專利名稱：預(yù)測(cè)吉非替尼療效的fas-670a/g基因分型檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)吉非替尼療效的FAS-670A/G基因分型檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
肺癌是最常見、死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率還在逐年增加。其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占整個(gè)肺癌的80%以上，并且大部分患者在診斷時(shí)已經(jīng)是晚期。 化療曾經(jīng)是晚期非小細(xì)胞肺癌最主要的治療手段，但即便是最好的化療方案，目前治療的總有效率也不足50%，1年生存率僅40%左右。靶向治療藥物的出現(xiàn)改變了非小細(xì)胞肺癌的治療現(xiàn)狀，顯著地提高了患者的生存期。其中吉非替尼(Gefitinib，ZD1839)是最早上市、目前臨床應(yīng)用最為廣泛的非小細(xì)胞肺癌靶向治療藥物，屬于一種選擇性、可逆性EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)酪氨酸激酶抑制劑， 目前在包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家已經(jīng)上市，商品名為易瑞沙(Iressa)。吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌的客觀有效率差異很大，文獻(xiàn)報(bào)道從8. 9-69%不等。 其中在IDEALl臨床研究中，日本人的有效率為27%，而美國(guó)人則僅為12%。而在EAP研究中，中國(guó)人的有效率約為30%。以上均提示吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌的臨床療效存在著顯著的個(gè)體差異。由于晚期非小細(xì)胞肺癌患者生存期很有限，因此盡早選擇最可能有效的藥物治療對(duì)延長(zhǎng)患者生存尤為重要。加之吉非替尼為代表的靶向治療藥物比較昂貴，價(jià)格是普通化療的數(shù)十倍，從衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度也要求選擇最可能獲益的患者接受靶向治療。 因此，尋找吉非替尼療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，指導(dǎo)個(gè)體化靶向治療，是目前亟待解決的關(guān)鍵性臨床問題。目前最常用于預(yù)測(cè)吉非替尼療效的生物標(biāo)記物為EGFR基因的突變，主要為外顯子19的堿基缺失(G2235-A2249缺失)和外顯子21的點(diǎn)突變(L858R)。一項(xiàng)針對(duì)ISEL國(guó)際多中心III期臨床研究的生物標(biāo)記物回顧性分析發(fā)現(xiàn)，存在EGFR基因突變的16例NSCLC 患者接受吉非替尼治療后的有效率為37.5%，而EGFR基因野生型的116例患者吉非替尼的有效率僅為2.6%。但是EGFR基因突變作為吉非替尼療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物，存在一定的不足①突變的檢測(cè)需要腫瘤組織，而大部分肺癌在初次診斷時(shí)已經(jīng)是晚期，失去手術(shù)獲得腫瘤標(biāo)本的機(jī)會(huì)，即便是少部分患者有可能活檢取得標(biāo)本，也會(huì)因?yàn)闄z出率有限和活檢標(biāo)本量限制，難以進(jìn)行突變檢測(cè)，目前臨床上能夠滿足突變檢測(cè)要求的患者比例少于20% (ISEL研究中約為17% )；②基因突變受腫瘤異質(zhì)性的影響，同一患者在不同部位或者疾病不同階段獲得的腫瘤標(biāo)本，其突變檢測(cè)結(jié)果可能存在差異，因此檢測(cè)到的結(jié)果可能不能代表全身和全程的腫瘤特點(diǎn)；③突變檢測(cè)的流程復(fù)雜，儀器設(shè)備的要求高，一般實(shí)驗(yàn)室難以開展，同時(shí)檢測(cè)成本也高，影響了其廣泛的臨床應(yīng)用；④突變作為療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，其敏感性不高(ISEL研究中為68.8%)，而針對(duì)吉非替尼這樣昂貴的治療藥物，敏感性高的臨床指導(dǎo)意義更大?；谝陨螮GFR基因突變的不足之處，開發(fā)更理想的療效預(yù)測(cè)生物標(biāo)記物及其檢測(cè)方法的臨床需求顯得更為迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)測(cè)吉非替尼療效的FAS-670A/G基因分型檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了輔助預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼療效的專用引物，是PCR擴(kuò)增包括序列表的序列3自5'末端第301位脫氧核糖核苷酸(FAS-670A/G)在內(nèi)的DNA片段所用的引物對(duì)。所述專用引物可為PCR擴(kuò)增包括序列表的序列3所示核苷酸在內(nèi)的DNA片段所用的引物對(duì)。所述專用引物具體可為由序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2 所示DNA片段組成的引物對(duì)。本發(fā)明還保護(hù)所述專用引物在制備輔助預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼療效的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)所述專用引物和限制性內(nèi)切酶krF I在制備輔助預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼療效的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼療效的試劑盒，包括所述專用引物。所述試劑盒還可包括限制性內(nèi)切酶krF I。以待測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的基因組DNA為模板，用所述專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶krF I酶切所述PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物；如果酶切產(chǎn)物為136bp和 57bp的片段，所述患者的基因型為GG;如果酶切產(chǎn)物為193bp的片段，所述患者的基因型為 AA ；如果酶切產(chǎn)物為193bp+136bp和57bp的片段，所述患者的基因型為GA。如果待測(cè)患者為非GG基因型(AA基因型或GA基因型)，待測(cè)患者為候選的應(yīng)用吉非替尼治療有效的患者；如果待測(cè)患者為GG基因型，待測(cè)患者為候選的應(yīng)用吉非替尼治療無效的患者。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS基因單核苷酸多態(tài)(FAS-670A/G)是一種可預(yù)測(cè)吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌療效的生物指標(biāo)。FAS基因(TNF receptor superfamily, member 6) 屬于 TNF 受體家族，有時(shí)又稱為 APT1、CD95、FASU APO-U FASTM、ALPS1A、TNFRSF6。FAS 基因在NCBI GENBANK中的序列號(hào)為NG_009089. 2 (range :5001. . 30255)。單核苷酸多態(tài) (FAS-670A/G)位于FAS基因上游(啟動(dòng)子區(qū))，見序列表的序列3。(FAS-670A/G)的rs號(hào)為 rsl800682o以FAS-670A/G基因多態(tài)檢測(cè)作為吉非替尼療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，能在一定程度上克服現(xiàn)行預(yù)測(cè)指標(biāo)(EGFR基因突變)的部分缺點(diǎn)①FAS-670A/G檢測(cè)的標(biāo)本可以來源自任何正?；蚰[瘤組織的有核細(xì)胞，最簡(jiǎn)便的方法是2ml外周血即可，因此幾乎所有患者均可以獲得檢測(cè)標(biāo)本；②FAS-670A/G屬于遺傳變異，檢測(cè)結(jié)果不受腫瘤異質(zhì)性的影響，在患者一生中任何時(shí)候取得標(biāo)本，或者取自任何部位標(biāo)本，其檢測(cè)結(jié)果應(yīng)保持一致；③FAS-670A/G檢測(cè)流程相對(duì)簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、成本低廉，有利于臨床推廣；④FAS-670A/G作為療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，其敏感性顯著高于基因突變，檢測(cè)結(jié)果對(duì)預(yù)測(cè)患者獲益的把握性更高，因此更適合中國(guó)當(dāng)前的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)要求。EGFR基因突變預(yù)測(cè)療效和FAS-670A/G預(yù)測(cè)療效的對(duì)比見表1。表1 EGFR基因突變預(yù)測(cè)療效和FAS-670A/G預(yù)測(cè)療效的對(duì)比
權(quán)利要求
1.輔助預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼療效的專用引物，是PCR擴(kuò)增包括序列表的序列3自5'末端第301位脫氧核糖核苷酸在內(nèi)的DNA片段所用的引物對(duì)。
2.如權(quán)利要求1所示的引物對(duì)，其特征在于所述專用引物是PCR擴(kuò)增包括序列表的序列3所示核苷酸在內(nèi)的DNA片段所用的引物對(duì)。
3.如權(quán)利要求2所述的專用引物，其特征在于所述專用引物是由序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段組成的引物對(duì)。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述專用引物在制備輔助預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼療效的試劑盒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1至3中任一所述專用引物和限制性內(nèi)切I在制備輔助預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼療效的試劑盒中的應(yīng)用。
6.輔助預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者吉非替尼療效的試劑盒，包括權(quán)利要求1至3中任一所述專用引物。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括限制性內(nèi)切酶義評(píng)I。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測(cè)吉非替尼療效的FAS-670A/G基因分型檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了一種專用引物，是PCR擴(kuò)增包括FAS-670A/G在內(nèi)的片段所用的引物對(duì)，具體可為由序列1所示DNA片段和序列2所示DNA片段組成的引物對(duì)。應(yīng)用本發(fā)明的專用引物輔助預(yù)測(cè)患者應(yīng)用吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌療效具有如下優(yōu)點(diǎn)①檢測(cè)的標(biāo)本可來自任何正?；蚰[瘤組織的有核細(xì)胞，因此幾乎所有患者均可以獲得檢測(cè)標(biāo)本；②FAS-670A/G屬于遺傳變異，檢測(cè)結(jié)果不受取材時(shí)機(jī)或取材部位的任何影響；③檢測(cè)流程相對(duì)簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、成本低廉；④敏感性顯著高于基因突變，檢測(cè)結(jié)果對(duì)預(yù)測(cè)患者獲益的把握性更高，因此更適合中國(guó)當(dāng)前的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)要求。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102230012SQ20111016570
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者馬飛 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院