專利名稱：直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品發(fā)酵劑的制備工藝，特別是直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑的制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
果蔬醋是以果蔬(柑橘、蘋果、梨、蘿卜等)或果蔬加工下腳料為主要原料，利用現(xiàn)代生物技術(shù)釀制而成的一種營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸性調(diào)味品和營(yíng)養(yǎng)健康飲料。它兼有果蔬和食醋的營(yíng)養(yǎng)保健功能，是集營(yíng)養(yǎng)、保健、食療等功能為一體的新型飲品。現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，果醋具有多種生理功能(1)能促進(jìn)新陳代謝，調(diào)節(jié)酸堿平衡，消除疲勞；( 具有降血脂、降低膽固醇的作用；C3)能提高機(jī)體的免疫力，具有防癌抗癌作用；(4)可促進(jìn)血液循環(huán)，降壓作用；(5)抑制血糖升高的作用；(6)開胃消食、解酒保肝的作用；(7)抗菌消炎、防治感冒的作用；(8)開發(fā)智力的作用；(9)美容護(hù)膚、延緩衰老的作用；(10)減肥作用。目前世界食醋年產(chǎn)量25億升，其中我國(guó)是生產(chǎn)消費(fèi)大國(guó)，年產(chǎn)量4億升，歐美果醋生產(chǎn)消費(fèi)高于亞洲，以蘋果醋、葡萄醋為主。我國(guó)是食醋生產(chǎn)和消費(fèi)最多的國(guó)家之一， 但果醋生產(chǎn)量很小，十多年來(lái)國(guó)內(nèi)研究并開發(fā)了系列果醋如蘋果醋、柑桔醋、葡萄醋、梨醋寸。醋酸發(fā)酵目前一般采用繼代式液體培養(yǎng)方法接種或醋醅接種，工藝繁雜，菌種易退化和遭受雜菌污染，影響醋酸發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性。直投式濃縮固態(tài)發(fā)酵劑菌種活力強(qiáng)，濃度高，菌數(shù)能高達(dá)109_12 Cfu/g，在生產(chǎn)時(shí)可以直接接種，無(wú)須中間繼代培養(yǎng)過(guò)程，使用方便， 發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，是一類新型的商品化生產(chǎn)菌種。商品化生產(chǎn)的直投式發(fā)酵劑可以直接供應(yīng)給中小型企業(yè)使用，企業(yè)可以省去菌種生產(chǎn)車間，減少投資，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，避免因技術(shù)力量不足而造成的菌種污染和退化的問(wèn)題。更重要的是直投式發(fā)酵劑的生產(chǎn)和應(yīng)用促使生產(chǎn)專業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。國(guó)外對(duì)于發(fā)酵劑的研究開始較早，早在19世紀(jì)末20世紀(jì)初，西方科學(xué)家就開始研制濃縮發(fā)酵劑，到現(xiàn)在發(fā)酵劑已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。例如丹麥hansen公司、美國(guó)marshell 公司和mauri. food公司、澳大利亞csiro研究所、荷蘭nizo研究所，它們生產(chǎn)的發(fā)酵劑性能優(yōu)良、品種多樣。1988年底漢森公司開發(fā)的樸-Flex酸奶發(fā)酵劑，可直接入罐生產(chǎn)， 有多種型號(hào)，乳品廠可依據(jù)當(dāng)?shù)叵M(fèi)者嗜好選購(gòu)能生產(chǎn)不同酸度、風(fēng)味、粘度的酸奶發(fā)酵劑。另外漢森公司還開發(fā)出含雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的直接使用型AB發(fā)酵劑，極大的方便了功能性發(fā)酵乳的生產(chǎn)。我國(guó)的干燥發(fā)酵劑研究亦起步較晚，目前直投式發(fā)酵劑主要應(yīng)用酸奶及泡菜的發(fā)酵。1992年于景華對(duì)噴霧法生產(chǎn)酸奶粉的工藝進(jìn)行了研究，1988年無(wú)錫輕工學(xué)院徐心軍運(yùn)用冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑，1998年北京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)系開始高效濃縮嗜熱鏈球菌W AerffloMi^z1S)和保加利亞乳桿菌(Z. ^/^aricm)的研究。1991年，內(nèi)蒙古輕工研究所高松柏等首次發(fā)表了高效嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑的研究報(bào)告，利用緩沖鹽進(jìn)行了嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)，使培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)達(dá)到6. 5X IO9個(gè)/mL，然后經(jīng)離心，加保護(hù)劑， 真空冷凍干燥后，細(xì)胞總數(shù)達(dá)8.3X109f/g。1995年，黑龍江應(yīng)用微生物研究所劉宇峰等利用碳酸鈣作為緩沖劑的脫脂乳培養(yǎng)酸奶發(fā)酵劑，菌體濃度可達(dá)5. 6 X IO9個(gè)/mL，然后高速冷凍高速冷凍離心得菌體，真空凍干后，活菌數(shù)達(dá)4.2X109個(gè)/g。另外，無(wú)錫輕工大學(xué)的呂兵等研制出了具有不同粘度、風(fēng)味和保健功能的新型酸奶發(fā)酵劑，同時(shí)還對(duì)凍干過(guò)程乳酸菌保護(hù)劑的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，為篩選高效保護(hù)劑提供了很好的理論基礎(chǔ)。2006 年，西南大學(xué)食品學(xué)院賀稚非等人對(duì)泡菜活性直投式乳酸菌發(fā)酵劑的進(jìn)行了研究。目前直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑尚屬空白，隨著人們營(yíng)養(yǎng)保健意識(shí)的增強(qiáng)，果蔬醋需求將大大增加，直投式果蔬醋酸發(fā)酵劑使用是一個(gè)必然趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于果蔬醋的發(fā)酵生產(chǎn)的直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑及其制備方法。本發(fā)明方法包括以下步驟
1、菌種采用醋酸桿菌，在種子培養(yǎng)基中添加果汁，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌；
2、菌種培養(yǎng)
a、種子培養(yǎng)
一級(jí)種子培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖1.0 % 3.0 %、酵母膏0.5 % 1.5 %、碳酸鈣0.5 % 2.0 %、酒精1.0 % 4.0 %取料，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中， 水定容至1000 mL, pH值自然pH4. 5 6. 5 ；然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)基于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻至30 ；34 °C，接入醋酸菌試管斜面菌種，在32 34 °C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)，得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌；
b、發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖1. 0 % 3. 0 %、柑橘汁20 % 50 %、黃豆芽汁2. 0 % 8. 0 %、食用酒精 2. 0 % 6. 0 %，pH4. 5 6. 5 ；
培養(yǎng)條件培養(yǎng)基于100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻至30 ；34 V。接入經(jīng)種子培養(yǎng)制得的液體醋酸菌種5 10 %，在32 34 V下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)；
3、菌體收集將上述醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體，制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆茫?br> 4、干燥在-20 -350C冷柜中預(yù)凍12 M小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥 16 24小時(shí)，即得。本發(fā)明在種子培養(yǎng)過(guò)程中增加二級(jí)種子擴(kuò)培步驟采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，按重量百分比添加3.0 %食用酒精，冷卻至30 34 °C;按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 0C下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。
本發(fā)明所述的醋酸桿菌ASl. 41或滬釀1.01經(jīng)醋酸菌種子培養(yǎng)基按重量百分比添加10 % 30 %果汁，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化獲得。本發(fā)明在冷凍干燥之前，在所述醋酸菌懸液按重量百分比添加脫脂奶粉5 % 20 %或麥芽糊精2 % 10 %或β-環(huán)狀糊精2 % 10%或海藻糖1 % 8 %或蔗糖1 % 8 %之一種以上。本發(fā)明所述果汁為柑橘汁或蘋果汁。本發(fā)明方法具備以下優(yōu)點(diǎn)1、菌數(shù)高，菌種活力強(qiáng)，菌數(shù)能高達(dá)IO9 cfu/g以上。 2、使用方便，簡(jiǎn)化果蔬醋生產(chǎn)工藝，有利果蔬醋生產(chǎn)專業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化。生產(chǎn)時(shí)無(wú)須中間繼代培養(yǎng)菌種，可以直接接種，使用方便，發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。3、商品化生產(chǎn)的直投式果蔬醋酸發(fā)酵劑使用，可以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，促進(jìn)果蔬醋生產(chǎn)專業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1
(一)菌種采用醋酸桿菌ASl. 41，在種子培養(yǎng)基中添加10 % 30 %果汁，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖10克、酵母膏12克、碳酸鈣15克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，每瓶按重量百分比3. 0 %添加食用酒精(含量> 95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 24小時(shí)，得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，按重量百分比添加3.0 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 ；34 °C。按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖1.0 %、柑橘汁30 %、黃豆芽汁6.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量4.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入5 10 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 0C下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入10 % 30 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉15%、麥芽糊精8 %、β -環(huán)狀糊精6%、海藻糖1 %、蔗糖1 %做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 對(duì)小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。應(yīng)用實(shí)例一利用本發(fā)明方法制得的發(fā)酵劑釀造柑橘果醋
(1)選擇柑橘；⑵清洗去雜；⑶去皮；⑷榨汁去除渣子和種子；(5)果汁過(guò)濾、澄清； (6)果汁巴氏殺菌后冷卻至25 30 °C，以每100千克果汁加10 25克酒精干酵母，(7)裝入發(fā)酵罐進(jìn)行酒精發(fā)酵，在25 30。C溫度下，發(fā)酵5 7天；(8)將發(fā)酵好的果酒注入果醋發(fā)酵罐內(nèi)(罐內(nèi)有攪拌機(jī)和空氣注入管)，以每100千克果酒加入固態(tài)果醋發(fā)酵劑15 30克；發(fā)酵溫度控制30 34 °C，進(jìn)行攪拌和通入無(wú)菌空氣，發(fā)酵時(shí)間為3 5天；(9)中止發(fā)酵；(10)將發(fā)酵好的果醋注入陳釀罐內(nèi)陳釀菌4 6個(gè)月； (11)澄清、過(guò)濾；(1 灌裝、包裝。應(yīng)用實(shí)例二、利用本發(fā)明方法制得的發(fā)酵劑釀造柑橘果醋
(1)選擇柑橘；(2)清洗去雜；(3)去皮；(4)榨汁去除渣子和種子；(5)果汁過(guò)濾、澄清；(6)加入黃豆芽汁2.0 % 5.0 %，巴氏殺菌后冷卻至30 34 °C，以每100千克果汁加4 6千克食用酒精，(7)注入果醋發(fā)酵罐內(nèi)(罐內(nèi)有攪拌機(jī)和空氣注入管)，以每 100千克果酒加入固態(tài)果醋發(fā)酵劑15 30克；發(fā)酵溫度控制30 34 °C，進(jìn)行攪拌和通入無(wú)菌空氣，發(fā)酵時(shí)間為3 5天；(8)中止發(fā)酵；(9)將發(fā)酵好的果醋注入陳釀罐內(nèi)陳釀4 6個(gè)月；(10)澄清、過(guò)濾；(11)灌裝、包裝。實(shí)施例2
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加10 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖30克、酵母膏5克、碳酸鈣20克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌20分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量1.0 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟 (一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在34。C下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125。C 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量> 95%)， 冷卻至30 ；34 °C。按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 ；34 V 下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖3.0 %、柑橘汁50 %、黃豆芽汁8.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6. 5)。100 110°C下滅菌10分鐘，冷卻后按添加總重量6.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入10 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 0C下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的30 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間按重量百分比補(bǔ)入10 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥
在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉20%、麥芽糊精10 %、β-環(huán)狀糊精洲、 海藻糖8%、蔗糖8 %做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 24小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例3
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加30 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖15克、酵母膏15克、碳酸鈣18克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量1.0 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)， 得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入5 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的30 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖2.0 %、柑橘汁20 %、黃豆芽汁2.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量2.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入8 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入15 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 ！下保存?zhèn)溆谩?五)干燥在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉5%、麥芽糊精2%、 3-環(huán)狀糊精洲、海藻糖5 %、蔗糖2 %做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 24小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。
實(shí)施例4:
(一)菌種采用醋酸桿菌ASl. 41，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加15 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖10克、酵母膏12克、碳酸鈣5克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量2.0 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)， 得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 ；34 °C。按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 ；34 V 下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的25 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖1.0 %、柑橘汁40 %、黃豆芽汁5.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量5.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入8 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的觀 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入10 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥
在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉16%、麥芽糊精8 %、β-環(huán)狀糊精10%、 海藻糖5 %、蔗糖5%做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 24小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例5
(一)菌種采用醋酸桿菌ASl. 41，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加25 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖28克、酵母膏10克、碳酸鈣15克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)， 得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。
2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入6 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的15 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖2.0 %、柑橘汁35%、黃豆芽汁6.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量4.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入5 10 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 0C下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的觀％，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入25 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥
在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉18%、麥芽糊精6 %、β -環(huán)狀糊精6%、海藻糖6 %做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 24小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例6
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加20 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖20克、酵母膏8克、碳酸鈣10克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量1.5 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)， 得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 ；34 °C。按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 ；34 V 下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的22 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖2.5 %、柑橘汁45 %、黃豆芽汁7.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量3. 5 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入6 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入18 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 ！下保存?zhèn)溆谩?五)干燥在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉12%、麥芽糊精7%、 旦-環(huán)狀糊精5%、蔗糖2 %做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 24小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 M小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例7
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加30 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖12克、酵母膏13克、碳酸鈣16克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量1.5%食用酒精(含量> 95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)，得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3. 0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入6 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的22 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖3.5 %、柑橘汁25%、黃豆芽汁3.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4.5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量3.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入6 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34。C下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20%，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入20 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥
在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉17%、麥芽糊精9 %、β -環(huán)狀糊精3%做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 對(duì)小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。
實(shí)施例8
(一)菌種采用醋酸桿菌ASl. 41，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加22 %的蘋果汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖30克、酵母膏15克、碳酸鈣20克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3. 5 %食用酒精(含量>95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)，得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 ；34 °C。按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 ；34 V 下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的沈％，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖2.0 %、柑橘汁36%、黃豆芽汁4.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量4.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入5 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的M %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入16 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥
在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉15%、麥芽糊精8 %做為保護(hù)劑，在 -20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 對(duì)小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 M小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例9
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加22 %的蘋果汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖22克、酵母膏11克、碳酸鈣8克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量1.8 %食用酒精(含量>95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)，得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。
(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖2.0 %、柑橘汁36%、黃豆芽汁4.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量4.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入5 %上述一級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的對(duì)％，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入16 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥
在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉20%，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 對(duì)小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例10
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加16 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖10克、酵母膏8克、碳酸鈣18克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6. 5)。然后分裝于 1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量2.0 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)，得到液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖1.0 %、柑橘汁20 %、黃豆芽汁6.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量4.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入8 %上述液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的30 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入30 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉20%做為保護(hù)劑，在 -20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 對(duì)小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。11:[微軟用戶1]
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加10 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖10克、酵母膏12克、碳酸鈣15克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)， 得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 ；34 °C。按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 ；34 V 下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖1.0 %、柑橘汁30 %、黃豆芽汁6.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量4.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入5 10 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 0C下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入10 % 30 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥
在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉15 %、麥芽糊精8 %、β-環(huán)狀糊精6%、 海藻糖1 %、蔗糖1 %做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 對(duì)小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例12
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加10 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖10克、酵母膏12克、碳酸鈣15克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)， 得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3.0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 ；34 °C。按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 ；34 V 下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖1.0 %、柑橘汁30 %、黃豆芽汁6.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量4.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入5 10 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 0C下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入10 % 30 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥
在醋酸菌菌懸液中按重量百分比添加脫脂奶粉15 %、麥芽糊精8 %、β-環(huán)狀糊精6%、 海藻糖1 %、蔗糖1 %做為保護(hù)劑，在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 對(duì)小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例13
(一)菌種采用醋酸桿菌滬釀1.01，醋酸菌種子培養(yǎng)基添加10 %的柑橘汁(按重量百分比)，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌。(二)種子培養(yǎng)
1、一級(jí)種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件稱取葡萄糖22克、酵母膏11克、碳酸鈣8克，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中，水定容至1000 mL，pH值自然(pH4.5 6.5)。然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL，于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量1.8%食用酒精(含量彡95%)，冷卻至30 34 °C。接入步驟(一)中制得的醋酸菌試管斜面菌種，在32 34。C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)，得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。2、二級(jí)種子培養(yǎng)采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 V 下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，添加總重量3. 0 %食用酒精(含量彡95%)， 冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入6 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的沈％，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(三)發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件按重量百分比葡萄糖2.0%、柑橘汁觀％、黃豆芽汁7.0 %混合、水定容至100 %，pH值自然(pH 4. 5 6.5)。100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻后按添加總重量4.0 %的食用酒精，冷卻至30 34 °C。按重量百分比接入5 10 %二級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 0C下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的25%，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)，培養(yǎng)中間可按重量百分比補(bǔ)入25 %培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)酸度達(dá)到2.0 %左右，鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。(四)菌體收集
醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆谩?五)干燥將醋酸菌菌懸液在-20 -350C冷柜中預(yù)凍12 對(duì)小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)。(六)包裝袋先進(jìn)行滅菌處理，在無(wú)菌條件下進(jìn)行包裝密封。實(shí)施例14
種子培養(yǎng)基的組份為按重量百分比葡萄糖1. 0 %、酵母膏0.5 % %、碳酸鈣1.5 %、 酒精1.0 % ；干燥過(guò)程中保護(hù)劑組份配比為麥芽糊精8 %、β_環(huán)狀糊精6%、海藻糖8%、蔗糖6%，其它工藝過(guò)程及參數(shù)均與實(shí)施例3。實(shí)施例15
發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖2. 5 %、蘋果汁20 %、黃豆芽汁5.0 %、食用酒精5.0 %，干燥過(guò)程中保護(hù)劑組份配比為脫脂奶粉15 %、β-環(huán)狀糊精10%、海藻糖6%、蔗糖7%，其它工藝過(guò)程及參數(shù)均與實(shí)施例6。實(shí)施例16
種子培養(yǎng)基的組份為按重量百分比葡萄糖2. 0 %、酵母膏1.5 % %、碳酸鈣2.0 %、 酒精3.0 %。發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖3.0 %、蘋果汁45%、黃豆芽汁7.0 %、食用酒精6.0 %，干燥過(guò)程中保護(hù)劑組份配比為脫脂奶粉20%、麥芽糊精8 %、海藻糖3%、蔗糖5%， 其它工藝過(guò)程及參數(shù)均與實(shí)施例8。實(shí)施例17:
種子培養(yǎng)基的組份為按重量百分比葡萄糖2. 0 %、酵母膏1.5 % %、碳酸鈣2.0 %、 酒精3.0 %。發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖3.0 %、蜜橙汁45%、黃豆芽汁7.0 %、食用酒精6.0 %，干燥過(guò)程中保護(hù)劑組份配比為脫脂奶粉20%、蔗糖5%，其它工藝過(guò)程及參數(shù)均與實(shí)施例9。實(shí)施例18
種子培養(yǎng)基的組份為按重量百分比葡萄糖3. 0 %、酵母膏1.5 % %、碳酸鈣0.5 %、 酒精4.0 %。發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖3.0 %、蜜橙汁45%、黃豆芽汁7.0 %、食用酒精2.0 %，干燥過(guò)程中保護(hù)劑組份配比為麥芽糊精8 %、β-環(huán)狀糊精10%，其它工藝過(guò)程及參數(shù)均與實(shí)施例4。實(shí)施例19
種子培養(yǎng)基的組份為按重量百分比葡萄糖2. 0 %、酵母膏1.5 % %、碳酸鈣2.0 %、 酒精3.0 %。發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖3.0 %、蜜橙汁45%、黃豆芽汁7.0 %、食用酒精6.0 %，干燥過(guò)程中保護(hù)劑組份配比為脫脂奶粉20%、蔗糖5%，其它工藝過(guò)程及參數(shù)均與實(shí)施例9
實(shí)施例20
干燥過(guò)程中保護(hù)劑組份配比為麥芽糊精8 %、海藻糖5%，其它工藝過(guò)程及參數(shù)均與實(shí)施例5。實(shí)施例21:干燥過(guò)程中保護(hù)劑組份配比為脫脂奶粉20%、麥芽糊精8 %、β-環(huán)狀糊精10%，其它工藝過(guò)程及參數(shù)均與實(shí)施例7。
權(quán)利要求
1. 一種直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟1. 1菌種采用醋酸桿菌，在種子培養(yǎng)基中添加果汁，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌；1. 2菌種培養(yǎng)a、種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖1.0 % 3.0 %、酵母膏0.5 % 1.5 %、碳酸鈣0.5 % 2.0 %、酒精1.0 % 4.0 %取料，先將葡萄糖、酵母膏、碳酸鈣溶于水中， 水定容至1000 mL, pH值自然pH4. 5 6. 5 ；然后分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶裝量為200 mL ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)基于110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻至30 ；34 °C，接入醋酸菌試管斜面菌種，在32 34 °C下振蕩培養(yǎng)16 M小時(shí)，得到一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌；b、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖1. 0 % 3. 0 %、柑橘汁20 % 50 %、黃豆芽汁2. 0 % 8. 0 %、食用酒精 2. 0 % 6. 0 %，pH4. 5 6. 5 ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)基于100 110°C下滅菌5 15分鐘，冷卻至30 ；34 °C，接入經(jīng)種子培養(yǎng)制得的液體醋酸菌種5 10 %，在32 34 V下通氣培養(yǎng)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，培養(yǎng)時(shí)間為12 20小時(shí)；1. 3 菌體收集將上述醋酸菌發(fā)酵液采用冷凍高速離心機(jī)離心15 30分鐘收集菌體，用2 5倍的生理鹽水稀釋菌體，制備醋酸菌菌懸液，0 4 °C下保存?zhèn)溆茫?.4干燥在-20 -35 0C冷柜中預(yù)凍12 M小時(shí)，然后真空冷凍干燥機(jī)中干燥16 24小時(shí)，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于種子培養(yǎng)過(guò)程中增加二級(jí)種子擴(kuò)培步驟采用一級(jí)種子培養(yǎng)基，配好裝入種子培養(yǎng)罐中，110 125 °C下滅菌15 30分鐘，冷卻后在無(wú)菌條件下，按重量百分比添加3. 0 %食用酒精，冷卻至30 34 °C;按重量百分比接入5 10 %—級(jí)液體醋酸菌種，在32 34 V下通氣培養(yǎng)培養(yǎng)12 16小時(shí)，每分鐘通氣量為發(fā)酵液體積的20 % 30 %，得到二級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于醋酸桿菌ASl. 41或滬釀1.01經(jīng)醋酸菌種子培養(yǎng)基按重量百分比添加10 % 30 %果汁，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于冷凍干燥之前，在所述醋酸菌懸液按重量百分比添加脫脂奶粉5 % 20 %或麥芽糊精2 % 10 %或β -環(huán)狀糊精2 % 10%或海藻糖1 % 8 %或蔗糖1 % 8 %之一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于果汁為柑橘汁或蘋果汁。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種直投式高活性濃縮固態(tài)果蔬醋酸發(fā)酵劑的制備方法，包括以下步驟菌種采用醋酸桿菌，在種子培養(yǎng)基中添加果汁，連續(xù)馴化培養(yǎng)、分離純化，獲得醋酸菌試管斜面菌種，菌種形態(tài)正常，活力強(qiáng)，無(wú)雜菌；菌種培養(yǎng)[微軟用戶1] 種子培養(yǎng)基按重量百分比葡萄糖1.0%～3.0%、酵母膏0.5%～1.5%、碳酸鈣0.5%～2.0%、酒精1.0%～4.0%取料，一級(jí)液體醋酸菌種，菌種鏡檢菌體生長(zhǎng)正常，無(wú)雜菌；發(fā)酵培養(yǎng)、干燥制得。本發(fā)明方法菌數(shù)高，菌種活力強(qiáng)，菌數(shù)能高達(dá)109cfu/g以上，使用方便，簡(jiǎn)化果蔬醋生產(chǎn)工藝，有利果蔬醋生產(chǎn)專業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化。生產(chǎn)時(shí)無(wú)須中間繼代培養(yǎng)菌種，可以直接接種，使用方便，發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102304487SQ20111026028
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者孫長(zhǎng)濤, 蔡凱凱, 黃占旺 申請(qǐng)人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)