專利名稱：一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B₁₂高產(chǎn)菌株的誘變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于菌種誘變技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12 高產(chǎn)菌株的誘變方法。
背景技術(shù)：
維生素B12為鈷胺素類化合物，主要用于治療惡性貧血；與葉酸合用治療其他巨幼細(xì)胞貧血、抗葉酸藥引起的貧血及脂肪瀉；亦用于某些神經(jīng)系統(tǒng)疾患如神經(jīng)炎、神經(jīng)萎縮等，肝臟疾病如肝硬化、肝炎等，以及血液系統(tǒng)疾病如白細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血等的治療。已經(jīng)被列為我國(guó)基本醫(yī)療保險(xiǎn)項(xiàng)目中的甲類品種，在我國(guó)大城市的用藥普及率已經(jīng)達(dá)到90 %以上，其需求量日趨旺盛。目前國(guó)內(nèi)外商品化的維生素B12幾乎都是通過(guò)微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)的。其中在發(fā)酵過(guò)程中作為活細(xì)胞催化劑的微生物是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的核心。因此，選育出產(chǎn)物產(chǎn)量高， 遺傳性狀穩(wěn)定和發(fā)酵條件優(yōu)良的菌株對(duì)于維生素B12的微生物發(fā)酵生產(chǎn)具有非常現(xiàn)實(shí)的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種產(chǎn)物產(chǎn)量高，遺傳性狀穩(wěn)定和發(fā)酵條件優(yōu)良的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株的誘變方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的所采取的技術(shù)方案為一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法，其特征是以脫氮假單胞菌為出發(fā)菌株，將其菌懸液首先用甲磺酸乙酯進(jìn)行化學(xué)誘變篩選后，再將選篩出來(lái)的菌株在低能離子注入機(jī)上進(jìn)行低能離子注入誘變篩選獲得脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株；所述的菌懸液采用如下方法獲得取培養(yǎng)好的脫氮假單胞菌菌株新鮮斜面，用 0. lmol/L、pH7. 0的磷酸緩沖液洗下菌體，裝入帶玻璃珠的三角瓶中振蕩池，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)菌體數(shù)約為IO7 IO8個(gè)/ml ；所述的化學(xué)誘變篩選過(guò)程為a.在菌懸液中加入0. 05mol/L甲磺酸乙酯，混勻后置于恒溫振蕩箱中振蕩50分鐘，隨后，立即加入0. lmol/L硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)；同時(shí)另取菌懸液，不加甲磺酸乙酯作對(duì)照品；b.用0. 2mol/L、pH7. 0 7. 4磷酸鹽緩沖液將誘變后的菌懸液及對(duì)照品采用10倍倍比法分別稀釋至10_4，然后分別吸取10_2、10_3、10_4的菌懸液進(jìn)行平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度32°C，培養(yǎng)5 6天；c.初篩從平板培養(yǎng)基上挑選抗性突變株至斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 后將菌株接至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)Mh，接至發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)16 后測(cè)VB12的單位，選取VB12含量高于對(duì)照品5%以上的高產(chǎn)菌株進(jìn)行復(fù)篩；d.復(fù)篩將菌株從斜面接至種子培養(yǎng)基，24h后將10%的種子液接至搖瓶培養(yǎng)基， 每株接3瓶，培養(yǎng)165 17 后測(cè)各菌株的維生素B12的發(fā)酵單位，以此確定高產(chǎn)菌株；所述的離子注入誘變篩選的過(guò)程為A.從化學(xué)誘變獲得的高產(chǎn)菌株斜面培養(yǎng)基上刮取菌落接至種子培養(yǎng)基中，于 35 37°C振蕩培養(yǎng)50h，再于6°C放置lh，使之同步生長(zhǎng)，然后加0. 5%酵母膏，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20 60min ；培養(yǎng)液于2°C下3000r/min離心洗滌，收集菌體；移取適量菌體于盛0. 85% 的生理鹽水和玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，在300r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩lOmin，使其分散， 過(guò)濾；通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用生理鹽水將細(xì)胞懸液稀釋至IO8個(gè)/ml備用；B.離子注入誘變?nèi)∩鲜?. 5ml菌懸液均勻涂布于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，無(wú)菌風(fēng)制成菌膜后進(jìn)行等離子體誘變；在低能離子注入機(jī)上進(jìn)行，采用能量為IOkeV,劑量分別為(1 9) X1014ions/cm2，采用脈沖式注入，每個(gè)脈沖為5s，間隔為30 50s，同時(shí)做對(duì)照樣品；C.離子注入誘變后的樣品用無(wú)菌生理鹽水洗滌后進(jìn)行10倍法稀釋，取10_4、10_5、 10_6 3個(gè)稀釋度涂布平板，32 士 1 °C，50 士 5 %相對(duì)濕度下培養(yǎng)6d，對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)；D.菌株初篩離子注入后，各處理組分別挑取140個(gè)單菌落，32士 1°C，50士5%相對(duì)濕度下培養(yǎng) 3d，然后挖塊接種進(jìn)行搖瓶初篩；E.菌株復(fù)篩從初篩結(jié)果中選出效價(jià)高的突變株，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次復(fù)篩，選出前15%的突變株再進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩時(shí)，一株接三瓶平行樣。對(duì)挑選出的典型誘變菌株，逐一進(jìn)行發(fā)酵搖瓶考察， 選擇起步效價(jià)、放瓶發(fā)酵單位和OD值均較高的菌種。上述過(guò)程中1.平板培養(yǎng)基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 120g、硫酸銨0. 20g、硫酸鎂2. 5g、硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、磷酸氫二銨2. 35g、瓊脂15g。用20% NaOH溶液調(diào)pH， 消前7. 0 7. 4。以上培養(yǎng)基配制好經(jīng)滅菌(0. 11 0. 12MPa, 121°C，30min)后，分別裝于
無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成平板培養(yǎng)基。2.斜面培養(yǎng)基配方(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 140g、硫酸銨0. 45g、 硫酸鎂3. lg、硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、磷酸氫二銨2. 35g、瓊脂^g。用20% NaOH溶液調(diào)PH，消前7. 0 7. 4。以上培養(yǎng)基配制好后，分別裝于試管中，經(jīng)滅菌(0. 11 0. 12MPa, 121°C，30min)后制成斜面使用。用消毒后的蒸餾水0. 5ml注入凍干管，使其內(nèi)容物懸浮，將懸浮液接到三支斜面培養(yǎng)基上，在觀 30°C培養(yǎng)72小時(shí)，得到斜面。3.種子培養(yǎng)基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 100g、硫酸銨0. 8g、硫酸鎂2. 6g、硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、氯化鈷0. 02g、前體0. Olg、用20% NaOH溶液調(diào)pH，消前 7.0 7.4。經(jīng)滅菌(0. 11 0. 12MPa，121°C，30min)后制成種子培養(yǎng)基。4.菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜50% 180g、蔗糖16g、 氯化膽堿11. 3g、硫酸銨3. 6g、硫酸鎂2. 5g、硫酸鋅0. 4g、氯化鈷0. 04g、、前體0. Olg、甘油 1.58、甘油磷酸88。經(jīng)滅菌(0. 11 0. 12MPa,12rC,30min)后制成搖瓶培養(yǎng)基。
5.斜面接種瓶將第三代斜面的培養(yǎng)物1 2cm2接入300ml三角瓶(內(nèi)裝60ml 種子培養(yǎng)基)在觀 30°C，相對(duì)濕度40 60%，搖床上培養(yǎng)20 Mh，轉(zhuǎn)速為300 320
轉(zhuǎn)/分鐘。6.種瓶接發(fā)酵瓶將上述種子液3ml移至300nlml三角瓶中(內(nèi)裝已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基30ml)內(nèi)，培養(yǎng)溫度30 33°C，濕度40 60%，搖床轉(zhuǎn)速觀0 300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為165 175小時(shí)后，放瓶并測(cè)定發(fā)酵單位。甲磺酸乙酯(Ethyl Methan Sulfonate)是一種烷化劑。1953年，KLMARK首次報(bào)告了 EMS對(duì)突變誘導(dǎo)的有效性。此后，EMS在誘變育種中得到廣泛應(yīng)用，并且效果很好。其作用機(jī)理是通過(guò)與核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反應(yīng)來(lái)誘發(fā)突變。EMS誘發(fā)的突變體主要通過(guò)兩個(gè)步驟完成首先鳥(niǎo)嘌呤的06位置被烷基化，而后在DNA復(fù)制過(guò)程中，烷基化的鳥(niǎo)嘌呤與胸腺嘧啶配對(duì)，導(dǎo)致堿基交換，即GC變?yōu)锳T，形成點(diǎn)突變。低能離子誘變是80年代廣泛應(yīng)用于金屬材料表面改性的一項(xiàng)高新技術(shù)。1986年中國(guó)科學(xué)院等離子物理研究所率先開(kāi)展低能離子注入生物學(xué)效應(yīng)并將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于植物育種。目前已在誘變機(jī)理和育種應(yīng)用上取得重要進(jìn)展。低能離子注入誘變育種具有損傷輕，突變率高和突變譜廣的特點(diǎn)，是人工誘變方法的一個(gè)新發(fā)展。低能離子注入生物學(xué)效應(yīng)的原初過(guò)程包括能量沉積、動(dòng)量傳遞、離子注入和電荷交換4個(gè)方面。能量為幾十至幾百keV的荷能離子通過(guò)發(fā)生器注入生物體內(nèi)，在其到達(dá)終位前，將同靶材料中的分子原子發(fā)生一系列的碰撞。起初的入射能量較高，與靶分子、原子的相互作用主要是非彈性碰撞過(guò)程(電子阻止過(guò)程)，使生物分子電離或激發(fā)導(dǎo)致電離損傷。以后入射離子能量逐漸降低，彈性碰撞將起主要作用(核阻止過(guò)程)，通過(guò)碰撞、級(jí)連和反沖碰撞，導(dǎo)致靶原子移位，留下斷鏈或缺陷。隨著入射離子能量進(jìn)一步降低，核阻止本能急劇上升，能量損失達(dá)到峰值。這時(shí)慢化的原初離子也將以高斯分布的形式沉積下來(lái)。如果注入離子是活性離子，則它們?cè)诔练e過(guò)程中將不斷與生物分子鍵合、置換，形成新的分子基團(tuán)。伴隨著入射離子的能量沉積，其中一小部分能量將隨著動(dòng)量方向到達(dá)表面，引起生物體表面的二次離子發(fā)射，即濺射。濺射離子可以是原子、分子或離子。本發(fā)明采用以甲磺酸乙酯為誘變劑的化學(xué)誘變法和低能離子束誘變法相結(jié)合的方法，最終獲得了遺傳性狀穩(wěn)定、發(fā)酵條件優(yōu)良的菌種。本發(fā)明誘變方法易行、操作安全，其誘變效果遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法，以此方法誘變得到的菌種同原始菌株相比，發(fā)酵單位提高8 12%。


圖1為甲磺酸乙酯與致死率關(guān)系圖；圖2為誘變劑量與致死率、變異率的關(guān)系；圖3為離子注入誘變處理突變株初篩結(jié)果。
具體實(shí)施例方式1培養(yǎng)基配方1)平板培養(yǎng)基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 120g、硫酸銨0. 20g、硫酸鎂2. 5g、硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、磷酸氫二銨2. 35g、瓊脂15g。用20% NaOH溶液調(diào)pH，消前7. 0 7. 4。以上培養(yǎng)基配制好經(jīng)滅菌(0. 11 0. 12MPa, 121°C，30min)后，分別裝于
無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成平板培養(yǎng)基。2)斜面培養(yǎng)基配方(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 140g、硫酸銨0. 45g、 硫酸鎂3. lg、硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、磷酸氫二銨2. 35g、瓊脂^g。用20% NaOH溶液調(diào)PH，消前7. 0 7. 4。以上培養(yǎng)基配制好后，分別裝于試管中，經(jīng)滅菌(0. 11 0. 12MPa, 121°C，30min)后制成斜面使用。用消毒后的蒸餾水0. 5ml注入凍干管，使其內(nèi)容物懸浮，將懸浮液接到三支斜面培養(yǎng)基上，在觀 30°C培養(yǎng)72小時(shí)，得到斜面。3)種子培養(yǎng)基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜(50% ) 100g、硫酸銨0. Sg、硫酸鎂2. 6g、硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、氯化鈷0. 02g、前體0. Olg、用20% NaOH溶液調(diào)pH，消前 7.0 7.4。經(jīng)滅菌(0. 11 0. 12MPa，121°C，30min)后制成種子培養(yǎng)基。4)菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(投料配比g/1000ml)甜菜糖蜜50% 180g、蔗糖16g、 氯化膽堿11. 3g、硫酸銨3. 6g、硫酸鎂2. 5g、硫酸鋅0. 4g、氯化鈷0. 04g、、前體0. Olg、甘油 1.58、甘油磷酸88。經(jīng)滅菌(0. 11 0. 12MPa,12rC,30min)后制成搖瓶培養(yǎng)基。5)斜面接種瓶將第三代斜面的培養(yǎng)物1 2cm2接入300ml三角瓶(內(nèi)裝60ml 種子培養(yǎng)基)在觀 30°C，相對(duì)濕度40 60%，搖床上培養(yǎng)20 Mh，轉(zhuǎn)速為300 320 轉(zhuǎn)/分鐘。6)種瓶接發(fā)酵瓶將上述種子液3ml移至300ml三角瓶中(內(nèi)裝已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基30ml)內(nèi)，培養(yǎng)溫度30 33 °C，濕度40 60 %，搖床轉(zhuǎn)速280 300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間為165 175小時(shí)后，放瓶并測(cè)定發(fā)酵單位。2甲磺酸乙酯化學(xué)誘變1)誘變方法取培養(yǎng)好的脫氮假單胞菌菌株新鮮斜面，用0. lmol/L、pH7. 0的磷酸緩沖液洗下菌體，裝入帶玻璃珠的三角瓶中振蕩池，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)菌體數(shù)約為IO7 IO8個(gè)/ml (采用血球計(jì)數(shù)器)。將菌懸液分裝于6只試管，每支IOml，分別加入0. 05mol/L甲磺酸乙酯0. anl，混勻后置于恒溫振蕩箱中，在^°C，分別振蕩10min、20min、30min、40min、 50min、60min。待反應(yīng)完成后，立即加入0. lmol/L硫代硫酸鈉溶液0. 5ml終止反應(yīng)；同時(shí)另取菌懸液10ml，不加甲磺酸乙酯作為對(duì)照；用0. 2mol/L、pH7. 0 7. 4磷酸鹽緩沖液將對(duì)照及誘變后的菌懸液采用10倍倍比法分別稀釋至10_4，然后分別吸取10_2、10_3、10_4的菌懸液 200ul加到制備好的平板培養(yǎng)基，涂布均勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中，32°C，培養(yǎng)5 6天，挑選菌落進(jìn)行篩選。2)菌種篩選方法初篩從平板培養(yǎng)基上挑選抗性突變株至斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 后將菌株接至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)Mh，接至發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)16 后測(cè)VB12的單位，選取VB12含量高于對(duì)照5 % 以上的高產(chǎn)菌株共9株菌株進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩將菌株從斜面接至種子培養(yǎng)基，24h后以將10%的種子液接至搖瓶培養(yǎng)基， 每株接3瓶，培養(yǎng)165 17 后測(cè)各菌株的維生素B12的發(fā)酵單位，以此確定高產(chǎn)菌株。3)效價(jià)檢測(cè)方法采用高效液相色譜法。4)穩(wěn)定性考察結(jié)果致死率與時(shí)間關(guān)系
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表1不同誘變時(shí)間菌落數(shù)致死率明細(xì)表
權(quán)利要求
1.一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法，其特征是以脫氮假單胞菌為出發(fā)菌株，將其菌懸液首先用甲磺酸乙酯進(jìn)行化學(xué)誘變篩選后，再將選篩出來(lái)的菌株在低能離子注入機(jī)上進(jìn)行低能離子注入誘變篩選獲得脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株。
2.按照權(quán)利要求1所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法， 其特征在于所述的菌懸液采用如下方法獲得取培養(yǎng)好的脫氮假單胞菌菌株新鮮斜面，用 0. lmol/L、pH7. 0的磷酸緩沖液洗下菌體，裝入帶玻璃珠的三角瓶中振蕩池，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)菌體數(shù)約為IO7 IO8個(gè)/ml。
3.按照權(quán)利要求1所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法， 其特征在于所述的化學(xué)誘變篩選過(guò)程為a.在菌懸液中加入0.05mol/L甲磺酸乙酯，混勻后置于恒溫振蕩箱中振蕩50分鐘，隨后，立即加入0. lmol/L硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)；同時(shí)另取菌懸液，不加甲磺酸乙酯作對(duì)照品；b.用0.2mol/L、pH7. 0 7. 4磷酸鹽緩沖液將誘變后的菌懸液及對(duì)照品采用10倍倍比法分別稀釋至10 —4，然后分別吸取10_2、10 —3、10一4的菌懸液進(jìn)行平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度32°C，培養(yǎng)5 6天；c.初篩從平板培養(yǎng)基上挑選抗性突變株至斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 后將菌株接至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)Mh，接至發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)16 后測(cè)VB12的單位，選取VB12含量高于對(duì)照品5%以上的高產(chǎn)菌株進(jìn)行復(fù)篩；d.復(fù)篩將菌株從斜面接至種子培養(yǎng)基，24h后將10%的種子液接至搖瓶培養(yǎng)基，每株接3瓶，培養(yǎng)165 17 后測(cè)各菌株的維生素B12的發(fā)酵單位，以此確定高產(chǎn)菌株。
4.按照權(quán)利要求1所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法， 其特征在于所述的離子注入誘變篩選的過(guò)程為A.從化學(xué)誘變獲得的高產(chǎn)菌株斜面培養(yǎng)基上刮取菌落接至種子培養(yǎng)基中，于35 37°C振蕩培養(yǎng)50h，再于6°C放置lh，使之同步生長(zhǎng)，然后加0. 5%酵母膏，繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 20 60min ；培養(yǎng)液于2°C下3000r/min離心洗滌，收集菌體；移取適量菌體于盛0. 85%的生理鹽水和玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，在300 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩lOmin，使其分散， 過(guò)濾；通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用生理鹽水將細(xì)胞懸液稀釋至IO8個(gè)/ml備用；B.離子注入誘變?nèi)∩鲜?. 5ml菌懸液均勻涂布于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，無(wú)菌風(fēng)制成菌膜后進(jìn)行等離子體誘變；在低能離子注入機(jī)上進(jìn)行，采用能量為10 keV，劑量分別為(1 9)X1014ions/cm2，采用脈沖式注入，每個(gè)脈沖為5s，間隔為30 50s，同時(shí)做對(duì)照樣品；C.離子注入誘變后的樣品用無(wú)菌生理鹽水洗滌后進(jìn)行10倍法稀釋，取10_4、10_5、10_63 個(gè)稀釋度涂布平板，32 士 1°C，50 士 5%相對(duì)濕度下培養(yǎng)6d，對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)；D.菌株初篩離子注入后，各處理組分別挑取140個(gè)單菌落，32 士 1°C，50 士 5%相對(duì)濕度下培養(yǎng)3d，然后挖塊接種進(jìn)行搖瓶初篩；E.菌株復(fù)篩從初篩結(jié)果中選出效價(jià)高的突變株，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次復(fù)篩，選出前15%的突變株再進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩時(shí)，一株接三瓶平行樣，對(duì)挑選出的典型誘變菌株，逐一進(jìn)行發(fā)酵搖瓶考察，選擇起步效價(jià)、放瓶發(fā)酵單位和OD值均較高的菌種。
5.按照權(quán)利要求2、3或4所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素^2高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法，其特征在于上述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為50%甜菜糖蜜140g、硫酸銨0.45g、硫酸鎂3. lg、硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、磷酸氫二銨2. 35g、瓊脂^g，投料配比g/1000ml。
6.按照權(quán)利要求3或4所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素^2高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法，其特征在于平板培養(yǎng)基配方為甜菜糖蜜(50% ) 120g、硫酸銨0. 20g、硫酸鎂2. 5g、 硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、磷酸氫二銨2. 35g、瓊脂15g，投料配比g/1000ml。
7.按照權(quán)利要求3或4所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素^2高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法，其特征在于種子培養(yǎng)基配方為甜菜糖蜜(50%)100g、硫酸銨0.88、硫酸鎂2.68、硫酸錳0. 2g、硫酸鋅0. 2g、氯化鈷0. 02g、前體0. 01g，投料配比g/1000ml。
8.按照權(quán)利要求3或4所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法，其特征在于菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基甜菜糖蜜50% 180g、蔗糖16g、氯化膽堿11. 3g、硫酸銨3. 6g、硫酸鎂2. 5g、硫酸鋅0. 4g、氯化鈷0. 04g、前體0. 01g、甘油1. 5g、甘油磷酸8g， 投料配比g/1000ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株的誘變篩選方法，其特征是以脫氮假單胞菌為出發(fā)菌株，將其菌懸液首先用甲磺酸乙酯進(jìn)行化學(xué)誘變篩選后，再將選篩出來(lái)的菌株在低能離子注入機(jī)上再進(jìn)行低能離子注入誘變篩選獲得脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12高產(chǎn)菌株。本發(fā)明采用以甲磺酸乙酯為誘變劑的化學(xué)誘變法和低能離子束誘變法相結(jié)合的方法，最終獲得了遺傳性狀穩(wěn)定、發(fā)酵條件優(yōu)良的菌種。本發(fā)明誘變方法易行、操作安全，其誘變效果遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法，以此方法誘變得到的菌種同原始菌株相比，發(fā)酵單位提高8～12%。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102453690SQ201110419220
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者任勇, 冷曉紅, 奇乃, 王友善, 董媛 申請(qǐng)人:寧夏多維藥業(yè)有限公司