專利名稱：一種發(fā)酵制備花生抗氧化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵制備花生抗氧化肽的方法，屬于食品蛋白加工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著自由基生命科學(xué)研究的不斷進(jìn)展，氧化應(yīng)激損傷和抗氧化保護(hù)作用的研究受到了人們的日益關(guān)注。嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，當(dāng)活性氧的濃度超過細(xì)胞防御能力時，氧化損傷就可改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，影響機(jī)體健康。同樣，食品是一系列復(fù)雜的體系，過多的自由基存在也會嚴(yán)重影響體系的穩(wěn)定性?，F(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展表明，通過添加具有抗氧化活性物質(zhì)的方法可以增加食品體系的穩(wěn)定性。隨著營養(yǎng)學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)介于蛋白質(zhì)和氨基酸間的肽類，由于其特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，食用安全性更高，抗氧化活性更為顯著，亦可歸屬于抗氧化劑，作為人體內(nèi)清除自由基的物質(zhì)來源。目前，酶解法制備抗氧化肽主要有兩種工藝技術(shù)蛋白酶酶解法和發(fā)酵法。蛋白酶酶解法反應(yīng)條件溫和，可得到一定分子量范圍的抗氧化肽產(chǎn)品，現(xiàn)在主要使用的方法是蛋白酶酶解法，但由于酶的底物專一性和酶的空間構(gòu)象的限制，使得蛋白酶酶解法只能利用分離蛋白作為底物，增加了操作成本。發(fā)酵法利用微生物生長繁殖時能產(chǎn)生蛋白酶的原理，直接將微生物與原料混合一起進(jìn)行發(fā)酵，省去了提取分離蛋白的步驟。此外，微生物除了產(chǎn)生蛋白酶外，還能產(chǎn)生纖維素酶、植酸酶等，可以分解細(xì)胞壁，有利于蛋白與蛋白酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，提高水解效率，增加酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，降低生產(chǎn)成本，但發(fā)酵法在動物血清蛋白抗氧化肽制備中有報(bào)道，在植物特別是花生抗氧化肽提取中仍未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種操作簡便、反應(yīng)條件溫和，可連續(xù)化生產(chǎn)具有較好抗氧化活性的花生抗氧化肽的發(fā)酵制備方法?；ㄉ鞍踪|(zhì)含量為25 36%，其生物價為58，蛋白質(zhì)效價為1:7，含18種氨基酸， 包括8種必需氨基酸，研究表明，蘊(yùn)藏在花生蛋白質(zhì)肽鏈中的一些短肽具有抗氧化活性。由于枯草芽孢桿菌能產(chǎn)蛋白酶，黑曲霉能產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和植酸酶，米曲霉能產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶，本發(fā)明擬采用枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉的混合菌種作為發(fā)酵菌種，通過固體發(fā)酵或液體發(fā)酵方法制備花生抗氧化肽，以提高酶解效率和抗氧化肽的抗氧化活性，為花生抗氧化肽的開發(fā)提供新途徑。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下步驟
低變性脫脂花生蛋白粉加入蒸餾水，攪拌均勻，超聲波分散溶解，調(diào)節(jié)PH值，滅菌，冷卻；接入菌種種子培養(yǎng)液，發(fā)酵培養(yǎng)；超聲波輔助酶解，滅酶，離心，上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。具體來說，所述的方法如下
(1)低變性脫脂花生蛋白粉中加入蒸餾水，玻璃棒攪拌均勻，超聲波分散溶解，調(diào)節(jié)PH值，滅菌，冷卻；
(2)接入菌種種子培養(yǎng)液，固體發(fā)酵或液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物；
(3)發(fā)酵物經(jīng)超聲波輔助酶解，滅酶，離心，上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。優(yōu)選地，步驟(1)所述的低變性脫脂花生蛋白粉加入蒸餾水6. 5ml/g原料(固體發(fā)酵)，19. 5ml/g原料(液體發(fā)酵)，超聲波分散溶解條件超聲波功率為300w，超聲波頻率為^kHz,溫度為25°C，時間為15min，用濃度為1. Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至 6. 5 7. 5，高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌15min。優(yōu)選地，步驟(2)所述的菌種種子培養(yǎng)液為枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉的混合種子培養(yǎng)液，接入量為22.5% (固體發(fā)酵)，6.5% (液體發(fā)酵)，枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉的菌齡分別為妨h、70h和38h，混合種子培養(yǎng)液中它們的比例為枯草芽孢桿菌黑曲霉 米曲霉=1. 8:1. 4:1.8,固體發(fā)酵條件為溫度31. 5°C，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)34h，液體發(fā)酵條件為溫度34. 5°C，以65r/min轉(zhuǎn)速，搖瓶振蕩培養(yǎng)36h。優(yōu)選地，步驟(3)所述的發(fā)酵物經(jīng)超聲波輔助酶解的方法是固體發(fā)酵物加入 l(Tl5ml/g原料的蒸餾水后超聲波輔助酶解，而液體發(fā)酵物直接超聲波輔助酶解，超聲波輔助酶解的條件超聲波功率為180w，超聲波頻率為^kHz,溫度為48. 5°C，時間為22. 5min, 滅酶的條件為100°C恒溫水浴中滅酶18min，離心條件為12°C，6500r/min轉(zhuǎn)速離心12min。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明制備的花生抗氧化肽產(chǎn)品具有清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基、對羥自由基介導(dǎo)脫氧核糖損傷的抑制作用、鐵還原力、鉬還原力、鐵離子螯合能力、銅離子螯合能力、抑制脂質(zhì)體過氧化活性、抗亞油酸體系氧化作用、 抗油脂過氧化能力等體外抗氧化活性，可以作為功能食品用于清除體內(nèi)自由基、預(yù)防和輔助治療現(xiàn)代文明病，也可以作為天然抗氧化劑用在食品的貯藏和保鮮中，延長食品貨架期； 發(fā)酵制備花生抗氧化肽的方法反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，可大批量連續(xù)化生產(chǎn)，為花生抗氧化肽的開發(fā)提供了新的途徑。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
低變性脫脂花生蛋白粉加入蒸餾水6. 5ml/g原料，玻璃棒攪拌均勻，以超聲波功率為 300w，超聲波頻率為^kHz,溫度為25°C的條件，超聲分散溶解15min，得到花生蛋白粉糊狀物，用濃度為1. Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 86，在高壓滅菌鍋內(nèi)，121°C滅菌 15min，冷卻至室溫；取菌齡分別為46h、70h和38h的枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊狀物中接入以枯草芽孢桿菌黑曲霉米曲霉=1. 8:1. 4:1. 8比例混合的種子培養(yǎng)液，接入量為22. 5%，在培養(yǎng)箱中，以溫度31. 5°C，靜置固體發(fā)酵培養(yǎng)34h，得到固體發(fā)酵物；在固體發(fā)酵物中加入12. 5ml/g原料的蒸餾水，在超聲波功率為180w，超聲波頻率為 ^kHz,溫度為48. 5°C的條件下，超聲波輔助酶解22. 5min ；在100°C恒溫水浴中滅酶18min， 冷卻到室溫，在12°C條件下，6500r/min轉(zhuǎn)速離心12min，取上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。該抗氧化肽的抗氧化活性如下清除羥自由基的IC5tl值為0. 35mg/mL，清除超氧陰離子自由基的IC5tl值為1. 47mg/mL,清除DPPH自由基的IC5tl值為1. 39mg/mL,對羥自由基介導(dǎo)脫氧核糖損傷的抑制作用的IC5tl值為0. 53mg/mL，鐵還原力的吸光值為0. 5時所需花生抗氧化肽的濃度為4. Hmg/mL，鉬還原力的吸光值為0. 5時所需花生抗氧化肽的濃度為1. 26mg/mL，鐵離子螯合力的IC5tl值為1. 71mg/mL，銅離子螯合力的IC5tl值為1. 48mg/mL，抑制脂質(zhì)體過氧化活性的IC5tl值為1. 82mg/mL，抗亞油酸體系氧化作用的IC5tl值為2. 06mg/mL，抗油脂過氧化能力的IC5tl值為2. 13mg/mL。實(shí)施例2
低變性脫脂花生蛋白粉加入蒸餾水6. 5ml/g原料，玻璃棒攪拌均勻，以超聲波功率為 300w，超聲波頻率為^kHz,溫度為25°C的條件，超聲分散溶解15min，得到花生蛋白粉糊狀物，用濃度為l.Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 62，在高壓滅菌鍋內(nèi)，121°C滅菌 15min，冷卻至室溫；取菌齡分別為46h、70h和38h的枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊狀物中接入以枯草芽孢桿菌黑曲霉米曲霉=1. 8:1. 4:1. 8比例混合的種子培養(yǎng)液，接入量為22. 5%，在培養(yǎng)箱中，以溫度31. 5°C，靜置固體發(fā)酵培養(yǎng)34h，得到固體發(fā)酵物；在固體發(fā)酵物中加入14. 5ml/g原料的蒸餾水，在超聲波功率為180w，超聲波頻率為 ^kHz,溫度為48. 5°C的條件下，超聲波輔助酶解22. 5min ；在100°C恒溫水浴中滅酶18min， 冷卻到室溫，在12°C條件下，6500r/min轉(zhuǎn)速離心12min，取上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。該抗氧化肽的抗氧化活性如下清除羥自由基的IC5tl值為0. 57mg/mL，清除超氧陰離子自由基的IC5tl值為0. 98mg/mL,清除DPPH自由基的IC5tl值為1. 02mg/mL,對羥自由基介導(dǎo)脫氧核糖損傷的抑制作用的IC5tl值為0. 42mg/mL，鐵還原力的吸光值為0. 5時所需花生抗氧化肽的濃度為2. 46mg/mL，鉬還原力的吸光值為0. 5時所需花生抗氧化肽的濃度為0. 99mg/ mL，鐵離子螯合力的IC5tl值為1. 2%ig/mL，銅離子螯合力的IC5tl值為1. llmg/mL，抑制脂質(zhì)體過氧化活性的IC5tl值為1. 43mg/mL，抗亞油酸體系氧化作用的IC5tl值為1. 08mg/mL，抗油脂過氧化能力的IC5tl值為1. ^mg/mL。實(shí)施例3
低變性脫脂花生蛋白粉加入蒸餾水19. 5ml/g原料，玻璃棒攪拌均勻，以超聲波功率為 300w，超聲波頻率為^kHz,溫度為25°C的條件，超聲分散溶解15min，得到花生蛋白粉懸浮液，用濃度為l.Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.觀，在高壓滅菌鍋內(nèi)，121°C滅菌 15min，冷卻至室溫；取菌齡分別為46h、70h和38h的枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉，在花生蛋白粉糊狀物中接入以枯草芽孢桿菌黑曲霉米曲霉=1. 8:1. 4:1. 8比例混合的種子培養(yǎng)液，接入量為6. 5%，在搖床中，以溫度34. 5°C，搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)36h，得到液體發(fā)酵物； 取液體發(fā)酵物，在超聲波功率為180w，超聲波頻率為^kHz,溫度為48. 5°C的條件下，超聲波輔助酶解22. 5min ；在100°C恒溫水浴中滅酶18min，冷卻到室溫，在12°C條件下，6500r/ min轉(zhuǎn)速離心12min，取上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。該抗氧化肽的抗氧化活性如下清除羥自由基的IC5tl值為0. 17mg/mL,清除超氧陰離子自由基的IC5tl值為0. 49mg/mL, 清除DPPH自由基的IC5tl值為0. 61mg/mL，對羥自由基介導(dǎo)脫氧核糖損傷的抑制作用的IC5tl 值為0. 33mg/mL，鐵還原力的吸光值為0. 5時所需花生抗氧化肽的濃度為1. 09mg/mL，鉬還原力的吸光值為0. 5時所需花生抗氧化肽的濃度為0. 65mg/mL，鐵離子螯合力的IC5tl值為0. 58mg/mL,銅離子螯合力的IC5tl值為0. 43mg/mL,抑制脂質(zhì)體過氧化活性的IC5tl值為 0. 41mg/mL，抗亞油酸體系氧化作用的IC5tl值為0. 75mg/mL，抗油脂過氧化能力的IC5tl值為 0. 28mg/mL。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵制備花生抗氧化肽的方法，包括以下步驟(1)低變性脫脂花生蛋白粉中加入蒸餾水，玻璃棒攪拌均勻，超聲波分散溶解，調(diào)節(jié)PH 值，滅菌，冷卻；(2)接入菌種種子培養(yǎng)液，固體發(fā)酵或液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵物；(3)發(fā)酵物經(jīng)超聲波輔助酶解，滅酶，離心，上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備花生抗氧化肽的方法，其特征在于，步驟(1)所述的低變性脫脂花生蛋白粉加入蒸餾水6. 5ml/g原料(固體發(fā)酵)，19. 5ml/g原料(液體發(fā)酵)，超聲波分散溶解條件超聲波功率為300w，超聲波頻率為^kHz,溫度為25°C，時間為15min， 用濃度為l.Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 5 7. 5，高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備花生抗氧化肽的方法，其特征在于，步驟(2)所述的菌種種子培養(yǎng)液為枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉的混合種子培養(yǎng)液，接入量為22. 5% (固體發(fā)酵)，6. 5% (液體發(fā)酵)，枯草芽孢桿菌、黑曲霉和米曲霉的菌齡分別為妨h、70h和38h， 混合種子培養(yǎng)液中它們的比例為枯草芽孢桿菌黑曲霉米曲霉=1. 8:1. 4:1. 8，固體發(fā)酵條件為溫度31. 5°C，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)34h，液體發(fā)酵條件為溫度34.5°C，以65r/min轉(zhuǎn)速，搖瓶振蕩培養(yǎng)36h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備花生抗氧化肽的方法，其特征在于，步驟(3)所述的發(fā)酵物經(jīng)超聲波輔助酶解的方法是固體發(fā)酵物加入l(Tl5ml/g原料的蒸餾水后超聲波輔助酶解，而液體發(fā)酵物直接超聲波輔助酶解，超聲波輔助酶解的條件超聲波功率為180w， 超聲波頻率為^kHz,溫度為48. 5°C，時間為22. 5min，滅酶的條件為100°C恒溫水浴中滅酶 18min，離心條件為12°C，6500r/min轉(zhuǎn)速離心12min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵制備花生抗氧化肽的方法，包括以下步驟低變性脫脂花生蛋白粉加入蒸餾水，超聲波分散溶解，調(diào)節(jié)pH值，滅菌，冷卻；接入菌種種子培養(yǎng)液，發(fā)酵培養(yǎng)；超聲波輔助酶解，滅酶，離心，上清液冷凍干燥得到花生抗氧化肽。以本發(fā)明制得的花生抗氧化肽產(chǎn)品具有清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基、對羥自由基介導(dǎo)脫氧核糖損傷的抑制作用、鐵還原力、鉬還原力、鐵離子螯合能力、銅離子螯合能力、抑制脂質(zhì)體過氧化活性、抗亞油酸體系氧化作用、抗油脂過氧化能力等抗氧化活性，操作簡便，反應(yīng)條件溫和，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P21/06GK102286601SQ201110229979
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者于麗娜, 孫杰, 張會翠, 張初署, 朱鳳, 楊慶利, 畢杰 申請人:山東省花生研究所