專利名稱：犬惡絲蟲核酸疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種犬惡絲蟲核酸疫苗，用于犬惡絲蟲病的預(yù)防和治療，同時(shí)還提供了該疫苗的制備方法，屬于生物制品制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬惡絲蟲病是由犬惡絲蟲i遞 iiis)成蟲寄生于犬的右心室、肺動(dòng)脈內(nèi)，使患犬形成機(jī)械性栓塞，影響心肺功能，導(dǎo)致呼吸衰竭、循環(huán)和泌尿系統(tǒng)遭受嚴(yán)重?fù)p傷的寄生線蟲病。犬、貓科動(dòng)物是本病的天然宿主，野生肉食動(dòng)物、馬屬動(dòng)物、海貍、猩猩、麝鼠、靈長類等偶見感染，還可以感染人類。該病雖經(jīng)多年研究，迄今尚無理想的防治藥物以及預(yù)防和治療辦法。因此，利用獲得的免疫相關(guān)基因制備核酸疫苗以刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的免疫干預(yù)可能是控制犬惡絲蟲病更合適的途徑
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種犬惡絲蟲核酸疫苗，是抗犬惡絲蟲的新型疫苗，對于犬惡絲蟲病的預(yù)防有明顯效果。本發(fā)明還提供了該疫苗的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明公開的犬惡絲蟲的保護(hù)性抗原基因基因(命名為GSP1)，如SEQ ID NO. I所
/Jn ο本發(fā)明所述保護(hù)性抗原基因的擴(kuò)增引物，其特征在于
FI : 5 ’ - GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3，，
SI :5’ -CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3'本發(fā)明提供的犬惡絲蟲核酸疫苗，其特征在于將犬惡絲蟲保護(hù)性抗原基因插入到真核載體PVAX1，獲得了核酸疫苗pVAXl-GSPl。本發(fā)明公開的犬惡絲蟲核酸疫苗的制備工藝，包括以下步驟
根據(jù)犬惡絲蟲保護(hù)性抗原基因序列的開放性閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，與克隆載體PMD18-T 連接；
將克隆所得的兩個(gè)保護(hù)性抗原基因分別插入到真核表達(dá)載體PVAX1，構(gòu)建犬惡絲蟲核酸疫苗；
將構(gòu)建的核酸疫苗分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的間接免疫熒光、SDS-PAGE電泳、以及Western blot進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物分析，并對免疫小鼠進(jìn)行特異性抗體效價(jià)以及⑶4+和⑶8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量的檢測以驗(yàn)證其免疫效果。本發(fā)明積極效果在于選用了保護(hù)性抗原基因進(jìn)行了核酸疫苗的研制，以獲得免疫保護(hù)。犬惡絲蟲核酸疫苗能引起機(jī)體較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，從而可以達(dá)到預(yù)防犬惡絲蟲病的目的。


圖I :重組質(zhì)粒PVAXl-GSPl的酶切鑒定圖；圖2 :轉(zhuǎn)染細(xì)胞的間接免疫熒光；
圖3 pVAXl- GSPl轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物Western Blot分析；
圖4 :重組蛋白疫苗免疫小鼠血清特異性抗體IgG抗體效價(jià)測定。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解至IJ，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。 實(shí)施例I :
犬惡絲蟲核酸的制備
本發(fā)明以犬惡絲蟲免疫相關(guān)基因GSPl為例，進(jìn)行真核表達(dá)載體的構(gòu)建。犬惡絲蟲核酸疫苗的制備步驟如下
I、參照GSPl基因序列開放性閱讀框及真核表達(dá)載體pVAXl圖譜設(shè)計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)。根據(jù)目的基因序列，設(shè)計(jì)兩對引物用來擴(kuò)增GPSl片段
Fl :5’ - GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3’，下劃線為 BamH I 酶切位點(diǎn)。SI :5’ -CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3’，下劃線為 Xho I 酶切位點(diǎn)。2、以制備的含有GPSl插入片段的噬菌體基因組為模板擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件(95°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 2min，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR純化產(chǎn)物克隆分別至PMD18-T載體，經(jīng)PCR及相對應(yīng)的酶切鑒定后，送生物公司測序鑒定，結(jié)果與(附篩選的免疫相關(guān)GSPl基因序列)相同。3、凝膠回收各個(gè)目的片段然后與用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切的真核表達(dá)載體pVAXl連接，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，提取質(zhì)粒并雙酶切鑒定真核表達(dá)載體pVAX I-GSPl (如圖I)。4、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，G418選擇培養(yǎng)基篩選。對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行間接免疫突光試驗(yàn)以及重組質(zhì)粒的Western blotting鑒定(如附圖2,3所示)。試驗(yàn)例I
I、體液免疫檢測30只BALB/c小鼠，隨機(jī)分成3組。共免疫3次，I次/2周。重組質(zhì)粒DNA:佐劑=Iyg :0.5μ ，其余用水補(bǔ)足，混合均勻。免疫途徑均為肌肉注射。試驗(yàn)組重組pVAXl- GSP1，IOOPg/次，佐劑為司苯甘油；空白對照組PBS ;陰性對照組pVAXl，IOC^g/次。分別于免疫前、免疫第14d、免疫第28d和免疫第42d取每組小鼠血清(尾靜脈采血，離心收集血清)，以犬惡絲蟲成蟲抗原為包被抗原，常規(guī)間接ELISA常規(guī)方法操作，檢測原核表達(dá)的重組蛋白免疫小鼠后的體液免疫水平。SPSS軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)。2、細(xì)胞免疫水平的檢測于免疫第42d，分別每組處死5只小鼠，無菌摘取脾臟；力口入2mLPBS液,于300目篩上研磨,將研磨液吸入試管,加入2mL PBS,室溫1000g/min離心IOmin,棄去上清；PBS液清洗沉淀I次，加蒸餾水lmL，渦旋振蕩20s，加入5mL PBS,靜置5min ;取上清ImL,加入PBS lmL, 1000g/min離心IOmin,棄上清，向沉淀加入PBSlmL ;計(jì)數(shù)PBS稀釋至含IO6個(gè)/mL細(xì)胞的懸液，取其中100 μ L，加FITC標(biāo)記的抗⑶4+、⑶8+單抗，避光20min，熒光洗液洗2次，加O. 5mL熒光保存液，流式細(xì)胞儀檢測⑶4+、⑶8+ T淋巴細(xì)胞的數(shù)量；SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)。
3、分別在免疫前，一免、二免、三免后兩周對小鼠尾靜脈采血的間接ELISA方法檢測犬惡絲蟲抗體滴度及其變化結(jié)果(見表I及圖4)。結(jié)果表明試驗(yàn)組血清IgG滴度隨著免疫次數(shù)的增加逐漸升高。第三次免疫后IgG滴度與佐劑和空白對照組相比均差異極顯著(P〈0. 01)，而佐劑與空白對照組相比差異不顯著(P>0. 05)。可見，試驗(yàn)組小鼠免疫后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。表I重組核酸疫苗免疫小鼠特異性抗體效價(jià)檢測
權(quán)利要求
1.一種犬惡絲蟲的保護(hù)性抗原基因，如SEQ ID NO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述基因的擴(kuò)增引物，其特征在于FI : 5 ’ - GGATCCATGTCGGTGCCAGATCCGGAC- 3，，SI :5’ -CTCGAGTTACAACATCTTAGCGGC- 3'
3.一種犬惡絲蟲核酸疫苗,其特征在于將犬惡絲蟲保護(hù)性抗原基因插入到真核載體PVAXI，獲得了核酸疫苗pVAXl-GSPl。
4.權(quán)利要求3所述犬惡絲蟲核酸疫苗的制備工藝，包括以下步驟 根據(jù)犬惡絲蟲保護(hù)性抗原基因序列的開放性閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，與克隆載體 PMD18-T連接；將克隆所得的兩個(gè)保護(hù)性抗原基因分別插入到真核表達(dá)載體pVAXl，構(gòu)建犬惡絲蟲核酸疫苗；將構(gòu)建的核酸疫苗分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的間接免疫熒光、SDS-PAGE電泳、以及Western blot進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物分析，并對免疫小鼠進(jìn)行特異性抗體效價(jià)以及⑶4+和⑶8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量的檢測以驗(yàn)證其免疫效果。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種犬惡絲蟲核酸疫苗，用于犬惡絲蟲病的預(yù)防和治療，同時(shí)還提供了該疫苗的制備方法，根據(jù)犬惡絲蟲保護(hù)性抗原基因序列的開放性閱讀框設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，與克隆載體PMD18-T連接；將克隆所得的兩個(gè)保護(hù)性抗原基因分別插入到真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建犬惡絲蟲核酸疫苗。選用了保護(hù)性抗原基因進(jìn)行了核酸疫苗的研制，以獲得免疫保護(hù)。犬惡絲蟲核酸疫苗能引起機(jī)體較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，從而可以達(dá)到預(yù)防犬惡絲蟲病的目的。
文檔編號C12N15/12GK102643822SQ20111041953
公開日2012年8月22日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者侯洪烈, 宮鵬濤, 張國才, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉, 程柏淇, 陳玉江 申請人:吉林大學(xué)