專利名稱：一種預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用分子標(biāo)記檢測綿羊毛纖維直徑的方法。
背景技術(shù)：
我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，畜牧業(yè)是我國農(nóng)業(yè)的重要組成部分，畜牧業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年畜牧業(yè)收入的增長速度已超過種植業(yè)，成為農(nóng)民收入的主要來源之一。大力發(fā)展畜牧業(yè)仍然是我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及農(nóng)民增收的重點(diǎn)。養(yǎng)羊業(yè)是我國畜牧業(yè)的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，細(xì)毛羊在我國養(yǎng)羊業(yè)中占重要位置，細(xì)毛羊是兵團(tuán)畜牧業(yè)的主要畜種，也是兵團(tuán)畜牧經(jīng)濟(jì)中最具特色和代表性的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。我國人口眾多，又是世界服裝出口大國，細(xì)毛羊業(yè)的發(fā)展與我國畜牧業(yè)和紡織業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和市場競爭力密切相關(guān)，影響著區(qū)域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定。培育成功的中國美利奴細(xì)毛羊享譽(yù)國內(nèi)外。細(xì)毛羊業(yè)的發(fā)展為優(yōu)化兵團(tuán)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)毛紡工業(yè)發(fā)展，提高畜牧業(yè)整體效益，以及加快養(yǎng)羊良種化進(jìn)程都做出了重大貢獻(xiàn)。我國是世界上消耗羊毛最多的國家，羊毛的自給率僅為1/3，供求缺口很大，每年需要從國外進(jìn)口大批細(xì)羊毛，總價(jià)值達(dá)到60億美元左右，其中大部分是細(xì)綿羊毛和超細(xì)綿羊毛。近年來，隨著毛紡產(chǎn)品向自然、舒適、輕薄、柔軟的方向發(fā)展，世界羊毛品質(zhì)也出現(xiàn)了劃時(shí)代的變革，主要表現(xiàn)在羊毛細(xì)度上。中國對(duì)進(jìn)口羊毛品質(zhì)和細(xì)度的要求越來越高，我國和澳大利亞雙邊羊毛貿(mào)易的品質(zhì)結(jié)構(gòu)以羊毛細(xì)度作為標(biāo)準(zhǔn)，羊毛細(xì)度是體現(xiàn)加工價(jià)值的一個(gè)重要的指標(biāo)，過去毛紡部門需求毛細(xì)度以60 64支為主，近年來66 70支羊毛的需求不斷增加，羊毛越細(xì)，加工附加值越高。中國美利奴羊(新疆軍墾型)的培育從1972年開始，劉守仁等在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)協(xié)作組以紫泥泉種羊場為育種場在短期內(nèi)通過級(jí)進(jìn)雜交方法成功培育中國美利奴羊(新疆軍墾型)。分為六個(gè)品系，分別為軍墾A型品系、軍墾B型品系、超細(xì)型品系、肉用多胎品系、 毛用多胎品系、U品系。A品系具有體格大，產(chǎn)毛量高，毛密的特點(diǎn)。B品系具有毛長，羊毛品質(zhì)好的特點(diǎn)。超細(xì)毛品系具有毛細(xì)的特點(diǎn)，主體細(xì)度達(dá)到15 18 μ m (80 90支)。肉用多胎品系兼具肉品質(zhì)好和繁殖率高的特點(diǎn)。毛用多胎品系兼具毛品質(zhì)好和繁殖率高的特點(diǎn)。截止2002年已向全國23個(gè)省、自治區(qū)推廣優(yōu)質(zhì)種羊12萬只，為我國細(xì)毛羊事業(yè)的發(fā)展和改良工作做出了重大貢獻(xiàn)。但是，如何進(jìn)一步提高羊毛細(xì)度，培育超細(xì)毛種羊，以及快速擴(kuò)大種群規(guī)模仍然是一個(gè)重要問題。分子標(biāo)記技術(shù)能夠在種羊選育中避免年齡、性別、環(huán)境的干擾，實(shí)現(xiàn)早期、快速、準(zhǔn)確的選擇優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊，組建并擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊種群。因此，尋找羊毛細(xì)度(毛纖維直徑)相關(guān)基因及分子標(biāo)記，應(yīng)用現(xiàn)代分子育種新技術(shù)快速培育超細(xì)毛羊、快速擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊種質(zhì)規(guī)模勢在必行。研究表明，羊毛纖維的復(fù)雜結(jié)構(gòu)主要由角蛋白家族組成。這些蛋白對(duì)于羊毛纖維的機(jī)械性能和主要構(gòu)造起主要作用。羊毛纖維主要由三部分組成角質(zhì)層、皮質(zhì)層和一少部分有髓粗毛組成。羊毛纖維的90%由皮質(zhì)層組成，皮質(zhì)層由嵌入角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白-KAPs 里面的絲狀的微纖維組成。微纖維包括角蛋白中間絲蛋白，而角蛋白中間絲蛋白是我們已知的“硬” a -角蛋白。這些角蛋白是低硫蛋白，由兩個(gè)蛋白家族構(gòu)成，分別是I型角蛋白和II型角蛋白。根據(jù)氨基酸組成，KAPs分成三類高硫角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(KAP1. η、ΚΑΡ2. η、 ΚΑΡ3. η)，超高硫角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(ΚΑΡ4. η、ΚΑΡ5. ικΚΑΡΙΟ. η)和高甘氨酸-酪氨酸角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(ΚΑΡ6. η、ΚΑΡ7. η、ΚΑΡ8. η)。KAP基因大多為小片段，大小一般在0. 6Kb 1. 5Kb之間，并且都不含內(nèi)含子。在羊毛纖維蛋白中有很多變異，尤其對(duì)于基質(zhì)蛋白，盡管在數(shù)千年針對(duì)羊毛纖維的品質(zhì)選育中，變異逐漸減少，但是，毛纖維異質(zhì)性仍然存在。很多研究報(bào)道角蛋白和KAP 基因家族存在多態(tài)性。角蛋白及亞家族編碼基因存在多個(gè)插入/缺失和單核苷酸(SNP) 突變，這些基因多樣性與羊毛性狀(細(xì)度、強(qiáng)度、彈性和彎曲度等)存在相關(guān)關(guān)系(管峰等， 2007)。羊毛細(xì)度是一個(gè)高遺傳力性狀，達(dá)到0. 59，但在不同綿羊品種間略有差異(Safari 等，2007)，同時(shí)羊毛纖維的細(xì)度是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程，受到多種影響因素的調(diào)控和制約， 與體重、體脂含量、繁殖率等也存在相互制約關(guān)系。最近在KAP1. 1、KAP1.3基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)SNP位點(diǎn)，但是和羊毛性狀之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究(Itenge-Mweza等，2007)。劉桂芬等(2005)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)新疆優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊進(jìn)行專門的遺傳多樣性及羊毛細(xì)度候選基因進(jìn)行分析，選擇21號(hào)染色體上高硫蛋白家族中KAP1. UKAP1. 3中的部分序列和1號(hào)染色體高甘氨酸一酪氨酸蛋白KAP6. 1的外顯子進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KAP1. 1、KAP1. 3所在區(qū)域中位點(diǎn)W08667與羊毛細(xì)度相關(guān)(P<0. 05)。張亞妮等研究了 KAP基因與內(nèi)蒙古絨山羊經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系得出KAP基因的部分位點(diǎn)與絨細(xì)度存在相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、成本低、精確度高的采用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測綿羊毛纖維直徑，從而預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征主要包括以下步驟 (1)根據(jù)綿羊KAP1. 1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物 KFl: <210>1 ； KRl: <210>2。(2)從綿羊血液中提取基因組DNA，利用該引物對(duì)綿羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(3)使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測出KAP1.1基因外顯子中的 60bp和30bp插入/缺失的變異位點(diǎn)；
(4)多態(tài)性分析當(dāng)綿羊KAP1.1基因外顯子缺失60bp時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長度為^lbp, 將其命名為CC基因型；當(dāng)綿羊KAP1. 1基因外顯子缺失30bp時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長度為311bp， 將其命名為BB基因型；當(dāng)綿羊KAP1. 1基因外顯子含有60bp和30bp插入時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長度為341bp，將其命名為AA基因型；該位點(diǎn)雜合的個(gè)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶，分別為 341bp和311bp，將其命名為AB基因型；341bp和281bp，將其命名為AC基因型；311bp和
5^lbp,將其命名為BC基因型。實(shí)驗(yàn)證明具有BB基因型綿羊的平均毛纖維直徑顯著小于具有AA、BC、AC、AB和CC 基因型綿羊的平均毛纖維直徑(P<0. 05)。其中用于分析多態(tài)性的位點(diǎn)選自綿羊KAP1. 1基因如下序列中的60個(gè)和30個(gè)堿
基的插入/缺失，
1 caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg 61 atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg 121 ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat 181 ccagaccagc tgctgccaac cga(tctccat ccagaccagc tgctgccagc caa)cctccat 241 ccagaccagc tgctgccagc caacctgcct ccagaccagt ggctgtgaga cgggctgtgg 301 cattggtggc agcattggct atggccaggt gggtagcagc g，
以上序列下劃線部分為60個(gè)堿基的插入/缺失，單劃線部分為30個(gè)堿基的插入/缺失。其中分析基因多態(tài)性的方法是通過檢測堿基的插入/缺失而分類的基因型，其中用于分析基因多態(tài)性的部位是外顯子。而且是由KFl和KRl表示的引物擴(kuò)增的部分外顯子區(qū)。其中用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠濃度為1 或14%任一種均可。所述的PCR擴(kuò)增退火溫度最好為65°C。其中綿羊毛纖維直徑是綿羊的毛細(xì)度。本發(fā)明巧妙地采用PCR擴(kuò)增和凝膠分離的方法檢測綿羊KAP1. 1基因外顯子中的 60bp和30bp插入/缺失的變異位點(diǎn)。由于AA基因型和BB基因型的KAP1. 1基因片段長度僅差30個(gè)堿基，由于BB基因型和CC基因型的KAP1. 1基因片段長度也僅差30個(gè)堿基，使用瓊脂糖凝膠電泳很難將兩種基因型分離，因此本發(fā)明采用1 或14%的聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離六種基因型。按照以下步驟
從綿羊血液中提取基因組DNA，應(yīng)用KFl和KRl引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，根據(jù)條帶進(jìn)行基因型判定，并根據(jù)基因型，與綿羊毛纖維直徑進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明操作簡單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行自動(dòng)化檢測。使用本發(fā)明的標(biāo)記基因型對(duì)綿羊的毛纖維直徑進(jìn)行選擇時(shí)，將使綿羊毛纖維直徑取得很大的遺傳進(jìn)展。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法對(duì)毛纖維直徑進(jìn)行選擇，不僅為綿羊育種工作中標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)更為有效、簡便易行的分子標(biāo)記方法，同時(shí)為綿羊的細(xì)度性狀改良提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段，可以加速優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊的育種進(jìn)程。


圖1 是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 綿羊KAP1. 1基因PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中聚丙烯酰胺凝膠濃度為14%。M泳道pUC 19DNA/Msp (HapII)Marker ；泳道 1 :CC基因型個(gè)體；泳道2、3 :AB基因型個(gè)體；泳道4、5、12、13 :BC基因型個(gè)體；泳道6、7、8、 9、10 :BB基因型個(gè)體；泳道11、14 4(基因型個(gè)體；泳道15、16 44基因型個(gè)體。箭頭所指為331bp的條帶。
圖3 為3個(gè)分子標(biāo)記在群體中不同基因型展示圖。其中，A為AA基因型位點(diǎn)，B 為BB基因型位點(diǎn)，C為CC基因型位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 下面舉例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)地描述 一、實(shí)驗(yàn)材料
1、樣品采集和性狀測定
采用一次性注射器從綿羊頸靜脈抽取約Iml的血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約200μ1 2% 無菌 EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝齊[J的 L 5ml 離心管中，輕輕搖勻，記錄羊號(hào)，-20°C保存?zhèn)溆?。采集綿羊體側(cè)部皮膚毛樣，根據(jù)國家纖維檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)并參考國際羊毛組織(IWTO)纖維檢測標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)綿羊體側(cè)部毛樣進(jìn)行細(xì)度、卷曲度、細(xì)度離散、自然長度、污毛量、密度、凈毛率的測定。2、藥品和酶
三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co ;Tris飽和酚，北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；蛋白酶 K (Proteinase K),MERCK Co ；dNTP (dATP; dTTP; dCTP; (IGTP)Jaq 酶(配套 IOXTaq buffer, 25 讓ol / L Mg2+ )，大連寶生物公司；瓊脂糖(Agarose H)、pUC19DNA / Msp (Hap II) Marker、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，生工生物(上海)有限公司。3、主要儀器
Icycler PCR 儀(Bio-fcid 公司)、梯度 PCR 儀(Eppendorf 公司)、Gel2000 凝膠成像系統(tǒng)、Ultrospec 1000紫外分光光度計(jì)、Sigma 3K30高速冷凍離心機(jī)、Milli-Q超純水儀、 Bio-Rad穩(wěn)壓電泳儀及配套電泳槽。二、實(shí)驗(yàn)方法
1、緩沖液與常用試劑的配制
TE 緩沖液=IOmM Tris · Cl，ImM EDTA，pH8. O，高壓滅菌。20 X SET 緩沖液3M NaCl, IM Tris .Cl CpH 8.0)，20mM EDTA (pH 8.0)，高壓滅菌。5XTBE 緩沖液54g Tris 堿，27. 5g 硼酸，20ml 0. 5M EDTA (pH8. 0)，加水至 1L。50XTAE 緩沖液242g Tris 堿，57. Iml 冰乙酸，100ml 0. 5M EDTA (pH8. 0)，加水至IL0IM Tris · Cl :121. 14g iTris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8. 0，定容至1000ml，高壓滅菌。0.5M EDTA :186. Ig EDTA 溶于 800ml 雙蒸水中，用 NaOH 調(diào) pH 值至 8. 0，定容至 1000ml，高壓滅菌。3M NaAc (pH5. 2) :408. Ig NaAc · 3H20 溶于 800ml 雙蒸水中，用冰乙酸調(diào) pH 至 7. 0，定容至 IOOOml0200ml 銀染液=NH3 · H2O 2ml ； 3. 6% NaOH 4. 2ml ；20% AgNO3 3. 6ml，加去離子水至 200ml。200ml顯色液1%檸檬酸鈉Iml ；甲醛IOOul ；加去離子水至200ml。
7
血細(xì)胞裂解液:10mMTris · Cl (ρΗ8· 0),0. IM EDTA (ρΗ8· 0),0. 5% SDS。2、引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)KAP1. 1基因序列(GenBank登錄號(hào)AY835603)設(shè)計(jì)上游引物KFl和下游引物KR1， 引物由生工生物(上海)有限公司合成 KFl: <210>1 ； KRl: <210>2。3、綿羊基因組DNA的小量提取
(1)取20 μ 1抗凝血液，加入500 μ 1血細(xì)胞裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200 μ g/ml，混勻55°C消化l ir，直至溶液中不再有粘稠的團(tuán)塊。(2)將溶液冷卻至室溫，加入5M NaCl至終濃度1. 5 M，混勻lOmin。加入等體積酚/氯仿，反復(fù)顛倒離心管混勻lOmin。豊
(3) 12,000 rpm，室溫離心lOmin。取上清，加等體積氯仿混勻IOmin0(4) 12,000 rpm,室溫離心lOmin。取上清2倍體積無水乙醇沉淀DNA。(5)將DNA挑出放到1. 5ml離心管中，用70%乙醇洗1次。豊 (6)7，500 rpm,室溫離心5min,棄上清。(7)將DNA干燥后(注意不能太干)溶于200 μ 1 TE中。4、PCR 反應(yīng)
(1)以綿羊基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μ 1反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑
IOXPCR reaction buffer2. 5 μ 1
dNTP Mixture (各 2. 5mM)2. O μ 1
引物 1 (10 μ Μ)0. 5μ 1
引物 2 (10 μ Μ)0. 5μ 1
EX-Taq (5U/μ 1)0.25 μ 1
去離子水18. 25 μ 1
基因組 DNA (50ng/y 1)1. Ομ 1
(2)將上述溶液混合并按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。94°C變性5 min;94°C 30 sec，65°C 30 sec，72°C 30 sec，33個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5 min。(3)反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(5 10 μ 1)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物。5、非變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳
以濃度為14%、體積為25ml，厚度為0. Icm的膠為例。(1)清洗制膠用的玻璃板并用蒸餾水沖洗干凈，烘干后，用0.8%瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙。(2)在 IOOml 燒杯內(nèi)加入 30% 丙烯酰胺 11. 7ml, 50% 甘油 2. 5ml, 5XTBE 5ml, 10% 過硫酸銨0. 175ml, TEMED 8 μ 1，去離子水5. 617ml，混勻后迅速灌膠。(3)當(dāng)澆灌至離玻璃板上沿0. Icm時(shí)停止灌膠，插入梳子，室溫聚和半小時(shí)，多余的丙烯酰胺4°C保存。隨時(shí)觀察凝膠聚合情況，并補(bǔ)加丙烯酰胺。(4)凝膠聚合好后，向電泳槽加入IXTBE，用注射器沖洗加樣孔。(5)預(yù)電泳lOmin，同時(shí)準(zhǔn)備點(diǎn)樣。(6)取2 μ 1 PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加2 μ 1上樣Buffer混勻，用微量注射器點(diǎn)樣。
8
(7) 120V，電泳 8 10h。6、硝酸銀染色方法
(1)電泳結(jié)束后關(guān)上電泳儀，放出電泳液，小心取下凝膠，置于70%乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定l(Tl5min。(2)雙蒸水洗膠2遍，每次2min，去除殘留乙醇。(3 )用 200ml 染色液染色 30min。(4)雙蒸水洗膠3遍，每次anin。(5)用200ml顯色液顯色，約l(T30min，當(dāng)DNA帶的強(qiáng)度合適時(shí)，倒掉顯色液。(6)去離子水洗掉多余的顯色液，保鮮膜封好，掃描照相或保存。7、基因型判定
經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，KAP1. 1基因在綿羊群體存在六種基因型，對(duì)于 PCR擴(kuò)增片段長度為觀讓？，將其命名為CC基因型；對(duì)于PCR擴(kuò)增片段長度為311bp，將其命名為BB基因型；對(duì)于PCR擴(kuò)增片段長度為341bp，將其命名為AA基因型；該位點(diǎn)雜合的個(gè)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶，分別為341bp和31 lbp，將其命名為AB基因型；341bp和^lbp, 將其命名為AC基因型；31讓？和^lbp,將其命名為BC基因型。(附圖)。8、統(tǒng)計(jì)模型建立
根據(jù)中國美利奴羊品系選育的特點(diǎn)，構(gòu)建線性統(tǒng)計(jì)模型如下 Yijkm= μ + Gi+ L , AJGiXLj+ GiXAffl + LjXAffl + e
其中為性狀觀察值，μ為群體性狀均值，G i為基因型固定效應(yīng)，L j為品系固定效應(yīng)，Am為年齡效應(yīng)。GiXLj為基因型和品系互作效應(yīng)，GiXAm為基因型和年齡互作效應(yīng)， LjXAm為品系和年齡互作效應(yīng)，e為隨機(jī)誤差。使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP 4.0 (SAS Institute Inc.，Cary, NC, 2000)檢驗(yàn)基因型與性狀間的相關(guān)程度，并估計(jì)性狀的最小二乘均值。本實(shí)施例是運(yùn)用本發(fā)明的分子標(biāo)記選擇方法在中國美利奴(新疆軍墾型)5個(gè)品系群體羊毛細(xì)度性狀的選擇應(yīng)用。具體為選用中國美利奴羊(新疆軍墾型)5個(gè)品系，共計(jì)768只，其中超細(xì)型品系 158只，毛用多胎型品系138只，軍墾A型品系167只，軍墾B型品系163只，肉用多胎型品系142只。采集綿羊頸靜脈血液樣本，_20°C保存?zhèn)溆?。同時(shí)采集綿羊體側(cè)部皮膚毛樣，根據(jù)國家纖維檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)并參考國際羊毛組織 (IWTO)纖維檢測標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)綿羊體側(cè)部毛樣進(jìn)行自然長度、細(xì)度、細(xì)度離散、卷曲度、污毛量、 凈毛率、密度的測定，按照細(xì)毛羊鑒定標(biāo)準(zhǔn)測定生產(chǎn)性能。其中，羊毛的細(xì)度和卷曲度在農(nóng)業(yè)部種羊及羊毛羊絨質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(烏魯木齊)檢測。利用本發(fā)明的引物(KFl和KRl)對(duì)中國美利奴(新疆軍墾型)群體768個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。KAP1. 1基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離得到6種基因型，分別為AA基因型、AB基因型、AC基因型、BB基因型、BC基因型、CC基因型。對(duì)KAP1. 1基因60bp和30bp插入/缺失的變異位點(diǎn)的6種基因型在中國美利奴(新疆軍墾型)5個(gè)品系群體中的分布進(jìn)行分析， 結(jié)果表明BB基因型個(gè)體最多，基因型頻率為0348。(表1)
表1 KAP1. 1基因插入/缺失位點(diǎn)不同基因型在綿羊群體中的分布單位只
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權(quán)利要求
1.一種預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征主要包括以下步驟(1)根據(jù)綿羊KAP1.1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物KFl: <210>1，KRl: <210>2 ；(2)從綿羊血液中提取基因組DNA，利用該引物對(duì)綿羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測出KAP1.1基因外顯子中的 60bp和30bp插入/缺失的變異位點(diǎn)；(4)多態(tài)性分析當(dāng)綿羊KAP1.1基因外顯子缺失60bp時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長度為^lbp, 將其命名為CC基因型；當(dāng)綿羊KAP1. 1基因外顯子缺失30bp時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長度為311bp， 將其命名為BB基因型；當(dāng)綿羊KAP1. 1基因外顯子含有60bp和30bp插入時(shí)，PCR擴(kuò)增片段長度為341bp，將其命名為AA基因型；該位點(diǎn)雜合的個(gè)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶，分別為 341bp和311bp，將其命名為AB基因型；341bp和281bp,將其命名為AC基因型；311bp和 ^lbp,將其命名為BC基因型，具有BB基因型綿羊的平均毛纖維直徑顯著小于具有AA、BC、 AC、AB和CC基因型綿羊的平均毛纖維直徑。
2.如權(quán)利要求1所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是 其中用于分析多態(tài)性的位點(diǎn)選自綿羊KAP1. 1基因如下序列中的60個(gè)和30個(gè)堿基的插入 /缺失，1 caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg61 atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg121 ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat181 CCaRaCCaRC tRctRccaac CRa(tctccat CcaRaccaRc tRctRccaRC caa)cctccat241 ccagaccagc tgctgccagc caacctgcct ccagaccagt ggctgtgaga cgggctgtgg301 cattggtggc agcattggct atggccaggt gggtagcagc g，以上序列下劃線部分為60個(gè)堿基的插入/缺失，在括號(hào)內(nèi)的劃線部分為30個(gè)堿基的插入/缺失。
3.如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是其中分析基因多態(tài)性的方法是通過檢測堿基的插入/缺失而分類的基因型，其中用于分析基因多態(tài)性的部位是外顯子。
4.如權(quán)利要求3所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是 其中用于分析基因多態(tài)性的部位是由KFl和KRl表示的引物擴(kuò)增的部分外顯子區(qū)。
5.如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是其中用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠濃度為1 或14%。
6.如權(quán)利要求3所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是 其中用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠濃度為1 或14%。
7.如權(quán)利要求4所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是 其中用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的丙烯酰胺凝膠濃度為1 或14%。
8.如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是所述的PCR擴(kuò)增退火溫度為65°C。
9.如權(quán)利要求4所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是所述的PCR擴(kuò)增退火溫度為65°C。
10.如權(quán)利要求7所述的預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，其特征是所述的PCR擴(kuò)增退火溫度為65°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)示和鑒定綿羊毛纖維直徑的分子標(biāo)記選擇方法，主要包括以下步驟根據(jù)綿羊KAP1.1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物；從綿羊血液中提取基因組DNA，利用該引物對(duì)綿羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測出KAP1.1基因外顯子中的60bp和30bp插入/缺失的變異位點(diǎn)；多態(tài)性分析。本發(fā)明操作簡單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行自動(dòng)化檢測。利用本發(fā)明不僅為綿羊育種工作中標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)更為有效、簡便易行的分子標(biāo)記方法，同時(shí)為綿羊的細(xì)度性狀改良提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段，可以加速優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊的育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102363813SQ20111036670
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者馮靜, 劉守仁, 楊華, 楊永林 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院