專(zhuān)利名稱(chēng)：一種與耐氯嘧磺隆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與耐氯嘧磺隆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代生物技術(shù)已引起農(nóng)業(yè)中若干領(lǐng)域的重大變革，其中最突出的是將外源基因?qū)胫参矬w中的表達(dá)，給作物育種帶來(lái)革命性的變化，使人們擺脫了利用傳統(tǒng)雜交技術(shù)培育新品種的局面，進(jìn)入自由構(gòu)建遺傳性狀的新時(shí)代。通過(guò)遺傳工程培育轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物品種是發(fā)展最快、研究最深、農(nóng)民接受程度最高的案例，其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是抗除草劑基因的獲得，從突變的抗除草劑植物和微生物體中分離抗性基因是最主要途徑。乙酰乳酸合成酶抑制劑類(lèi)除草劑通過(guò)抑制植物體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶活性，從而阻止支鏈氨基酸的合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到破壞，阻礙細(xì)胞分裂期的DNA合成，從而使植物細(xì)胞的有絲分裂停止在Gl階段的S期(DNA合成期)和G2階段的M期，干擾了 DNA的合成，細(xì)胞因此不能完成有絲分裂，進(jìn)而使植物停止生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致植物個(gè)體死亡。Lawther等(1978)首先在大腸桿菌(Escherichia coli)中發(fā)現(xiàn)并克隆到了乙酰乳酸合成酶基因。Falco等(1985)在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中也發(fā)現(xiàn)并克隆到了其ALS基因，各國(guó)科學(xué)家花費(fèi)了大量精力去研究各物種中的乙酰乳酸合成酶基因，到目前為止，可在NCBI中搜索到與乙酰乳酸合成酶基因相關(guān)的相關(guān)信息多達(dá)上千條，概括起來(lái)至少來(lái)源于50個(gè)不同的生物種類(lèi)。隨著抗除草劑乙酰乳酸合成酶基因的不斷發(fā)現(xiàn)和分離，通過(guò)轉(zhuǎn)化抗性基因培育抗乙酰乳酸合成酶抑制劑類(lèi)除草劑作物發(fā)展突飛猛進(jìn)。至今，通過(guò)轉(zhuǎn)化乙酰乳酸合成酶酶突變基因，創(chuàng)制出了抗乙酰乳酸合成酶抑制劑類(lèi)除草劑的大豆、玉米、小麥、水稻、油菜、煙草、亞麻等多種作物的抗性品系(Saari L L.et al, 1996 JamesC，1999 ；Baylis A D，2000 ;蘇少`泉，2002 James C，2009)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與耐氯嘧磺隆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與耐氯嘧磺隆相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白中，一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述的序列2由690個(gè)氨基酸組成。編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述編碼基因?yàn)槿缦?I)或(2)或⑶的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；
(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼與耐氯嘧磺隆相關(guān)蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與耐氯嘧磺隆相關(guān)蛋白的DNA分子。上述編碼基因中，所述嚴(yán)格條件可為如下:在6XSSC，0.5%305的溶液中，在65°〇下雜交，然后用2 X SSC, 0.1% SDS和1XSSC,0.1% SDS各洗膜一次。上述的序列I由2073個(gè)脫氧核苷酸組成，自5’端的第I至2073位核苷酸為蛋白的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame, ORF),組成。含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組載體具體為將所述蛋白的編碼基因插入pGBKT7載體的BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)間，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。上述重組菌為將上述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌，在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述宿主菌具體為BL21 (DE3)。擴(kuò)增上述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述引物對(duì)的一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列3，上述引物對(duì)中的另一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列4。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種耐氯嘧磺隆產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為上述蛋白、上述的編碼基因、上述的重組載體、上述的表達(dá)盒、上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的重組菌。上述蛋白、上述的編碼基因、上述的重組載體、上述的表達(dá)盒、上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的重組菌在制備耐氯嘧磺隆產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、上述的編碼基因、上述的重組載體、上述的表達(dá)盒、上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的重組菌在耐氯嘧磺隆中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述蛋白、上述的編碼基因、上述的重組載體、上述的表達(dá)盒、上述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的重組菌在培育耐氯嘧磺隆植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種培育耐氯嘧磺隆重組菌的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將上述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌，所述重組菌的耐氯嘧磺隆性高于所述宿主菌，所述宿主菌具體為酵母AH109R。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的蛋白，將其編碼基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，可提高轉(zhuǎn)基因菌株的耐氯嘧磺隆能力，得到耐氯嘧磺隆產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的基因可用于培育高耐氯嘧磺隆轉(zhuǎn)基因作物品種，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為抗氯嘧磺隆TR-H菌株乙酰乳酸合成酶(ALS)酶活性的測(cè)定圖2為轉(zhuǎn)pGKT7-AnALSl基因的酵母菌株(AH109R)對(duì)氯嘧磺隆抗性鑒定
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、氯嘧磺隆抗性菌株TR-H的鑒定1、抗氯嘧磺隆TR-H菌株乙酰乳酸合成酶(ALS)酶活性的測(cè)定TR-H菌株為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)科篩選保存，黑曲霉菌株Hml、Hm2、Hm3為黑龍江省微生物研究所提供。供試藥劑為98%氯嘧磺隆原藥，由大連瑞澤農(nóng)藥股份有限公司生產(chǎn)。取1.0g待測(cè)菌體，乙酰乳酸合成酶的提取及活性測(cè)定方法，參照陳以峰和路凱介紹的方法，并加以改進(jìn)(路凱·，錢(qián)傳范.2000.萘二甲酸酐減輕胺苯磺隆對(duì)水稻藥害的作用機(jī)制.植物保護(hù)學(xué)報(bào).27(3):268 272 ;陳以峰，李宜慰，湯日圣等.1996.乙酸乳酸合酶活性的簡(jiǎn)易測(cè)定方法建立.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).18 (2):213 218)。酶比活力定義為單位時(shí)間(Ih)內(nèi)單位蛋白(Img)生成乙酰甲基甲醇的含量,單位為nmol./(h mg.ργο)。相對(duì)比活力為同一菌株藥劑誘導(dǎo)情況下與微誘導(dǎo)時(shí)酶比活力的比值。數(shù)據(jù)分析如圖1所示，TR-H菌株耐氯嘧磺隆的能力顯著高于其他菌株，酶活力在供試濃度下與其他三種菌株有顯著性差異。2、菌體總DNA的提取將活化好的保存抗氯嘧磺隆菌株孢子接種于液體察氏培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm條件下振蕩培養(yǎng)2 3d，收集菌絲體，用無(wú)菌水沖洗，盡量吸干水分，基因組DNA提取采用Fermentas 公司 Genomic DNA puritication kit 試劑盒法。提取的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，將基因組DNA溶液放入_20°C冰箱中保存。3、TR-H 菌株 18S rRNA 克隆以Fermentas公司Genomic DNA puritication kit提取的基因組為模板，設(shè)計(jì)引物為:5' SSU,5; -AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT-3'；3' SSU, 5; -TGA TCC TTC TGC AGG TTC ACC TAC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:DNA模板(20ng/μL)，2.0 μ L ； 10 X PCR Buffer (含 25 μ mol/mLMg2+)，2.0μ L ；2mmol/L dNTPs，2.0 μ L ;5' SSU (2 μ mol/L)，1.5 μ L ;3' SSU (2 μ mol/L), 1.5 μ L ；ExTaq DNA 酶(5U/ μ L)，0.2 μ L ;滅菌 ddH20,10.8 μ L ;總體積 20 μ L。PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收目的條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)Axygen公司的凝膠回收試劑盒提供的方法回收純化后與T載體連接，測(cè)序。以獲得序列為信息探針利用GenBank的BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)分析，其與黑曲霉(Aspergillus niger)的18S rRNA具有較高的同源性,進(jìn)一步利用DNA Star軟件包中的MegAlign進(jìn)行序列比對(duì),其與黑曲霉(Aspergillus niger)的序列同源性高達(dá)98%。以菌株TR-H的18S rRNA序列為比對(duì)序列，通過(guò)GenBank中的BLAST程序比對(duì)并下載其近緣菌株的18S rRNA序列。與TR-H的18S rRNA序列一起輸入MEGA 4.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析可知，菌株TR-H與Aspergillus niger JC(ER)68267)具有較高的同源性，相似性為92%，遺傳距離最近。將菌株TR-H確定為黑曲霉(Aspergillusniger),命名為 Aspergillus niger TR-H(18S 序列，GeneBank 登錄號(hào) GU981468)。實(shí)施例2、抗氯嘧磺隆蛋白及其編碼基因的獲得搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與ALS抑制劑靶標(biāo)酶-乙酰乳酸合成酶(ALS)相關(guān)序列，下載全部序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR的方法從黑曲霉(Aspergillus nigerTR-H)的菌絲體中克隆該具有抗氯嘧磺隆功能的乙酰乳酸合成酶的基因的cDNA序列。具體方法為:將菌株黑曲霉(Aspergillus niger TR-H)(張洪巖，張慶賀，張利斌，陶波.2010.抗氯嘧磺隆黑曲霉乙酰乳酸合成酶(ALS)酶學(xué)特性研究.油料作物學(xué)報(bào).32 (4) =563-566,公眾可從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得)接種在含有氯嘧磺隆500mg/L的察氏培養(yǎng)基(配方:蛋白胨5g、葡萄糖20g、NaN033g、KC10.5g、MgSO40.5g、K2HPO4Ig' FeSO40.lg、水 IOOOmL, pH 值自然)中，在 30°C，150rpm 的搖床中恒溫培養(yǎng) 48h，收集菌絲體用DEPC水沖洗后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以該cDNA為模板，用引物AncDF, 5; -ATG ATG CCT ATG AGA CCT TC-3'(序列 3) ；AncDR, 5; -TTA GAA ACC GGGAAC TTT C-3'(序列4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為:10XBuffer 2.5 μ L, dNTP 2.5mM, AncDF 5 μ M, AncDR 5 μ Μ,cDNA 20ng, Taq酶1U，加去離子水至25 μ L。PCR 反應(yīng)程序:先 94°C 5min ;然后 94°C 30S, 55°C 30s, 72°C lmin,擴(kuò)增 35 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8min。PCR擴(kuò)增得到2. 1kb左右的片段。將該P(yáng)CR產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果為該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因具有序列表中序列I所示的核苷酸，將該基因命名為AnALSI，該基因編碼的蛋白命名為AnALSI。該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。序列I由2073個(gè)核苷酸組成，其編碼區(qū)為序列表中序列I的5’端的第I至2073位核苷酸，序列2由690個(gè)氨基酸組成。人工合成序列I。實(shí)施例3、抗氯嘧磺隆蛋白及其編碼基因的功能驗(yàn)證1、抗氯嘧磺隆蛋白的獲得將AnALSl的ORF克隆pGBKT7載體并置于T7啟動(dòng)子控制下，具體方法為:根據(jù)上述AnALSlcDNA序列設(shè)計(jì)引物，序列如下所示:AncDFl，5, GA GGA TCCGTATGA TGC CTA TGA GAC CTT C~3'(序列5，下劃線標(biāo)注的是BamH I酶識(shí)別位點(diǎn))；AncDRl,5' -TC GTC GAC TTA GAA ACC GGG AAC TTT CC-3'(序列 6，下劃線標(biāo)注的是 Sal I 酶識(shí)別位點(diǎn))。將菌株黑曲霉(Aspergillus niger TR-H)接種在含有氯卩密磺隆500mg/L的察氏培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm的搖床中恒溫培養(yǎng)48h，收集菌絲體用DEPC水沖洗后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以該cDNA為模板，以AncDFl和AncDRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增得到2073bp的片段，測(cè)序表明，該片段具有序列I的5’端的第I至2073位的核苷酸序列。
2、酵母中表達(dá)載體的構(gòu)建將上述I得到的擴(kuò)增得到2073bp的片段用BamHI和Sal I雙酶切，將得到的片段與同樣酶切得到的PGBKT7載體(購(gòu)自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為:630443)骨架載體連接，得到連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列I插入pGBKT7的BamH I和Sal I酶識(shí)別位點(diǎn)之間，得到重組載體，將該重組載體命名為pGBKT7_AnALSl。3、轉(zhuǎn) pGBKT7_AnALSl 酵母的獲得用重組質(zhì)粒pGBKT7-AnALSl導(dǎo)入酵母AH109R感受態(tài)細(xì)胞的方法獲得轉(zhuǎn)pGBKT7-AnALSl 酵母；具體方法為:制作酵母AH109R(購(gòu)自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為:630444)感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pGBKT7-AnALSl轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109細(xì)胞中獲得重組菌株。以重組菌株為模板，以AncDFl和AncDRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2073bp的片段的重組菌為陽(yáng)性重組菌。提取陽(yáng)性重組菌的質(zhì)粒，送去測(cè)序，該質(zhì)粒為pGBKT7_AnALSl，將含有該質(zhì)粒的陽(yáng)性重組菌命名為酵母pGB-ALS。采用相同的方法，將空載體pGBKT7轉(zhuǎn)入酵母AH109R中，得到轉(zhuǎn)空載體酵母AH109R,提取該酵母的質(zhì)粒，以AncDFl和AncDRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，沒(méi)有目的片段，證明該酵母為轉(zhuǎn)空載體酵母，命名為酵母PGB。4、轉(zhuǎn)pGBKT7_AnALSl酵母的氯嘧磺隆抗性鑒定將酵母pGB-ALS，酵母pGB和酵母AH109R同時(shí)劃線在含有氯嘧磺隆濃度Omg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L 的固體 YPD 培養(yǎng)基(購(gòu)自 Clontech 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為:630409)平板上；將酵母pGB-ALS，酵母pGB同時(shí)劃線在含氯嘧磺隆濃度2000mg/L的SD/_Trp平板(購(gòu)自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào):630309)上，72h后觀察菌落生長(zhǎng)情況。結(jié)果圖2 所示，A =YPD 培養(yǎng)基；B:SD/-Trp+2000mg/L 氯嘧磺??；C:YPD+2000mg/L氯嘧磺隆；D:YPD+3000mg/L氯嘧磺??；E:YPD+4000mg/L氯嘧磺?。籉:YPD+5000mg/L氯嘧磺??；結(jié)果表明，酵母pGB-ALS、酵母pGB和酵母AH109R在Omg/L的YPD平板上均能生長(zhǎng)正常，證明三個(gè)菌種都具有較強(qiáng)的活力(圖2-A);酵母pGB-ALS在含有氯嘧磺隆2000mg/L的YPD平板中均能正常生長(zhǎng)，但是比在Omg/L的YPD平板中生長(zhǎng)稍弱，可見(jiàn)隨著氯嘧磺隆濃度的增加，氯嘧磺隆對(duì)酵母pGB-ALS的抑制作用增強(qiáng)，酵母pGB和酵母AH109R在含有氯嘧磺隆2000mg/L 的 YPD 平板上有微弱的生長(zhǎng)(圖 2-C);在 3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L 的 YPD平板中酵母PGB和酵母AH109R均不能正常生長(zhǎng)，而pGB-ALS均正常生長(zhǎng)(圖2_D，E，F(xiàn))。而菌種酵母AH109R本身就具有弱的抗氯嘧磺隆能力，但是在高氯嘧磺隆濃度下不能生長(zhǎng)。

酵母pGB-ALS在含有氯嘧磺隆濃度2000mg/L的SD/_Trp平板上可以正常生長(zhǎng)，而酵母PGB不能生長(zhǎng)(圖2-B)，證明轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母AH109R中成功復(fù)制表達(dá)，其功能得到了發(fā)揮。表明AnALSl基因在酵母中表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因酵母的抗氯嘧磺隆能力。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與耐氯嘧磺隆相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與耐氯嘧磺隆相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入PGBKT7載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.如權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌為將權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌，所述宿主菌具體為酵母AH109R。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)； 所述引物對(duì)具體為如下I)或2): 1)所示的引物對(duì)的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，另一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列4 ； 2)所示的引物對(duì)的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列5，另一條引物的核苷酸序列具體為序列表中的序列6。
8.一種耐氯嘧磺隆產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求4或6所述的重組菌。
9.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、權(quán)利要求4或6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求4所述的重組囷在制備耐氣卩密橫隆廣品中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、權(quán)利要求4或6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求4所述的重組菌在耐氯嘧磺隆中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因、權(quán)利要求4或5所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、權(quán)利要求4或6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求4所述的重組菌在培育耐氯嘧磺隆植物中的應(yīng)用。
10.一種培育耐氯嘧磺隆重組菌的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌中得到的重組菌，所述重組菌的耐氯嘧磺隆性高于所述宿主菌，所述宿主菌具體為酵母AH109R。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種與耐氯嘧磺隆相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與耐氯嘧磺隆相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的蛋白，將其編碼基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，可提高轉(zhuǎn)基因菌株的耐氯嘧磺隆能力，得到耐氯嘧磺隆產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的基因可用于培育高耐氯嘧磺隆轉(zhuǎn)基因作物品種，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/60GK103184211SQ20111044465
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者陶波, 任洪雷, 張洪巖, 金龍國(guó), 邱麗娟 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所