專利名稱：肝癌組織中具備致瘤潛能的細(xì)胞團(tuán)的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤組織細(xì)胞和腫瘤組織細(xì)胞原代培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種肝癌臨床標(biāo)本中性狀相對(duì)穩(wěn)定的高生長增殖和致瘤能力及高耐藥能力的肝癌細(xì)胞亞群的體外獲取方法。
背景技術(shù)：
目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性(heterogeneous)，其中少量癌干細(xì)胞，表現(xiàn)出更強(qiáng)的生長增殖、致瘤性和對(duì)抗腫瘤藥物的耐受能力，是腫瘤形成和維持以及治療后復(fù)發(fā)的源頭細(xì)胞，找到這些細(xì)胞并確定其細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)有助于發(fā)展新的診療方案實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的早期診斷和靶向治療方案，降低其發(fā)生率和致死率。1997年發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞性白血病中存在能在免疫缺陷鼠體內(nèi)大量擴(kuò)增的白血病干細(xì)胞亞群，實(shí)體瘤癌干細(xì)胞便成了研究者搜尋的目標(biāo)。2003年，Al-Hajj等報(bào)道的人乳腺癌干細(xì)胞和Singh等報(bào)道的人腦瘤干細(xì)胞為這一研究拉開了序幕。隨后，在肺癌]、前列腺癌、 胰腺癌、結(jié)腸癌和肝癌等惡性腫瘤中先后報(bào)道了少量細(xì)胞亞群表現(xiàn)出癌干細(xì)胞特性。以往的研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌組織及相關(guān)組織中，能檢測到⑶133表達(dá)于肝硬化假小結(jié)外周的卵圓或立方形的肝細(xì)胞，或匯管區(qū)附近由膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞過渡區(qū)域的與成熟肝細(xì)胞相比體積較小的細(xì)胞，這些細(xì)胞符合肝干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；而肝癌細(xì)胞系中CD133+細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的致瘤性，因此認(rèn)為⑶133+細(xì)胞是肝臟癌變的起源細(xì)胞(tumor initiating cell), 或癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(Cancer stem-like cell)，⑶133是肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志得到多家研究機(jī)構(gòu)的認(rèn)同。與此同時(shí)，肝癌細(xì)胞系中的側(cè)群細(xì)胞(Side Population)表現(xiàn)出的癌干細(xì)胞樣特征也被報(bào)道。隨后，研究者在肝癌細(xì)胞系中報(bào)道了根據(jù)不同方法得到的細(xì)胞亞群具有肝癌干細(xì)胞(Cancer Stem Cell)或癌前體細(xì)胞(HCC progenitor-like cells)特性， 如⑶90+肝癌細(xì)胞，0V-6+和內(nèi)源性Wnt/ β -Catenin活化的肝癌細(xì)胞，表達(dá)胰島素樣生長因子-1受體和表皮生長因子受體的肝癌細(xì)胞，Epcam+肝癌細(xì)胞及⑶13+細(xì)胞等。而在⑶133+ 細(xì)胞群內(nèi)，研究者又分別分離出ALDH+或CD44+的細(xì)胞在其表現(xiàn)出的癌干細(xì)胞特性中扮演了更加重要的角色。雖然眾多關(guān)于肝癌干細(xì)胞的報(bào)道讓其真實(shí)面目撲朔迷離，但其中存在更強(qiáng)生長增殖、致瘤和耐藥能力的細(xì)胞亞群得到越來越多的支持證據(jù)，而細(xì)胞表面表達(dá)CD133 的細(xì)胞亞群得到了多家機(jī)構(gòu)研究結(jié)果的支持。目前大部分關(guān)于癌干細(xì)胞的研究結(jié)果都是基于已經(jīng)建成的腫瘤細(xì)胞系，尤其是肝癌干細(xì)胞研究更是主要集中于在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系篩選具有更強(qiáng)致瘤性的細(xì)胞亞群，對(duì)癌干細(xì)胞特性的主要考量是其致瘤性，即分選細(xì)胞后進(jìn)行體外成瘤實(shí)驗(yàn)或免疫缺陷鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。我國HBV發(fā)病率高，相關(guān)的肝癌發(fā)病率和致死率都非常高，結(jié)合肝癌臨床樣本尋找肝癌干細(xì)胞為臨床治療提供參考是非常切實(shí)意義的工作。而臨床肝癌樣本大多伴有較嚴(yán)重的肝纖維化，難以獲得活力和數(shù)量足夠的細(xì)胞來完成分選和必要的鑒定，難以在此基礎(chǔ)上分離鑒定具有肝癌干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群。以往的研究表明，即便是癌旁肝組織，接種免疫缺陷鼠BNX皮下能夠觀察到腫瘤結(jié)節(jié)的形成，這提示其中存在具有致瘤性能力的功能單位，而需要對(duì)目前分離和鑒定肝癌干細(xì)胞的策略進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。根據(jù)干細(xì)胞與其生長的微環(huán)境(Niche)的關(guān)系，研究者認(rèn)為癌干細(xì)胞至少應(yīng)該具備自我更新、分化和歸巢等基本特性，而正是這些特性造成癌干細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤生成和耐藥等細(xì)胞生物學(xué)行為，而癌干細(xì)胞所有基本特性和表現(xiàn)行為受其Niche對(duì)它的支持和調(diào)控。肝細(xì)胞癌干細(xì)胞生長Niche特異性結(jié)構(gòu)目前雖然尚無定論，纖維化是HBV相關(guān)的肝癌病程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，成纖維細(xì)胞被認(rèn)為在肝癌的病程具有非常重要的支持作用。但目前得到廣泛認(rèn)同的其中存在支持肝癌干細(xì)胞生長的niche。臨床樣本中分離得到的單個(gè)肝癌細(xì)胞在傳代過程中分化和難以觀察到致瘤能力的原因可能是因?yàn)楸幌^程損傷或離開支持和調(diào)控其生長的微環(huán)境相關(guān)。因此，分離具有一定數(shù)量細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，如果能獲得在體外生長增殖、致瘤性和耐藥等特性上具有一定優(yōu)勢，并且其傳代細(xì)胞能夠表現(xiàn)出與原始標(biāo)本比較一致的性狀，可以為從臨床肝癌樣本中分離和鑒定肝癌干細(xì)胞提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種肝癌組織中具備致瘤潛能的細(xì)胞團(tuán)的分離方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種臨床肝癌樣本中樣本能夠維持肝癌特性的細(xì)胞團(tuán)的分離方法，包括以下步驟
(1)收集臨床標(biāo)本，利用機(jī)械分離和透明質(zhì)酸酶、IV型膠原酶和DNA酶聯(lián)合消化制備組織團(tuán)和細(xì)胞懸液；
(2)將組織團(tuán)和細(xì)胞懸液稀釋先后用IOOum和40um孔徑的濾網(wǎng)過濾，分別收集能通過 40um濾網(wǎng)的細(xì)胞懸液和能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)；結(jié)合苔盼藍(lán)染色方法細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)細(xì)胞成活率，能通過40um孔徑濾網(wǎng)的組分以單細(xì)胞為主要組分，能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)組分為9- (23. 8士6. 9)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)；
(3)與能通過40um孔徑濾網(wǎng)的以單細(xì)胞為主要組分的細(xì)胞懸液相比，能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)在體外原代培養(yǎng)中表現(xiàn)出明顯顯著的體外生長能力、耐藥能力和克隆形成能力；
(4)通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的組織細(xì)胞團(tuán)，從原代培養(yǎng)得到傳代細(xì)胞與病理標(biāo)本在抗人H印atocyte、CK18、CK19和⑶133等蛋白的表達(dá)上基本一致。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明可以快速、簡便和有效地從臨床樣本中分離到具備體外生長增殖、克隆形成和對(duì)抗腫瘤藥物耐受能力的細(xì)胞團(tuán)，并且其傳代細(xì)胞在具備一定的穩(wěn)定性，是分離和鑒定其中存在的高致瘤性的源頭細(xì)胞的基礎(chǔ)。在目前難以在原代組織中獲得足夠性狀穩(wěn)定的細(xì)胞研究肝癌干細(xì)胞及其生活的微環(huán)境的條下，研究這些細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞組成及在其表現(xiàn)出的維持腫瘤細(xì)胞持續(xù)增長、耐藥和致瘤性中發(fā)揮的作用，能夠幫助研究者逐步縮小搜索范圍，從而最終鎖定導(dǎo)致肝癌形成和治療后復(fù)發(fā)的元兇——肝癌干細(xì)胞，結(jié)合研究其特定微環(huán)境來探索對(duì)臨床治療有借鑒價(jià)值的可行方案。


圖1是分離細(xì)胞生長曲線(P<0.05)；圖2是藥物阿糖胞苷對(duì)分離細(xì)胞的生長抑制圖(P<0. 05)； 圖3是藥物甲氨喋呤對(duì)分離細(xì)胞的生長抑制圖(P<0. 05)。
具體實(shí)施例方式通過機(jī)械分離和透明質(zhì)酸酶、IV型膠原酶和DNA酶聯(lián)合消化結(jié)合獲得單細(xì)胞懸液和細(xì)胞團(tuán)，比較它們?cè)隗w外培養(yǎng)過程中生長、克隆形成和耐藥能力的差異，發(fā)現(xiàn)其中能通過 IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的組分中，存在9- (23. 8 士6. 9)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)， 在體外即能表現(xiàn)出更強(qiáng)的持續(xù)生長、體外克隆形成和對(duì)抗腫瘤藥物的耐受能力，同時(shí)其傳代細(xì)胞能維持表達(dá)與組織樣本相當(dāng)?shù)牡鞍讟?biāo)志。該發(fā)明包括以下步驟
1、收集臨床標(biāo)本，利用機(jī)械分離和透明質(zhì)酸酶、IV型膠原酶和DNA酶聯(lián)合消化制備組織團(tuán)和細(xì)胞懸液。其中，制備組織細(xì)胞懸液的實(shí)施步驟為
1. 1、手術(shù)完成后30分鐘內(nèi)取Edmondson-Steiner病理分級(jí)確定為II - III級(jí)肝癌組織 l-2cm3置于預(yù)冷4°C無鈣鎂HBSS離心管中；
1. 2、生物安全柜內(nèi)用組織沖洗液沖洗5遍，在該溶液中除去白色纖維狀組織、血凝塊、 組織碎片及明顯壞死的組織后，取1. 2-1. 6g組織塊，利用無菌眼科剪分解成Imm3大小組織塊，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中，加組織沖洗液至50ml，混勻，4°C 500rpm離心10分鐘，棄上清；
1.3、按15ml/g組織加入預(yù)熱至37°C的消化液，37°C消化1小時(shí)，間隔10分鐘輕柔混勻消化液30秒。2、將組織團(tuán)和細(xì)胞懸液稀釋先后用IOOum和40um孔徑的濾網(wǎng)過濾，分別收集能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞懸液和能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)；結(jié)合苔盼藍(lán)染色方法細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)細(xì)胞成活率，能通過40um孔徑濾網(wǎng)的組分以單細(xì)胞為主要組分， 能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)組分為9- (23. 8 士6. 9)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)。其中，分別收集能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞懸液和能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um 濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)的實(shí)施步驟為
2.1、按照消化液1 1-2體積添加4°C預(yù)冷組織沖洗液至總體積為50ml，懸液通過IOOum 濾網(wǎng)除去未消化的組織塊；得到懸液用40um濾網(wǎng)繼續(xù)過濾，收集40um濾網(wǎng)濾過溶液，用 4°C組織沖洗液收集和重懸濾網(wǎng)上的組織塊；
2. 2、40um濾網(wǎng)濾過懸液和濾網(wǎng)上組織塊用4°C預(yù)冷組織沖洗液15ml重懸，500rpm離心10分鐘，棄上期，用組織清洗液5ml重懸沉淀；
2. 3、得到成分為兩組能通過40um的細(xì)胞懸液和能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um 濾網(wǎng)的組織細(xì)胞團(tuán)。其中，對(duì)能通過40um濾網(wǎng)的懸液結(jié)合苔盼藍(lán)染色方法細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)細(xì)胞成活率方法為
A、利用組織沖洗液將能通過40um濾網(wǎng)的懸液細(xì)胞懸液稀釋至細(xì)胞計(jì)數(shù)板四個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)細(xì)胞數(shù)在100個(gè)左右，即對(duì)應(yīng)的細(xì)胞濃度約106/ml ；
B、取稀釋好的能通過40um的組織細(xì)胞懸液0.9ml置于M孔板中，加入0. Iml 0. 4%苔盼藍(lán)PBS懸液，混勻1分鐘后，5-10分鐘內(nèi)迅速利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，判斷被染成藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞；
C、細(xì)胞總數(shù)=細(xì)胞計(jì)數(shù)X稀釋倍數(shù)X獲得細(xì)胞懸液體積成活率=1-死細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。對(duì)能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)結(jié)合苔盼藍(lán)染色方法細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)細(xì)胞成活率方法為
a、利用組織沖洗液將細(xì)胞團(tuán)從40um濾網(wǎng)上洗脫至Φ60πιπι培養(yǎng)皿，清洗離心后轉(zhuǎn)移到 15ml離心管定容成5ml，即權(quán)利要求3所述獲得懸液體積為常數(shù)5ml ；
b、取0.5ml細(xì)胞團(tuán)置于15ml離心管中，用組織沖洗液稀釋至2. 5ml，連續(xù)用該比例稀釋至滴加IOOul溶液至96孔板中，孔內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)不大于1個(gè)目標(biāo)稀釋度；
c、取適量的細(xì)胞團(tuán)懸液置于15ml離心管，用組織沖洗液稀釋至目標(biāo)稀釋度，總體積 10ml，混勻后每孔IOOul加入96孔板中；
d、加入PH7. 4 PBS緩沖液配制的0. 05%的IV膠原酶至終濃度0. 025%，37°C消化成單細(xì)胞，按照9:1的比例加入0. 4%的苔盼藍(lán)PBS懸液，混勻染色1分鐘后，5-10分鐘內(nèi)迅速計(jì)數(shù)，判斷被染成藍(lán)色的細(xì)胞為死細(xì)胞；
e、細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞總數(shù)為折算方法為
細(xì)胞濃度=平均細(xì)胞數(shù)X有細(xì)胞的培養(yǎng)孔的概率X稀釋倍數(shù)細(xì)胞總數(shù)=細(xì)胞濃度X獲得細(xì)胞團(tuán)體積成活率=1-死細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。3、與能通過40um孔徑濾網(wǎng)的以單細(xì)胞為主要組分的細(xì)胞懸液相比，能通過IOOum 濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)在體外原代培養(yǎng)中表現(xiàn)出明顯顯著的體外生長能力、 耐藥能力和克隆形成能力。體外原代培養(yǎng)，獲得組分體外原代培養(yǎng)的方法為
3. 1、培養(yǎng)器皿利用鼠尾膠原預(yù)包被，參照細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和成活率統(tǒng)計(jì)，利用細(xì)胞培養(yǎng)液將權(quán)利要求1步驟1)得到的兩種組分調(diào)配成成含活細(xì)胞濃度為2X 106/ml的懸液，按 IOfVcm2濃度接種至鼠尾膠原預(yù)包被的培養(yǎng)皿中；
3. 2、靜置15-30分鐘后小心吸去培養(yǎng)皿上層細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)培養(yǎng)皿面積大小不同按照0. 05-0. lml/cm2比例小心地沿培養(yǎng)皿邊沿加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液；(X)2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng) 30-90分鐘待細(xì)胞貼壁(60%以上)，間隔30分鐘觀察并按照0. 05ml/cm2比例添加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液；
3. 3、細(xì)胞完成貼壁后按0. 5ml/cm2添加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，12小時(shí)后換液去除死細(xì)胞或未貼壁細(xì)胞，按lml/cm2加入細(xì)胞培養(yǎng)液，后續(xù)培養(yǎng)間隔2-3天后換液。體外生長能力檢測，體外生長能力檢測方法為
A、96孔板利用鼠尾膠原預(yù)包被，接種活細(xì)胞細(xì)胞密度為2000細(xì)胞/孔；
B、培養(yǎng)M小時(shí)后用無鈣鎂PBS清洗去除未貼壁生長細(xì)胞或團(tuán)塊后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液， 后續(xù)培養(yǎng)中間隔2天換液，370C 5%C02培養(yǎng)；
C、在細(xì)胞接種后第1、3、6、9和12天，取5個(gè)重復(fù)孔，每孔加入5mg/mlMTT IOul 37°C 孵育4小時(shí)；
D、加入IOOulFormazan溶解液37°C繼續(xù)孵育4小時(shí)待結(jié)晶紫完全溶解；E、用酶標(biāo)儀檢測0D570吸光度值，以0D570為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。耐藥能力，耐藥能力的檢測方法為
a、96孔板利用鼠尾膠原預(yù)包被，接種活細(xì)胞細(xì)胞密度4000細(xì)/孔；
b、培養(yǎng)M小時(shí)后無鈣鎂PBS清洗除去未貼壁生長細(xì)胞，添加加入含5ug/ml阿糖胞苷或40ug/ml甲氨喋呤的細(xì)胞培養(yǎng)液，24小時(shí)后小心更換新細(xì)胞培養(yǎng)液，后續(xù)培養(yǎng)間隔48小時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C 5%C02培養(yǎng)；
e、從加藥后第一天開始連續(xù)7天，每天取5個(gè)重復(fù)孔，每孔加入5mg/ml MTT IOul 37°C 孵育4小時(shí)；
d、加入IOOulFormazan溶解液37°C繼續(xù)孵育4小時(shí)待結(jié)晶紫完全溶解；
e、用酶標(biāo)儀檢測0D570吸光度值，以0D570為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制曲線?？寺⌒纬赡芰Γ寺⌒纬赡芰Φ臋z測方法為
i、含0. 5%軟瓊脂的細(xì)胞培養(yǎng)液，42°C條件下取Iml鋪被于Φ35πιπι培養(yǎng)皿； 、待基層軟瓊脂凝集后，置37°C培養(yǎng)箱待溫度恒定；
iii、上層瓊脂終濃度0.3%，42°C接種1000個(gè)細(xì)胞入Iml細(xì)胞培養(yǎng)液，迅速混勻鋪被于預(yù)鋪好基層軟瓊脂的培養(yǎng)皿；
iv、待瓊脂凝集后加入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，370C 5%C02培養(yǎng)，間隔2_3天更換上層細(xì)胞培養(yǎng)液；
ν、間隔M小時(shí)利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞克隆生長和形成，最長觀察至9天。4、通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的組織細(xì)胞團(tuán)，從原代培養(yǎng)得到傳代細(xì)胞與病理標(biāo)本在抗人!fepatocyte、CK18、CK19和⑶133等蛋白的表達(dá)上基本一致。從原代培養(yǎng)得到傳代細(xì)胞，從原代培養(yǎng)得到傳代細(xì)胞的方法為 4. 1、細(xì)胞培養(yǎng)皿或潔凈無菌載玻片利用鼠尾膠原預(yù)包被；
4. 2、待細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)皿表面，利用0. 25%胰酶+0. 02%EDTA消化后成單細(xì)胞后， 加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，接種到鼠尾膠原預(yù)包被的培養(yǎng)皿或清潔無菌的載玻片； 4. 2、 細(xì)胞貼壁后更換，后續(xù)培養(yǎng)中2-3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液。抗人！fepatocyte、CK18、CK19和 CD133 等蛋白的表達(dá)，傳代細(xì)胞！fepatocyte、CK18、 CK19和⑶133等蛋白表達(dá)檢測方法為
A、接種于載玻片上的細(xì)胞或小組織團(tuán)塊除去細(xì)胞培養(yǎng)液，PH7.4 PBS緩沖液，置于搖床上50rpm 5分鐘，重復(fù)清洗3次；
B、接種于載玻片的細(xì)胞利用PH7.4 PBS配制的4%多聚甲醛固定10分鐘后用_20°C預(yù)冷丙酮固定10分鐘；
C、PBS清洗三次后，3%過氧化氫孵育20分鐘后，含1%牛血清白蛋白的PBS室溫封閉1 小時(shí)；
D、抗人CDl33 (1 10 稀釋)、！fepatocye (1 250 稀釋)、CK18 (1 250 稀釋)、CK19 (1:150 稀釋)和Albumin (1:150稀釋)4°C過夜孵育，含0. 1% Tween-20的PBS (PBST)清洗6次， 每次5分鐘；
E、分別用1:250稀釋度HRP標(biāo)記的相應(yīng)的二抗室溫孵育1小時(shí)，PBST清洗6次后，DAB 顯色后，蘇木精復(fù)染后，顯微鏡檢并采集圖像。
抗人H印atocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白的表達(dá)，病理標(biāo)本H印atocyte、CK18、 CK19和⑶133等蛋白表達(dá)檢測方法為
a、厚度4mm石蠟組織切片用二甲苯脫蠟和梯度乙醇溶液水化后利用標(biāo)準(zhǔn)微波程序進(jìn)行抗原修復(fù)；
b、3%過氧化氫阻斷和1%BSA封閉1小時(shí)后；
c、抗人CDl33 (1 10 稀釋)、！fepatocye (1 250 稀釋)、CK18 (1 250 稀釋)、CK19 (1:150 稀釋)和Albumin (1:150稀釋)4°C過夜孵育，含0. 1% Tween-20的PBS (PBST)清洗6次， 每次5分鐘；
d、分別用1:250稀釋度HRP標(biāo)記的相應(yīng)的二抗室溫孵育1小時(shí)，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，顯微鏡檢及采集圖像。組織沖洗液配制方法為組織沖洗液含400U青霉素/ml+400mg鏈霉素/ml的無鈣鎂HBSS。消化液的配制方法為消化液0. 025%IV型膠原，0. 05%透明質(zhì)酸酶，10U/mlDNA酶的William，s E培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)液的配制方法為細(xì)胞培養(yǎng)液含17%胎牛血清、5ug/ml胰島素，lmg/ml 牛血清白蛋白，20mM丙酮酸鈉，100U青霉素/ml和IOOmg鏈霉素/ml的William，s E培養(yǎng)基。統(tǒng)計(jì)分析方法為利用微軟辦公軟件Excel軟件進(jìn)行student’ s t檢驗(yàn)，P<0. 05 判定具有統(tǒng)計(jì)意義。利用鼠尾膠原預(yù)包被，利用鼠尾膠原預(yù)包被的方法為用0. 0lmg/ml濃度鼠尾膠原按照2ug/cm2密度加入需要預(yù)包被的培養(yǎng)介質(zhì)表面完全覆蓋，靜置30分鐘以上，吸干殘余液體，置超凈臺(tái)中過夜風(fēng)干，超凈臺(tái)內(nèi)紫外光照30分鐘完成包被。收集臨床標(biāo)本方法為jdmondson-Meiner II - III級(jí)臨床肝癌切除或肝癌移植受者手術(shù)切除病肝，HBV陽性，術(shù)前影像診斷均為單個(gè)癌灶，邊界清晰的肝細(xì)胞癌患者，腫瘤直徑3. 2cm-7. 4cm (4. 4士 1. 2cm)，無血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。下面根據(jù)實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實(shí)施例1 樣本基本資料
36例標(biāo)本均取自HBV陽性，術(shù)前影像診斷均為單個(gè)癌灶，邊界清晰的肝細(xì)胞癌患者，腫瘤直徑3. 2cm-7. 4cm(4. 4士 1. 2cm)，無血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所有病肝均存在不同程度纖維化。實(shí)施例2 細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊活性
利用上述分離方法處理后獲得懸液為單細(xì)胞與不同大小細(xì)胞團(tuán)塊組成的混合物，苔盼藍(lán)染色顯示藍(lán)染細(xì)胞<5%，利用40um孔徑濾網(wǎng)過濾清洗后得到細(xì)胞基本為單個(gè)細(xì)胞，其中含部分膽汁液滴，平均每克組織得到單個(gè)細(xì)胞數(shù)量5. 6-21. 4 X IO6 (1. 312 士0. 464*107)，苔盼藍(lán)染色顯示獲得的細(xì)胞懸液中活細(xì)胞占95. 7士4. 5%。取部分獲得的小團(tuán)組織進(jìn)一步消化后統(tǒng)計(jì)其中細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算細(xì)胞總量，將這部分細(xì)胞列入統(tǒng)計(jì)結(jié)果，平均每克樣本經(jīng)本方法處理獲得細(xì)胞為1.625士0. 324*107細(xì)胞。小團(tuán)組織塊內(nèi)細(xì)胞數(shù)為9- (23. 8士6. 9) 個(gè)，利用培養(yǎng)基稀釋至合適倍數(shù)后能夠貼附于經(jīng)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)皿表面。苔盼藍(lán)染色結(jié)果表明細(xì)胞團(tuán)塊繼續(xù)消化后活細(xì)胞占96. 0士3. 8%，與獲得的單個(gè)細(xì)胞懸液中活細(xì)胞率沒有統(tǒng)計(jì)上的差異。細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)原代培養(yǎng)12小時(shí)后貼壁狀態(tài)沒有明顯的變化，貼壁細(xì)胞約占75-80%。貼壁培養(yǎng)七天后，兩組細(xì)胞圖像顯示細(xì)胞生長良好，形態(tài)呈較為均一的三角形， 細(xì)胞邊界清楚，其中接種組織團(tuán)塊的培養(yǎng)皿中細(xì)胞以接種部位為中心成簇生長，而接種單細(xì)胞懸液培養(yǎng)皿中細(xì)胞呈均勻分布。實(shí)施例3 肝癌組織不同蛋白的表達(dá)
免疫組化結(jié)果表明抗人h印atocyte抗體在所有36例肝癌樣本中均在肝細(xì)胞癌胞膜檢測呈陽性；CK19則在膽管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性在肝癌組織中，大部分肝癌細(xì)胞CK18陽性，在中央靜脈周圍散在部分細(xì)胞胞漿和胞膜均呈抗CK18強(qiáng)陽性；和我們以往的研究結(jié)果一致 [1]，⑶133陽性細(xì)胞在肝癌細(xì)胞中分散成條索狀或呈簇狀分布。實(shí)施例4 小細(xì)胞團(tuán)具有更顯著的致瘤能力
單個(gè)細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)過程中，單個(gè)細(xì)胞在第五天可以觀察到細(xì)胞分裂現(xiàn)象，但繼續(xù)培養(yǎng)無明顯的克隆形成，第九天鏡檢常見細(xì)胞崩解現(xiàn)象，而利用能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行軟瓊脂培養(yǎng)九天后，形成的克隆形態(tài)完整，邊界清晰，顯示出良好的生長狀態(tài)。初步檢測表明小細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)2-3周后能夠繼續(xù)觀察到形成克隆繼續(xù)擴(kuò)增并且其中細(xì)胞具備傳代能力的超過15%。實(shí)施例5 傳代細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)
細(xì)胞團(tuán)原代培養(yǎng)或挑取軟瓊脂培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，目前的檢測結(jié)果表明，傳代至四代后，獲得的細(xì)胞在抗人h印atOCyte、CK18、CK19和⑶133等蛋白表達(dá)上基本一致。所有細(xì)胞h印atocyte呈強(qiáng)陽性和CK18強(qiáng)陽性，而CK19則基本上檢測不到，而前期研究中我們發(fā)現(xiàn)可望作為肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的CD133則部分表達(dá)于細(xì)胞膜表面，并且表達(dá)強(qiáng)度不均一。傳代蛋白在這幾個(gè)標(biāo)志蛋白的表達(dá)上基本與其原始樣本中肝癌細(xì)胞上這些蛋白的表達(dá)一致。實(shí)施例6 小細(xì)胞團(tuán)具有更強(qiáng)的生長能力
接種能通過40um濾網(wǎng)單細(xì)胞為主要組分的懸液和能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um 濾網(wǎng)的的細(xì)胞團(tuán)MTT方法檢測細(xì)胞生長增殖狀況。細(xì)胞貼壁后第1和第3天，接種單細(xì)胞懸液的培養(yǎng)孔0D570值高出接種細(xì)胞團(tuán)的分別高出5. 20士 1. 34%和9. 19士2. 07%，而在第 6、9、12天接種單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，MTT檢測顯示細(xì)胞無顯著增加，而接種細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)孔0D570檢測值繼續(xù)升高(如圖1所示)，與接種單細(xì)胞懸液的相比，接種細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)孔在接種后第 6、9 和 12 天分別相應(yīng)高出 13. 26士2. 11%,21. 78士3. 40% 和 26. 40士3. 37%。實(shí)施例7 小細(xì)胞團(tuán)具有更強(qiáng)的耐藥性
利用5ug/ml阿糖胞苷處理M小時(shí)后，繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)過程中，接種單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊的培養(yǎng)孔細(xì)胞生長受到抑制，MTT檢測表明繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)后，接種單細(xì)胞懸液的培養(yǎng)孔中0D570值降低了 28. 34%，而接種細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)孔該吸光度值僅降低23. 46% ；而如果繼續(xù)培養(yǎng)到168小時(shí)的過程中，接種單細(xì)胞懸液的培養(yǎng)孔0D570值繼續(xù)下降，168小時(shí)后降低至51. 68% ；而接種細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)孔0D570值升高，168小時(shí)后與阿糖胞苷處理M小時(shí)時(shí)相比，570nm吸光度值降低6. 35% (如圖2)。 40ug/ml甲氨蝶呤處理M小時(shí)后，接種單細(xì)胞懸液的培養(yǎng)孔在后續(xù)培養(yǎng)前72小時(shí)細(xì)胞生長沒有明顯表現(xiàn)出受到抑制的趨勢，培養(yǎng)48小時(shí)后，0D570升高3. 89%，隨后0D570 開始表現(xiàn)出下降趨勢，72小時(shí)后0D570降低7. 98%，培養(yǎng)168小時(shí)后0D570降低42. 47%。而接種細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)孔在整個(gè)7天168小時(shí)培養(yǎng)過程中0D570值沒有表現(xiàn)出顯著的下降趨勢，僅繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，0D570降低5. 80%,而培養(yǎng)72小時(shí)后0D570即開始升高，但整個(gè)過程中升高趨勢平緩(如圖3所示)，培養(yǎng)72小時(shí)后0D570升高10. 83%，而168小時(shí)后0D570 升高 27. 42%ο機(jī)械分離得到的l_2mm3的組織樣本通過透明質(zhì)酸酶、IV型膠原酶和DNA酶聯(lián)合消化后，通過40um孔徑濾網(wǎng)后得到的細(xì)胞以單細(xì)胞為主，其中存在極少量的由2-5個(gè)細(xì)胞黏連在一起的小細(xì)胞團(tuán)，為指代和理解方便，本文稱之為“單細(xì)胞懸液”。能夠通過IOOum孔徑濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)經(jīng)進(jìn)一步消化成單細(xì)胞后計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)其中細(xì)胞最少9個(gè)， 最多四個(gè)，平均細(xì)胞數(shù)23. 8士6. 9。同得到的單細(xì)胞懸液相比，這些小的“細(xì)胞團(tuán)”在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)出更顯著的持續(xù)生長的能力(如圖1所示)，同時(shí)獲得的傳代細(xì)胞與臨床樣本中肝癌細(xì)胞的hepatocyte、 CK18和CK19的表達(dá)上保持一致，而作為我們前期研究中發(fā)現(xiàn)的癌干細(xì)胞的一個(gè)重要表面標(biāo)志物⑶133的表達(dá)上也表現(xiàn)出較顯著的一致性，而⑶133同時(shí)也是目前得到眾多研究機(jī)構(gòu)認(rèn)可的肝癌CSC[1_4]的細(xì)胞表面標(biāo)志，這意味著如果將CD133作為一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，能夠通過IOOum孔徑濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)原代培養(yǎng)傳代擴(kuò)增獲得的細(xì)胞中可望富集到一定數(shù)量的CD133陽性細(xì)胞，這是進(jìn)行其中肝癌干細(xì)胞分離和鑒定的第一步。同時(shí)體外軟瓊脂克隆形成及對(duì)抗腫瘤藥物阿糖胞苷和甲氨喋呤的耐受性表明，得到的細(xì)胞團(tuán)具備一定的體外克隆形成能力和耐受能力。而本專利研究發(fā)現(xiàn)能夠通過IOOum孔徑濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)能夠具有一定的比例能夠維持穩(wěn)定的細(xì)胞生長增殖能力，其傳代細(xì)胞與原始標(biāo)本相比，在一些細(xì)胞標(biāo)志表現(xiàn)一致，存在一定比例的細(xì)胞表達(dá)目前公認(rèn)的肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志的同時(shí)，體現(xiàn)出可以被本文研究方法檢測的致瘤和耐藥能力。能夠檢測到體外生長增殖、致瘤和耐藥能力，傳代細(xì)胞能夠在ifepatOCyte、CK18、CK19及⑶133等抗體表達(dá)上與原始標(biāo)本一致，是進(jìn)一步從臨床標(biāo)本中富集具備CD133陽性等潛在肝癌干細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞的基礎(chǔ)，為研究肝癌樣本中致瘤性源頭細(xì)胞提供可能。能夠通過IOOum孔徑濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)能保持源頭細(xì)胞功能穩(wěn)定性的同時(shí)，保全其必不可少的外部微環(huán)境，因而體現(xiàn)與腫瘤特性相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)特征，研究其細(xì)胞組成和相互調(diào)控是可望為肝癌干細(xì)胞研究帶來新的進(jìn)展。
權(quán)利要求
1.一種臨床肝癌樣本中樣本能夠維持肝癌特性的細(xì)胞團(tuán)的分離方法，其特征在于，包括以下步驟(1)收集臨床標(biāo)本，利用機(jī)械分離和透明質(zhì)酸酶、IV型膠原酶和DNA酶聯(lián)合消化制備組織團(tuán)和細(xì)胞懸液；(2)將組織團(tuán)和細(xì)胞懸液稀釋先后用IOOum和40um孔徑的濾網(wǎng)過濾，分別收集能通過 40um濾網(wǎng)的細(xì)胞懸液和能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)；結(jié)合苔盼藍(lán)染色方法細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)細(xì)胞成活率，能通過40um孔徑濾網(wǎng)的組分以單細(xì)胞為主要組分，能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)組分為9- (23. 8士6. 9)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)；(3)與能通過40um孔徑濾網(wǎng)的以單細(xì)胞為主要組分的細(xì)胞懸液相比，能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)在體外原代培養(yǎng)中表現(xiàn)出明顯顯著的體外生長能力、耐藥能力和克隆形成能力；(4)通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的組織細(xì)胞團(tuán)，從原代培養(yǎng)得到傳代細(xì)胞與病理標(biāo)本在抗人H印atocyte、CK18、CK19和⑶133等蛋白的表達(dá)上基本一致。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述臨床肝癌樣本中樣本能夠維持肝癌特性的細(xì)胞團(tuán)的分離方法， 其特征在于，所述步驟(1)中，所述制備組織團(tuán)和細(xì)胞懸液，其實(shí)施步驟為(1. 1)手術(shù)完成后30分鐘內(nèi)取Edmondson-Steiner病理分級(jí)確定為II -III級(jí)肝癌組織 l-2cm3置于預(yù)冷4°C無鈣鎂HBSS離心管中；(1.2)生物安全柜內(nèi)用組織沖洗液沖洗5遍，在該溶液中除去白色纖維狀組織、血凝塊、組織碎片及明顯壞死的組織后，取1. 2-1. 6g組織塊，利用無菌眼科剪分解成Imm3大小組織塊，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中，加組織沖洗液至50ml，混勻，4°C 500rpm離心10分鐘， 棄上清；(1. 3)按15ml/g組織加入預(yù)熱至37°C的消化液，37°C消化1小時(shí)，間隔10分鐘輕柔混勻消化液30秒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述臨床肝癌樣本中樣本能夠維持肝癌特性的細(xì)胞團(tuán)的分離方法， 其特征在于，所述步驟(2)中，所述分別收集能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞懸液和能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um濾網(wǎng)的細(xì)胞團(tuán)，其實(shí)施方法為(2. 1)按照消化液1:1-2體積添加4°C預(yù)冷組織沖洗液至總體積為50ml，懸液通過 IOOum濾網(wǎng)除去未消化的組織塊；得到懸液用40um濾網(wǎng)繼續(xù)過濾，收集40um濾網(wǎng)濾過溶液，用4°C組織沖洗液收集和重懸濾網(wǎng)上的組織塊；(2. 2)40um濾網(wǎng)濾過懸液和濾網(wǎng)上組織塊用4°C預(yù)冷組織沖洗液15ml重懸，500rpm離心10分鐘，棄上期，用組織清洗液5ml重懸沉淀；(2. 3)得到成分為兩組能通過40um的細(xì)胞懸液和能通過IOOum濾網(wǎng)而不能通過40um 濾網(wǎng)的組織細(xì)胞團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述臨床肝癌樣本中樣本能夠維持肝癌特性的細(xì)胞團(tuán)的分離方法， 其特征在于，所述步驟(3)中，所述體外原代培養(yǎng)，獲得組分體外原代培養(yǎng)的方法為(3. 1)培養(yǎng)器皿利用鼠尾膠原預(yù)包被，參照細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和成活率統(tǒng)計(jì)，利用細(xì)胞培養(yǎng)液將權(quán)利要求1步驟1)得到的兩種組分調(diào)配成成含活細(xì)胞濃度為2X 106/ml的懸液，按 IOfVcm2濃度接種至鼠尾膠原預(yù)包被的培養(yǎng)皿中；(3. 2)靜置15-30分鐘后小心吸去培養(yǎng)皿上層細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)培養(yǎng)皿面積大小不同按照0. 05-0. lml/cm2比例小心地沿培養(yǎng)皿邊沿加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液；(X)2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng) 30-90分鐘待細(xì)胞貼壁(60%以上)，間隔30分鐘觀察并按照0. 05ml/cm2比例添加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液；(3. 3)細(xì)胞完成貼壁后按0. 5ml/cm2添加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，12小時(shí)后換液去除死細(xì)胞或未貼壁細(xì)胞，按lml/cm2加入細(xì)胞培養(yǎng)液，后續(xù)培養(yǎng)間隔2-3天后換液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述臨床肝癌樣本中樣本能夠維持肝癌特性的細(xì)胞團(tuán)的分離方法， 其特征在于，所述步驟(4)中，所述從原代培養(yǎng)得到傳代細(xì)胞，從原代培養(yǎng)得到傳代細(xì)胞的方法為(4. 1)細(xì)胞培養(yǎng)皿或潔凈無菌載玻片利用鼠尾膠原預(yù)包被；(4. 2)待細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)皿表面，利用0. 25%胰酶+0. 02%EDTA消化后成單細(xì)胞后， 加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，接種到鼠尾膠原預(yù)包被的培養(yǎng)皿或清潔無菌的載玻片；(4. 3)細(xì)胞貼壁后更換，后續(xù)培養(yǎng)中2-3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肝癌組織中具備致瘤潛能的細(xì)胞團(tuán)的分離方法，本發(fā)明可以快速、簡便和有效地從臨床樣本中分離到具備體外生長增殖、克隆形成和對(duì)抗腫瘤藥物耐受能力的細(xì)胞團(tuán)，并且其傳代細(xì)胞在具備一定的穩(wěn)定性，是分離和鑒定其中存在的高致瘤性的源頭細(xì)胞的基礎(chǔ)。在目前難以在原代組織中獲得足夠性狀穩(wěn)定的細(xì)胞研究肝癌干細(xì)胞及其生活的微環(huán)境的條下，研究這些細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞組成及在其表現(xiàn)出的維持腫瘤細(xì)胞持續(xù)增長、耐藥和致瘤性中發(fā)揮的作用，能夠幫助研究者逐步縮小搜索范圍，從而最終鎖定導(dǎo)致肝癌形成和治療后復(fù)發(fā)的元兇肝癌干細(xì)胞，結(jié)合研究其特定微環(huán)境來探索對(duì)臨床治療有借鑒價(jià)值的可行方案。
文檔編號(hào)C12N5/09GK102199574SQ20111007944
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者周琳, 殷勝勇, 謝海洋, 鄭樹森 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)