專利名稱：用于擴(kuò)增的通用緩沖液的制作方法
用于擴(kuò)增的通用緩沖液
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增方法。這樣的方法通常用于研究以及體外診斷測試。在核酸研究和分子診斷領(lǐng)域，從許多來源擴(kuò)增核酸已經(jīng)具有相當(dāng)?shù)闹匾?。核酸擴(kuò)增和檢測的診斷應(yīng)用的實例是諸如人乳頭瘤病毒(HPV)、西尼羅病毒(WNV)等病毒的檢測或獻(xiàn)血中人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)的存在的常規(guī)篩選。此外，所述擴(kuò)增技術(shù)適用于細(xì)菌靶標(biāo)(諸如分枝桿菌或沙眼衣原體和淋病奈瑟球菌)，或腫瘤學(xué)標(biāo)志物的分析。最突出的且廣泛使用的擴(kuò)增技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。其它擴(kuò)增反應(yīng)包括 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、聚合酶連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、Gap-LCR、修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、3SR、NASBA、鏈置換擴(kuò)增 (SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)和Qi3_擴(kuò)增，以及其它。現(xiàn)有的可商業(yè)得到的實驗(尤其是用于診斷)包括為每個實驗優(yōu)化以得到良好測試效率的試劑。本發(fā)明提供了用于測試不同類型的參數(shù)的改良的方法、系統(tǒng)、工藝、試劑盒和試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增可能存在于至少一個流體樣品中的至少第一種和第二種靶核酸的方法。所述方法包括，分別在至少2個反應(yīng)容器中在一定條件下溫育所述核酸和溶液一段時間，所述溶液包含擴(kuò)增劑和對所述第一種或第二種靶核酸特異性的寡核苷酸，其中所述擴(kuò)增劑包含具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，所述時間和條件適合發(fā)生所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶對RNA的轉(zhuǎn)錄。在第一次溫育以后，分別在至少2個反應(yīng)容器中在一定條件下溫育所述靶核酸和溶液一段時間，所述溶液包含擴(kuò)增劑和對所述第一種或第二種靶核酸特異性的寡核苷酸，所述時間和條件足以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，所述擴(kuò)增反應(yīng)指示所述第一種和第二種靶核酸存在與否。在所述方法中，在第一個和在第二個反應(yīng)容器中的溶液包含相同比例的擴(kuò)增劑。 第一種靶核酸的寡核苷酸存在于至少2個反應(yīng)容器的第一個中，且在至少2個反應(yīng)容器的第二個中不存在，第二種靶核酸的寡核苷酸存在于至少2個反應(yīng)容器的第二個中，且在至少2個反應(yīng)容器的第一個中不存在。本發(fā)明也涉及用于分離和擴(kuò)增至少2種不同核酸的系統(tǒng)，所述核酸可以存在于至少一個樣品中。所述系統(tǒng)包括
-分離站(s印aration station)，其構(gòu)造和安排成將所述核酸與其它物質(zhì)分離， -試劑盒，其包含至少一個容器，所述至少一個容器包含含有擴(kuò)增劑的溶液， -第一種溶液，其包含用于擴(kuò)增第一種靶核酸的寡核苷酸， -第二種溶液，其包含用于擴(kuò)增第二種靶核酸的寡核苷酸， -擴(kuò)增站，其包含反應(yīng)容器，
組合包含擴(kuò)增劑的溶液和包含寡核苷酸的第一種或第二種溶液，使得所述反應(yīng)容器包含擴(kuò)增劑、分離的靶核酸和寡核苷酸，其中在包含用于擴(kuò)增第一種靶核酸的寡核苷酸的反應(yīng)容器中和在包含用于擴(kuò)增第二種靶核酸的寡核苷酸的反應(yīng)容器中，擴(kuò)增劑的比例是相同的。本發(fā)明另外涉及用于在分離的反應(yīng)容器中分別逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增至少第一種和第二種靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個容器，其中所述容器包含溶液，所述溶液含有具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，且缺少寡核苷酸。
此外，本發(fā)明涉及用于分別擴(kuò)增至少2種不同靶核酸的方法，所述靶核酸可能存在于至少一個流體樣品中。所述方法包括，提供至少一個容器，所述容器包含溶液，所述溶液用于擴(kuò)增靶核酸，且缺少寡核苷酸。將一定體積的所述溶液轉(zhuǎn)移至至少2個容器，并將特異性地用于擴(kuò)增第一種靶核酸的寡核苷酸加入到第一個所述容器中，并將特異性地用于擴(kuò)增第二種靶核酸的寡核苷酸加入到第二個所述容器中。也可以在加入溶液之前，將寡核苷酸轉(zhuǎn)移至容器中。然后混合容器的內(nèi)容物。然后，將第一個和第二個容器裝載進(jìn)用于自動化擴(kuò)增所述第一種和第二種靶核酸的自動化分析儀中。在該分析儀中，將第一種靶核酸與第一個反應(yīng)容器中的第一個容器的一定體積的混合的內(nèi)容物相組合，并將第二種靶核酸與第二個反應(yīng)容器中的第二個容器的一定體積的混合的內(nèi)容物相組合。該步驟以后，在一定條件下溫育反應(yīng)容器的內(nèi)容物一段時間，所述條件和時間足以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，所述擴(kuò)增反應(yīng)指示所述第一種和第二種靶核酸存在與否。


圖1:在本發(fā)明的實施方案中使用的樣品制備工作流程的示意描述。圖 2:如實施例 1 所述在LightCycler480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE)上進(jìn)行的源自HIV、HBV和CT的靶核酸的擴(kuò)增的生長曲線。在y_軸上指示的“信號”是標(biāo)準(zhǔn)化的熒光信號。χ-軸顯示了各個PCR周期的數(shù)目。沿著對應(yīng)的內(nèi)部對照核酸的生長曲線，顯示了 HIV和HBV的生長曲線。用直線表示各個靶核酸曲線，用虛線表示對照核酸曲線。圖加定性HIV試驗，在用于檢測靶探針的通道中測得。圖2b:定性HIV試驗，在用于檢測對照探針的通道中測得。圖2c:定量HIV試驗，在用于檢測靶探針的通道中測得。圖2d:定量HIV試驗，在用于檢測對照探針的通道中測得。圖加定量HBV試驗，在用于檢測靶探針的通道中測得。圖2f:定量HBV試驗，在用于檢測對照探針的通道中測得。圖2g: CT試驗，在用于檢測靶探針的通道中測得。圖3:分析系統(tǒng)
圖4:具有控制單元的分析系統(tǒng)
圖5:包含試劑盒的系統(tǒng)，所述試劑盒具有含有溶液的容器圖6 根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的一個實施方案具體實施方式
。本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增可能存在于至少一個流體樣品中的至少第一種和第二種靶核酸的方法。所述方法包括，分別在至少2個反應(yīng)容器中在一定條件下溫育所述核酸和溶液一段時間，所述溶液包含擴(kuò)增劑和對所述第一種或第二種靶核酸特異性的寡核苷酸，其中所述擴(kuò)增劑包含具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，所述時間和條件適合發(fā)生所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶對RNA的轉(zhuǎn)錄。在第一次溫育以后，分別在至少2個反應(yīng)容器中在一定條件下溫育所述靶核酸和溶液一段時間，所述溶液包含擴(kuò)增劑和對所述第一種或第二種靶核酸特異性的寡核苷酸，所述時間和條件足以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，所述擴(kuò)增反應(yīng)指示所述第一種和第二種靶核酸存在與否。在所述方法中，在第一個和在第二個反應(yīng)容器中的溶液包含相同比例的擴(kuò)增劑。 第一種靶核酸的寡核苷酸存在于至少2個反應(yīng)容器的第一個中，且在至少2個反應(yīng)容器的第二個中不存在，第二種靶核酸的寡核苷酸存在于至少2個反應(yīng)容器的第二個中，且在至少2個反應(yīng)容器的第一個中不存在。本發(fā)明的一個優(yōu)點是，單個溶液可以用于以足夠的效率擴(kuò)增不同的核酸。這簡化了試驗開發(fā)，因為只需要優(yōu)化核酸(即寡核苷酸和/或?qū)φ蘸怂?。優(yōu)化應(yīng)當(dāng)理解為包括順序優(yōu)化、核酸修飾的優(yōu)化和/或試驗中濃度的優(yōu)化。核酸擴(kuò)增的一種方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其公開在美國專利號4，683，202、 4，683，195,4, 800，159和4，965，188以及其它參考文獻(xiàn)中。PCR通常采用2種或更多種結(jié)合選擇的核酸模板(例如DNA或RNA)的寡核苷酸引物?？捎糜诤怂岱治龅囊锇ㄟ@樣的寡核苷酸，其能夠作為靶核酸的核酸序列內(nèi)的核酸合成的起點。通過常規(guī)方法，可以從限制酶切消化純化引物，或可以合成地生產(chǎn)它。為了擴(kuò)增的最大效率，引物通常是單鏈的，但是引物可以是雙鏈的。首先使雙鏈引物變性(即，處理)，以分離鏈。變性雙鏈核酸的一種方法是通過加熱。“熱穩(wěn)定的聚合酶”是耐熱的聚合酶，即，它是這樣的酶，該酶催化與模板互補的引物延伸產(chǎn)物的形成，且當(dāng)處于高溫實現(xiàn)雙鏈模板核酸的變性所必需的時間時，不會不可逆地變性。通常，合成是在每個引物的3’末端處開始，并在5’至3’方向沿著模板鏈前進(jìn)。熱穩(wěn)定的聚合酶已經(jīng)分離自例如黃棲熱菌(Thermus flavus)、紅棲熱菌(T. ruber)、 嗜熱棲熱菌(Τ. thermophilus)、水生棲熱菌(Τ. aquaticus)、乳棲熱菌(Τ. lacteus)、紅色棲熱菌(Τ. rubens)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、熾熱甲烷嗜熱菌(Methanothermus fervidus)。盡管如此，不耐熱的聚合酶也可以用于PCR試驗中，只要該酶被再補足(r印lenished)。如果模板核酸是雙鏈的，在它可以用作PCR的模板之前，必須分離2個鏈。通過任意合適的變性方法，包括物理的、化學(xué)的或酶的方法，可以實現(xiàn)鏈分離。一種分離核酸鏈的方法包括熱處理核酸，直到它大部分變性(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%變性)。變性模板核酸必需的加熱條件取決于，例如，緩沖鹽濃度和要變性的核酸的長度和核苷酸組成，但是通常是在約90°C至約105°C的范圍內(nèi)一定時間，所述時間取決于諸如溫度和核酸長度等反應(yīng)特征。變性通常進(jìn)行約5秒至9 min0為了不使各個聚合酶(如例如Z05 DNA聚合酶)暴露于這樣的高溫太長時間并從而冒損失功能酶的風(fēng)險，通常使用短的變性步馬聚ο在本發(fā)明的一個實施方案中，變性步驟是最多30秒、最多20秒、最多10秒、最多 5秒、或約5秒。如果通過熱來變性雙鏈模板核酸，將反應(yīng)混合物冷卻至這樣的溫度，該溫度促進(jìn)每種引物與它在靶核酸上的靶序列對合。
用于退火的溫度是約35°C至約70°C、或約45°C至約65°C;或約50°C至約60°C、或約55°C至約58°C。退火時間可以是約10秒至約1 min (例如，約20秒至約50秒；約30 秒至約40秒)。在該背景下，可以有利地使用不同的退火溫度，以便增加各個試驗的包容性 (Inclusivity)0簡而言之，這意味著，在相對低的退火溫度，引物也可以結(jié)合具有單個錯配的靶物，所以也可以擴(kuò)增某些序列的變體。這可能是合乎需要的，例如如果特定生物體具有也應(yīng)當(dāng)被檢測出的已知的或未知的遺傳變體。另一方面，相對高的退火溫度具有提供更高特異性的優(yōu)點，因為向著更高的溫度，引物結(jié)合不精確匹配的靶序列的可能性連續(xù)降低。為了從兩種現(xiàn)象獲益，在本發(fā)明的有些實施方案中，上述的方法有利地包括在不同的溫度退火，或首先在低溫，然后在高溫。例如，如果第一次溫育在55°C進(jìn)行約5個循環(huán)，可以(預(yù)_) 擴(kuò)增非精確匹配靶序列。這之后可以在58°C進(jìn)行例如約45個循環(huán)，在實驗的主要部分中提供更高的特異性。以此方式，不會錯過潛在重要的遺傳變體，同時特異性保持相對較高。然后將反應(yīng)混合物調(diào)整至能提高或優(yōu)化聚合酶活性的溫度，即足以從退火的引物延伸產(chǎn)生與要分析的核酸互補的產(chǎn)物的溫度。該溫度應(yīng)當(dāng)足以從與核酸模板退火的每種引物合成延伸產(chǎn)物，但不應(yīng)高到使延伸產(chǎn)物與其互補模板變性(如，延伸溫度通常為約40°C 至80°C (例如，約50°C至約70°C ；約60°C )。延伸時間可以是約10秒至約5 min、或約15 秒至2 min、或約20秒至約1 min、或約25秒至約35秒。新合成的鏈形成可用于后續(xù)反應(yīng)步驟的雙鏈分子?？筛鶕?jù)需要重復(fù)鏈分離、退火和延伸的步驟，以產(chǎn)生所需量的與靶核酸對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)的限制因素是反應(yīng)中存在的引物、熱穩(wěn)定性酶和核苷三磷酸的量。循環(huán)步驟(即變性、退火和延伸)重復(fù)至少一次。用于檢測時，循環(huán)步驟的數(shù)量取決于例如樣品的性質(zhì)。如果樣品是核酸的復(fù)雜混合物，則需要更多個循環(huán)步驟來擴(kuò)增足夠檢測的靶序列。通常，循環(huán)步驟重復(fù)至少約20次，但可以重復(fù)多至40次、60次或甚至100次。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以進(jìn)行PCR，其中退火和延伸步驟在相同的步驟中進(jìn)行(單步PCR)，或如上所述，在分離的步驟中進(jìn)行(兩步PCR)。使用合適的酶(例如，Z05 DNA聚合酶)一起進(jìn)行退火和延伸(且因而在相同的物理和化學(xué)條件下)，具有節(jié)省每個循環(huán)中的額外步驟的時間的優(yōu)點，且也消除了退火和延伸之間額外的溫度調(diào)節(jié)的需要。因而，單步PCR 會減少各個試驗的總復(fù)雜性。一般而言，更短的總擴(kuò)增時間是更好的，因為減少了等待結(jié)果時間 (time-to-result)，并導(dǎo)致可能更早的診斷。要用于本發(fā)明的背景中的其它核酸擴(kuò)增方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR; Wu D. Y.禾口 Wallace R. B. , Genomics 4 (1989) 560—69 ；禾口 Barany F. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193)；聚合酶連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany F. , PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16) ； Gap-LCR (TO 90/01069)；修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(EP 0439182 A2)， 3SR (Kwoh D. Y.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli J. C.,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; WO 92/08808)， 和NASBA (US 5，130，238)。此外，存在鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、包括實時 TMA 禾PQP-擴(kuò)增(綜述參見例如 Whelen A. C.和 Persing D. H. , Annu. Rev. Microbiol. 50(1996) 349—373; Abramson R. D.禾口Myers Τ. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41-47)。合適的核酸檢測方法是本領(lǐng)域?qū)＜宜阎?，且描述在?biāo)準(zhǔn)教科書中，如Sambrook J.等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989禾口Ausubel F.等人Current Protocols in Molecular Biology 1987，J. Wiley 和 Sons, NY。在進(jìn)行核酸檢測步驟之前，也可以存在其它純化步驟，例如沉淀步驟。檢測方法可以包括、但不限于，特定染料如溴化乙錠的結(jié)合或嵌入，所述溴化乙錠嵌入雙鏈DNA中，且此后改變它的熒光。通過電泳方法，也可以分離純化的核酸，任選地在限制酶切消化以后，并在此后顯影。也存在基于探針的試驗，其利用對特定序列的寡核苷酸雜交，并隨后檢測雜合體。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中或之后，可以檢測擴(kuò)增的靶核酸，以便評價分析結(jié)果。具體地， 對于實時檢測，有利地使用核酸探針。通過使用可商業(yè)得到的實時PCR儀器(例如，LightCycler 或TaqMan )，可將 PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測合并在單個封閉的試管(cuvette)中進(jìn)行，從而顯著縮短循環(huán)時間。由于檢測與擴(kuò)增同時進(jìn)行，該實時PCR方法不需要操作擴(kuò)增產(chǎn)物，并且消除了擴(kuò)增產(chǎn)物之間交叉污染的風(fēng)險。實時PCR極大縮短了周轉(zhuǎn)(turn-around)時間，是非常吸引人的臨床實驗室中的常規(guī)PCR技術(shù)的替代方式。但是，也可以使用技術(shù)人員已知的其它檢測方法?！暗谝环N靶核酸”和“第二種靶核酸”是不同的核酸。本文使用的術(shù)語“流體樣品”包括可以進(jìn)行靶向核酸的診斷試驗的任何流體物質(zhì)， 且通常源自生物源。在有些實施方案中，所述流體樣品源自人，且是體液。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述流體樣品是人血、尿、痰、汗、拭子、可吸量的糞便或脊髓液。本文使用的術(shù)語“反應(yīng)容器”涉及、但不限于試管或平板的孔，諸如微孔 (microwell)、深孔(de印well)或其它類型的多孔板，在其中進(jìn)行分析流體樣品的反應(yīng)，例如逆轉(zhuǎn)錄或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這樣的容器的外邊界或壁是化學(xué)惰性的，使得它們不干擾在其中發(fā)生的分析反應(yīng)。上述的核酸分離也在多孔板中進(jìn)行。在該背景下，在分析系統(tǒng)中的多孔板允許平行分離和分析或儲存多個樣品?？梢詾樽畲笠后w攝取或為最大熱轉(zhuǎn)移，優(yōu)化多孔板。優(yōu)化用于本發(fā)明背景中的多孔板的一個實施方案，以在自動化分析儀中溫育或分離分析物。另一個多孔板被構(gòu)造和安排成接觸磁裝置和/或加熱裝置。在下文中進(jìn)一步描述了多孔板的實施方案?！昂怂帷币约啊鞍泻怂帷笔潜绢I(lǐng)域技術(shù)專家已知的核苷酸的聚合化合物?！鞍泻怂帷?在本文中用于表示樣品中有待分析的核酸，即要測定其在樣品中的存在、不存在和/或量。根據(jù)本發(fā)明，“寡聚的化合物”是由“單體單元”組成的化合物，所述單體單元可以是單獨的核苷酸或非天然化合物(參見下面)，更具體地是單獨的修飾的核苷酸(或核苷酸類似物)或非核苷酸化合物或其組合?！肮押塑账帷焙汀靶揎椀墓押塑账帷?或“寡核苷酸類似物”)是寡聚化合物的亞群。 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“寡核苷酸”表示從多個核苷酸(作為它們的單體單元)形成的組分。通常提及磷酸基形成寡核苷酸的核苷間主鏈。RNA和DNA的正常連接或主鏈?zhǔn)?’至 5’磷酸二酯連接。原則上可以如本領(lǐng)域所述和本領(lǐng)域?qū)＜乙阎?，合成可用于本發(fā)明中的寡核苷酸和修飾的寡核苷酸(參見下面)。制備特定序列的寡聚化合物的方法是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，適當(dāng)序列和直接化學(xué)合成的克隆和限制性酶切?；瘜W(xué)合成方法可以包括， 例如，Narang S. A.等人，Methods in Enzymology 68 (1979) 90-98 中所述的磷酸三酯方法，Brown E. L.，等人，Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151 公開的磷酸二酯方法，在Beaucage等人，^Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859中公開的亞磷酰胺方法，在Garegg等人，Chem. Scr. 25 (1985) 280-282中公開的H-膦酸酯方法，和在US 4，458，066中公開的固體支持物方法。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以化學(xué)地修飾寡核苷酸，即引物和/或探針包括修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。所述探針或引物則是修飾的寡核苷酸。本文使用的術(shù)語“擴(kuò)增劑”涉及能夠擴(kuò)增核酸的化學(xué)或生化組分。這樣的試劑包括、但不限于，核酸聚合酶、緩沖劑、單核苷酸諸如核苷三磷酸、寡核苷酸諸如寡核苷酸引物、鹽和它們各自的溶液、檢測探針、染料和更多。在一個實施方案中，在第一個和在第二個反應(yīng)容器中的溶液包含相同濃度的擴(kuò)增劑。在一個實施方案中，在本文所述的方法中，與其它靶核酸同時擴(kuò)增任一種靶核酸。這是有利的，因為可以平行地分析多個靶物，增加彈性和處理量。在一個實施方案中，通過前文所述的方法，有效地擴(kuò)增任一種靶核酸。這使得增加診斷測試的處理量和彈性成為可能。在本發(fā)明的意義上，“同時地”是指，2個動作(諸如擴(kuò)增第一種和第二種或更多種核酸)同時地且在相同的物理條件下進(jìn)行。在一個實施方案中，在一個容器中同時擴(kuò)增至少第一種和第二種靶核酸。在另一個實施方案中，同時且在相同的物理條件(尤其關(guān)于溫度和溫育時間)下，同時擴(kuò)增用在一個容器中的至少一種核酸和在第二個容器中的至少第二種核酸進(jìn)行。因而，在一個實施方案中，上述方法提供了 1-100 cp/ml或0. 5-50 IU/ml的L0D， 或 1-75 cp/ml 或 0. 5-30 IU/ml 的 L0D，或 1-25 cp/ml 或 1-20 IU/ml 的 L0D。這樣的 LOD 是具有足以用于診斷目的的靈敏測試所必需的?！皺z測限”或“L0D”是指樣品中核酸的最低可檢測量或濃度。低“L0D”對應(yīng)著高靈敏度，反之亦然。“L0D”通常通過單位“cp/ml”來表示，具體地如果核酸是病毒核酸，或表示為IU/ml?！癈p/ml”是指“每毫升的拷貝數(shù)”，其中“拷貝”是各個核酸的拷貝。IU/ml代表 “國際單位/ml，，，是指WHO標(biāo)準(zhǔn)。廣泛使用的計算LOD的方法是“概率單位分析”，它是一種分析刺激(劑量)和量子(全或無)應(yīng)答之間的關(guān)系的方法。在典型的量子應(yīng)答實驗中，給動物組施用不同劑量的藥物。記錄在每個劑量水平的垂死百分比。然后可以使用概率單位分析，分析這些數(shù)據(jù)。 概率單位模型假定，應(yīng)答百分比與對數(shù)劑量有關(guān)，成累積正態(tài)分布。也就是說，對數(shù)劑量可以用作解讀來自累積正態(tài)的垂死百分比的變量。使用正態(tài)分布(而不是其它概率分布)，會影響在可能劑量的高和低末端的預(yù)測應(yīng)答率，但是在中間附近幾乎沒有影響。可以在不同的“命中率”，應(yīng)用概率單位分析。如本領(lǐng)域已知的，通常用百分比[%] 表示“命中率”，并指示在分析物的特定濃度時的陽性結(jié)果的百分比。因而，例如，可以在95% 命中率測定L0D，這意味著，為其中95%的有效結(jié)果是陽性的場合，計算L0D。關(guān)于來自某些病毒的可能靶核酸的一些實施例，在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法會提供下述的L0D:
HIV:最多60 cp/ml、或最多50 cp/ml、或最多40 cp/ml、或最多30 cp/ml、或最多20 cp/ml、或最多 15 cp/ml
HBV:最多 10 IU/ml、或最多 7.5 IU/ml、或最多 5 IU/ml HCV:最多 10 IU/ml、或最多 7.5 IU/ml、或最多 5 IU/ml
WNV I 最多 20 cp/ml、或最多 15 cp/ml、或最多 10 cp/ml
WNV II 最多 20 cp/ml、或最多 15 cp/ml、或最多 10 cp/ml、或最多 5 cp/ml
JEV:最多 100 cp/ml、或最多 75 cp/ml、或最多 50 cp/ml、或最多 30 cp/ml
SLEV 最多100 cp/ml、或最多75 cp/ml、或最多50 cp/ml、或最多25 cp/ml、或最多 10 cp/mlο前文所述的具有LOD的試驗具有下述優(yōu)點，即它們可以用于體外診斷實驗。更高的LOD不夠靈敏。因而，本發(fā)明的一個特殊優(yōu)點是，可以提供適合體外診斷的簡化的靶核酸擴(kuò)增方法，該方法包括通用溶液，所述溶液可以用于擴(kuò)增具有上文所述LOD的本文所述的不同靶核酸。在一個實施方案中，所述靶核酸是RNA。RNA包括、但不限于，病毒RNA。本文公開了非限制性實例。在另一個實施方案中，所述靶核酸是DNA。DNA包括病毒或細(xì)菌DNA。本文描述了非限制性實例。在一個實施方案中，所述第一種和所述第二種靶核酸被富集。本文使用的術(shù)語“富集”涉及處理包含靶核酸的樣品的任意方法，該方法允許將所述靶核酸與樣品中存在的至少一部分其它物質(zhì)分離。“富集”因而可以理解為生產(chǎn)比其它物質(zhì)更高量的靶核酸。存在幾種純化核酸的方法
-序列-依賴性的或生物特異性的方法，例如 親和色譜法 與固定化的探針的雜交 -序列-依賴性的或物理化學(xué)方法，例如 使用例如苯酚-氯仿的液-液萃取法 使用例如純乙醇的沉淀法 使用濾紙的萃取法
使用微團(tuán)形成劑(如鯨蠟基-三甲基-溴化銨)的萃取法 結(jié)合固定化的嵌入染料，例如吖啶衍生物 吸附到硅膠或硅藻土上
在高離液序列條件下，吸附到磁性玻璃顆粒(MGP)或有機(jī)-硅烷顆粒上富集靶核酸的一種方法是使用可從Qiagen (例如定單號158389)商業(yè)得到的 Puregene-試齊Ll盒進(jìn)行富集。“具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶”是能夠基于RNA模板合成DNA的核酸聚合酶。在 RNA已經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA以后，它也能形成雙鏈DNA。在本發(fā)明的一個實施方案中，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶是熱穩(wěn)定的。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括，在至少所有4種天然的或修飾的脫氧核糖核苷三磷酸存在下，在適當(dāng)緩沖液(包括緩沖PH和金屬離子濃度的金屬離子緩沖液) 中，使含有RNA模板的樣品和與所述RNA模板充分互補的寡核苷酸引物一起溫育，以與后者和(在一個實施方案中)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶雜交。在足以使所述引物與所述RNA模板和所述DNA聚合酶雜交的溫度，進(jìn)行該溫育，以催化所述脫氧核糖核苷三磷酸的聚合，形成與所述RNA模板的序列互補的cDNA序列。本文使用的術(shù)語“cDNA”表示使用核糖核酸鏈(RNA)作為模板合成的互補DNA分子。所述RNA可以是例如mRNA、tRNA、rRNA或其它形式的RNA，諸如病毒RNA。所述cDNA可以是單鏈、雙鏈，或可以與互補的RNA分子氫鍵合，如在RNA/cDNA雜合體中。適合與RNA模板退火的引物也可以適用于PCR擴(kuò)增。對于PCR，與逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 鏈互補的第二種引物會提供合成延伸產(chǎn)物的起始位點。在DNA聚合酶對RNA分子的擴(kuò)增中，第一個延伸反應(yīng)是使用RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄，并生成DNA鏈。使用DNA模板的第二個延伸反應(yīng)生成雙鏈DNA分子。因而，DNA聚合酶從RNA 模板合成互補的DNA鏈會提供擴(kuò)增原料。熱穩(wěn)定的DNA聚合酶可以用于偶聯(lián)的單酶逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)。在該背景下，術(shù)語 “均質(zhì)的”表示用于逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增RNA靶物的兩步單添加反應(yīng)。均質(zhì)的是指，在逆轉(zhuǎn)錄(RT) 步驟以后，不需要在擴(kuò)增步驟之前打開反應(yīng)容器或以其它方式調(diào)節(jié)反應(yīng)組分。在非均質(zhì)的 RT/PCR反應(yīng)中，在逆轉(zhuǎn)錄之后和在擴(kuò)增一種或更多種反應(yīng)組分之前，例如調(diào)節(jié)、添加或稀釋擴(kuò)增劑等，為此必須打開反應(yīng)容器，或至少必須操縱它的內(nèi)容物。盡管均質(zhì)的和非均質(zhì)的實施方案都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，RT/PCR的均質(zhì)形式是有利的。逆轉(zhuǎn)錄是RT/PCR中的一個重要步驟。例如，本領(lǐng)域已知，RNA模板會表現(xiàn)出形成第二種結(jié)構(gòu)的傾向，所述第二種結(jié)構(gòu)可能阻礙引物結(jié)合和/或各個逆轉(zhuǎn)錄酶對cDNA鏈的延伸。因而，在轉(zhuǎn)錄效率方面，相對高的RT反應(yīng)溫度是有利的。另一方面，升高溫育溫度也暗示更高的特異性，即RT引物不會退火至表現(xiàn)出與預(yù)期的一個或多個序列的錯配的序列。 具體地，在多個不同靶RNA的情況下，可能也希望轉(zhuǎn)錄和隨后擴(kuò)增和檢測具有單個錯配的序列，例如在流體樣品中可能存在生物體的未知的或罕見的亞系或亞種的情況下。為了從上述優(yōu)點(即第二種結(jié)構(gòu)的減少和具有錯配的模板的逆轉(zhuǎn)錄)獲益，本發(fā)明的一個方面是，在超過一種不同的溫度進(jìn)行RT溫育。因此，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中在步驟d)中，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶的溫育是在30°C -75°C或45°C _70°C或55°C _65°C的不同溫度進(jìn)行。作為逆轉(zhuǎn)錄的另一個重要方面，長的RT步驟可以破壞在流體樣品中可能存在的 DNA模板。如果流體樣品含有RNA和DNA物質(zhì)，因而有利地保持RT步驟的持續(xù)時間盡可能短，但是同時確保合成足夠量的cDNA用于以后的擴(kuò)增和任選的擴(kuò)增物檢測。因而，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中在步驟d)中，所述時間段是最多30 分鐘、20分鐘、15分鐘、12. 5分鐘、10分鐘、5分鐘或1分鐘。本發(fā)明的另一個方面是，上述的方法，其中所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性且包含突變的聚合酶選自
a.CS5 DNA聚合酶
b.CS6 DNA聚合酶
c.海棲熱袍菌(Hiermotogamaritima) DNA 聚合酶
d.水生棲熱菌DNA聚合酶
e.嗜熱棲熱菌DNA聚合酶
f.黃棲熱菌DNA聚合酶
11g.絲狀棲熱菌(Thermusfiliformis) DNA聚合酶
h.棲熱菌屬物種spsl7DNA聚合酶
i.棲熱菌屬物種Z05DNA聚合酶
j.那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana) DNA聚合酶 k.非洲棲熱腔菌(Termosipho africanus) DNA聚合酶 1. Thermus caldophilus DNA 聚合酶
特別適合這些要求的是攜帶在聚合酶結(jié)構(gòu)域中的突變的酶，其在更快的延伸速率的方面增強(qiáng)它們的逆轉(zhuǎn)錄效率。因此，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶是這樣的聚合酶，其包含與各個野生型聚合酶相比賦予提高的核酸延伸速率和/或提高的逆轉(zhuǎn)錄酶活性的突變。在一個實施方案中，在上述的方法中，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶是這樣的聚合酶，其包含與各個野生型聚合酶相比賦予提高的逆轉(zhuǎn)錄酶活性的突變。在WO 2008/046612中，公開了攜帶點突變的聚合酶，所述點突變使它們在本發(fā)明的上下文中是特別有用的。要在本發(fā)明的上下文中使用的有利的聚合酶是突變的DNA聚合酶，其在聚合酶結(jié)構(gòu)域中至少包含下述基序
T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N ；其中)(b7是選自S或T的氨基酸，且其中Xb8是選自G、 T、R、K或L的氨基酸，其中所述聚合酶包含3’ -5’外切核酸酶活性，且與野生型DNA聚合酶相比具有提高的核酸延伸速率和/或提高的逆轉(zhuǎn)錄效率，其中在所述野生型DNA聚合酶中，是選自D、E或N的氨基酸。一個實施例是來自棲熱菌屬物種Z05的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的突變體(例如描述在US 5，455，170中)，所述突變體與各個野生型酶Z05相比，在聚合酶結(jié)構(gòu)域中包含突變。 根據(jù)本發(fā)明的方法的一種突變體是突變型Z05 DNA聚合酶，其中在位置580處的氨基酸選自G、T、R、K 禾口 L。由于將RNA靶核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時保留DNA靶核酸，使得cDNA和DNA都可以用于以后的擴(kuò)增，是在本發(fā)明的范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的方法對于同時擴(kuò)增源自具有RNA的生物體或具有DNA基因組的生物體的靶核酸是特別有用的。該優(yōu)點顯著增加在相同的物理條件下可以分析的不同生物體(尤其是病原體)的范圍。因此，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中所述至少2種靶核酸包括RNA和 DNA。特別地，由于適宜的最適溫度，如Tth聚合酶等酶或上述的突變型Z05 DNA聚合酶適合進(jìn)行擴(kuò)增靶核酸的后續(xù)步驟。采用相同的酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，會促進(jìn)實現(xiàn)該方法的容易度，并促進(jìn)它的自動化，因為在RT和擴(kuò)增步驟之間不需要操作流體樣品。因此，在一個實施方案中，在上述方法中，相同的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶被用于步驟d)和步驟e)中。在一個實施方案中，所述酶是上述的突變型Z05 DNA聚合酶。為了不使在本發(fā)明的上下文中中使用的反應(yīng)混合物的聚合酶或其它組分暴露于高溫比必需更長的時間，在一個實施方案中，在90°C以上的步驟的長度是最多20秒、或最多15秒、或最多10秒、或最多5秒和/或5秒。這也會減少等待結(jié)果時間，并減少試驗所需的總時間。
在這樣的均質(zhì)方案(setup)中，在開始RT和擴(kuò)增之前，可以非常有利地密封反應(yīng)容器，從而減少污染的風(fēng)險。例如，可以如下實現(xiàn)密封通過施加透明的箔材、帽，或?qū)⒂图尤敕磻?yīng)容器中，并形成親脂相，作為在流體頂部的密封層。因而，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其在步驟C)和步驟d)之間另外包含密封至少2個反應(yīng)容器的步驟。擴(kuò)增步驟的靶物可以是RNA/DNA雜種分子。所述靶物可以是單鏈或雙鏈核酸。盡管最廣泛使用的PCR方法使用雙鏈靶物，這不是必要的。在單鏈DNA靶物的第一個擴(kuò)增周期以后，反應(yīng)混合物含有由單鏈靶物和新合成的互補鏈組成的雙鏈DNA分子。類似地，在RNA/ cDNA靶物的第一個擴(kuò)增周期以后，反應(yīng)混合物含有雙鏈cDNA分子。在該點，如上所述進(jìn)行連續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)。由于核酸擴(kuò)增(特別是但不僅在PCR的情況下)如果作為循環(huán)反應(yīng)來進(jìn)行是非常有效的，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中在步驟e)中的擴(kuò)增反應(yīng)由多個循環(huán)步驟組成。在裂解步驟之后的樣品制備步驟中，進(jìn)一步富集目標(biāo)組分。如果非蛋白性的目標(biāo)組分是例如核酸，通常在它們用于基于探針的試驗之前，從復(fù)雜的裂解混合物中提取它們。在一個實施方案中，在前文所述的方法中，在步驟e)和d)之前存在下述步驟。提供多個容器，所述容器含有不同類型的流體樣品。在一定條件下，將固體支持物與容器中多種不同類型的流體樣品組合到一起一段時間，所述條件和時間足以允許包含靶核酸的核酸固定化在固體支持物上。然后在分離站中，將固體支持物與流體樣品中存在的其它物質(zhì)分離開，并如下在分離站中純化核酸通過使流體樣品與固體支持物分離，并用洗滌緩沖液洗滌固體支持物一次或更多次。對于多種不同類型的流體樣品中的任一種，組合固體支持物和多種不同類型的流體樣品的物理條件和時間段是相同的。在本發(fā)明的意義上，核酸的“純化”、“分離”或“提取”涉及下述的在可以在診斷試驗(例如通過擴(kuò)增)中分析核酸之前，它們通常必須從含有不同組分的復(fù)雜混合物的生物樣品中純化、分離或提取出來。對于第一個步驟，可以使用允許核酸富集的方法。本文描述了這樣的富集方法?！跋礈炀彌_液”是用于去除不希望的組分的液體，特別是在純化操作中。這樣的緩沖液是本領(lǐng)域眾所周知的。在核酸純化的上下文中，洗滌緩沖液適合洗滌固體支持物，以便分離固定化的核酸和任意不希望的組分。洗滌緩沖液可以例如含有在緩沖的溶液中的乙醇和/或離液劑(chaotropic agent)，或是沒有上述乙醇和/或離液劑的具有酸性pH的溶液。洗滌溶液或其它溶液經(jīng)常提供為儲備溶液，它們在使用之前必須稀釋。在根據(jù)本發(fā)明的方法中的洗滌要求固體支持物和固定化在其上面的核酸或高或低強(qiáng)度地接觸洗滌緩沖液。不同的方法可能實現(xiàn)該目的，例如沿著各個容器或多個容器或在其中，與固體支持物一起搖動洗滌緩沖液。另一種有利的方法是，抽吸和分配懸浮液一次或更多次，所述懸浮液包含洗滌緩沖液和固體支持物。在一個實施方案中，使用吸量管進(jìn)行該方法，其中所述吸量管包括一次用棄的吸量管尖，其中吸入所述懸浮液，并從它再次分配。這樣的吸量管尖在被拋棄和更換之前可以使用幾次?？捎糜诒景l(fā)明中的一次用棄的吸量管尖具有至少10 μ 、或至少15 μι、或至少100 μι、或至少500 μ 、或至少1 ml、或約1 ml的容積。在本發(fā)明的上下文中使用的吸量管也可以是吸量針。
因而，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中在步驟c中的所述洗滌包括，抽吸和分配包含固體支持物的洗滌緩沖液。具體地，但是不僅對于具有高樣品處理量的臨床實驗室，為從多個不同類型的流體樣品中快速地、容易地且可靠地同時分離多種靶核酸而提供這樣的改良的方法，是非常有利的。包含上述自動化步驟的方法表現(xiàn)出各種優(yōu)點。首先，根據(jù)本發(fā)明的樣品制備方法與例如RNA的逆轉(zhuǎn)錄和靶核酸的擴(kuò)增的自動化方式的組合，會顯著減少手工干預(yù)的需要，并從而減少潛在的污染風(fēng)險。此外，提供了單個過程的可能性，其中多種不同的樣品(即不同的核酸來源)顯著促進(jìn)核酸診斷的總復(fù)雜性的降低。例如，如果必須將不同的方法施用于每類流體樣品，如現(xiàn)有技術(shù)中的情況，樣品制備是遠(yuǎn)遠(yuǎn)更復(fù)雜的、耗時的和資源密集的。最主要的是，必須采用不同的試劑，這導(dǎo)致增加的成本，并阻礙快速且不復(fù)雜的自動化溶液的開發(fā)。根據(jù)本發(fā)明的樣品制備表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)膹椥院凸ぷ髁鞒?，以處理多種不同的樣品類型，它們含有不同類型的核酸，例如DNA和RNA?！じ鶕?jù)本發(fā)明的方法需要明顯更少的實際操作(hands-on)時間，且進(jìn)行的測試比在現(xiàn)有技術(shù)中使用的樣品制備方法更簡單。根據(jù)本發(fā)明的方法會在例如臨床病毒學(xué)中提供主要優(yōu)點，因為它允許平行的樣品制備和在平行的實驗中下游擴(kuò)增幾種病毒。因此，本發(fā)明的一個方面是上述的方法，其中步驟a另外包括通過裂解在多個不同的流體樣品中潛在存在的細(xì)胞和/或病毒衣殼，從它們的細(xì)胞和/或病毒環(huán)境中釋放出核酸。為了釋放細(xì)胞或病毒顆粒的內(nèi)容物，可以用酶或化學(xué)試劑處理它們，以溶解、降解或變性細(xì)胞壁或病毒顆粒。該過程通常稱作裂解。得到的含有這樣的裂解的物質(zhì)的溶液稱作裂解物。經(jīng)常，要分析的核酸不是游離于目標(biāo)流體樣品內(nèi)的溶液中，而是位于密閉的結(jié)構(gòu) (例如細(xì)胞或病毒)中。在診斷試驗中，目的經(jīng)常是具體地鑒別流體樣品(諸如臨床樣品)中的病原性細(xì)胞或病毒。這樣的病原體可以包括，例如RNA病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、西尼羅病毒(WNV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、日本腦炎病毒(JEV)、圣路易腦炎病毒(SLEV)和其它RNA病毒，或DNA病毒如乙型肝炎病毒(HBC)，巨細(xì)胞病毒(CMV) 和其它DNA病毒，或細(xì)菌如沙眼衣原體(CT)、淋病奈瑟球菌(NG)和其它細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的方法可用于從上述以及其它生物體提取核酸。適合裂解細(xì)胞和/或病毒衣殼或類似結(jié)構(gòu)的試劑通常提供在裂解緩沖液內(nèi)。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，上述方法另外包括，在步驟a中，將裂解緩沖液加入多個不同的流體樣品中。由于根據(jù)本發(fā)明的方法在高處理量、效率和并行化方面是特別有利的，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中對于所述多個不同類型的流體樣品的成員，所述裂解緩沖液是相同的。以此方式，進(jìn)一步降低了樣品制備操作的復(fù)雜性，因為不需要為要處理的不同樣品單獨提供不同的裂解試劑。此外，當(dāng)用單一裂解緩沖液進(jìn)行時，可以更容易地控制該過程。例如，可以用多吸量管從單個容器抽吸裂解緩沖液，并隨后同時地分配進(jìn)不同的樣品中。 在本發(fā)明的一個實施方案中，在上述方法中的裂解緩沖液包含一種或更多種選自下述的組分 離液劑 緩沖物質(zhì)
還原劑。離液劑(其通常擾亂溶液中水分子的有序結(jié)構(gòu)以及分子內(nèi)和分子之間的非共價結(jié)合力)可以對樣品制備過程做出幾個貢獻(xiàn)。具體地，但不限于，它們可以作為RNA酶抑制劑來施用，通過擾亂核酸酶的三級結(jié)構(gòu)。通常，不需要將其它的RNA酶抑制劑施用于裂解緩沖液。此外，離液劑會促進(jìn)生物膜(諸如質(zhì)膜或細(xì)胞器的膜，如果存在的話)的破壞。另外，它們可以在核酸與玻璃等表面的粘附結(jié)合中起重要作用(參見下文)。在本發(fā)明的上下文中， 離液劑是胍鹽(如硫氰酸胍或鹽酸胍或胍氯化物或異硫氰酸胍)、脲、高氯酸鹽(諸如高氯酸鉀)、其它硫氰酸鹽或碘化鉀。但是，其它離液劑也可以用于本發(fā)明的范圍內(nèi)。對于維持溶液的特定pH值或PH范圍，緩沖物質(zhì)通常是重要的。這是大多數(shù)生物系統(tǒng)的必要條件，且也是大多數(shù)體外反應(yīng)所需要的。對于本發(fā)明的方法，也可以是有利的。 在裂解緩沖液的上下文中，緩沖液是檸檬酸鹽緩沖液諸如檸檬酸鈉，以及Tris (三_(羥甲基)_氨基甲烷)緩沖液諸如Tris HC1、磷酸鹽、N-(2-羥乙基)-哌嗪4’-(2-乙磺酸) (HEPES),乙酸鹽緩沖液，而且其它緩沖液可以用于本發(fā)明的上下文中。在裂解緩沖液中的醇用于核酸制備的應(yīng)用也可以是有利的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。使用的一種醇是聚多卡醇(polidocanol)，而其它醇也可以用于上述的裂解緩沖液中。在例如EP 1 932 913中，已經(jīng)描述了聚多卡醇用于制備核酸的應(yīng)用。還原劑也可以促進(jìn)不希望的組分(諸如上述的RNA酶A)的變性。具體地，如本領(lǐng)域廣泛已知的，還原劑會切割分子間和分子內(nèi)二硫鍵，所述二硫鍵對于許多蛋白的三級結(jié)構(gòu)是特別重要的。在本發(fā)明的上下文中，實施方案是還原劑諸如二硫蘇糖醇(DTT)，但是本領(lǐng)域已知的其它還原劑(諸如2-巰基乙醇)也可以有利地用于本發(fā)明的上下文中?？紤]到前述內(nèi)容，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中所述裂解緩沖液包含下述組分
硫氰酸胍， 檸檬酸鈉， 聚多卡醇，
DTT0在本發(fā)明的一個實施方案中，裂解緩沖液的上述組分的濃度如下 硫氰酸胍4 M
檸檬酸鈉50 mM 聚多卡醇5%w/v
DTT: 2%w/v0上述裂解緩沖液的pH不限于特定pH值。但是，在一個實施方案中，所述裂解緩沖液具有酸性PH，或5. 5至6. 5、或約5. 8的pH。
用于上述這樣的裂解或樣品制備方法中的酶是切割蛋白底物中的酰胺鍵并歸類為蛋白酶或(互換地)肽酶的酶(參見Walsh, 1979，Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco,第3章)。在現(xiàn)有技術(shù)中使用的蛋白酶包括堿性蛋白酶(W0 98/04730)或酸性蛋白酶(US 5，386，024)。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)在核酸分離中廣泛用于樣品制備的蛋白酶是來自iTritirachium album的蛋白水解酶K (參見例如 Sambrook J.等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)，它在中性 pH 附近是有活性的，且屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知為枯草桿菌蛋白酶的蛋白酶家族。在上述裂解或樣品制備方法中有用的是酶esperase，即一種在高堿性和在高溫保留它的活性的強(qiáng)力蛋白酶。對于純化目的而言特別感興趣的是核酸向玻璃表面的吸附，盡管其它表面是可能的。近年來已經(jīng)提出許多從它們的天然環(huán)境分離核酸的方法，其中利用它們對玻璃表面的結(jié)合行為。如果未修飾的核酸是靶物，核酸與具有二氧化硅表面的材料的直接結(jié)合是有利的，因為除了其它原因以外，核酸不必進(jìn)行修飾，且甚至可以結(jié)合天然核酸。這些方法詳細(xì)描述在各種文件中。例如，在 Vogelstein B.等人，Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-9中，提出了在有碘化鈉存在下使來自瓊脂糖凝膠的核酸結(jié)合到磨碎的火石玻璃上的方法。在Marko Μ. A.等人，Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387 中，描述了在有高氯酸鈉存在下，從玻璃粉上細(xì)菌純化質(zhì)粒DNA。在DE-A 37 34 442中，描述了在玻璃纖維濾器上的單鏈M13噬菌體DNA的分離，其中使用醋酸沉淀噬菌體顆粒，并用高氯酸鹽裂解噬菌體顆粒。洗滌結(jié)合到玻璃纖維濾器上的核酸，然后用含有甲醇的Tris/EDTA緩沖液洗脫。 在 Jakobi R.等人，Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201 中，描述了從 λ 噬菌體純化 DNA的類似方法。該方法需要在高離液序列的鹽溶液中使核酸選擇性地結(jié)合到玻璃表面上， 并使核酸與污染物(諸如瓊脂糖、蛋白或細(xì)胞殘余物)分離。為了使玻璃顆粒與污染物分離， 可以離心顆粒，或通過玻璃纖維濾器抽出液體。這是一個限制步驟，但是，其會阻止該方法被用于處理大量樣品。磁性的多孔玻璃也是可商業(yè)得到的，其含有在多孔的特殊玻璃基質(zhì)中的磁性顆粒，且被覆蓋含有抗生蛋白鏈菌素的層。該產(chǎn)物可以用于分離生物材料，例如， 蛋白或核酸，如果它們在復(fù)雜的制備步驟中被修飾，使得它們共價地結(jié)合生物素。經(jīng)證實， 可磁化的(magnetizable)特殊吸附劑對于自動化樣品制備是非常有效的和合適的。亞鐵磁性和鐵磁性以及超順磁性色素被用于該目的。磁性玻璃顆粒和使用它們的方法是描述在 WO 01/37291中的那些。通過適應(yīng)在所述方法中使用的各個流體樣品的體積，可以進(jìn)一步提高根據(jù)本發(fā)明的方法的彈性。該實施方案聚焦于不同類型的流體樣品的多樣性和在它們中可能存在的生物體和核酸的類型。例如，在全血樣品中的某些病毒可能需要比其它樣品更多的原料，如果已知在這些特定情況下通常僅存在低拷貝數(shù)。因而，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中所述多個不同的流體樣品中的至少一個流體樣品具有不同于其它流體樣品的體積。在一個實施方案中，可替換地或附加地，將不同體積的裂解緩沖液加入所述多個不同的流體樣品中。在另一個實施方案中，當(dāng)所述多個不同的流體樣品中的至少一個流體樣品具有不同于其它流體樣品的體積時，將裂解緩沖液加入樣品中，使得所有樣品在加入以后具有相同的體積。在該實施方案中，甚至更方便地，在不同樣品上同時地進(jìn)行自動化過程。其優(yōu)點是，能夠選擇適當(dāng)?shù)钠鹗俭w積(取決于樣品類型)和具有相同的體積(用于進(jìn)行分離)，并任選地在該方案中組合例如擴(kuò)增和檢測。術(shù)語“固體支持物”包括與核酸的固定化有關(guān)的任一種上述固體材料，例如磁性玻璃顆粒、玻璃纖維、玻璃纖維濾器、濾紙等，同時固體支持物不限于這些材料。本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中所述固體支持物包括核酸結(jié)合顆粒，或選自二氧化硅、金屬、金屬氧化物、塑料、聚合物和核酸的一種或更多種材料。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述固體支持物是磁性玻璃顆粒。在本發(fā)明的上下文中，“固定化”是指以可逆或不可逆的方式捕獲對象，諸如核酸。 具體地，“固定化在固體支持物上”是指，為了它們與任何周圍的介質(zhì)分離的目的，使單種或多種對象與固體支持物結(jié)合，且可以回收，例如通過在更后的時點與固體支持物分離。在該背景下，“固定化”可以包括例如，將核酸吸附到玻璃或上述固體材料的其它合適的表面上。 此外，通過結(jié)合捕獲探針，可以特異性地“固定化”核酸，其中所述核酸通過堿基配對，結(jié)合連接在固體支持物上的基本上互補的核酸。在后一種情況下，這樣的特異性的固定化導(dǎo)致靶核酸的顯著結(jié)合。在前文所述方法的一個實施方案中，步驟d)包括
在至少2個反應(yīng)容器中，使純化的核酸接觸所述擴(kuò)增劑，所述擴(kuò)增劑包含具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，其中至少第一個反應(yīng)容器至少包含所述第一種靶核酸，且至少第二個反應(yīng)容器至少包含所述第二種靶核酸；
在所述反應(yīng)容器中，將所述純化的核酸與所述擴(kuò)增劑一起在一定條件下溫育一段時間，所述條件和時間適合發(fā)生所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶對RNA的轉(zhuǎn)錄。在前文所述的方法的一個實施方案中，對于在第一個和第二個反應(yīng)容器中包含的至少第一種和第二種靶核酸，在步驟d)和e)中的轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的條件是相同的。在本發(fā)明的一個方面，所述第一種和所述第二種核酸存在于至少2個流體樣品中。在本發(fā)明的另一個方面，同時地擴(kuò)增所述第一種和第二種靶核酸。在本發(fā)明的一個方面，用于擴(kuò)增所述第一種靶核酸的反應(yīng)混合物包含優(yōu)化濃度的對所述第一種靶核酸特異性的所述寡核苷酸，且用于擴(kuò)增所述第二種靶核酸的反應(yīng)混合物包含優(yōu)化濃度的對所述第二種靶核酸特異性的所述寡核苷酸。在本文所述方法的一個方面，在用于擴(kuò)增所述第一種靶核酸的反應(yīng)混合物中的對所述第一種靶核酸特異性的寡核苷酸的濃度，與在用于擴(kuò)增所述第二種靶核酸的反應(yīng)混合物中的對所述第二種靶核酸特異性的寡核苷酸的濃度基本上相同。在本文所述發(fā)明的一個方面，所述擴(kuò)增劑也包含內(nèi)部對照(IC)和/或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)0^)。在一個實施方案中，所述IC和/或QS被包含在含有用于擴(kuò)增的酶的溶液中。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于擴(kuò)增內(nèi)部對照(IC)和/或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)tos)的寡核苷酸也包含在所述溶液中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，還個別地優(yōu)化所述內(nèi)部對照(IC)和 /或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)的濃度。在一個實施方案中，對于至少第一種和第二種靶核酸，或?qū)τ诔^2種靶核酸，內(nèi)部對照和/或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)的序列是相同的。在另一個實施方案中，IC和IQS的序列是相同的。該通用內(nèi)部對照(IC)和/或內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)OiS)允許開發(fā)在多個參數(shù)和/或核酸類型上的同時試驗，同時對于所述不同的參數(shù)和/或核酸類型，使用相同的內(nèi)部對照核酸序列。因此，它有助于在不同的水平減少對應(yīng)實驗的總復(fù)雜性例如，僅需要設(shè)計一個內(nèi)部對照核酸序列，并加入到各個擴(kuò)增混合物中，從而節(jié)省設(shè)計和合成或購買多種對照核酸序列的時間和成本?？梢允箚蝹€或多個試驗流線化，并減少操作錯誤的風(fēng)險。另外，在一個試驗中或在相同條件下同時進(jìn)行的平行試驗中采用的不同對照核酸序列越多，它可能導(dǎo)致調(diào)節(jié)各個條件的復(fù)雜性越高。此外，使用適合檢測多個靶核酸的單個對照，所述對照可以從單個來源分配到例如含有所述不同靶核酸的不同容器中。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，單個對照核酸序列也可以用作定性和定量對照。內(nèi)部對照序列選自包含^^ ID No. 45 -48 的組。作為上述對照的另一個優(yōu)點，在加入不同的內(nèi)部對照核酸的情況下，在可能的后續(xù)實驗中檢測特定生物樣品的其它核酸，不需要包括其它樣品制備操作，因為在本發(fā)明中使用的對照可以用于控制不同核酸的擴(kuò)增。因而，加入內(nèi)部對照核酸以后，可以在相同條件下在相同樣品中測試其它參數(shù)。內(nèi)部對照核酸可以是競爭性的、非競爭性的、或部分競爭性的。競爭性的內(nèi)部對照核酸攜帶與靶物基本上相同的引物結(jié)合位點，因而與靶物競爭相同的引物。盡管該原理允許良好地模仿各個靶核酸(由于它們的類似的結(jié)構(gòu))，它可以降低單種或多種靶核酸的擴(kuò)增效率，從而產(chǎn)生更低靈敏度的試驗。非競爭性的內(nèi)部對照核酸具有與靶物不同的引物結(jié)合位點，因而結(jié)合不同的引物。這樣的方案的優(yōu)點包括，反應(yīng)混合物中的不同核酸的單個擴(kuò)增事件可以沒有任何競爭效應(yīng)地彼此獨立地發(fā)生的事實，以及其它優(yōu)點。因而，在試驗的檢測限方面，沒有不良作用發(fā)生，而在競爭性方案中可以發(fā)生該情況。最后，在使用部分競爭性方案的擴(kuò)增中，各種對照核酸和至少一種靶核酸競爭相同的引物，同時至少一種其它的靶核酸結(jié)合不同的引物。上述方法包括每種所述靶核酸和所述內(nèi)部對照核酸的不同引物集合的事實，使得該方法具有相當(dāng)大的彈性。在該非競爭性方案中，不一定象競爭性方案的情況中一樣向?qū)φ蘸怂嶂幸氚形锾禺愋缘慕Y(jié)合位點，避免了上述競爭性方案的缺點。在非競爭性方案中， 內(nèi)部對照核酸具有不同于任何靶序列的序列，以便不競爭它們的引物和/或探針。在一個實施方案中，內(nèi)部對照核酸的序列不同于流體樣品中的其它核酸序列。作為一個實例，如果流體樣品源自人，則內(nèi)部對照核酸不具有也在人類中內(nèi)源地產(chǎn)生的序列。序列的差異因而至少是足夠顯著的，不允許引物和/或探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下結(jié)合各種內(nèi)源核酸(單種或多種)， 從而使得該方案是競爭性的。為了避免這種干擾，在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的內(nèi)部對照核酸的序列源自不同于流體樣品起源的來源。在一個實施方案中，它源自天然存在的基因組。在一個實施方案中，它源自植物基因組，在另一個實施方案中，它源自葡萄基因組。在一個實施方案中，源自天然存在的基因組的核酸是雜亂的(scrambled)。如本領(lǐng)域已知的，“雜亂”是指在某種程度上在序列中引入堿基突變。在一個實施方案中，與它來源的天然存在的基因相比，在本發(fā)明中使用的內(nèi)部對照核酸的序列存在實質(zhì)改變。這具有下述優(yōu)點，即極大地減少了弓丨物和探針與流體樣品中的核酸的交叉反應(yīng)性。
在一個實施方案中，所述IC/IQS是DNA。如果靶核酸是RNA，則IC/IQS是RNA。如果要在上述方法中分析RNA和DNA，則內(nèi)部對照核酸是RNA，因為該內(nèi)部對照核酸會模仿包含多種靶物的試驗的最靈敏的靶物，且RNA靶物通常必須被更緊密地控制。由于RNA比DNA 更易于降解(由于諸如堿性PH、核糖核酸酶等的影響)，在一個實施方案中，由RNA制成的內(nèi)部對照核酸被提供為披甲的(armored )顆粒。在例如EP910643中描述了披甲的顆粒，例如特殊的披甲的RNA。簡而言之，將RNA至少部分地包裹在病毒外殼蛋白中，所述RNA可以化學(xué)地生產(chǎn)，或在一個實施方案中，由例如細(xì)菌(例如大腸桿菌)異源地生產(chǎn)。后者賦予RNA 對外部影響(尤其是核糖核酸酶)的抗性。必須理解，內(nèi)部對照DNA也可以提供為披甲的顆粒。披甲的RNA和DNA都可以用作在本發(fā)明的上下文中的內(nèi)部對照核酸。在一個實施方案中，在大腸桿菌中給RNA對照核酸披被MS2外殼蛋白。在另一個實施方案中，使用λ噬菌體GTl 1，給DNA對照核酸披甲。包括上述自動化步驟的方法也顯示出不同的其它優(yōu)點
在現(xiàn)有技術(shù)中，在單個反應(yīng)容器中在多路試驗中進(jìn)行的不同靶核酸的數(shù)目受到適當(dāng)標(biāo)記的數(shù)目的限制，這已經(jīng)成為一個挑戰(zhàn)。在實時PCR試驗中，例如，熒光染料波譜的潛在重疊對試驗性能具有極大影響(假陽性結(jié)果的風(fēng)險、更低精確度等)。因此，必須小心地選擇各個熒光團(tuán)，且在波譜上較好地分離，以便確保診斷實驗的預(yù)期性能。通常，不同的可用熒光團(tuán)的數(shù)目對應(yīng)著單位(single-digit)數(shù)目的PCR儀器熒光通道。相反，在上述方法中，內(nèi)部控制的至少第一種和第二種靶核酸的擴(kuò)增發(fā)生在至少2 個不同的反應(yīng)容器中，允許同時擴(kuò)增更高數(shù)目的不同的靶核酸，因為不同反應(yīng)容器中的信號可以彼此獨立地檢出。這意味著，在第一個容器(而非第二個容器)中擴(kuò)增第一種靶核酸， 在第二個容器(而非第一個容器)中擴(kuò)增第二種靶核酸。另外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括這樣的實施方案，其中在多個反應(yīng)容器中的一個或更多個中，進(jìn)行多路反應(yīng)，從而增加在相同條件下可以同時擴(kuò)增的靶物的數(shù)目。在這樣的實施方案中，內(nèi)部對照核酸用作容器內(nèi)不同靶核酸以及不同容器中不同靶核酸的對照。因而，本發(fā)明的一個方面涉及上述的方法，其中在相同的反應(yīng)容器中擴(kuò)增至少2 種靶核酸。在其它情況下，可以方便地在第一個反應(yīng)容器中擴(kuò)增第一種、而非第二種靶核酸， 例如取決于樣品和/或目標(biāo)靶核酸(一種或多種)。因此，本發(fā)明的一個實施方案是，上述的方法，其中在第一個反應(yīng)容器中不存在所述第二種靶核酸。具體地，如果流體樣品疑似含有來自不同生物體的靶核酸，或甚至不同的生物體本身，或如果不清楚在所述樣品中可能存在哪種不同的核酸或生物體，本發(fā)明的一個實施方案是，上述的方法，其中所述第一種靶核酸和第二種靶核酸來自不同的生物體。如前所述，上述方法可用于定性地或定量地控制至少第一種和第二種靶核酸的擴(kuò)
+曰O生物樣品中核酸的定性檢測，對于例如識別個體的感染而言是重要的。因此，檢測微生物感染的試驗的一個重要的要求是，避免假陰性或假陽性結(jié)果，因為這樣的結(jié)果幾乎不可避免地在各個患者的治療方面導(dǎo)致嚴(yán)重后果。因而，特別是在基于PCR的方法中，將定性內(nèi)部對照核酸加入檢測混合物中。所述對照對于證實實驗結(jié)果的有效性是特別重要的CN 102399866 A
說明書
17/30
至少在關(guān)于各個靶核酸的陰性結(jié)果的情況下，在給定的場合內(nèi)定性內(nèi)部對照反應(yīng)必須是表現(xiàn)為反應(yīng)性的，即必須檢測出定性內(nèi)部對照，否則實驗本身被視作無效的。但是，在定性方案中，在陽性結(jié)果的情況下，不一定必須檢測出所述定性內(nèi)部對照。對于定性實驗，特別重要的是，確保并因此嚴(yán)格控制反應(yīng)的靈敏度。結(jié)果，定性內(nèi)部對照的濃度必須相對較低，使得即使在例如輕微抑制的情況下，不會檢測到定性內(nèi)部對照，因此實驗被無效化。因而，本發(fā)明的一個方面是，上述的方法，其中所述內(nèi)部對照核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，指示在反應(yīng)混合物中發(fā)生的擴(kuò)增，即使不存在一種或更多種所述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一方面，除了僅僅檢測樣品中核酸的存在與否以外，測定所述核酸的量經(jīng)常是重要的。作為一個實例，基于病毒載量，可以評估病毒病的階段和嚴(yán)重性。此外，任意治療的監(jiān)測需要關(guān)于在個體中存在的病原體的量的信息，以便評價治療的成功。對于定量試驗，必須引入定量標(biāo)準(zhǔn)核酸，用作測定靶核酸的絕對量的參照。通過參照外部校準(zhǔn)，或通過執(zhí)行內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)，可以實現(xiàn)定量。在外部校準(zhǔn)的情況下，使用已知量的相同的或相當(dāng)?shù)暮怂?，在單獨的反?yīng)中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后，通過將用分析的樣品得到的結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)進(jìn)行對比，確定靶核酸的絕對量。但是，外部校準(zhǔn)具有下述缺點，即在對照中未反映可能的提取操作、它的變化的效能和可能的且經(jīng)常不可預(yù)測的抑制擴(kuò)增和/或檢測反應(yīng)的試劑的存在。該情況適用于任何樣品有關(guān)的效應(yīng)。因此，它可能是這樣的情況，其中由于不成功的提取操作或其它基于樣品的因素，樣品被判讀為陰性，然而要檢測和定量的靶核酸實際上存在于樣品中。出于這些和其它原因，加入實驗反應(yīng)本身中的內(nèi)部對照核酸具有優(yōu)點。當(dāng)用作定量標(biāo)準(zhǔn)時，所述內(nèi)部對照核酸在定量實驗中至少具有下述兩種功能
i)它監(jiān)測反應(yīng)的有效性。ii)它用作效價計算的參照，從而補償抑制效應(yīng)，并控制制備和擴(kuò)增過程，以實現(xiàn)更準(zhǔn)確的定量。因此，不同于定性實驗中的定性內(nèi)部對照核酸(其僅在靶物陰性的反應(yīng)中必須是陽性的)，定量實驗中的定量對照核酸具有兩種功能反應(yīng)控制和反應(yīng)校準(zhǔn)。因此，在靶物陰性的和靶物陽性的反應(yīng)中，它必須是陽性的和有效的。它還必須適合提供可靠的參照值，用于計算高核酸濃度。因而，內(nèi)部定量對照核酸的濃度需要相對較高。 在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法被自動化。 本發(fā)明也涉及用于分離和擴(kuò)增至少2種不同核酸的分析系統(tǒng)，所述核酸可能存在于至少一個樣品中，所述分析系統(tǒng)包含
-分離站，其構(gòu)造和安排成將所述核酸與其它物質(zhì)分離，
-試劑盒，其包含至少一個容器(container)，所述至少一個容器包含含有擴(kuò)增劑的溶
液，
-第一種溶液，其包含用于擴(kuò)增第一種靶核酸的寡核苷酸， -第二種溶液，其包含用于擴(kuò)增第二種靶核酸的寡核苷酸， -擴(kuò)增站，其包含反應(yīng)容器(vessel)，
其中組合包含擴(kuò)增劑的所述溶液和包含寡核苷酸的第一種或第二種溶液，使得所述反
2應(yīng)容器包含擴(kuò)增劑、分離的靶核酸和寡核苷酸，其中在包含用于擴(kuò)增第一種靶核酸的寡核苷酸的反應(yīng)容器中和在包含用于擴(kuò)增第二種靶核酸的寡核苷酸的反應(yīng)容器中，擴(kuò)增劑的比例是相同的。在上文中和在下文中描述了所述系統(tǒng)的實施方案。圖5顯示了一個示例性的系統(tǒng) (1020)。所述系統(tǒng)包含試劑盒(1021)，所述試劑盒包含容器(container) (1022)和(1023)， 所述容器包含溶液(1028)和(1029)。容器(1024)包含溶液(1025)，它是含有寡核苷酸的溶液(102 。將來自容器(102 和/或(102 的溶液與溶液(102 相組合。這可以如下實現(xiàn)通過將溶液(102 加入容器(102 或(102 中，然后組合所有溶液，或通過將溶液(1028)和/或(1029)加入反應(yīng)容器(vessel) (1026)中，然后加入溶液(102 。應(yīng)當(dāng)理解，僅將來自容器(1022)、(1023)、(1024)的必要體積加入反應(yīng)容器(1026)中，并非所有它們的內(nèi)容物。在將適當(dāng)體積加入反應(yīng)容器(1026)以后，在擴(kuò)增站(40 中溫育反應(yīng)容器 (1026)。溶液、容器(container)和容器(vessel)的實施方案如本文所述。本發(fā)明的系統(tǒng)的一個優(yōu)點是，不需要象在現(xiàn)有技術(shù)中一樣生產(chǎn)不同的包含擴(kuò)增劑的總體溶液，所述擴(kuò)增劑用于有效地擴(kuò)增不同的靶核酸，具有本文所述的L0D。相反，從相同的總體溶液(單種或多種)，在一個實施方案中，從第一種溶液和第二種溶液，準(zhǔn)備任一種靶核酸的所有擴(kuò)增反應(yīng)。組合的反應(yīng)溶液包含所有必要的擴(kuò)增劑，但是不包含寡核苷酸。然后可以為反應(yīng)溶液中的最佳性能優(yōu)化寡核苷酸。優(yōu)化可以包括設(shè)計寡核苷酸序列，修飾以提高寡核苷酸的性能，和/或優(yōu)化寡核苷酸的濃度，以在通用的反應(yīng)溶液中得到良好性能。 因而，優(yōu)化包括技術(shù)人員眾所周知獲得方法。但是，也可以制備已經(jīng)包含優(yōu)化的寡核苷酸濃度的溶液。如圖5所示，在本發(fā)明的一個方面，試劑盒(1021)至少包含含有第一種溶液的第一個容器(102 和含有第二種溶液的第二個容器(102 。所述試劑盒也可以包含含有其它溶液的其它容器。所述溶液是濃縮的儲備溶液，當(dāng)與包含寡核苷酸和靶核酸的溶液相混合時，其包含擴(kuò)增所述靶核酸必需的所有試劑。本發(fā)明的一個方面也涉及至少包含第一種溶液和第二種溶液的儲備溶液，其中通過混合所述第一種和第二種溶液得到的終濃度適用于擴(kuò)增任一種靶核酸，具有本文公開的 LOD。在一個實施方案中，所述第一種和第二種溶液被用于制備反應(yīng)混合物，分別用于在分離的反應(yīng)容器中檢測不同的靶核酸，其中通過加入對各個靶核酸特異性的寡核苷酸。在一個實施方案中，所述第一種溶液包含Mn2+，有或沒有Mg2+存在。在一個實施方案中，所述第一種溶液包含Mn2+，沒有Mg2+存在。在一個實施方案中，所述第一種溶液由 MnOAc和無活性的補充成分組成。無活性的補充成分被理解為實驗性能非必需的成分。這樣的成分是例如起防腐劑作用的成分。一種無活性的補充成分是NaN3。在該實施方案中， 不存在Mg2+離子。終濃度是從1、或從2、或從3至5、或至4、或至3. 5 mM Mn2+。在一個實施方案中，Mn2+是MnOAc的形式。在一個實施方案中，所述儲備溶液包含含有N-三(羥甲基)甲基甘氨酸 (Tricine)的第二種溶液。對于3 l/3x濃縮的第二種溶液，N-三(羥甲基)甲基甘氨酸的濃度是從100 mM、或從150 mM至300 mM、或至250 mM。在一個實施方案中，所述濃度是 200 mM。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 l/3x濃縮的儲備溶液的濃度。在一個實施方案中，所述第二種溶液不包含Tris。在一個實施方案中，所述儲備溶液另外包含鉀離子。3 1/3 χ濃縮的儲備溶液的濃度是從300 mM、或從350 mM至500 mM、或至450 mM。在一個實施方案中，鉀離子的濃度是 400 mM。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 l/3x濃縮的儲備溶液的濃度。 在一個實施方案中，使用乙酸鉀來提供鉀離子。在一個實施方案中，所述第二種溶液另外包含甘油。3 1/3 χ濃縮的儲備溶液的濃度是從2%、或從5%、或從7%至20%、或至17%、或至15%、或至12%。在一個實施方案中，所述甘油濃度是10%。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 l/3x濃縮的儲備溶液的濃度。在一個實施方案中，所述第二種溶液另外包含DMS0。3 1/3 χ濃縮的儲備溶液的濃度是從5%、或從10%、或從12%、或從17%至30%、或至25%、或至20%。在一個實施方案中， 所述濃度是18%。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 1/3χ濃縮的儲備溶液的濃度。在一個實施方案中，所述第二種溶液另外包含表面活性劑。在一個實施方案中，所述表面活性劑是吐溫或吐溫20。3 1/3 χ濃縮的儲備溶液的濃度是從0.01%、或從0.025% 至0. 1%、或至0. 075%。在一個實施方案中，所述濃度是0. 05%。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 1/3χ濃縮的儲備溶液的濃度。第二種溶液也可以包含NaN3，其在適合保存溶液的濃度。3 1/3 χ濃縮的儲備溶液的濃度是從0. 01%、或從0. 025%至0. 1%、或至0. 075%。在一個實施方案中，所述濃度是 0.09%。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 1/3χ濃縮的儲備溶液的濃度。在一個實施方案中，所述第二種溶液另外包含適體。3 1/3 χ濃縮的儲備溶液的濃度是從0.1 uM、或從0.25 uM、或從0. 5 uM至1 uM、或至0. 8 uM、或至0.75 uM。在一個實施方案中，濃度是0.74 uM。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 l/3x濃縮的儲備溶液的濃度。在一個實施方案中，3 1/3 χ濃縮的第二種溶液的pH是從7.0、或從7. 5、或從8.0 至9.0、或至8. 5、或至8. 2。在一個實施方案中，pH是8. 1。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)pH。在本發(fā)明的一個方面，第二種溶液包含擴(kuò)增必需的核苷酸。在一個實施方案中，所述核苷酸是脫氧核苷酸(dNTP)。在一個實施方案中，所述核苷酸包括dATP、dGTP、dCTP和 dTTP或dUTP，或dATP、dGTP、dCTP和dUTP。在3 1/3 χ儲備溶液中的濃度是從5 mM、或從 4 mM、或從3 mM至0. 5mM、或至ImM、或至2 mM。在一個實施方案中，dATP、dGTP和dCTP的濃度是1333. 33 uM，對于(1^ ，是沈66.67 uM。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 l/3x濃縮的儲備溶液的濃度。在本發(fā)明的一個方面，第二種溶液另外包含用于擴(kuò)增核酸的聚合酶。本文公開了聚合酶的實施方案。3 1/3 χ濃縮的儲備溶液的濃度是從1000 KU/1、或從2000 KU/1或從 2500 KU/1 至 6000 KU/1、或至 5000 KU/1、或至 4000 KU/1。一種濃度是 3000 KU/1。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 l/3x濃縮的儲備溶液的濃度。在本發(fā)明的一個方面，第二種溶液另外包含UNG。3 1/3 χ濃縮的儲備溶液的濃度是從 450 KU/1、或從 500 KU/1、或從 600 KU/1 至 1000 KU/1、或至 800 KU/1、或至 700 KU/1。一種濃度是670 KU/1 UNG。對于濃縮度更高或更低的儲備溶液，相應(yīng)地調(diào)節(jié)3 l/3x濃縮的儲備溶液的濃度。在本發(fā)明的一個方面，第二種溶液另外包含EDTA。包含EDTA的優(yōu)點是，在組合第一種和第二種溶液之前，EDTA會促進(jìn)在第二種溶液中包含的酶的無活性狀態(tài)，這通過絡(luò)合和滅活可能促進(jìn)酶活性的污染來實現(xiàn)。EDTA的濃度是從luM、或從10uM、或從40 uM至200 uM、或至 100 uM、或至 50 uM、或 44 uM。儲備溶液的濃縮度可以是從2 χ、或從3 χ、或從4 χ至20 χ、或至10 χ、或至5 χ。 在一個實施方案中，所述儲備溶液的濃縮度是3 1/3 χ或5 χ。不同儲備溶液的濃縮χ倍也可以是不同的。第二種溶液也可以分入一份或更多份其它儲備溶液中。但是，儲備溶液必須提供上文所述的成分濃度。在一個實施方案中，第一種和第二種溶液和任選的其它溶液的組合由錳2+、N-三 (羥甲基)甲基甘氨酸、鉀離子、甘油、DMS0、吐溫、疊氮化鈉、dNTP、聚合酶、UNG和適體組成。 因而，在任一種儲備溶液中不存在其它成分。在組合不同的儲備溶液和任選的寡核苷酸以后，下述鹽濃度存在于最終的PCR反應(yīng)混合物的一個實施方案中
Mn2+具有從1 mM、或從2 mM、或從2. 5 mM至5 mM、或至4 mM、或至3. 5 mM的終濃度。 一個終濃度是3. 3 mM。甘油具有從1%、或從2%、或從2. 5%至5%、或至4. 5%、或至4%或3. 5%的終濃度。甘油的一個濃度是3%。％應(yīng)當(dāng)理解為％(v/v)。N-三(羥甲基)甲基甘氨酸具有從30 mM、或從40 mM、或從45 mM或50 mM至70 mM、或至65 mM、或至60 mM的終濃度。一個濃度是60 mM N-三(羥甲基)甲基甘氨酸。DMSO具有從0%、或從1%、或從21或3%至6. 5%、或至6%、或至5. 5%的終濃度。一個實施方案是5. 4%的DMSO終濃度。％應(yīng)當(dāng)理解為％(v/v)。K+具有從 80 mM、或從 90 mM、或從 100 mM 或 110 mM 至 150 mM、或至 145 mM、或至 135 mM或125 mM的終濃度。一個K+終濃度是120 mM。一個實施方案是120 mM KOAc的
終濃度。如果選擇在溶液中包含吐溫20，則終濃度是從0%、或從0. 005%、或從0. 015%至 0. 03%、或至0. 025%、或至0. 02%。一種吐溫20濃度是0. 015%。%應(yīng)當(dāng)理解為%(v/v)。反應(yīng)混合物中UNG的含量是每個反應(yīng)從2 U、或從5 U、或從7 U或8 U至20 U、或至15 U、或至12 U。在一個實施方案中，包含10 U/反應(yīng)的UNG。在一個實施方案中，反應(yīng)混合物的體積是50 Ul0從中可以計算其它濃度。在一個實施方案中，在最終反應(yīng)物中的Z05D聚合酶含量是每個反應(yīng)從25 U、或從 30 U、或從35 U或40 U至55 U、或至50 U、或至45 U。在一個實施方案中，所述含量是45 U/反應(yīng)。反應(yīng)混合物的一個實施方案的體積是50 Ul0從中可以計算其它濃度。最終的反應(yīng)液可以另外包含非活性成分，它們例如適合保存儲備溶液，且因而也存在于最終的反應(yīng)混合物中。這樣的非活性成分是，例如，NaN3。本發(fā)明也涉及本文所述的儲備溶液，其另外包含寡核苷酸。寡核苷酸在3 1/3 χ 儲備溶液中的濃度是從0. 1 uM、或從0.沈67 uM至5 uM、或至4 uM。在一個方面，第二種溶液包含優(yōu)化的濃度的寡核苷酸，其用于擴(kuò)增靶物和對照核酸。在另一個方面，第二種溶液包含0.1 uM-4 uM的用于擴(kuò)增和檢測靶核酸的任一種寡核苷酸。在一個實施方案中，所述寡核苷酸濃度是0.05 uM至0.5 uM，或0.3 uM。在一個實施方案中，任一種寡核苷酸的使用濃度是相同的。因而，在一個實施方案中，使用0.3 uM的任一種寡核苷酸。在其它實施方案中，單個地優(yōu)化寡核苷酸濃度，且在0. 025 uM至0.75 uM、或0. 05 uM至0. 5 uM的范圍內(nèi)。如果第二種溶液另外包含寡核苷酸，可以將低濃度的其它成分引入溶液中，諸如濃度低于1 mM、或低于0.5 mM、或等于或小于0.3 mM的Tris。可以引入濃度小于5 uM、或小于 2.5 uM或小于1 uM的EDTA。如果與寡核苷酸一起引入N-三(羥甲基)甲基甘氨酸或鉀離子，則第二種溶液的濃度最初可以與本文所述的濃度相差10%至15%，或包含寡核苷酸的最終儲備溶液可以相差10%至15%。技術(shù)人員會知道如何優(yōu)化要在本發(fā)明的溶液中使用的每種寡核苷酸的濃度。在本發(fā)明的一個方面，第二種溶液另外包含用于檢測內(nèi)部對照核酸的寡核苷酸。 在本文中公開了對照核酸和寡核苷酸的實施方案。如前文所述，優(yōu)化用于檢測內(nèi)部對照的所述寡核苷酸的濃度。前文公開了濃度。在一個實施方案中，所述第二種溶液包含用于檢測內(nèi)部對照核酸的寡核苷酸，其在沒有寡核苷酸存在下用于檢測靶核酸。在前文所述試劑盒的一個實施方案中，所述試劑盒另外至少包含一個容器，所述容器含有對照核酸。本文公開了所述對照核酸的實施方案。在一個實施方案中，所述試劑盒包含一個容器，該容器含有包含DNA的對照核酸，和另一個容器，該容器含有包含RNA的對照核酸。該試劑盒特別適用于同時測試RNA和DNA靶核酸。在前文所述系統(tǒng)的一個方面，在所有反應(yīng)容器中，所述擴(kuò)增劑的濃度是相同的。相同是指，包括20%或15%或10%的差異性。“分離站”是允許將固體支持物與在流體樣品中存在的其它物質(zhì)分離的裝置或分析系統(tǒng)組件。這樣的分離站可以包含，例如，但不限于，離心機(jī)、具有過濾管的支架、磁體或其它適當(dāng)?shù)慕M件。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分離站包含一個或更多個磁體。在一個實施方案中，一個或更多個磁體被用于分離磁性顆粒，例如磁性玻璃顆粒，作為固體支持物。例如，如果將流體樣品和固體支持物一起組合在多孔板的孔中，則通過將磁體引入孔中，可以使分離站所包含的一個或更多個磁體例如接觸流體樣品本身，或可以使所述一個或更多個磁體接近孔的外壁，以便吸引磁性顆粒，并隨后使它們與周圍的液體分離。在本發(fā)明和所述分離站的上下文中，還有用的是，分離和純化核酸的方法。該方法包括，在多孔板的容器中，使核酸結(jié)合磁性顆粒的步驟。所述容器包含頂部開口、中央部分和底部部分。然后當(dāng)液體的主要部分位于容器的圓錐部分被具有矩形形狀的中央部分替換的界面以上時，如下使結(jié)合的物質(zhì)與液體中含有的未結(jié)合的物質(zhì)分離將磁體從第二個位置移動到第一個位置，且在所述第一個位置，將磁場施加于中央部分，并任選地，另外將磁場施加于所述容器的底部部分。任選地，可以用洗滌溶液洗滌磁性顆粒。通過選擇性地施加磁場于所述容器的底部部分，使小體積的液體與所述磁性顆粒分離，其中大部分液體位于容器的圓錐部分被具有矩形形狀的中央部分替換的界面以下?！皵U(kuò)增站”(403)包括用于溫育至少2個反應(yīng)容器的內(nèi)容物的控溫培養(yǎng)箱。它另外包含多個反應(yīng)容器，如試管或平板，在其中發(fā)生分析樣品的反應(yīng)，諸如PCR。這樣的容器的外邊界或壁是化學(xué)惰性的，使得它們不會干擾在其中進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)。為了容易操作和促進(jìn)自動化，至少2個反應(yīng)容器是在一個整體排列中，使得它們可以被一起操作。結(jié)果，本發(fā)明的一個方面是，上述的分析系統(tǒng)，其中至少2個反應(yīng)容器被組合在一個整體排列中。整體排列可以是例如可逆地或不可逆地彼此相連或排列在支架中的管形瓶或試管。在一個實施方案中，所述整體排列是多孔板。在本發(fā)明的一個方面，所述系統(tǒng)另外包含用于擴(kuò)增所述靶核酸的多孔板。在本發(fā)明的一個方面，所述系統(tǒng)另外包含用于分離所述靶核酸的多孔板。在一個實施方案中，在所述系統(tǒng)的各站之間運輸在整體排列中組合的至少2個反
應(yīng)容器。在第二個實施方案中，將純化的靶核酸從所述分離站轉(zhuǎn)移至所述擴(kuò)增站。在一個實施方案中，使用移液器(其包含具有連接的吸量管尖的吸量管)轉(zhuǎn)移包含純化的核酸的液體。在第三個實施方案中，將純化的核酸從所述分離站轉(zhuǎn)移至保留在容納站中的整體排列的反應(yīng)容器中。在一個實施方案中，然后將整體排列中的所述反應(yīng)容器從所述容納站轉(zhuǎn)移至所述擴(kuò)增站。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)另外包含吸量單元。所述吸量單元包含至少一個吸量管或多個吸量管。在一個實施方案中，在一個或更多個整體排列中組合所述多個吸量管，其中所述吸量管可以單個地操作。在本發(fā)明的上下文中使用的吸量管是包含本文所述的吸量管尖的吸量管。在另一個實施方案中，所述吸量管是吸量針。或者，在分離站的樣品制備中使用的且含有包含純化的靶核酸的液體的反應(yīng)容器或反應(yīng)容器排列，可以從分離站轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增站。為此目的，在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)另外包含轉(zhuǎn)移單元。在一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)移單元另外包含機(jī)器人裝置。在一個方面，所述裝置另外包含操縱器。為了在根據(jù)本發(fā)明的方法的上下文中在上面闡述的原因，下面是本發(fā)明的其它方
上述的分析系統(tǒng)(440)，其中至少一個反應(yīng)容器包含RNA靶核酸和DNA靶核酸。
·上述的分析系統(tǒng)040)，其中至少一個反應(yīng)容器包含RNA靶核酸，且至少一個其它反應(yīng)容器包含DNA靶核酸。在一個方面，上述的分析系統(tǒng)040)另外包含一個或更多個選自下述的元件 檢測模塊003)，用于檢測由分析物引起的信號
密封器(410)
試劑和/或可拋棄物的儲存模塊(1008)。·控制單元(1006)，用于控制系統(tǒng)組件。示例性的系統(tǒng)如圖3和4所示?！皺z測模塊”(403)可以是例如光學(xué)檢測單元，其用于檢測擴(kuò)增操作的結(jié)果或效應(yīng)。光學(xué)檢測單元可以包含光源，例如氙燈，光學(xué)器件(諸如反光鏡、透鏡、濾光器、用于引導(dǎo)和過濾光的光纖)、一個或更多個參照通道、或CCD照相機(jī)或不同的照相機(jī)?！懊芊馄鳌?410)被構(gòu)造和安排成密封與根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)聯(lián)合使用的任意容器。這樣的密封器可以是，例如，具有適當(dāng)帽子的密封試管，或具有箔或其它合適的密封材料的多孔板?！皟Υ婺K”(1008)儲存必要的試劑，以實現(xiàn)對于流體樣品的分析而言重要的化學(xué)或生化反應(yīng)。它也可以包含可用于本發(fā)明方法中的其它組分，例如可拋棄物，諸如要用作分離站和/或擴(kuò)增站內(nèi)的反應(yīng)容器的吸量管尖或容器。在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的分析系統(tǒng)另外包含用于控制系統(tǒng)組件的控制單元(圖 4)。這樣的“控制單元”(1006)可以包括軟件，其用于確保所述分析系統(tǒng)的不同組件在正確的時機(jī)正確地工作和交互作用，例如以協(xié)調(diào)的方式移動和操縱組件，諸如吸量管?？刂茊卧部梢园\行實時操作系統(tǒng)(RTOS)的處理器，所述RTOS是預(yù)期用于實時用途的多任務(wù)處理操作系統(tǒng)。換而言之，所述系統(tǒng)處理器能夠管理實時約束，即從事件至系統(tǒng)響應(yīng)的運轉(zhuǎn)期限，無論系統(tǒng)負(fù)載。它實時控制在所述系統(tǒng)內(nèi)的不同單元根據(jù)給出的指令正確地運轉(zhuǎn)和響應(yīng)。顯示在圖3中的示例性的系統(tǒng)表現(xiàn)出下述特征它包含分析儀G00)，所述分析儀具有用于制備樣品的模塊002)、用于處理樣品的模塊001)、用于擴(kuò)增的模塊(403)和轉(zhuǎn)移模塊004)。它另外包含液體處理模塊(500)。用于制備樣品的模塊(40 包含容納站 (470) 0用于處理樣品的模塊(401)包含容納(holding)站070)、處理站或分離站(201、 230)、容納站(330)、加熱裝置(128)和密封站(128) 0用于擴(kuò)增的模塊(403)包含培養(yǎng)箱 (405)。所述分析儀(400)另外包含在模塊(401)和模塊(40 之間的氣塞(460)。這些特征中的一些也顯示在圖4所示的示例性的系統(tǒng)中。在圖4中，用于制備樣品的模塊(402)另外包含用于容納尖支架(70)的托架(1007)，所述尖支架容納吸量管尖頭(3，4)。它另外包含用于容納深孔板(101)的托架(1007)，所述深孔板包含可以向其中加入液體樣品(1011) 的貯器(rec印tele) (103)。它也包含支架(100 的托架(1003)，所述支架包含含有液體樣品(1010)的第一個貯器(1001)。用于制備樣品的模塊002)另外包含第一種吸量裝置 (700)，其受第一種處理器(1004)控制。用于處理樣品的模塊(401)包含分離站001)或加熱裝置(1 )，其包含處理平板(101)。處理平板(101)包含貯器(103)。它也包含容納站G70)，其容納包含吸量管尖頭(3、4)的吸量管尖頭支架070)。用于處理樣品的模塊 (401)另外包含吸量裝置(35)，其受第二個處理器(100 控制。分析系統(tǒng)(440)包含分析儀(400)和控制單元(1006)，所述控制單元控制第一個處理器(1004)和第二個處理器 (1005)。此外，所述分析儀(400)包含轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(480)。在一個方面，本發(fā)明涉及用于分別擴(kuò)增至少2種靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個容器，其中所述容器包含用于分別擴(kuò)增至少2種不同靶核酸中的任一種的溶液。容器(1022、1023、1024)是用于容納液體的任意類型的儲存容器。在一個實施方案中，所述試劑盒包含至少2個容器，其中第一個容器含有第一種溶液，第二個容器含有第二種溶液，它們用于制備組合溶液，用于分別擴(kuò)增至少2種靶核酸中的任一種。在一個實施方案中，所述第一種溶液包含至少一種擴(kuò)增核酸必需的鹽，所述第二種溶液至少包含用于擴(kuò)增核酸和dNTP的酶。本發(fā)明也涉及包含第一個容器(102 和第二個容器(102 的試劑盒(1021)，所
26述第一個容器含有Mn2+離子或MnAc的溶液，所述第二個容器含有用于擴(kuò)增核酸的酶。在一個方面，所述第二個容器另外包含dNTP。溶液的其它實施方案如前文所述。在另一個方面，本發(fā)明涉及擴(kuò)增可能存在于至少一個流體樣品中的至少一個靶核酸的方法，所述方法包括
提供至少一個容器，該容器含有用于擴(kuò)增所述靶核酸的溶液， 向所述溶液中，加入特異性地擴(kuò)增所述靶核酸的寡核苷酸， 將所述靶核酸與所述溶液和所述寡核苷酸相組合，
在一定條件下，在反應(yīng)容器中溫育所述靶核酸、所述溶液和所述寡核苷酸一段時間，所述條件和時間足以發(fā)生指示所述靶核酸存在與否的擴(kuò)增反應(yīng)。在一個方面，第一個容器含有第一種溶液，該溶液包含至少一種擴(kuò)增核酸必需的鹽，且其中第二個容器含有第二種溶液，該溶液包含擴(kuò)增核酸必需的酶和脫氧核苷酸，其中在所述反應(yīng)容器中組合所述第一種和所述第二種溶液，以得到所述溶液。根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的一個實施方案如圖6所示。包含在容器(1022)和/或
(1023)中的第一種和/或第二種溶液(10觀、1029)包含擴(kuò)增必需的所有試劑，但是不包含寡核苷酸。將溶液(1028)和/或(1029)與寡核苷酸溶液(102 相組合，后者包含在容器
(1024)中。在容器(1026)中組合溶液，從而組成溶液(1027)。然后將溶液(1027)轉(zhuǎn)移至容器(1030)。該容器設(shè)計成裝載進(jìn)分析儀(400)中。在本方法中，將容器(1030)裝載進(jìn)分析儀G00)中。所述溶液的其它實施方案如前文所述。現(xiàn)在，使用下面的非限制性實施例來例證本發(fā)明 實施例。根據(jù)各個生產(chǎn)商的說明書，使用在下表中列出的儀器
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增可能存在于至少一個流體樣品中的至少第一種和第二種靶核酸的自動化的方法，所述方法包括下述步驟d)分別在至少2個反應(yīng)容器中在一定條件下溫育所述核酸和溶液一段時間，所述溶液包含擴(kuò)增劑和對所述第一種或第二種靶核酸特異性的寡核苷酸，其中所述擴(kuò)增劑包含具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，所述時間和條件適合發(fā)生所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶對 RNA的轉(zhuǎn)錄，e)分別在所述至少2個反應(yīng)容器中在一定條件下溫育所述靶核酸和所述溶液一段時間，所述溶液包含擴(kuò)增劑和對所述第一種或第二種靶核酸特異性的寡核苷酸，所述時間和條件足以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，所述擴(kuò)增反應(yīng)指示所述第一種和第二種靶核酸存在與否，其中在所述第一個和在所述第二個反應(yīng)容器中的所述溶液包含相同比例的擴(kuò)增劑，且其中用于所述第一種靶核酸的寡核苷酸存在于所述至少2個反應(yīng)容器的第一個中，且在所述至少2個反應(yīng)容器的第二個中不存在，用于所述第二種靶核酸的寡核苷酸存在于所述至少2個反應(yīng)容器的第二個中，且在所述至少2個反應(yīng)容器的第一個中不存在。
2.如權(quán)利要求1所述的自動化的方法，其中在所述第一個和在所述第二個反應(yīng)容器中的所述溶液包含相同濃度的擴(kuò)增劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的自動化的方法，其中所述靶核酸是RNA。
4.如權(quán)利要求1或2所述的自動化的方法，其中所述靶核酸是DNA。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的自動化的方法，其中在步驟e)和d)之前存在下述步驟al.提供多個容器，所述容器包含不同類型的流體樣品，a2.在一定條件下，將固體支持物與所述多個容器中所述多種不同類型的流體樣品組合到一起一段時間，所述條件和時間足以允許包含靶核酸的核酸固定化在固體支持物上，b.在分離站中，將固體支持物與流體樣品中存在的其它物質(zhì)分離開，c.如下在分離站中純化核酸通過使流體樣品與固體支持物分離，并用洗滌緩沖液洗滌固體支持物一次或更多次，其中對于多種不同類型的流體樣品中的任一種，在步驟a2中的條件和時間段是相同的。
6.如權(quán)利要求4-5中任一項所述的方法，其中對于在所述第一個和第二個反應(yīng)容器中包含的至少第一種和第二種靶核酸，在步驟d)和e)中的轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的條件是相同的。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中在分離的容器中同時擴(kuò)增所述第一種和第二種靶核酸。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中用于擴(kuò)增所述第一種靶核酸的反應(yīng)混合物包含優(yōu)化濃度的對所述第一種靶核酸特異性的所述寡核苷酸，且用于擴(kuò)增所述第二種靶核酸的反應(yīng)混合物包含優(yōu)化濃度的對所述第二種靶核酸特異性的所述寡核苷酸。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中在用于擴(kuò)增所述第一種靶核酸的反應(yīng)混合物中的對所述第一種靶核酸特異性的寡核苷酸的濃度，與在用于擴(kuò)增所述第二種靶核酸的反應(yīng)混合物中的對所述第二種靶核酸特異性的寡核苷酸的濃度基本上相同。
10.用于分離和擴(kuò)增至少2種不同核酸的分析系統(tǒng)，所述核酸可能存在于至少一個樣品中，所述分析系統(tǒng)包含-分離站，其構(gòu)造和安排成將所述核酸與其它物質(zhì)分離，-試劑盒，其包含至少一個容器，所述至少一個容器包含含有擴(kuò)增劑的溶液，-第一種溶液，其包含用于擴(kuò)增第一種靶核酸的寡核苷酸，-第二種溶液，其包含用于擴(kuò)增第二種靶核酸的寡核苷酸，-擴(kuò)增站，其包含反應(yīng)容器，其中組合包含擴(kuò)增劑的所述溶液和包含寡核苷酸的所述第一種或第二種溶液，使得所述反應(yīng)容器包含擴(kuò)增劑、分離的靶核酸和寡核苷酸，其中在包含用于擴(kuò)增第一種靶核酸的寡核苷酸的反應(yīng)容器中和在包含用于擴(kuò)增第二種靶核酸的寡核苷酸的反應(yīng)容器中，擴(kuò)增劑的比例是相同的。
11.如權(quán)利要求10所述的系統(tǒng)，其中所有反應(yīng)容器中所述擴(kuò)增劑的濃度是相同的。
12.用于在分離的反應(yīng)容器中分別逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增至少第一種和第二種靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個容器，其中所述容器包含溶液，所述溶液含有具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶，且缺少寡核苷酸。
13.用于分別擴(kuò)增至少2種不同靶核酸的方法，所述靶核酸可能存在于至少一個流體樣品中，所述方法包括，a)提供至少一個容器，所述容器包含溶液，所述溶液用于擴(kuò)增靶核酸，且缺少寡核苷酸，b)將一定體積的所述溶液轉(zhuǎn)移至至少2個容器，c)將特異性地用于擴(kuò)增第一種靶核酸的寡核苷酸加入到第一個所述容器中，并將特異性地用于擴(kuò)增第二種靶核酸的寡核苷酸加入到第二個所述容器中，d)混合所述容器的內(nèi)容物，e)將所述第一個和第二個容器裝載進(jìn)用于自動化擴(kuò)增所述第一種靶核酸的自動化分析儀中，f)將所述第一種靶核酸與第一個反應(yīng)容器的所述第一個容器中的一定體積的所述混合的內(nèi)容物相組合，并將所述第二種靶核酸與第二個反應(yīng)容器中的所述第二個容器的一定體積的所述混合的內(nèi)容物相組合，g)在步驟f)以后，在一定條件下溫育所述第一個和第二個反應(yīng)容器的內(nèi)容物一段時間，所述條件和時間足以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，所述擴(kuò)增反應(yīng)指示所述第一種或第二種靶核酸存在與否，其中在步驟c)之前或之后進(jìn)行步驟b)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，另外包括，在步驟d)之后，將所述第一個容器的混合的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至第一個試劑容器，并將所述第二個容器的混合的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至第二個試劑容器，且在步驟f)中，將包含第一個和第二個容器的混合的內(nèi)容物的所述第一個和第二個試劑容器裝載進(jìn)所述自動化分析儀中。
全文摘要
本發(fā)明涉及在單獨的反應(yīng)容器中擴(kuò)增第一種和第二種靶核酸的方法，其中所述反應(yīng)容器包含溶液，該溶液包含擴(kuò)增劑和對所述第一種或所述第二種靶核酸特異性的寡核苷酸，其中所述溶液與用于擴(kuò)增所述第一種靶核酸和所述第二種靶核酸的溶液相同。
文檔編號C12Q1/68GK102399866SQ20111026183
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者齊默曼 D., 萊英 H. 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司