專利名稱：一種從胎盤絨毛膜組織中提取造血干細(xì)胞的方法及造血干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從胎盤絨毛膜組織中提取造血干細(xì)胞的方法，特別是指一種從胎盤絨毛膜組織中提?、?33陽性干細(xì)胞的方法，及利用提取的⑶133陽性干細(xì)胞構(gòu)建造血干細(xì)胞庫的方法。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞(Hemopoietic Stem cell, HSC)的干，譯自英文“stem”,意為“樹”、“干”和“起源”。類似于一棵樹干可以長出樹杈、樹葉，并開花和結(jié)果等。通俗地講，造血干細(xì)胞是指尚未發(fā)育成熟的細(xì)胞，是所有造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的起源，它不僅可以分化為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，還可跨系統(tǒng)分化為各種組織器官的細(xì)胞，具有自我更新、多向分化 和歸巢(即定向遷移至造血組織器官)潛能。一般造血干細(xì)胞來源于三個渠道骨髓造血干細(xì)胞；外周造血干細(xì)胞；臍帶血造血干細(xì)胞。胎盤是胎兒和母親血液交換的場所，含有非常豐富的血液微循環(huán)。人在母親子宮內(nèi)發(fā)育的階段，胎盤是首先形成的器官之一。這表明在胚胎干細(xì)胞的發(fā)育、分化過程中，在胎盤中滯留有大量的早期干細(xì)胞，而且很有可能這些干細(xì)胞在胎盤內(nèi)還繼續(xù)保持著造血干細(xì)胞的能力。胎盤內(nèi)含有豐富的各個階段早期造血干細(xì)胞，⑶34自發(fā)現(xiàn)以來一直作為干細(xì)胞表面標(biāo)志物。它無種屬特異性，選擇性表達(dá)于造血干細(xì)胞，在血管內(nèi)皮細(xì)胞也有表達(dá)。CD133即 AC133,也被稱做Promininl ；hematopoitic stem cell antigen ；Prominin-Iike I,是一種跨膜蛋白，屬于Prominin家族成員，相對分子質(zhì)量為120ka, 1997年Miraglia等[Miraglia S,Godffey ff,Yin AH,et al. A novel five trans membrance h ematopoieticstem cell antigen !isolation, characterization, and molecular cl oning [J].Blood, 1997,90(12) :5013-5021]將其作為新的造血干細(xì)胞表面抗原提出。與CD34抗原不同的是，⑶133在晚期祖細(xì)胞，如前B細(xì)胞、紅系集落形成單位(colony formingunit-erythrocyte, CFU-E)、粒系集落形成單位(colony forming unit-granulocyte,CFU-G)上不表達(dá)。⑶133主要表達(dá)于成人、胎兒骨髓，臍血，胎肝等造血組織的⑶34+細(xì)胞亞群上，代表比⑶34+更原始的造血干/祖細(xì)胞亞群。2005年，美國加州大學(xué)Mikkola教授首次報道胎盤是胎兒的一個主要造血器官(Dev Cell 8 :365_75，2005 ;Cell Stem Cell2:252-263,2008)。2009年，Kuypers教授等人發(fā)現(xiàn)人足月胎盤是一個造血器官(Exp BiolMed, 234 :813-823，2009)，這一結(jié)論隨后被許多實驗室證實。人足月胎盤可以提供大量的⑶133陽性細(xì)胞以及其他原始的造血祖先細(xì)胞，適合人類移植。而且目前公認(rèn)⑶133陽性的造血干細(xì)胞比CD34陽性造血干細(xì)胞更早期，由胎盤取得的造血干細(xì)胞或培養(yǎng)出的群落形成單元的總數(shù)量可以是同一來源臍帶血可得造血干細(xì)胞的10倍。⑶133陽性細(xì)胞具有長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(Long-term culture-initiating cells,LTC-IC)和長期重建造血細(xì)胞(Long term repopulation cells, LTRC)的能力，為最原始的造血細(xì)胞,移植給宿主后可以長期植活。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)LTC-IC主要見于⑶133陽性⑶34陽性亞群，一小群⑶133陽性/⑶34陰性細(xì)胞也具有長期增殖潛能，故認(rèn)為⑶133為原始造血細(xì)胞群(包括⑶34陰性細(xì)胞)標(biāo)志。Rappold等所做的臍帶血⑶34和⑶133分選研究發(fā)現(xiàn)同一份標(biāo)本的⑶34+細(xì)胞擴增潛能低于⑶133+細(xì)胞。因此⑶133分選可能優(yōu)于⑶34分選。⑶133還可以作為其它非造血干、祖細(xì)胞的表面標(biāo)志，如神經(jīng)干細(xì)胞(neural stemcell, NSC)。Stamm等進(jìn)行的體外實驗證實，外周血來源的⑶133+細(xì)胞可以分化為神經(jīng)細(xì)胞，具有臨床應(yīng)用前景，可用于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療，包括脊髓損傷，阿爾茨海默綜合征和帕金森氏病。血管內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)區(qū)別于成熟內(nèi)皮細(xì)胞的主要標(biāo)志是⑶133。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞不能結(jié)合⑶133的抗體。證實分化成熟的內(nèi)皮細(xì)胞不具有⑶133。這些說明⑶133可以作為EPCs區(qū)別于成熟內(nèi)皮細(xì)胞的一個表面標(biāo)志。許多學(xué)者從臍帶血和骨髓中分選出CD 133陽性細(xì)胞，體外培養(yǎng)證實能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞。因此有人提出，既然CD133+細(xì)胞在體外可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞，那么體內(nèi)試驗可能會在心肌梗塞患者中，通過血管再生改善患者 心功能。目前已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。Bonanno等研究發(fā)現(xiàn)臨床級分選臍帶血⑶133陽性細(xì)胞可以得到適量原始造血前體細(xì)胞，這些細(xì)胞具有很高造血活性以及體外間充質(zhì)細(xì)胞的潛能。目前分離胎盤干細(xì)胞的方法有機械分離法，灌洗法、膠原酶消化法，機械分離法對細(xì)胞損傷大且分離費時費力，不利于產(chǎn)業(yè)化，灌洗法主要用于成血管細(xì)胞，且細(xì)胞得率低；膠原酶消化法國內(nèi)周勝利等的專利從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫的新方法(專利號01131190. 8)中提到，主要是分選組織來源的⑶34陽性細(xì)胞，其應(yīng)用單一膠原酶消化胎盤組織15分鐘，但上述方法只能得到極少量細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于機械分離得到的細(xì)胞數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種操作簡單方便的從胎盤組織中提?、?33陽性干細(xì)胞的方法。從胎盤組織中提?、?33陽性干細(xì)胞建立干細(xì)胞庫用于臨床治療是本發(fā)明的要旨，實現(xiàn)這一技術(shù)方案是采用多酶消化法。本發(fā)明使用的多酶消化技術(shù)，可以快速將整個胎盤組織消化成單細(xì)胞，而且得到的細(xì)胞混懸液粘稠度不高，有利于濃縮細(xì)胞。本發(fā)明的提取的⑶133陽性造血干細(xì)胞流程方便、成本較低、一次可以快速處理一整個胎盤，且單核細(xì)胞數(shù)量多，可達(dá)5-10 X IO9個細(xì)胞，其中⑶133陽性含量高達(dá)2. 0-5. 0 %。該技術(shù)也適合構(gòu)建造血干細(xì)胞庫，所保存的造血干細(xì)胞可用于成人多次使用，可長期存放，便于隨時取用。本發(fā)明的技術(shù)方案概括如下(I)采集胎盤及母血、臍帶血，對采集的樣品進(jìn)行相關(guān)病原微生物檢測；將采集信息錄入系統(tǒng)；
(2)絨毛膜組織塊在無菌條件下，用緩沖鹽溶液反復(fù)沖洗，清除其中的血凝塊和積血；(3)用酶消化的方法得到消化后的混合液，將混合后的消化液用濾網(wǎng)過濾得到細(xì)胞懸液；(4)用離心法濃縮細(xì)胞懸液后加入沉淀劑，并將其轉(zhuǎn)入離心袋中；
(5)先用低離心力離心分離法將混合液中的紅細(xì)胞和組織塊雜質(zhì)分離，去除紅細(xì)胞和組織塊雜質(zhì)；(6)再用高離心力離心分離法將離心袋中的有核細(xì)胞濃縮，獲得富含⑶133陽性細(xì)胞的混合物；(7)將離心袋中的胎盤造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存管/袋中，并加入凍存保護(hù)劑；(8)將加有凍存保護(hù)劑的胎盤造血干細(xì)胞降溫，放入液氮暫存庫暫存；(9)對分離后細(xì)胞進(jìn)行HLA配型、CD133陽性細(xì)胞含量檢測、單核細(xì)胞計數(shù)、內(nèi)毒素和微生物檢測檢測，將合格細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮長期保存，并將相關(guān)信息錄入系統(tǒng)。根據(jù)上述方法，我們達(dá)到了以下效果⑴可以對整個胎盤進(jìn)行處理；⑵處理時間短，只有3個小時左右，最大程度的保持細(xì)胞特性；(3)細(xì)胞數(shù)量多，可達(dá)5-10 X IO9個/胎盤；(4)⑶133陽性率高，達(dá)到3. 0-6.0%，完全可以滿足成人多次使用；(5)本發(fā)明最大的優(yōu) 點是直接從胎盤組織中富集足夠數(shù)量的CD133陽性干細(xì)胞。


圖I為分離后的絨毛膜來源細(xì)胞免疫表型分析結(jié)果圖；圖2為胎盤絨毛膜來源⑶133陽性細(xì)胞的⑶133分選后流式表型分析圖；圖3為胎盤絨毛膜來源⑶133陽性細(xì)胞用內(nèi)皮分化培養(yǎng)基培養(yǎng)后細(xì)胞⑶31表型檢測圖；圖4為胎盤絨毛膜來源⑶133陽性細(xì)胞在N0D/SCID鼠體內(nèi)重建造血的人⑶45陽性比例檢測圖。
具體實施例方式實施例一胎盤來源細(xì)胞的分離I.胎盤的采集，在產(chǎn)婦知情同意的情況采集胎盤。用無菌生理鹽水沖洗胎盤，然后將胎盤裝入專用的無菌采集盒中，并加入采集液。隨后將胎盤4°C運輸?shù)綄嶒灥攸c，運輸胎盤的時間不超過48小時。2.胎盤絨毛膜組織造血干細(xì)胞的分離(I)用機械的方法分離出絨毛膜組織；(2)將組織剪碎至0. 1-1立方厘米，然后用磷酸鹽溶液反復(fù)沖洗組織塊5次以上，使組織塊無明顯的血凝塊及其它雜物；(3)按照與組織體積比I : I的比例加入膠原酶、胰酶和透明質(zhì)酸酶和DNA酶的混合物，37°C恒溫消化60分鐘；⑷羥乙基淀粉與消化液I : 6加入，用三聯(lián)袋離心的方法，先以50g離心10分鐘，棄紅細(xì)胞，然后再以500g離心10分鐘，得到絨毛膜組織細(xì)胞，其中富含CD133陽性干細(xì)胞；(5)將絨毛膜組織細(xì)胞用保護(hù)液重懸到45體積，在其中加入5毫升的DMS0，然后以0. 5毫升/管取樣4份，一份用來計數(shù)，另外幾份留樣做配型等相關(guān)檢測；將剩余48毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入凍存袋，通過程序降溫后轉(zhuǎn)入液氮中保存。3.流式細(xì)胞儀分析。將分離后的細(xì)胞按每個樣本I X IO6細(xì)胞分管，按專業(yè)人士熟知的方法使用抗體標(biāo)記后，用PBS重懸到400 u L裝入流式管。用BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀檢測、分析。如圖I所示結(jié)果我們分離的細(xì)胞主要來源于胎盤組織(只有2. 36%的血細(xì)胞)，分離的細(xì)胞群包括總細(xì)胞4. 04%的⑶133陽性細(xì)胞，總細(xì)胞20%左右的⑶73陽性和⑶105陽性的間充質(zhì)干細(xì)胞。實施例二 胎盤絨毛膜來源⑶133陽性細(xì)胞的分選分選方法同實施例一，僅將來源換為胎盤絨毛膜組織。將分選后的細(xì)胞，通過使用專業(yè)人士都熟知的磁珠分選方法，從胎盤來源細(xì)胞分理出CD133陽性細(xì)胞。圖2所示結(jié)果通過⑶133磁珠分選后，獲得的⑶133陽性細(xì)胞純度為總細(xì)胞的93. 07%。實施例三胎盤絨毛膜來源⑶133陽性細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞
圖3所示結(jié)果用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細(xì)胞(中圖)CD31陽性比例為2. 85%，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后的細(xì)胞(右圖)⑶31陽性比例為74. 36%。實施例四胎盤絨毛膜來源細(xì)胞重建照射后N0D/SCID鼠的造血系統(tǒng)以勃脈力A溶液重懸胎盤絨毛膜來源細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5xl07個/毫升(高劑量組)和IxlO7個/毫升(低劑量組)。按表I將動物分組，經(jīng)尾靜脈輸入100微升的相應(yīng)劑量的細(xì)胞或勃脈力A溶液。細(xì)胞植入6周后，取存活小鼠骨髓分離單個核細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀檢測骨髓和外周血中表達(dá)人⑶45+細(xì)胞數(shù)，檢測移植胎盤絨毛膜來源⑶133陽性細(xì)胞植入情況。圖4所示結(jié)果在N0D/SCID鼠骨髓內(nèi)人的⑶45陽性細(xì)胞比例，高劑量組植入率83. 73±23. 20%，低劑量組植入率29. 83±13. 01% ;中圖為高劑量組最高植入率和右圖為低劑量組最高植入率。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從胎盤絨毛膜組織中提取造血干細(xì)胞的方法，包括以下步驟 米集胎盤； 用機械的方法將胎盤絨毛膜處理成組織塊； 在無菌條件下，用磷酸鹽溶液將所述組織塊反復(fù)沖洗； 用酶消化所述組織塊得到消化后的混合液，將混合液過濾得到細(xì)胞懸液； 用離心法移出血漿，并濃縮細(xì)胞懸液，獲得富含造血干細(xì)胞的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述造血干細(xì)胞為CD133陽性干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，對采集的胎盤進(jìn)行了病原微生物檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述離心法為兩步離心法，即先用低離心力移除混合液中的紅細(xì)胞和組織塊雜質(zhì)，再用高離心力將離心袋中的造血干細(xì)胞濃縮，獲得富含⑶133陽性細(xì)胞的混合物；
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，還包括儲存方法，即將所述富含造血干細(xì)胞的混合物轉(zhuǎn)移至凍存管中，加入凍存保護(hù)劑；將加有凍存保護(hù)劑的造血干細(xì)胞降溫，放入液氮中儲存。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一種方法獲得的造血干細(xì)胞。
7.一種利用權(quán)利要求6所述的造血干細(xì)胞建造造血干細(xì)胞庫的方法，其特征在于，還包括在分離前將胎盤的采集信息錄入系統(tǒng)； 對分離后造血干細(xì)胞進(jìn)行檢測，將合格造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮長期保存，并將相關(guān)信息錄入系統(tǒng)的方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述造血干細(xì)胞為CD133陽性干細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述檢測包括HLA配型、CD133陽性細(xì)胞含量檢測、單核細(xì)胞計數(shù)、內(nèi)毒素和微生物檢測。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種從胎盤絨毛膜組織中提取CD133陽性干細(xì)胞的方法。(1)采集胎盤，將胎盤采到胎盤采集盒中，加入保護(hù)液；(2)在胎盤進(jìn)入分離干細(xì)胞的操作之前進(jìn)行信息登記及血清學(xué)病毒檢測；(3)清洗掉胎盤組織中血凝塊及積血；(4)采用機械的方法分離胎盤干細(xì)胞；(5)濃縮、純化胎盤干細(xì)胞，提取胎盤來源CD133陽性干細(xì)胞；(6)保存CD133陽性干細(xì)胞。保存的CD133陽性細(xì)胞可以用于造血干細(xì)胞移植，血管再生、神經(jīng)損傷修復(fù)等。本發(fā)明的制作CD133陽性干細(xì)胞流程方便、成本較低、一次可以快速處理一整個胎盤，且單核細(xì)胞數(shù)量多，CD133陽性干細(xì)胞的含量高達(dá)2.0-5.0％。該技術(shù)也適合構(gòu)建CD133陽性干細(xì)胞庫，所保存的CD133陽性干細(xì)胞可用于成人多次使用，可長期存放，便于隨時取用。
文檔編號C12N5/0735GK102757935SQ20111011203
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者王濤, 邵元康, 韓忠朝 申請人:北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司