專利名稱：一種臍帶血分離二聯(lián)袋分離造血干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離干細(xì)胞的方法，尤其是一種利用臍帶血分離二聯(lián)袋分離造血干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，其臨床應(yīng)用的范圍也不斷擴(kuò)大，造血干細(xì)胞是臨床上應(yīng)用最早的干細(xì)胞，是體內(nèi)各種血細(xì)胞的唯一來源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。造血干細(xì)胞的移植是治療血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤疾病的有效方法。臍帶血因其采集容易、來源廣泛、免疫原性低等特點(diǎn)成為造血干細(xì)胞的重要來源， 臍帶血造血干細(xì)胞儲(chǔ)存成為了滿足臨床使用的有效手段。臍帶血造血干細(xì)胞儲(chǔ)存的核心技術(shù)之一是臍帶血的分離，是經(jīng)過一系列的處理方法將臍帶血中的紅細(xì)胞和多余血漿去除， 有效的濃縮儲(chǔ)存體積并盡可能的提高造血干細(xì)胞的回收率。在這個(gè)過程中，需要注意的是 1、有效的分離，既要保證能夠濃縮血液體積，又不會(huì)造成造血干細(xì)胞的丟失，還要保證濃縮的血液中無小塊凝血；2、嚴(yán)格的無菌操作，臍血樣本十分的珍貴，一個(gè)孩子一生只有一次， 一旦細(xì)胞被污染，會(huì)造成當(dāng)事人無法接受治療或者治療的難度加大；3、過于復(fù)雜的裝置不僅給操作帶來麻煩，也不利于分離出細(xì)胞的質(zhì)量和降低污染，同時(shí)精簡結(jié)構(gòu)又不能夠犧牲其實(shí)用性。目前用于造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、分離的容器相關(guān)產(chǎn)品主要是三聯(lián)袋、開放性分離袋及采集多聯(lián)袋，開放性分離袋在操作的過程中需要多次與其他容器連接，所有連接過程均需要在無菌的環(huán)境下操作，容易造成污染；采集多聯(lián)袋主要是用于普通的采血，不適用于臍帶血的分離；而三聯(lián)袋是由三個(gè)大小不同的袋子封閉連接，通過將臍帶血分離出的干細(xì)胞加入凍存液后至凍存袋中封閉后凍存，但三聯(lián)袋通常僅能滿足基本的分離轉(zhuǎn)移功能，針對(duì)分離過程中的細(xì)節(jié)，如何去除小的凝血如何保證分離中添加的溶液無菌，確保分離無菌得不到保證，同樣存在受污染的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、分離的開放式操作易受污染等不足，本發(fā)明提供一種臍帶血分離二聯(lián)袋分離造血干細(xì)胞的方法，該方法密閉操作，安全有效，無污染。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種臍帶血分離二聯(lián)袋分離造血干細(xì)胞的方法，包括 200ml主袋、150ml轉(zhuǎn)移袋，所述主袋上連通有進(jìn)料管、轉(zhuǎn)移接管，進(jìn)料管上設(shè)有進(jìn)料控制閥和0. 22um過濾器，轉(zhuǎn)移接管上連通有并聯(lián)的進(jìn)血管和轉(zhuǎn)移管，進(jìn)血管上設(shè)有進(jìn)血控制閥和血液過濾網(wǎng)，轉(zhuǎn)移管上連通轉(zhuǎn)移袋，且轉(zhuǎn)移管上還設(shè)有轉(zhuǎn)移控制閥，轉(zhuǎn)移接管上還設(shè)有取樣口，所述主袋上還設(shè)有外接細(xì)胞冷凍袋的細(xì)胞排出口，所述分離造血干細(xì)胞的方法包括以下步驟(a)將臍帶血采集袋中的血液混勻后經(jīng)帶血液過濾網(wǎng)的進(jìn)血管轉(zhuǎn)移至200ml主袋中， 轉(zhuǎn)移后將進(jìn)血控制閥關(guān)閉；
(b)從進(jìn)料管加入采集血量1/5體積的羥乙基淀粉HES至主袋中，轉(zhuǎn)移后將進(jìn)料控制閥關(guān)閉；
(c)將臍帶血和羥乙基淀粉HES混勻，將臍帶血分離二聯(lián)袋整體至離心機(jī)中使主袋接口朝下，以400轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心7分鐘；
(d)將離心后置于主袋最下層的紅細(xì)胞(約為臍帶血總體積的1/5)通過轉(zhuǎn)移接管和轉(zhuǎn)移管轉(zhuǎn)移至150ml轉(zhuǎn)移袋中，轉(zhuǎn)移后將轉(zhuǎn)移控制閥關(guān)閉；
(e)將主袋所剩的血液成分重新混勻，將臍帶血分離二聯(lián)袋整體至離心機(jī)中使主袋接口朝上，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15分鐘；
(f)打開轉(zhuǎn)移控制閥，通過血液分漿夾將離心后置于主袋上層的2/3血漿經(jīng)轉(zhuǎn)移接管和轉(zhuǎn)移管轉(zhuǎn)移至150ml轉(zhuǎn)移袋中；
(g)混勻主袋中余下的富含造血干細(xì)胞的濃縮血，從轉(zhuǎn)移接管上的取樣口取Iml的樣品，計(jì)算有核細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞活率，檢測細(xì)胞集落形成能力和CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞的百分比；
(h)通過帶0.22um過濾器的進(jìn)料管加入濃縮血1/4體積的4°C預(yù)冷的細(xì)胞冷凍保護(hù)液，混勻，冷凍保護(hù)液的成分為DMS0、右旋糖酐，二者體積比為1:1 ；
(i)混勻后立即將細(xì)胞排出口上接細(xì)胞冷凍袋，將上述步驟主袋中的由細(xì)胞冷凍保護(hù)液保護(hù)的濃縮血全部轉(zhuǎn)移至細(xì)胞冷凍袋中；
(j)將細(xì)胞冷凍袋接口封口后，從臍帶血分離二聯(lián)袋上分離，放入程控降溫儀中緩慢降溫至-80°C后置入液氮罐中長期保存；
(k)將轉(zhuǎn)移袋中的混合血液成分混勻后轉(zhuǎn)移回至主袋中，通過主袋上的取樣口取30ml 留樣，取20ml做細(xì)菌檢測和病原微生物的檢測。采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是
1、采用血液過濾網(wǎng)，避免血液凝集物造成造血干細(xì)胞分離不徹底，影響儲(chǔ)存和將來使
用；
2、采用0.22um過濾器保證了分離過程中添加溶液無菌，降低細(xì)胞污染概率；
3、由多處控制閥確保分離袋在分離過程中完全密閉，不受污染，安全性能高；
4、主袋上的轉(zhuǎn)移接管處于正中，方便血液成分轉(zhuǎn)移至200ml主袋，也方便血液成分從 200ml主袋轉(zhuǎn)移至150ml轉(zhuǎn)移袋，細(xì)胞排出口在主袋上的邊緣易于操作，同時(shí)也能減少造血干細(xì)胞的丟失；
5、分離二聯(lián)袋的各部件封閉連接，易于操作，節(jié)省操作時(shí)間，降低污染。本發(fā)明的二聯(lián)袋采用離心的方法實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞的分離，采用的二聯(lián)袋結(jié)構(gòu)簡單實(shí)用，整體分離工藝簡便，全密閉的分離，能安全有效地濃縮造血干細(xì)胞的儲(chǔ)存體積，并盡可能的提高造血干細(xì)胞的回收率。5份臍帶血樣本經(jīng)此二聯(lián)袋分離后的結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種臍帶血分離二聯(lián)袋分離造血干細(xì)胞的方法，包括200ml主袋(1)、150ml轉(zhuǎn)移袋 O)，所述主袋上連通有進(jìn)料管(7)、轉(zhuǎn)移接管(3)，進(jìn)料管上設(shè)有進(jìn)料控制閥(10)和0. 22um 過濾器(11)，轉(zhuǎn)移接管上連通有并聯(lián)的進(jìn)血管(6)和轉(zhuǎn)移管(5)，進(jìn)血管上設(shè)有進(jìn)血控制閥 (9)和血液過濾網(wǎng)(13)，轉(zhuǎn)移管上連通轉(zhuǎn)移袋O)，且轉(zhuǎn)移管上還設(shè)有轉(zhuǎn)移控制閥(8)，轉(zhuǎn)移接管上還設(shè)有取樣口(12)，所述主袋上還設(shè)有外接細(xì)胞冷凍袋的細(xì)胞排出口 0)，其特征在于分離造血干細(xì)胞的方法包括以下步驟(a)將臍帶血采集袋中的血液混勻后經(jīng)帶血液過濾網(wǎng)的進(jìn)血管轉(zhuǎn)移至200ml主袋中， 轉(zhuǎn)移后將進(jìn)血控制閥關(guān)閉；(b)從進(jìn)料管加入采集血量1/5體積的羥乙基淀粉HES至主袋中，轉(zhuǎn)移后將進(jìn)料控制閥關(guān)閉；(c)將臍帶血和羥乙基淀粉HES混勻，將臍帶血分離二聯(lián)袋整體至離心機(jī)中使主袋接口朝下，以400轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心7分鐘；(d)將離心后置于主袋最下層的紅細(xì)胞通過轉(zhuǎn)移接管和轉(zhuǎn)移管轉(zhuǎn)移至150ml轉(zhuǎn)移袋中，轉(zhuǎn)移后將轉(zhuǎn)移控制閥關(guān)閉；(e)將主袋所剩的血液成分重新混勻，將臍帶血分離二聯(lián)袋整體至離心機(jī)中使主袋接口朝上，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15分鐘；(f)打開轉(zhuǎn)移控制閥，通過血液分漿夾將離心后置于主袋上層的2/3血漿經(jīng)轉(zhuǎn)移接管和轉(zhuǎn)移管轉(zhuǎn)移至150ml轉(zhuǎn)移袋中；(g)混勻主袋中余下的富含造血干細(xì)胞的濃縮血，從轉(zhuǎn)移接管上的取樣口取Iml的樣品，計(jì)算有核細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞活率，檢測細(xì)胞集落形成能力和CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞的百分比；(h)通過帶0.22um過濾器的進(jìn)料管加入濃縮血1/4體積的4°C預(yù)冷的細(xì)胞冷凍保護(hù)液，混勻；(i)混勻后立即將細(xì)胞排出口上接細(xì)胞冷凍袋，將上述步驟主袋中的由細(xì)胞冷凍保護(hù)液保護(hù)的濃縮血全部轉(zhuǎn)移至細(xì)胞冷凍袋中；(j)將細(xì)胞冷凍袋接口封口后，從臍帶血分離二聯(lián)袋上分離，放入程控降溫儀中緩慢降溫至-80°C后置入液氮罐中長期保存；(k)將轉(zhuǎn)移袋中的混合血液成分混勻后轉(zhuǎn)移回至主袋中，通過主袋上的取樣口取30ml 留樣，取20ml做細(xì)菌檢測和病原微生物的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶血分離二聯(lián)袋分離造血干細(xì)胞的方法，其特征在于所述細(xì)胞冷凍保護(hù)液的成分為DMS0、右旋糖酐，二者體積比為1:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臍帶血分離二聯(lián)袋分離造血干細(xì)胞的方法，采用主袋、轉(zhuǎn)移袋分步分離紅細(xì)胞和血漿至轉(zhuǎn)移袋，添加冷凍保護(hù)液將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞冷凍袋并最終冷凍儲(chǔ)存。本方法采用離心的方法實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞的分離，采用的分離轉(zhuǎn)移袋結(jié)構(gòu)簡單實(shí)用，整體分離工藝簡便，全密閉的分離，降低污染，能安全有效地濃縮造血干細(xì)胞的儲(chǔ)存體積，并盡可能的提高造血干細(xì)胞的回收率。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK102337245SQ201110219408
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月2日
發(fā)明者宋云慶, 李俊, 李曉鳴, 楊兵, 陳林 申請(qǐng)人:江蘇省北科生物科技有限公司