專利名稱：復(fù)合微生物發(fā)酵劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物飼料添加劑領(lǐng)域中的菌種及其混合菌發(fā)酵劑。
背景技術(shù)：
我國的秸稈資源十分豐富，年產(chǎn)量可達(dá)到5. 79億噸。其中，玉米、小麥、和稻草秸稈三大作物秸稈產(chǎn)量達(dá)到了 4. 39億噸，占整個秸稈產(chǎn)量的75. 88%。目前，隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，加劇了畜牧業(yè)對糧食的依賴性，但秸稈用作飼料數(shù)量較少，即使用作飼料也因加工利用不當(dāng)，使得秸稈的利用率及飼料報酬率低。農(nóng)作物秸稈營養(yǎng)價值低、適口性差、消化率低。如果對其進(jìn)行合理的加工調(diào)劑，可用于飼喂家畜。據(jù)報道，秸稈經(jīng)青貯、氨化等方法調(diào)治后，每6kg青貯秸稈或4kg氨化秸稈相當(dāng)于Ikg玉米飼料的營養(yǎng)價值。因此，采用科學(xué)的方法對秸稈進(jìn)行加工調(diào)劑，廣泛用于畜牧業(yè)，具有良好的生態(tài)效益社會效益和經(jīng)濟效益。近年來在我國推廣的氨化飼料，不僅成本高、能耗高，并且存在與農(nóng)業(yè)爭肥、污染環(huán)境，有些方法對于牲畜還有毒副作用。而飼料清楚技術(shù)的研究與應(yīng)用已有上百年的歷史， 目前關(guān)鍵的技術(shù)在于微生物優(yōu)良菌株的選育、復(fù)合菌種的有效復(fù)配和發(fā)酵工藝的優(yōu)化。在這些方面，國內(nèi)外學(xué)者均進(jìn)行了大量的研究工作，但對于綜合解決清楚飼料發(fā)酵過程中抑制腐敗菌、防治二次發(fā)酵，有效控制有機酸和降解木質(zhì)纖維素，降低成本，便于使用等方面仍然存在問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種青儲飼料用微生物發(fā)酵劑。本發(fā)明生產(chǎn)用復(fù)合微生物發(fā)酵劑黑曲霉孢子、鼠李糖乳桿菌CGMCC4430和植物乳桿菌組成。復(fù)合微生物發(fā)酵劑中各菌種活細(xì)胞數(shù)量范圍如下鼠李糖乳桿菌為(0.1 60. 0) *109個/克，植物乳桿菌數(shù)量為(0. 01 6. 0) *109個/克，黑曲霉孢子數(shù)量為(1 50)*108 個 / 克。將發(fā)酵制得黑曲霉孢子、鼠李糖乳桿菌粉、植物乳桿菌粉以質(zhì)量比例為 1 (0. 5-2) (0. 5-2)混合，以干重計。1)黑曲霉孢子的制備工藝為A.斜面培養(yǎng)方法試管，121°C，20min滅菌后，擺斜面，冷卻，接種。30°C培養(yǎng)到黑色孢子鋪滿斜面。B. K式培養(yǎng)瓶孢子取10° Brix麥芽汁加入2%瓊脂，裝入500mL K式培養(yǎng)瓶，12rC，20min滅菌后， 鋪斜面冷卻。接入孢子懸浮液lmL，保證懸浮液接種于整個培養(yǎng)基表面；側(cè)放入恒溫箱， 30°C培養(yǎng)到黑色孢子鋪滿斜面。C.固態(tài)放大培養(yǎng)將K式瓶孢子制成孢子懸浮液，孢子濃度大于1. OX IO8個/mL。取200kg固態(tài)培養(yǎng)基(麩皮140kg、10° Brix麥芽汁60L)，充分混勻后放入淺盤，在121°C下滅菌1小時。 待放涼后，接入孢子懸浮液。培養(yǎng)溫度控制在30°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次， 培養(yǎng)時間3天；待培養(yǎng)料長滿孢子即可結(jié)束培養(yǎng)干燥粉碎發(fā)酵結(jié)束后，將淺盤放在流化床干燥，干燥溫度控制在60°C，待物料水分含量將低于10%以下時，用粉碎機將固體培養(yǎng)料進(jìn)行粉碎，物料粉碎孔徑在100目以上。2)鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌菌粉的制備工藝為植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌粉狀菌粉生產(chǎn)步驟如下將斜面菌種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基并逐級擴培到要求的體積；將擴培得到的菌液進(jìn)行離心分離，收集沉淀菌體；向沉淀菌體中加入保護劑并進(jìn)行稀釋；利用干燥設(shè)備制備粉狀菌劑，復(fù)合菌粉混合時可以加入淀粉和糊精實現(xiàn)各菌活菌數(shù)的合適比例。最終菌粉產(chǎn)品中各菌種活細(xì)胞數(shù)量范圍如下鼠李糖乳桿菌為(0. 1 60. 0) *109個/克，植物乳桿菌數(shù)量為(0.01- 6. 0) *109個/克，黑曲霉孢子數(shù)量為(1 50)*108個/克。鼠李糖乳桿菌所用培養(yǎng)基如下斜面培養(yǎng)基(g/L) 20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10 牛肉膏，5NaCl，10 乙酸鈉，2 檸檬酸銨，0. 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20，15 瓊脂，pH 6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) :40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，無機鹽(0. OlNaCl，0. 5 乙酸鈉，0. 2 檸檬酸銨，0. 2ΚΗ2Ρ04，0· 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20)，pH 6. 5。本發(fā)明中各種菌種組成比例也是經(jīng)過精心試驗研究得到，上述菌種的選擇和配比保障了產(chǎn)品的良好質(zhì)量。復(fù)合菌粉混合時可以加入淀粉和糊精實現(xiàn)各菌活菌數(shù)的合適比例。復(fù)合菌粉中各菌種活細(xì)胞數(shù)量較好范圍如下鼠李糖乳桿菌為(1 60.0)*109個 /克，植物乳桿菌數(shù)量為(0. 1 6. 0) *109個/克，黑曲霉孢子數(shù)量為(1 30) *108個/克。鼠李糖乳桿菌菌粉的具體生產(chǎn)方法已有較多報道，報道文章有黃良昌的碩士學(xué)位論文“真空冷凍干燥法生產(chǎn)干酸奶發(fā)酵劑工藝的研究”(2002年)，劉宇峰等在中國乳品工業(yè)雜志發(fā)表的“直接使用型酸奶發(fā)酵劑的研制”發(fā)表于1995年第5期。本發(fā)明采用的菌種如下鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430菌株特點如下在顯微鏡下觀察，該菌株為桿狀，寬度小于1 μ m，2到3個桿菌易于連成連接在一起；在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為乳白色，表面光滑，濕潤，粘稠，邊緣較整齊。與原始菌相比，該誘變菌株在形態(tài)上明顯小于出發(fā)菌株。出發(fā)菌株鼠李糖乳桿菌CGMCC No. 1.2134購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發(fā)明鼠李糖乳桿菌采用下述流程進(jìn)行選育原始出發(fā)菌種一試管活化一高溫馴化一硫酸二乙酯(DEQ誘變一高糖平板篩選一亞硝基胍(NTG)誘變篩選一高溫菌篩選一搖瓶復(fù)篩一傳代穩(wěn)定性試驗一5L發(fā)酵罐試驗。將目的菌株CGMCC No. 4430做5L乳酸發(fā)酵罐實驗，結(jié)果表明與出發(fā)菌株相比，CGMCC No. 4430葡萄糖耐受濃度可以達(dá)到270g/L，與原始菌相比提高了 95% ；發(fā)酵結(jié)束后，乳酸含量為60g/L，與原始菌相比提高了 158%。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
黑曲霉(Aspergillusniger) CGMCC No. 3. 5洸9、植物乳桿菌(Lactobacillus ρlantarum CGMCC. No. 1. 2158)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。保藏日期2010年 12月8日。微生物青儲混合菌發(fā)酵劑制作青儲飼料的工藝3)原料準(zhǔn)備精選無腐爛的稻草、玉米稈及豆科類桿原料或其混合物，鍘至2 5 cm 長。4)菌種活化將復(fù)合微生物發(fā)酵劑倒入1 2° Brix麥芽汁中，混合均勻，25°C 35°C下經(jīng)2 3小時即活化好。原料(稻草、玉米稈及豆科類桿原料或其混合物)的水含量應(yīng)控制在70% 80%，復(fù)合微生物發(fā)酵劑用量為青儲飼料原料的0. 1-5% ；5)接種裝料原料分層堆積，堆積20 30cm厚時，噴灑一遍菌液。堆積總高不應(yīng)超過2米。6)好氧培養(yǎng)空氣中放置5 30天，春、秋兩季應(yīng)適當(dāng)延長時間為20 30天；夏天放置5 10天。7)厭氧培養(yǎng)用塑料薄膜密封，20 90天后可以供牲畜食用，春、秋兩季時間為 60 90天。夏天20 30天。復(fù)合微生物發(fā)酵劑用量為青儲飼料原料的0. 1-1% ；有益效果黑曲霉、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌組成高活性復(fù)合微生物發(fā)酵劑。復(fù)合微生物發(fā)酵劑使用時，將青儲飼料發(fā)酵分為好氧和厭氧兩個階段。這樣在好氧階段促進(jìn)了菌體的快速生長，厭氧階段利于代謝物的快速積累，本發(fā)明有效的解決了青儲飼料發(fā)酵中的技術(shù)難題，使用簡單，便于農(nóng)民大規(guī)模使用。
具體實施例方式下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明中利用復(fù)合微生物發(fā)酵劑。 除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的培養(yǎng)劑組分、含量、培養(yǎng)條件進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。1)黑曲霉孢子的制備工藝為A.斜面培養(yǎng)方法試管，12rC,20min滅菌后，擺斜面，冷卻，接種。30°C培養(yǎng)到黑色孢子鋪滿斜面。B. K式培養(yǎng)瓶孢子取10° Brix麥芽汁加入2%瓊脂，裝入500mL K式培養(yǎng)瓶，12rC，20min滅菌后， 鋪斜面冷卻。接入孢子懸浮液lmL，保證懸浮液接種于整個培養(yǎng)基表面；側(cè)放入恒溫箱， 30°C培養(yǎng)到黑色孢子鋪滿斜面。C.固態(tài)放大培養(yǎng)將K式瓶孢子制成孢子懸浮液，孢子濃度大于1. OX IO8個/mL。取200kg固態(tài)培養(yǎng)基(麩皮140kg、10° Brix麥芽汁60L)，充分混勻后放入淺盤，在121°C下滅菌1小時。 待放涼后，接入孢子懸浮液。培養(yǎng)溫度控制在30°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次， 培養(yǎng)時間3天；待培養(yǎng)料長滿孢子即可結(jié)束培養(yǎng)干燥粉碎發(fā)酵結(jié)束后，將淺盤放在流化床干燥，干燥溫度控制在60°C，待物料水分含量將低于10%以下時，用粉碎機將固體培養(yǎng)料進(jìn)行粉碎，物料粉碎孔徑在100目以上。鼠李糖乳桿菌 CGMCC4430 和植物乳桿菌(Lactobacillus ρlantarum CGMCC. No. 1. 2158)菌粉的制備工藝為植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌粉狀菌粉生產(chǎn)步驟如下將斜面菌種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基并逐級擴培到要求的體積；將擴培得到的菌液進(jìn)行離心分離，收集沉淀菌體；向沉淀菌體中加入保護劑并進(jìn)行稀釋；利用干燥設(shè)備制備粉狀菌劑，上述方法制得鼠李糖乳桿菌菌粉中活細(xì)胞數(shù)為(0.1 6.0)*(101°)個/克，植物乳桿菌菌粉中活細(xì)胞數(shù)為(0. 1 6. 0) IO9個/克，復(fù)合菌粉混合時可以加入淀粉和糊精實現(xiàn)各菌活菌數(shù)的合適比例。最終菌粉產(chǎn)品中各菌種活細(xì)胞數(shù)量范圍如下鼠李糖乳桿菌為(0.1 60.0)*109個/克，植物乳桿菌數(shù)量為(0.01 6.0) *109個/克，黑曲霉孢子數(shù)量為(1 50)*108 個 / 克。鼠李糖乳桿菌所用培養(yǎng)基如下斜面培養(yǎng)基(g/L) 20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10 牛肉膏，5NaCl，10 乙酸鈉，2 檸檬酸銨，0. 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20，15 瓊脂，pH 6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) :40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，無機鹽(0. OlNaCl，0. 5 乙酸鈉，0. 2 檸檬酸銨，0. 2ΚΗ2Ρ04，0· 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20)，pH 6. 5。實施例1 :將發(fā)酵制的IOOg黑曲霉孢子、IOOg鼠李糖乳桿菌和IOOg植物乳桿菌混合組成，鼠李糖乳桿菌為30. 0*109個/克，植物乳桿菌數(shù)量為5*109個/克，黑曲霉孢子數(shù)量為20*108
個/克。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合微生物發(fā)酵劑，所述復(fù)合微生物發(fā)酵劑由黑曲霉孢子、鼠李糖乳桿菌 CGMCC4430和植物乳桿菌組成。
2.如權(quán)1所述復(fù)合微生物發(fā)酵劑，其特征在于所述復(fù)合微生物發(fā)酵劑中各菌種活細(xì)胞數(shù)量范圍如下鼠李糖乳桿菌為(0.1 60.0) *109個/克，植物乳桿菌數(shù)量為(0.01 6.0)*109個/克，黑曲霉孢子數(shù)量為(1 50)*108個/克。
3.如權(quán)1-2所述一種復(fù)合微生物發(fā)酵劑，，其特征在于所述復(fù)合微生物發(fā)酵劑中鼠李糖乳桿菌為(1 60.0) *109個/克，植物乳桿菌數(shù)量為(0. 1 6.0)*109個/克，黑曲霉孢子數(shù)量為(1 30)*108個/克。
4.如權(quán)1-3所述一種復(fù)合微生物發(fā)酵劑，，其特征在于所述復(fù)合微生物發(fā)酵劑中鼠李糖乳桿菌為30. 0*109個/克，植物乳桿菌數(shù)量為5*109個/克，黑曲霉孢子數(shù)量為20*108 個/克。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合微生物發(fā)酵劑，。所述復(fù)合微生物發(fā)酵劑由黑曲霉孢子、鼠李糖乳桿菌CGMCC4430和植物乳桿菌組成。通過向青儲原料中加入此發(fā)酵劑，在好氧、厭氧條件下，微生物快速生長，分泌大量的纖維素酶來分解纖維素，蛋白酶分解蛋白產(chǎn)生游離氨基酸，同時產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物乳酸等。處理后的青儲飼料pH值降低，基本無雜菌生長，是一種營養(yǎng)價值高、易消化的家畜用青儲飼料。
文檔編號C12N1/14GK102559546SQ20111042162
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者李政, 李績, 王玉, 蘇俊 申請人:李績