專利名稱：一種人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明書(shū)屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。具體涉及一種體外分離人類骨髓、臍帶血及外周血中干細(xì)胞的方法，特別是一種人類骨髓、臍帶血、外周血干細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)在科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，用于人類血液細(xì)胞的分離技術(shù)不斷地發(fā)展和優(yōu)化，目前的干細(xì)胞分離處理方法包括免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀法、血細(xì)胞分離機(jī)法、培養(yǎng)擴(kuò)增法及密度梯度離心法等，但是皆存在諸多的弊端。(I)免疫磁珠法通過(guò)包被在磁珠微粒上的抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原陽(yáng)性的細(xì)胞反應(yīng)結(jié)合，然后通過(guò)磁性吸附原理將非吸附的細(xì)胞去除掉，收集被磁珠抗體吸附的細(xì)胞，此方法造價(jià)高，增加了患者的負(fù)擔(dān)，不利于項(xiàng)目的 推廣和普及，而且對(duì)細(xì)胞活性有損傷，影響細(xì)胞療效。(2)流式細(xì)胞儀法也是利用對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記識(shí)別的原理通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選、收集。該方法存在篩選細(xì)胞范圍小、細(xì)胞被標(biāo)記后活性降低以及無(wú)法預(yù)知標(biāo)記物在人體內(nèi)的影響；而且該方法細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)高(3)血細(xì)胞分離機(jī)法只適用于從外周血中分離干細(xì)胞，應(yīng)用受到限制；該方法需要給患者注射干細(xì)胞動(dòng)員劑而增加治療負(fù)擔(dān)，同時(shí)分離后干細(xì)胞量小、液體體積大，對(duì)患者存在危險(xiǎn)；(4)體外培養(yǎng)擴(kuò)增法則需要對(duì)采集人類血液細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，再清洗使用，此方法增加了污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)干細(xì)胞向未知方向分化為未知干細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)。目前基于密度梯度法的干細(xì)胞分離方法在臨床上得到較廣的應(yīng)用。但是不同方法及操作步驟產(chǎn)生的效果不同，各有利弊，總體而言，存在如下幾個(gè)問(wèn)題(I)不能標(biāo)準(zhǔn)化。比如申請(qǐng)?zhí)枮?00610035900. 5的“一種干細(xì)胞分層液及其用于干細(xì)胞分離的方法”需要操作者自己配制工作液，而且需要調(diào)節(jié)比重，此方法增加了操作者的人為影響因素，不利于干細(xì)胞分離的推廣和產(chǎn)業(yè)化。(2)紅細(xì)胞去除不干凈比如申請(qǐng)?zhí)枮?00610035900. 5的“一種干細(xì)胞分層液及其用于干細(xì)胞分離的方法”特別是對(duì)于臍帶血來(lái)說(shuō)，該專利方法除不凈紅細(xì)胞，最終臨床應(yīng)用的時(shí)候大大增加了患者產(chǎn)生排異反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；申請(qǐng)?zhí)枮?00910187212.4的“人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法”也存在相同的缺點(diǎn)；(3)干細(xì)胞得率不高比如申請(qǐng)?zhí)枮?00610114475.9的“用于分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞的試劑盒”，其缺點(diǎn)是分離的干細(xì)胞得率數(shù)量不高，需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，但是由此增加了細(xì)胞污染率，同時(shí)體外細(xì)胞擴(kuò)增所產(chǎn)生的細(xì)胞功能性不穩(wěn)定，很難用于臨床治療 ’另外申請(qǐng)?zhí)枮?00610106875. 5的“一種有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法”所采用的HIST0PAGUE077的密度I. 077的淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)分離后的細(xì)胞絕大多數(shù)為淋巴細(xì)胞，這樣直接導(dǎo)致細(xì)胞中能夠用于治療的干細(xì)胞占少數(shù)，影響臨床療效；(4)分離純化成本太高比如申請(qǐng)?zhí)枮?00710137781. 9的“骨髓臍帶血干細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法”的專利，其試劑中添加了 Iin抗體，導(dǎo)致成本大大提高，投入臨床使用后，大大增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致患者看不起病，接受不起細(xì)胞治療，并且使用了 Iin抗體對(duì)細(xì)胞清洗造成了較大負(fù)擔(dān)，此種物質(zhì)進(jìn)入人體后對(duì)人體的影響還是個(gè)未知數(shù)，還有待進(jìn)一步研究。(5)沒(méi)有考慮蛋白沉淀、細(xì)胞凝聚因素對(duì)后期干細(xì)胞應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)采用離心的方式分離純化干細(xì)胞，在操作過(guò)程中往往由于臍血、外周血樣品質(zhì)量不同，干細(xì)胞在純化過(guò)程中產(chǎn)生凝聚和沉淀，但此沉淀如果沒(méi)有及時(shí)去除，在后期的應(yīng)用過(guò)程中容易造成患者的微血管栓塞，影響治療效果，嚴(yán)重者可危及患者的生命安全。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了提供一種操作性強(qiáng)、臨床安全性高、便于臨床推廣的人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，它從根本上解決了現(xiàn)有 細(xì)胞分離技術(shù)中存在的造價(jià)高、細(xì)胞活性低、標(biāo)記物進(jìn)入人體后對(duì)人體影響不明，需要注射動(dòng)員劑造成患者痛苦，繁瑣不適用臨床等問(wèn)題。同時(shí)本試劑盒易于存儲(chǔ)運(yùn)輸、可產(chǎn)業(yè)化、使用方便快捷。本發(fā)明的技術(shù)方案是人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒，其技術(shù)要點(diǎn)是所述試劑盒中包含以下四種試劑A號(hào)液為稀釋液PBS液；B號(hào)液為密度液泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HIST0PAQUE1077或Ficoll ;泛影酸鈉-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為I. 075±0. 001的密度液；C號(hào)液為洗滌液0. 9%氯化鈉注射液；D號(hào)液為除紅細(xì)胞液0. 8%氯化氨溶液；一種應(yīng)用如權(quán)利要求I所述的人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，其技術(shù)要點(diǎn)是將含有枸櫞酸鈉抗凝劑的骨髓或臍帶血或外周血按大于等于I I的比例加入A液，混勻；根據(jù)稀釋好的樣品體積，取適當(dāng)數(shù)量的15ml離心管，先各裝4ml的B液，再各取IOml稀釋好的樣品鋪到B液上，然后以500_850g離心25分鐘，分出干細(xì)胞層，收集干細(xì)胞層后用C液清洗細(xì)胞I次，用5-10ml的C液重懸細(xì)胞，加入約三倍體積的D液，混勻，反應(yīng)6分鐘，再以350-550g離心10分鐘，去除上清，收集干細(xì)胞后用C液清洗細(xì)胞1-2次，根據(jù)需要再用70微米過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集過(guò)濾后的干細(xì)胞后用C液清洗細(xì)胞1-2次，離心濃縮后用C液稀釋到5-50毫升，待用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極的技術(shù)效果(I)本發(fā)明能夠分離人類骨髓或臍帶血或外周血中的干細(xì)胞，即將試劑盒中4種試劑組合應(yīng)用，通過(guò)B號(hào)試劑密度梯度離心，根據(jù)各種細(xì)胞密度差異將它們分散于自上而下的試劑層次，去除人類骨髓或人類臍帶血或外周血中的血漿，血小板，血紅蛋白，粒細(xì)胞和大部分紅細(xì)胞等,經(jīng)過(guò)本發(fā)明分離的干細(xì)胞回收率能夠達(dá)到85%以上；(2)本發(fā)明通過(guò)將濃縮后的干細(xì)胞加入三倍體積的D號(hào)液進(jìn)行反應(yīng)，使紅細(xì)胞破碎，再通過(guò)離心收集純化的干細(xì)胞，達(dá)到去除紅細(xì)胞的作用，避免了干細(xì)胞在后續(xù)的應(yīng)用過(guò)程中患者產(chǎn)生排異反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)以及紅細(xì)胞干擾；(3)本發(fā)明將純化好的干細(xì)胞通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾，去除可能存在的沉淀雜質(zhì)，通過(guò)本方法制備的干細(xì)胞，避免了后續(xù)干細(xì)胞應(yīng)用過(guò)程中由于沉淀而引發(fā)的微血管栓塞危險(xiǎn)。
(4)本試劑盒包含分離純化試劑盒的所有溶液，無(wú)需使用者另外準(zhǔn)備溶液，簡(jiǎn)便使用者的使用準(zhǔn)備工作，也避免使用者人為的污染或者第三方污染引入。(5)本發(fā)明適用于人類骨髓、臍帶血、外周血的干細(xì)胞分離，對(duì)于不同的樣品，試劑組成相同，避免了國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的一些專利只能分離人類骨髓和臍帶血，不能分離外周血的問(wèn)題。(6)本發(fā)明試劑原料便宜，配置過(guò)程簡(jiǎn)單、質(zhì)量可控，不使用質(zhì)量難以控制的生物制品，具有造價(jià)低，無(wú)任何標(biāo)記物，保留原有細(xì)胞活性，細(xì)胞數(shù)量能夠滿足臨床治療的需要等優(yōu)點(diǎn)。(7)本發(fā)明可根據(jù)樣品體積的需要，按比例加入不同體積的試劑溶液進(jìn)行操作即 可，適用于臨床小批量樣品的操作或者大批量操作，避免了樣品的浪費(fèi)，是臨床上迫切需要的一種分離細(xì)胞的試劑盒及方法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施兩例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例I :本發(fā)明研制了一種骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒，其中試劑盒包含以下四種試劑A號(hào)液為稀釋液PBS溶液；B號(hào)液為密度液泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HIST0PAQUE1077或Ficoll ;泛影酸鈉-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影酸鈉配制成的密度為I. 075±0. 001的密度液；C號(hào)液為洗滌液0. 9%氯化鈉注射液；D號(hào)液為除紅細(xì)胞液0. 8%氯化氨溶液；本發(fā)明也公開(kāi)了一種應(yīng)用上述試劑盒的細(xì)胞處理方法，其具體步驟是將含有枸櫞酸鈉抗凝劑的骨髓或臍帶血或外周血按大于等于I : I的比例加入A液，混勻；根據(jù)稀釋好的樣品體積，取適當(dāng)數(shù)量的15ml離心管，先各裝4ml的B液，再各取IOml稀釋好的樣品鋪到B液上，然后以500-850g離心25分鐘，分出干細(xì)胞層，收集干細(xì)胞層后用C液清洗細(xì)胞I次，用5-10ml的C液重懸細(xì)胞，加入約三倍體積的D液，混勻，反應(yīng)6分鐘，再以350-550g離心10分鐘，去除上清，收集干細(xì)胞后用C液清洗細(xì)胞1-2次，根據(jù)需要再用70微米過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集過(guò)濾后的干細(xì)胞后用C液清洗細(xì)胞1-2次，離心濃縮后用C液稀釋到5-50暈升，待用。為了更好理解和說(shuō)明本發(fā)明，下面利用實(shí)施例來(lái)詳細(xì)闡述。實(shí)施例2 應(yīng)用本發(fā)明試劑盒分離臍帶血干細(xì)胞方法步驟試劑盒組成如下A號(hào)液為稀釋液PBS溶液；B號(hào)液為密度液Ficoll溶液；C號(hào)液為洗滌液0. 9%氯化鈉注射液溶液；D號(hào)液為除紅細(xì)胞液0. 8%氯化氨溶液；
將上述A號(hào)液經(jīng)過(guò)10磅、10分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)素含量彡0. 5EU/ml，裝瓶，4°C C保存。B號(hào)液經(jīng)過(guò)10磅、10分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)毒素含量彡0. 5EU/ml，裝瓶。利用上述試劑盒分離IOOml臍帶血干細(xì)胞方法步驟如下(I)取A液100ml，按I : I比例稀釋臍血，混勻，可4度保存?zhèn)溆茫?2)取20個(gè)15ml的離心管，用IOml移液管吸取B液4ml加入各管中備用；(3)用IOml的移液管吸取臍血各10ml，沿管壁緩慢疊加于B液液面上，注意保持清楚的界面；(4)水平離心，轉(zhuǎn)速2114rpm，離心時(shí)間25分鐘，溫度21度；(5)取4個(gè)50ml離心管，各加入35ml C液,備用； (6)步驟4離心后，離心管內(nèi)樣品溶液分為四層，用巴氏吸管吸取第三層(白色云霧層狹窄帶)平均分于步驟5中的4個(gè)離心管中，混勻；水平離心1674rpmX20分鐘，溫度21度；(7)用25ml移液管吸去上清，用IOml移液管吸取5ml的C液于一離心管中，重懸細(xì)胞，并依次將4管細(xì)胞匯集到一個(gè)50ml離心管中，輕柔吹打混勻；(8)若步驟7中紅細(xì)胞過(guò)多，則在離心管中緩慢加入15ml的D液，混勻，反應(yīng)6分鐘，其中每隔2分鐘混勻一次；水平離心1674rpmX 10分鐘，溫度21度；(9)用IOml移液管吸去上清，加入20ml的C液，混勻；水平離心，轉(zhuǎn)速1674rpm，離心時(shí)間20分鐘，溫度21度；(10)若重懸的細(xì)胞出現(xiàn)明顯可見(jiàn)大顆粒沉淀，可采用過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾；再將過(guò)濾液進(jìn)行離心；水平離心，轉(zhuǎn)速1674rpm，離心時(shí)間20分鐘，溫度21度；(11)用IOml移液管吸去上清，加入20ml的C液，混勻；水平離心，轉(zhuǎn)速1674rpm，離心時(shí)間20分鐘，溫度21度；(12)用IOml移液管吸去上清，根據(jù)需要加入5ml或者20ml的C液重懸細(xì)胞，保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，其特征在于所述試劑盒中包含以下四種試劑 A號(hào)液為稀釋液PBS液； B號(hào)液為密度液泛影酸鈉-聚蔗糖400#或HIST0PAQUE1077或Ficoll ;泛影酸鈉-聚蔗糖400#由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為I. 077±0. 001的密度液； C號(hào)液為洗滌液0. 9%氯化鈉液； D號(hào)液為紅細(xì)胞裂解液0. 8%氯化氨溶液。
2.—種應(yīng)用如權(quán)利要求I所述的人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，其特征在于該方法包括下列步驟 將含有枸櫞酸鈉抗凝劑的骨髓或臍帶血或外周血按大于等于I:I的比例加入A液，混勻；根據(jù)稀釋好的樣品體積，取適當(dāng)數(shù)量的15ml離心管，先各裝4ml的B液，再各取IOml稀釋好的樣品鋪到B液上，然后以500-850g離心25分鐘，分出干細(xì)胞層，收集干細(xì)胞層后用C液清洗細(xì)胞I次，用5-10ml的C液重懸細(xì)胞，加入約三倍體積的D液，混勻，反應(yīng)6分鐘，再以350-550g離心10分鐘，去除上清，收集干細(xì)胞后用C液清洗細(xì)胞1-2次，根據(jù)需要再用過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集過(guò)濾后的干細(xì)胞后用C液清洗細(xì)胞1-2次，離心濃縮后用C液稀釋到5-50暈升，待用。
3.—種應(yīng)用如權(quán)利要求I和2所述的人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，其特征在于使用0. 8%氯化氨溶液處理干細(xì)胞中殘留的紅細(xì)胞。
4.一種應(yīng)用如權(quán)利要求I和2所述的人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，其特征在于使用70微米孔徑過(guò)濾器過(guò)濾純化后的干細(xì)胞，以去除凝聚的細(xì)胞或者沉淀雜質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒，提供一種操作性強(qiáng)、臨床安全性高、便于臨床推廣的人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，所述試劑盒中包含以下四種試劑A號(hào)液為稀釋液；B號(hào)液為密度液；C號(hào)液為洗滌液；D號(hào)液為除紅細(xì)胞液。本發(fā)明從根本上解決了現(xiàn)有細(xì)胞分離技術(shù)中存在的造價(jià)高、細(xì)胞活性低、標(biāo)記物進(jìn)入人體后對(duì)人體影響不明，需要注射動(dòng)員劑造成患者痛苦，繁瑣不適用臨床等問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK102965339SQ20111025677
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者武棟成 申請(qǐng)人:武漢康苑生物醫(yī)藥科技有限公司