專利名稱：包含啶南平生物合成基因簇和標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含唳南平(pyripyropene)生物合成基因簇和標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
目前已經(jīng)證明在啶南平中有從啶南平A至啶南平R的18種類型的天然存在的類似物，所述類似物在它們側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)中不同(非專利文獻(xiàn)I)。已經(jīng)公開啶南平具有ACAT抑制活性(專利文獻(xiàn)I)。由此期望其用于治療膽固醇積累等引起的疾病。并且，已經(jīng)公開卩定南平具有針對(duì)棉鈴蟲(Helicoverlpa armlRera)幼K非專利文獻(xiàn)2),小菜蛾(Dlamondback moth)幼蟲(專利文獻(xiàn)2),黃粉蟲(專利文獻(xiàn)2)或者蚜蟲(aphids)(專利文獻(xiàn)3)的殺蟲活性，并且由此期望其用作殺蟲劑。已知啶南平是絲狀真菌作為次級(jí)代謝物產(chǎn)生的。例如，已經(jīng)公開了糞生青霉(Penicillium coprobium)PF1169 菌株(專利文獻(xiàn) 4),煙曲霉(Aspergillus fumigatus)IF0-1289 菌株(專利文獻(xiàn) 5),網(wǎng)狀抱正青霉(Eupenicillium reticulosporum)NRRL-3446菌株(非專利文獻(xiàn)2)或者灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)F1959菌株(專利文獻(xiàn)2)每種產(chǎn)生啶南平。通過培養(yǎng)上文提到的生產(chǎn)細(xì)菌并且收集啶南平進(jìn)行啶南平的工業(yè)生產(chǎn)。通常，分離的天然存在的微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的量是很少的。為了在工業(yè)上使用該產(chǎn)物，需要提高這些期望產(chǎn)物的生產(chǎn)力。為了提高這些期望產(chǎn)物的生產(chǎn)力，已經(jīng)進(jìn)行了用于培養(yǎng)生產(chǎn)期望產(chǎn)物的微生物的方法的研究，培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的改變?nèi)缂尤肭绑w的研究，以及通過用紫外線放射或者誘變劑突變對(duì)細(xì)菌菌株的修飾。此外，除了這些方法，最近已經(jīng)進(jìn)行了使用基因重組提高生產(chǎn)力的方法。通過基因重組提高生產(chǎn)力的一般方法是提高生物合成基因的表達(dá)。例如，通過這種方法，公開了提高無孢目(aRonomycetales)產(chǎn)生的PF1022物質(zhì)的生產(chǎn)力的方法(專利文獻(xiàn)6)。為了應(yīng)用這種方法，需要分離期望產(chǎn)物的生物合成基因并且需要建立在期望的產(chǎn)物產(chǎn)生微生物中用于轉(zhuǎn)化的方法。對(duì)于啶南平，目前沒有關(guān)于分離它們的生物合成基因簇的報(bào)告。另外，還未建立將產(chǎn)生啶南平的真菌作為宿主的轉(zhuǎn)化方法。因此，目前很難將啶南平的生物合成基因簇引入到產(chǎn)生啶南平的微生物中，并且通過基因重組提高生產(chǎn)力是不能實(shí)現(xiàn)的。
現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I日本特開公報(bào)號(hào)184158/1994專利文獻(xiàn)2W02004/060065專利文獻(xiàn)3W02006/129714專利文獻(xiàn)4技術(shù)公開雜志號(hào)500997/2008專利文獻(xiàn)5日本特開公報(bào)號(hào)360895/1992專利文獻(xiàn)6日本專利號(hào)3961289 非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)IJournal of Antibiotics (1996)，49 (3)，292-298非專利文獻(xiàn)2Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-4435發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在宿主中表達(dá)包含啶南平生物合成基因簇和標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體，顯著地提高了啶南平的生產(chǎn)力。基于這種發(fā)現(xiàn)已經(jīng)做出了本發(fā)明。相應(yīng)地，本發(fā)明的目的是提供包含啶南平生物合成基因簇和標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了包含啶南平生物合成基因簇和標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，也提供了轉(zhuǎn)化體，其通過將上文提到的核酸構(gòu)建體引入到宿主中獲得。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了轉(zhuǎn)化體，其通過將包含上文提到的啶南平生物合成基因簇的核酸構(gòu)建體和包含上文提到的標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體同時(shí)或者單獨(dú)引入到宿主中獲得。此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供生產(chǎn)啶南平的方法，所述方法包括培養(yǎng)上文提到的轉(zhuǎn)化體并且從培養(yǎng)物中收集啶南平。附圖簡述[圖I]圖I顯示了PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠的電泳模式。對(duì)于電泳，使用了以下引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物M :分子量標(biāo)記物(IOObp梯)，泳道I SEQ ID NO :1和2的引物，泳道 2:SEQ ID NO :239 和 240 的引物，泳道 3 :SEQ ID NO :237 和 238 的引物，泳道 4 :SEQ IDNO :241 和 242 的引物，泳道 5 :SEQ ID NO :247 和 248 的引物，泳道 6 :SEQ ID NO :251 和 252的引物，泳道7:SEQ ID N0:245 和 246 的引物，泳道8:SEQID NO :243和244的引物，泳道
9SEQ ID NO :249 和 250 的引物，泳道 10 SEQ ID NO :235 和 236 的引物，泳道 11 SEQ IDNO :233 和 234 的引物，泳道 12 SEQ ID NO :227 和 228 的引物，泳道 13 SEQ ID NO :229 和230的引物，泳道14 SEQ ID NO :231和232的引物。[圖2]類似于

圖1，圖2顯示了PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠的電泳模式。對(duì)于電泳，使用了以下引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物M :分子量標(biāo)記物(IOObp梯)，泳道I SEQ ID NO :253和254的引物，泳道2 SEQ ID NO :257和258的引物，泳道3 SEQ ID NO :259和260的引物，泳道4:SEQ ID NO :255和256的引物，泳道5 :SEQ ID NO :261和262的引物。
[圖3]類似于圖1，圖3顯示了PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠的電泳模式。對(duì)于電泳，使用了以下引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物泳道I :分子量標(biāo)記物(IOObp梯)，泳道2 SEQ ID NO 264和265的引物(400bp擴(kuò)增片段)。[圖4]圖4顯示用于使用的絲狀真菌的質(zhì)粒載體pBI-AnGpD-EGFP的圖譜。在該圖中，RB指右邊界,HYGr指的是潮霉素抗性編碼區(qū),PAngpdA指的是抱量血霆_ (Aspergi I Iusnidulans)甘油醛_3_磷酸脫氫酶啟動(dòng)子，EGFP指的是增強(qiáng)的綠色熒光蛋白編碼區(qū)，TAngpdA指的是構(gòu)巢曲霉甘油醒-3-磷酸脫氫酶終止子，并且LB指的是左邊界。[圖5A]在圖5A中，左圖顯示用土壤桿菌(ARrobacterium)感染形成的潮霉素抗性菌落，并且右圖顯示GFP熒光觀察的結(jié)果。[圖5B]在圖5B中，左圖顯示不用十壤桿菌感染的Il牛青霍菌株P(guān)F1169的菌落，在不含潮霉素的培養(yǎng)基中形成菌落，并且右圖顯示GFP熒光觀察的結(jié)果。 發(fā)明詳述微牛物的保藏用質(zhì)粒pCCl-PPl 轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(Escherichia coll)(大腸桿菌 EPI300 -T1K)于2008年10月9日(原始保藏日)保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(地址日本茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6，AIST，305-8566)，保藏號(hào)是FERM BP-11133(從國內(nèi)保藏FERM P-21704移管)(保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)大腸桿菌EPI300 -T1e/pCC1-PP1)。在2009年12月14日將用質(zhì)粒pPYRI02轉(zhuǎn)化的大腸桿菌,以保藏號(hào)FERMBP-11203(保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)XL1-Blue MRA/pPYRI02)保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(地址日本茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6，AIST,305-8566)。在2010年12月I日將用黏粒pPYRI07轉(zhuǎn)化的大腸桿菌,以保藏號(hào)FERMBP-11316(保藏者所用的識(shí)別標(biāo)識(shí)XL1-Blue MRA/pPYRI07)保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(地址日本茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6，AIST,305-8566)。啶南平生物合成基因簇將本發(fā)明中的啶南平生物合成基因簇排列在核酸構(gòu)建體中以便能與后文描述的標(biāo)記基因一起在宿主中表達(dá)。只要它是啶南平生物合成中涉及的基因簇，對(duì)其沒有特別限制。優(yōu)選地，提供構(gòu)建體，其含有選自以下的(I)至(IV)的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列的全部或者一部分(I)SEQ ID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列；(II)核苷酸序列，其能在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 266中的從2911至27797的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，并且編碼與SEQ ID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)；(III)SEQ ID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或者添加了一個(gè)或者多個(gè)核苷酸，并且所述核苷酸序列編碼與SEQID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)；和(IV)核苷酸序列，其具有與SEQ ID N0:266中的從2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一性，并且編碼與SEQ ID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的啶南平生物合成基因簇的實(shí)施方案，所述基因簇是含有目的基因和表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)的基因簇。這里，目的基因是具有一個(gè)或者多個(gè)編碼涉及啶南平的生物合成的蛋白質(zhì)的基因的基因。也不限制表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)，只要它具有調(diào)節(jié)上文提到的宿主中的目的基因必須的核苷酸序列。例如，包括了啟動(dòng)子和終止子，其是調(diào)節(jié)目的基因在宿主中轉(zhuǎn)錄的量的核苷酸序列。此外，在下面的路線I中顯示了在啶南平的生物合成中涉及的蛋白質(zhì)，例如在任一生物合 成途徑中涉及的蛋白質(zhì)。表I
權(quán)利要求
1.核酸構(gòu)建體，其包含啶南平生物合成基因簇和標(biāo)記基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的核酸構(gòu)建體，其中所述啶南平生物合成基因簇包含選自下面的(I)至(IV)的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列的全部或者一部分 (I)SEQID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列； (II)核苷酸序列，其能在嚴(yán)格條件下與SEQID N0:266中的從2911至27797的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交，并且編碼與SEQ ID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)； (III)SEQID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或者添加了一個(gè)或者多個(gè)核苷酸，并且所述核苷酸序列編碼與SEQ IDNO:266中的從2911至27797的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)；和 (IV)核苷酸序列，其具有與SEQID N0:266中的從2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一性，并且編碼與SEQ ID NO:266中的從2911至27797的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或者2的核酸構(gòu)建體，其中所述啶南平生物合成基因簇包含目的基因和表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所述基因包含編碼選自SEQID NOs:267至275的至少一種氨基酸序列或者與其基本等同的氨基酸序列的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所述基因包含選自下面(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列 (I)在下面(a)至⑴的核苷酸序列 (a)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從3342至5158的核苷酸序列， (b)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從5382至12777的核苷酸序列， (c)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從13266至15144的核苷酸序列， (d)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從16220至18018的核苷酸序列， (e)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從18506至19296的核苷酸序列， (f)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從19779至21389的核苷酸序列， (g)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從21793至22877的核苷酸序列， (h)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從23205至24773的核苷酸序列，以及 (i)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從25824至27178的核苷酸序列； (2)能在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，并且其編碼與每種核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或者添加了一個(gè)或者多個(gè)核苷酸，并且所述核苷酸序列編碼與每種核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)；和 (4)核苷酸序列，其具有與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一'丨生,并且編碼與每種核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)基本等同的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)包含選自下面(I)至(4)中的核苷酸序列的至少一種核苷酸序列 (I)在下面(j)至(s)中的核苷酸序列的全部或者一部分(j)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從2911至3341的核苷酸序列， (k)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從5159至5381的核苷酸序列， (1)在SEQID NO:266中顯示的核苷酸序列的從12778至13265的核苷酸序列， (m)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從15145至16219的核苷酸序列， (η)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從18019至18505的核苷酸序列， (ο)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從19297至19778的核苷酸序列， (P)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從21390至21792的核苷酸序列， (q)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從22878至23204的核苷酸序列， (r)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從24774至25823的核苷酸序列，和 (s)在SEQ ID NO:266中顯示的核苷酸序列的從27179至27797的核苷酸序列； (2)能在嚴(yán)格條件下與(I)中的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列具有與每種核苷酸序列基本等同的功能； (3)(I)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列,其中缺失、取代、插入或者添加了一個(gè)或者多個(gè)核苷酸，并且所述核苷酸序列具有與每種核苷酸序列基本等同的功能；和 (4)核苷酸序列，其具有與(I)中的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一'丨生,并且具有與每種核苷酸序列基本等同的功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6的核酸構(gòu)建體，其中所述標(biāo)記基因是藥物抗性基因或者營養(yǎng)缺陷基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至6的核酸構(gòu)建體，其中所述標(biāo)記基因是越霉素抗性基因或者潮霉素抗性基因。
9.轉(zhuǎn)化體,其能通過將根據(jù)權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)的所述核酸構(gòu)建體引入到宿主中而得到。
10.轉(zhuǎn)化體，其能通過同時(shí)地或者單獨(dú)地將包含啶南平生物合成基因簇的核酸構(gòu)建體和包含標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體引入到宿主中而得到。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化體，其能通過將質(zhì)粒PPYRI02或者粘粒PPYRI07引入到所述宿主中而得到。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主是產(chǎn)生啶南平的絲狀真菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化體，其中所述產(chǎn)生啶南平的絲狀真菌是直霉墾、正直霉麗或者曲霉屬。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化體，其中所述產(chǎn)生啶南平的絲狀真菌是糞生青霉(Penicillium coprobium)、灰黃青霉(Penicillium Rriseofulvum)、網(wǎng)狀抱正青霉(Eupenicillium reticulosporum)或者煙曲霉(AsperRillusfumiRatus)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化體，其中所述產(chǎn)生啶南平的絲狀真菌是糞生青霉。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化體，其中所述產(chǎn)生啶南平的絲狀真菌是糞生青霉PFl169菌株或者糞生青霉菌株ATCC58615。
17.生產(chǎn)啶南平的方法，其包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求9至16任一項(xiàng)的所述轉(zhuǎn)化體，并且從培養(yǎng)基中收集所述啶南平。
全文摘要
提供了包含啶南平生物合成基因簇和標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體。所述核酸構(gòu)建體允許以高生產(chǎn)力廉價(jià)地制備啶南平。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102884187SQ20118000718
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2011年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者相原智, 隅田奈緒美, 村島弘一郎, 矢內(nèi)耕二, 安西弘行, 山本憲太朗 申請(qǐng)人:明治制果藥業(yè)株式會(huì)社