去乙酰啶南平A與乙?；D(zhuǎn)移酶-2(AT-2)反應(yīng)，由此產(chǎn)生啶南平A。例如，通過下文的參考實(shí)施例3中的方法能夠合成去乙酰啶南平E。例如，通過日本專利特開公報(bào)號(hào)239385/1996中描述的方法能夠合成啶南平E。例如，通過下文的參考實(shí)施例4中描述的方法能夠合成11-去乙酰啶南平O。例如，通過在J. Antibiot. 1996，49，292中描述的方法能夠得到啶南平O。例如，通過在日本專利特開公報(bào)號(hào)259569/1996中描述的方法能夠合成7_去乙酰啶南平A。例如，通過在J. Org. Chem. 1983. 48. 3945中描述的方法能夠合成4_氧_6-(3_吡啶基)-a-吡喃酮。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2,pPP3,pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并通過啶南平0分離啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中弓I入以下
(IV)和(V)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并通過啶南平0分離啶南平A:
(IV)分離的多核苷酸，其具有選自編碼選自SEQID NO: 269，270和275的至少一種氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；和
(V)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列
(I)以下(a)至(c)中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列，
(b)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列，和
(c)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列；(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)微生物，所述微生物包含選自質(zhì)粒pPP2，pPP3和pPP9的一種或多種載體，并通過啶南平0分離啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP2，pPP3和pPP9的微生物，并通過啶南平0分離啶南平A。 根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并通過啶南平E和啶南平0分離啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并通過啶南平E和啶南平0分離啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中弓IA以下(VI)和(VII)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并通過啶南平E和啶南平0分離啶南平A:
(VI)分離的多核苷酸，其具有選自編碼選自SEQID NO: 269，270，274和275的至少一種氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；和
(VII)分離的多核苷酸,其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列
(1)以下(a)至⑷中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列，
(b)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列，
(C)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列；和
(d)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)微生物，所述微生物包含選自質(zhì)粒PPP2，pPP3，pPP7和pPP9的一種或多種載體，并通過啶南平E和啶南平0分離啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP2，pPP3，pPP7和pPP9的微生物，并通過啶南平E和啶南平0分離啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用4-氧-6-(3-吡啶基)_a -吡喃酮培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a-吡喃酮培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核 苷酸或包含其的重組載體，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。在此情況下，優(yōu)選使用能夠在體細(xì)胞內(nèi)生物合成法尼焦磷酸(FPP)的微生物作為上述微生物。這樣的微生物的實(shí)例包括屬于曲霉屬(Aspergillus)的微牛.物。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳_2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用4-氧-6-(3-吡啶基)_a -吡喃酮培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a-吡喃酮培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入以下(VIII)和(IX)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮
(VIII)分離的多核苷酸，其具有選自編碼SEQID NO: 273的氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；
(IX)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列
和
(1)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培養(yǎng)包含質(zhì)粒PPP6的微生物，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳 _2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離啶南平E。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并分離啶南平E。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案， 提供了一種生產(chǎn)啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入以下(X)和(XI)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離啶南平E:
(X)分離的多核苷酸，其具有選自編碼SEQID N0:274的氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；和
(XI)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列
(1)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列，
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用去乙酰啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平E的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP7的微生物，并分離啶南平E。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中弓I入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離啶南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并分離啶南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中弓IA以下(XII)和(XIII)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離啶南平0:
(XII)分離的多核苷酸，其具有選自編碼選自SEQID NO: 269和275的至少一種氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；和
(XIII)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序
列(1)以下(a)至(b)中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列，和
(b)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提 供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)微生物，所述微生物包含選自質(zhì)粒pPP2和pPP9的一種或多種載體，并分離啶南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法其特征在于用啶南平E培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP2和pPP9的微生物，并分尚卩疋南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)11-去乙酰啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離11-去乙酰啶南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)11-去乙酰啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并分離11-去乙酰
啶南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)11-去乙酰啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離11-去乙酰啶南平0:
(XIV)分離的多核苷酸，其具有選自編碼SEQID NO:269的氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列
(1)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白.根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平E培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)11-去乙酰啶南平0的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP2的微生物，并分離11-去乙酰啶南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平0培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平0培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離啶
南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平0培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平0培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并分離啶南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平0培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平0培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離啶 南平0:
(XIV)分離的多核苷酸，其具有選自編碼SEQID NO:275的氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列
(1)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用11-去乙酰啶南平0培養(yǎng))的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平0的方法，其特征在于用11-去乙酰啶南平0培養(yǎng)包含質(zhì)粒PPP9的微生物，并分離啶南平O。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平0培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平0培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離7-去乙酰啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平0培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平0培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP 3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并分離7-去乙酰啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平0培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平0培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入以下(XIV)和(XV)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離7-去乙酰啶南平A:
(XIV)分離的多核苷酸，其具有選自編碼SEQID NO:270的氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；和
(XV)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列(1)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用啶南平0培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)7-去乙酰啶南平A的方法，其特征在于用啶南平0培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP3的微生物，并分離7-去乙酰啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入上述(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并分離啶南平A。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培養(yǎng)微生物，在所述微生物中引入以下(XVI)和(XVII)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體，并分離啶南平A:
(XVI)分離的多核苷酸，其具有選自編碼SEQID NO: 275的氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列；和
(XVII)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序
列
(1)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法(所述方法包括用7-去乙酰啶南平A培養(yǎng))的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用7-去乙酰啶南平A培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP9的微生物，并分離啶南平A?？墒褂孟旅婷枋龅闹亟M載體將多核苷酸引入用于本發(fā)明的微生物。然而，可通過例如電穿孔法、聚乙二醇法、農(nóng)桿菌法、鋰法、氯化鈣法等等將多核苷酸引入微生物。用于本發(fā)明的微生物沒有特別的限制，只要其可引入多核苷酸，或包含其的重組載體。優(yōu)詵屬于曲霉屬的微牛物,特別優(yōu)詵米曲霉。
在本發(fā)明中，可通過例如在需氧條件下的固體培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、在攪拌下起泡培養(yǎng)或深部需氧培養(yǎng)，特別地，優(yōu)選振蕩培養(yǎng)?？墒褂猛ǔＪ褂玫某煞肿鳛榕囵B(yǎng)微生物的培養(yǎng)基，例如，使用葡萄糖、蔗糖、淀粉糖漿、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、動(dòng)物和植物油等等作為碳源。另外，可使用大豆粉、小麥胚芽、玉米衆(zhòng)、棉籽柏(cotton seed meal)、肉膏、聚蛋白胨、麥芽提取物、酵母提取物、硫酸銨、硝酸鈉、尿素等作為氮源。此外，根據(jù)需要加入鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、氯、磷酸(磷酸氫二鉀等等)、硫酸(硫酸鎂等等)或可產(chǎn)生其他有效離子的無機(jī)鹽。另夕卜，根據(jù)需要可加入多種微生素如硫胺(鹽酸硫胺等等)，氨基酸如谷氨酸(谷氨酸鈉等等)或天冬酰胺(DL-天冬酰胺等等)，微量營養(yǎng)物如核苷酸，或選擇劑如抗生素。此外，可適當(dāng)?shù)丶尤霂椭婢L和促進(jìn)啶南平A生產(chǎn)的有機(jī)物或無機(jī)物。培養(yǎng)基的pH為，例如約pH 5. 5至pH 8。合適的培養(yǎng)溫度為15°C至40°C，在許多情況下，生長在約22。。至30°C下進(jìn)行。4-羥基-6-(吡啶-3-基)_3_ ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳_2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮、去乙酰啶南平E、啶南平E、啶南平0和啶南平A的生產(chǎn)根據(jù)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，或使用的宿主而變化。在任意培養(yǎng)方法中，積累通常在2天至10天中達(dá)到峰值。當(dāng)培養(yǎng)物中的啶南平A的量達(dá)到峰值時(shí)終止培養(yǎng)，并從培養(yǎng)物中 分離和純化期望的物質(zhì)。為了從培養(yǎng)物中分離5- (3-吡啶基)-3，5- 二氧戊酸、4_氧_6_ (3_吡啶基)_ a -吡喃酮、去乙酰啶南平E、啶南平E、啶南平O、7-去乙酰啶南平A、啶南平A等等，可根據(jù)其性能通過通常的分離手段提取和純化上述產(chǎn)物，如溶劑提取法、離子交換樹脂法、吸附或分配柱層析法、凝膠過濾法、透析、沉淀法，所述方法可單獨(dú)使用或適當(dāng)?shù)亟M合使用。特別優(yōu)選溶劑提取法。在本發(fā)明中，術(shù)語"基本等同的氨基酸序列"指不影響多肽活性的氨基酸序列，盡管一個(gè)或多個(gè)氨基酸已通過取代、缺失、添加或插入而改變。優(yōu)選地，通過氨基酸取代、缺失、添加或插入改變的氨基酸序列與改變前的氨基酸序列等具有70%或更高，優(yōu)選80%或更高，更優(yōu)選90%或更高，更優(yōu)選95%或更高，和更優(yōu)選98%或更高的序列同一性。此外，改變的氨基酸殘基數(shù)為，優(yōu)選I至40，更優(yōu)選I至20，更優(yōu)選I至10，更優(yōu)選I至8，和最優(yōu)選I至4。此外，不影響活性的改變的一個(gè)實(shí)例包括保守取代。術(shù)語〃保守取代〃指用其他化學(xué)性質(zhì)類似的氨基酸殘基取代優(yōu)選I至40，更優(yōu)選I至20，更優(yōu)選I至10，更優(yōu)選I至8，和最優(yōu)選I至4個(gè)氨基酸殘基，使得基本不改變多肽的活性。其實(shí)例包括用另一種疏水氣基酸殘基取代特定的疏水氣基酸殘基的情況，和用另一種具有相同電荷的極性氣基酸殘基取代特定的極性氨基酸殘基的情況。能夠取代每種氨基酸的功能類似的氨基酸是本領(lǐng)域已知的。具體地，非極性(疏水)氨基酸的實(shí)例包括丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等等。極性(中性)氨基酸的實(shí)例包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等等。正電荷(堿性)氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、組氨酸、賴氨酸等等。負(fù)電荷(酸性)氨基酸的實(shí)例包括天冬氨酸、谷氨酸等等。術(shù)語〃嚴(yán)格條件〃在本發(fā)明中指下述條件，其中在高溫下和具有低鹽濃度的溶液中進(jìn)行雜交后的膜洗滌操作，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠適當(dāng)?shù)卮_定所述條件，例如所述條件包括在具有2 X SSC (I X SSC: 15mM檸檬酸三鈉，150mM氯化鈉)和0. 5%SDS的溶液中在60° C下洗滌20分鐘的條件，和在具有0. 2\330(1\33(:151111檸檬酸三鈉，1501111氯化鈉)和0.1%SDS的溶液中在60° C下洗滌15分鐘的條件。可依照已知方法進(jìn)行雜交。另外，當(dāng)使用市售的文庫時(shí)，可依照其附帶的說明中描述的方法進(jìn)行雜交。在本說明書中，術(shù)語核苷酸序列的〃同一性〃(又稱同源性)指在待比較的序列之間，組成各個(gè)序列的堿基的匹配程度。在比較時(shí)考慮缺口的存在和氨基酸特征。在本說明書中顯示的任意“同一性”值可為使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同源性檢索程序計(jì)算的值。例如，通過使用FASTA，BLAST等等中的默認(rèn)(初始設(shè)置)參數(shù)，可容易地計(jì)算所述值。在本說明書中，核苷酸序列的〃同一性〃為90%或更高，優(yōu)選95%或更高，更優(yōu)選98%或更高，更優(yōu)選99%或更高。在本說明書中，術(shù)語〃在多核苷酸中缺失、取代、插入或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸〃指通過已知方法如位點(diǎn)特異性誘變法，或多個(gè)核苷酸的取代等進(jìn)行的改變，改變的程度是 其可天然發(fā)生的。改變的核苷酸數(shù)為一個(gè)或多個(gè)核苷酸(例如，I至幾個(gè)核苷酸，或1，2，3或4個(gè)核苷酸)。術(shù)語"編碼與所述(各個(gè))核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白的核苷酸序列"指核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)與“所述(各個(gè))核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)”具有等同的活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從3342至5158的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有輔酶A連接酶活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從5382至12777的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有LovB樣聚酮合酶(PKS)活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有細(xì)胞色素P450單加氧酶(I) (P450-1)活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有細(xì)胞色素P450單加氧酶(2) (P450-2)活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從18506至19296的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有環(huán)化酶aMP:整合膜蛋白)活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從19779至21389的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有FAD依賴性單加氧酶(FMO)活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有UbiA樣異戊烯轉(zhuǎn)移酶(UbiAPT)活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有乙?；D(zhuǎn)移酶(AT)活性。優(yōu)選地，與SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白具有乙?；D(zhuǎn)移酶-2 (AT-2)活性。
獲得分離的多核苷酸
不特別限制獲得本發(fā)明的分離的多核苷酸的方法?？赏ㄟ^以下方法從龔生直藍(lán)PF1169菌株或絲狀真菌中分離多核苷酸。具體地，基于以下實(shí)施例9等方法得到的同源序列，合成了能夠特異性擴(kuò)增任意參與啶南平A合成的一種或多種以下基因的引物聚酮合酶基因，異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因，羥化酶基因，乙?；D(zhuǎn)移酶基因或腺苷酸合成酶基因。對(duì)糞生青霉PFl 169菌株的福斯質(zhì)粒(fosmid)基因組文庫進(jìn)行PCR，單獨(dú)制備了文庫并進(jìn)一步進(jìn)行了菌落雜交，由此獲得用于本發(fā)明的分離的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，提供了上述(I)至(III)的至少一種分離的多核苷酸。特別地，提供了以下⑴至(III)的至少一種多核苷酸
(I)分離的多核苷酸，其具有選自以下(a)至(d)的核苷酸序列的至少一種核苷酸序
列(a)SEQ ID NO :266的核苷酸序列，
(b)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與SEQID NO:266的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與SEQ ID NO:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白，
(C)SEQ ID N0:266的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與SEQ ID N0:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白，和
(d)核苷酸序列，其與SEQ ID N0:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一性，且其編碼與SEQ ID N0:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(II)分離的多核苷酸，其具有編碼選自SEQID NO:267至275的至少一個(gè)氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(III)分離的多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)的核苷酸序列的至少一種核苷酸序
列
(I)在以下(a)至⑴中的核苷酸序列
(a)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從3342至5158的核苷酸序列，
(b)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從5382至12777的核苷酸序列，
(c)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列，
(d)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列，
(e)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從18506至19296的核苷酸序列，
(f)SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從19779至21389的核苷酸序列，
(g)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列，
(h)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列，和
(i)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與和(I)的核苷酸序列互補(bǔ)的序列雜交，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；
(3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和
(4)核苷酸序列，其與(I)的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了選自以下(a)，(b)，(c)，(d)，(e), (f),
(g)和(h)的分離的多核苷酸
(a)多核苷酸，其具有SEQID NO:266的核苷酸序列，
(b)多核苷酸，其編碼由選自SEQID NO: 269，270，273，274和275的氨基酸序列組成的多肽，
(c)多核苷酸，其具有與SEQID N0:269顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有羥化酶活性的多肽，
(d)多核苷酸，其具有與SEQID NO: 270顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有羥化酶活性的多肽，
(e)多核苷酸，其具有與SEQID NO: 273顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有異戊烯轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，
(f)多核苷酸，其具有與SEQID NO: 274顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，
(g)多核苷酸，其具有與SEQID NO: 275顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，和(h)分離的多核苷酸，其具有選自以下(i)，(ii)，(iii)，(iv)和(V)的核苷酸序列
(i)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列，
(ii)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列，
(iii)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列，
(iv)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列，和
(v)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了選自以下(A)，⑶和(C)的分離的多核苷酸
(A)多核苷酸，其編碼由選自SEQID NO:275的氨基酸序列組成的多肽，
(B)多核苷酸，其具有與SEQID NO:顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列275，且其編碼具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，和
(C)分離的多核苷酸，其具有在SEQID N0:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了所述(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的多核苷酸，其中所述(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列分別與SEQ IDNO: 269，270，273，274和275中顯示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了所述(B)的多核苷酸，其中所述(B)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO: 275中顯示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性。重組載體
可依照常規(guī)方法，例如，在[Sambrook, J.等人，"Molecular cloning:a laboratorymanual", (USA),第 2 版,Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]中描述的基因重組技術(shù)，通過將上述(I)至(III)中的任一種或多種多核苷酸根據(jù)目的修飾為適當(dāng)?shù)男问?，并將其連接至載體制備根據(jù)本發(fā)明的重組載體。用于本發(fā)明的重組載體可適當(dāng)?shù)剡x自病毒、質(zhì)粒、福斯質(zhì)粒、粘粒載體等等。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是大腸桿菌時(shí)，其實(shí)例包括基于\噬菌體的噬菌體和基于pBR和pUC的質(zhì)粒。在枯草芽孢桿菌的情況下，實(shí)例包括基于pUB的質(zhì)粒。在酵母的情況下，實(shí)例包括基于YEp，YRp，YCp和Hp的質(zhì)粒。優(yōu)選地，在使用的質(zhì)粒中的至少一種質(zhì)粒包含用于選擇轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記?？墒褂镁幋a藥物抗性和基因互補(bǔ)營養(yǎng)缺陷體的基因作為選擇標(biāo)記。其具體的優(yōu)選實(shí)例包括，當(dāng)使用的宿主是細(xì)菌時(shí)為氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等等；在酵母的情況下為色氨酸生物合成基因(TRPl)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮氨酸生物合成基因(LEU2)等等；在真菌的情況下為潮霉素抗性基因、雙丙氣勝(bialaphos)抗性基因、博來霉素抗性基因、短梗霉素(aureobasidin)抗性基因等等；和在植物的情況下為卡那霉素抗性基因、雙丙氨膦抗性基因等等。另外，用于本發(fā)明的作為表達(dá)載體的DNA分子優(yōu)選具有表達(dá)各個(gè)基因所必需的DNA序列，例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)和翻譯調(diào)控信號(hào)，如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯終止信號(hào)、終止子。優(yōu)選的啟動(dòng)子的實(shí)例包括大腸桿菌中的乳糖操縱子、色氨酸操縱子等的啟動(dòng)子；在酵母中的醇脫氫酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖代謝基因、甘油醛3-磷酸脫氫酶基因等的啟動(dòng)子；在真菌中的a-淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、纖維二糖水解酶基因、甘油醛3-磷酸脫氫酶基因、abpl基因等的啟動(dòng)子；在植物中的CaMV 35S RNA啟動(dòng)子、CaMV 19S RNA啟動(dòng)子或胭脂氨酸合成酶基因啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的重組載體優(yōu)選地是選自質(zhì)粒pPP6，pPP7和pPP9的重組載體。 另外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，舉例說明了選自質(zhì)粒pPP6，pPP7和pPP9的重組載體用于生產(chǎn)啶南平A的用途。轉(zhuǎn)化體
根據(jù)使用的載體的類型，其中引入根據(jù)本發(fā)明的分離的多核苷酸的宿主可適當(dāng)?shù)剡x自放線菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母、絲狀真菌、植物細(xì)胞等等。根據(jù)檢測(cè)的宿主細(xì)胞，將重組載體引入宿主的方法可選自接合轉(zhuǎn)移、通過噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及例如鈣離子法、鋰離子法、電穿孔法、PEG法、農(nóng)桿菌法或基因槍法的轉(zhuǎn)化方法。在引入多個(gè)基因至本發(fā)明的宿主細(xì)胞中的情況下，基因可包含在單個(gè)DNA分子中或分別包含在不同的DNA分子中。此外，當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌時(shí)，可將各個(gè)基因設(shè)計(jì)為以多順反子mRNA的形式表達(dá)并成為I個(gè)DNA分子。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選地是包含選自質(zhì)粒pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的轉(zhuǎn)化體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，舉例說明了包含選自質(zhì)粒pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的轉(zhuǎn)化體用于生產(chǎn)啶南平A的用途。通過以下實(shí)施例將進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，所述實(shí)施例無意限制本發(fā)明。實(shí)施例I :制備糞牛青霉PFl 169株的基因組DNA
將無菌NB培養(yǎng)基(500ml)置于三角瓶(IL)。將在1/2CMMY瓊脂培養(yǎng)基中28°C預(yù)培養(yǎng)4 天的幾生青霉 PFl 169 株(Journal of Technical Disclosure No. 500997/2008 (專利文獻(xiàn)3))加入上述培養(yǎng)基，并在28°C液體培養(yǎng)4天。用Miracloth過濾，獲得5g真菌細(xì)胞。從這些真菌細(xì)胞根據(jù)基因組DNA純化試劑盒Genomic-tip 100/G (Qiagen K. K.制)所附的手冊(cè)獲得30 ii g基因組DNA。
實(shí)施例2 :用于擴(kuò)增聚酮化合物合酶(PKS)的簡并引物和其擴(kuò)增片段基于多種絲狀真菌聚酮化合物合酶中保守的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并合成下列引物作為簡并引物用于擴(kuò)增LCl GAYCCIMGITTYTTYAAYATG(SEQ ID NO :1)
LC2c GTICCIGTICCRTGCATYTC(SEQ ID NO :2)
(其中 R=A/G，X=CfT, M=A/C，I=肌苷)。
使用這些簡并引物，將實(shí)施例I中制備的基因組DNA和ExTaq聚合酶(Takara Bio Inc.制)按照所附的手冊(cè)進(jìn)行反應(yīng)。檢測(cè)到約700bp的擴(kuò)增片段(圖I)。進(jìn)一步地，分析上述擴(kuò)增片段來特定其內(nèi)部的500bp序列(SEQID NO :3)。
實(shí)施例3 :基因組DNA的大暈測(cè)序和氨基酸序列同源性檢索
將實(shí)施例I中獲得的糞生青霉PF1169株的基因組DNA進(jìn)行大量測(cè)序和氨基酸序列的同源性檢索。具體地，將基因組DNA的50 ii g份進(jìn)行預(yù)處理并隨后供Roche 454FLX DNA測(cè)序儀測(cè)序，獲得了 103000個(gè)約250bp片段序列(總計(jì)49Mb的序列)。
對(duì)于這些序列，作為聚酮化合物合酶和異戊烯轉(zhuǎn)移酶中已知的序列，選擇下列5種序列(衍生自聚酮化合物合酶煙曲霉PKS 2146a. a.和灰黃青霉(Penicillium(P.)griseofIuvum)6-甲基水楊酸(methylsalycilic acid)合酶 1744a. a.;異戍烯轉(zhuǎn)移酶煙曲霉異戊烯轉(zhuǎn)移酶，煙曲霉異戊烯轉(zhuǎn)移酶(4-羥基苯甲酸八異戊烯轉(zhuǎn)移酶)和馬尼菲青霉(Penicillium(P. )marneffei)異戍烯轉(zhuǎn)移酶)，并用同源序列檢索軟件blastx進(jìn)行檢索，由此分別獲得89個(gè)、86個(gè)、2個(gè)、I個(gè)和3個(gè)同源序列(見表2)。進(jìn)一步地，從煙曲霉PKS2146a. a.和灰黃青霉6_甲基水楊酸合酶1744a. a.的同源序列，分別獲得19個(gè)和23個(gè)疊連序列(煙曲霉PKS 2146a. a.的疊連序列SEQ ID NO :179至197 ;灰黃青霉6-甲基水楊酸合酶1744a. a.的疊連序列SEQ ID NO :198至220)(見表2)。
表2
酶名稱____同源性序列數(shù)目 SEQ ID NO. 聚酮化合物煙曲霉 89 4到92 合酶PKS 2146 a.a.___
灰黃青霉6 -8693到178
曱基水楊酸合酶
__1744 a.a.___
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)導(dǎo)入有以下(I)至(III)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體的微生物，并通過啶南平O分離啶南平A: (I)分離的多核苷酸，其具有選自以下(a)至(d)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列 (a)SEQ ID NO :266的核苷酸序列， (b)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與SEQID NO:266的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與SEQ ID NO:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白， (C)SEQ ID N0:266的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與SEQ ID N0:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白，和 (d)核苷酸序列，其與SEQ ID N0:266的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一性，且其編碼與SEQ ID NO:266的核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白； (II)分離的多核苷酸，其具有編碼選自SEQID NO:267至275的至少一個(gè)氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列； (III)分離的多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列 (I)在以下(a)至⑴中的核苷酸序列 (a)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從3342至5158的核苷酸序列， (b)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從5382至12777的核苷酸序列， (c)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列， (d)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列， (e)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從18506至19296的核苷酸序列， (f)SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從19779至21389的核苷酸序列， (g)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列， (h)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列，和 (i)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列； (2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白；和 (4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并通過啶南平O分離啶南平A。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)導(dǎo)入有以下(IV)至(V)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體的微生物，并通過啶南平O分離啶南平A: (IV)分離的多核苷酸，其具有選自對(duì)選自SEQID NO: 269，270和275的至少一種氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核苷酸序列中的至少一種核苷酸序列；(V)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列 (1)以下(a)至(C)中的核苷酸序列 (a)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列， (b)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列，和 (c)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列； (2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白； (4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用啶南平E培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP2，PPP3和pPP9的微生物，并通過啶南平O分離啶南平A。
5.生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)導(dǎo)入有根據(jù)權(quán)利要求I的(I)至(III)中的至少一種所述多核苷酸或包含其的重組載體的微生物，并通過啶南平E和啶南平O分離啶南平A。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并通過啶南平E和啶南平O分離啶南平A。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)導(dǎo)入有以下(VI)和(VII)中的至少一種所述多核苷酸或包含其的重組載體的微生物，并通過啶南平E和啶南平O分離啶南平A: (VI)分離的多核苷酸，其具有選自編碼選自SEQID NO: 269，270，274和275的至少一種氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的至少一種核苷酸序列； (VII)分離的多核苷酸,其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列 (1)以下(a)至⑷中的核苷酸序列 (a)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列， (b)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列， (C)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列；和 (d)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列； (2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白； (4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其編碼與每個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的生產(chǎn)啶南平A的方法，其特征在于用去乙酰啶南平E培養(yǎng)包含質(zhì)粒pPP2，pPP3，pPP7和pPP9的微生物，并通過啶南平E和啶南平O分離啶南平A。
9.一種生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培養(yǎng)導(dǎo)入有權(quán)利要求I的(I)至(III)中的至少一種所述多核苷酸或包含其的重組載體的微生物，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳_2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培養(yǎng)包含選自質(zhì)粒pCCl-PPl，pPP2，pPP3，pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的微生物，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-( (2E，6E) -3, 7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培養(yǎng)導(dǎo)入有以下(VIII)和(IX)中的至少一種多核苷酸或包含其的重組載體的微生物，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2E，6E)-3，7，11-三甲基十二碳-2,6, 10-三烯)-2H-吡喃-2-酮 (VIII)分離的多核苷酸，其具有選自編碼SEQID NO: 273的氨基酸序列或與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列； (IX)多核苷酸，其具有選自以下(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列 (1)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列； (2)核苷酸序列，其能夠在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白； (4)核苷酸序列，其與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸具有至少90%的同一丨丨生,且其編碼與所述核苷酸序列編碼的蛋白基本等同的蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的生產(chǎn)4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3-((2￡，6￡)-3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮的方法，其特征在于用4-氧-6- (3-吡啶基)-a -吡喃酮培養(yǎng)包含質(zhì)粒PPP6的微生物，并分離4-羥基-6-(吡啶-3-基)-3- ((2E, 6E) -3，7，11-三甲基十二碳 _2，6，10-三烯)-2H-吡喃-2-酮。
13.根據(jù)權(quán)利要求I的(I)至(III)的至少一種分離的多核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的分離的多核苷酸，其選自以下(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)和(h): (a)多核苷酸，其具有SEQID NO:266的核苷酸序列， (b)多核苷酸，其編碼由選自SEQID NO: 269，270，273，274和275的氨基酸序列組成的多肽， (c)多核苷酸，其具有與SEQID NO:269中顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有羥化酶活性的多肽， (d)多核苷酸，其具有與SEQID N0:270中顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有羥化酶活性的多肽，(e)多核苷酸，其具有與SEQID N0:273中顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有異戊烯轉(zhuǎn)移酶活性的多肽， (f)多核苷酸，其具有與SEQID N0:274中顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽， (g)多核苷酸，其具有與SEQID N0:275中顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，和 (h)分離的多核苷酸，其具有選自以下(i)，(ii)，(iii)，(iv)和(V)的核苷酸序列 (i)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列， (ii)SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列， (iii)SEQ ID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列， (iv)SEQ ID NO :266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列，和 (V)SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的分離的多核苷酸，其選自以下(A)，⑶和(C): (A)多核苷酸，其編碼由選自SEQID NO:275的氨基酸序列組成的多肽， (B)多核苷酸，其具有與SEQID NO:275中顯示的氨基酸序列基本等同的氨基酸序列，且其編碼具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，和 (C)分離的多核苷酸，其具有SEQID NO: 266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的多核苷酸，其中由權(quán)利要求14的所述(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列分別與SEQ ID NO: 269，270，273，274和275中顯示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的多核苷酸,其中由權(quán)利要求15的⑶的多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:275中顯示的氨基酸序列具有90%或更高的序列同一性。
18.選自質(zhì)粒pPP6，pPP7和pPP9的重組載體。
19.包含選自質(zhì)粒pPP6，pPP7和pPP9的一種或多種載體的轉(zhuǎn)化體。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的所述重組載體用于生產(chǎn)啶南平A和/或生產(chǎn)其中間體的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的所述轉(zhuǎn)化體用于生產(chǎn)啶南平A和/或生產(chǎn)其中間體的用途。
全文摘要
提供了用啶南平A生物合成所必需的中間體化合物培養(yǎng)微生物制備啶南平的方法，在所述微生物中引入特定多核苷酸或包含其的重組載體。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102762737SQ20118000726
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者三富正明, 后藤公彥, 土田麻里子, 安西弘行, 尾山和彥, 山本憲太朗 申請(qǐng)人:明治制果藥業(yè)株式會(huì)社