專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于修復(fù)脊髓損傷的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管的構(gòu)建方法，尤其是 一種具有功能的用多孔隙明膠海綿圓柱體支架構(gòu)建的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)損傷如嚴(yán)重的脊髓創(chuàng)傷主要表現(xiàn)為截癱和四肢癱，目前還沒(méi)有行之有 效的治療方法。現(xiàn)在認(rèn)為，不可能依賴受損傷脊髓自身神經(jīng)元之間在全橫斷處形成突觸 來(lái)修復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)通路。需要通過(guò)移植成體干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等 方式在脊髓損傷處形成新的神經(jīng)元，由此建立突觸聯(lián)系。為了實(shí)現(xiàn)這種實(shí)驗(yàn)性治療目 標(biāo)，通常需借助組織工程技術(shù)構(gòu)建一種含有干細(xì)胞的可降解生物導(dǎo)管，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建 成一種具有神經(jīng)傳導(dǎo)功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管，用于橋接脊髓全橫斷損傷處，起到修 復(fù)受損傷的神經(jīng)通路中繼站作用。在脊髓損傷中，生物組織工程材料作為移植細(xì)胞或作為具有保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn) 其軸突再生作用的活性因子的載體，被用于治療脊髓損傷而逐漸引起人們的關(guān)注。組織 工程材料具有天然來(lái)源生物材料和可降解高分子合成材料。1.天然來(lái)源生物材料包括明 膠，膠原和海藻酸鹽等等，它們能在一定程度上促進(jìn)脊髓結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。由于天然 材料支架本身結(jié)構(gòu)的無(wú)序性和機(jī)械性能較差，雖然在體外觀察到比較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 但要移植到體內(nèi)起導(dǎo)向軸突再生作用會(huì)有困難。2.可降解的高分子材料最大的優(yōu)點(diǎn)是生 物相容性好，降解產(chǎn)物易于被吸收而不產(chǎn)生炎癥反應(yīng)?？山到獾母叻肿硬牧弦远嗤ǖ郎?物多聚體材料-—聚左旋乳酸(poly D，L-Iactic acid, PLLA)和聚乳酸-聚羥基乙酸共聚 物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)為代表。但是，這種材料在用于體內(nèi)神經(jīng) 損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)它降解之后會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)等。天然生物材料做成的凝膠、明膠海綿和膠原海綿，或者用可降解高分子合成材 料做成的導(dǎo)管，都可用于橫斷性脊髓損傷修復(fù)。凝膠能夠在脊髓損傷空洞處起填充作 用，促進(jìn)軸突再生，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成的疤痕。但是，它不能較好地介導(dǎo)再生 軸突穿越損傷區(qū)域，尤其是缺乏機(jī)械強(qiáng)度。明膠海綿和膠原海綿具有凝膠的優(yōu)點(diǎn)，且能 夠方便承載活性物質(zhì)，但其機(jī)械強(qiáng)度不高。高分子合成材料導(dǎo)管最大的優(yōu)勢(shì)是在于它有 一定的機(jī)械強(qiáng)度，能夠起到橋接作用，但有些導(dǎo)管在降解之后產(chǎn)生的酸性物質(zhì)對(duì)鄰近細(xì) 胞有損害作用。用基因修飾細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷是目前研究的熱點(diǎn)之一， 但所運(yùn)用的多是神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NG F)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 素-3 (NT-3)等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因?，F(xiàn)已證明NGF主要作用于感覺(jué)神經(jīng)元，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng) 元作用不明顯，而B(niǎo)DNF作用的神經(jīng)元類(lèi)型范圍較窄小。許多研究認(rèn)為，NT-3對(duì)神經(jīng) 元的發(fā)育、分化以及對(duì)受損傷中樞神經(jīng)元的存活及其軸突再生有重要作用。有研究還證 實(shí)，NT-3對(duì)脊髓損傷處皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)纖維的再生有明顯的促進(jìn)作用，這也在我們先前的研究中得到了驗(yàn)證。有研究表明，NT-3介導(dǎo)的ERK信號(hào)通路能夠?qū)е律窠?jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化為神 經(jīng)元，因?yàn)閼?yīng)用ERK抑制劑后NSCs源性神經(jīng)元明顯減少。但作者并沒(méi)有顯示這些NSCs 源性神經(jīng)元之間形成連接，這可能與NSCs沒(méi)有足夠數(shù)量的NT-3受體(TrkC)有關(guān)。一 般認(rèn)為，當(dāng)NT-3與NSCs胞膜上TrkC結(jié)合，使其胞質(zhì)區(qū)的酪氨酸被磷酸化，激活ERK 信號(hào)通路，導(dǎo)致一系列的蛋白磷酸化，從而使NSCs向神經(jīng)元分化。因此我們認(rèn)為，過(guò) 表達(dá)TrkC的NSCs在NT-3的作用下更多地分化為神經(jīng)元，并相互間形成突觸連接，就有 可能促使NSCs源性神經(jīng)元存活較長(zhǎng)時(shí)間。對(duì)CNS的損傷或病變部位應(yīng)用細(xì)胞替換，是近年來(lái)新發(fā)展的一種細(xì)胞治療策 略。研究表明，在發(fā)育中或成年的CNS內(nèi)植入胚胎神經(jīng)組織，通過(guò)其中的神經(jīng)干細(xì)胞或 分裂后的年幼神經(jīng)元替換病傷死亡的神經(jīng)元，并重建神經(jīng)通路及其功能。胚胎或新生動(dòng) 物的NSCs數(shù)量較多，且組織免疫原性較低，用于移植后不易被宿主排斥。我們已經(jīng)從 新生動(dòng)物的大腦組織中分離出具有多潛能的NSCs，用膠原網(wǎng)架吸附后移植到全橫斷或半 橫斷脊髓的損傷處，觀察到它們能在宿主內(nèi)存活、遷移并可分化為神經(jīng)元。但在這種條 件下，移植的NSCs分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的占多數(shù)，僅少數(shù)分化為神經(jīng)元。因此，我們 還將NSCs與雪旺細(xì)胞一起移植，發(fā)現(xiàn)分化成神經(jīng)元的數(shù)量增多，有些神經(jīng)元還長(zhǎng)出較長(zhǎng) 的神經(jīng)突起，甚至有些屬于膽堿能神經(jīng)元，提示雪旺細(xì)胞可促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元，這 可能與雪旺細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān)。但自體NSCs的取材較為困難，不便于臨床 應(yīng)用。因此，人們?cè)噲D找到一種來(lái)源更方便的自體成體干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，MSCs) 來(lái)源豐富、取材簡(jiǎn)便、易分離和易純化培養(yǎng)，給予一定的條件可在體外迅速擴(kuò)增，具有 多向分化潛能。將其移植到體內(nèi)能分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì) 胞、成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞等。用于自體移植可克服倫理和免疫排斥等問(wèn)題，因 而被用于多種疾病的細(xì)胞治療和基因治療的載體。尤其是近年一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)MSCs可在 體外、體內(nèi)分化為神經(jīng)元等，并具有相應(yīng)的功能，有利于神經(jīng)損傷的修復(fù)。張永福等應(yīng) 用MSCs移植治療了 87例脊髓損傷病人，術(shù)后顯示有明顯的臨床療效(實(shí)用診斷與治療 雜志，2004，18(4) 260)。因此，MSCs已成為神經(jīng)損傷細(xì)胞治療的重要的細(xì)胞來(lái)源。 我們已從大鼠骨髓獲取MSCs，并在體外應(yīng)用維甲酸(retinoic acid，RA)誘導(dǎo)MSCs表達(dá) TrkC之后，再移植到脊髓損傷處。2個(gè)月后MSCs在脊髓損傷處能存活、分化和遷移； 應(yīng)用NT-3基因修飾和RA預(yù)誘導(dǎo)的MSCs移植能在脊髓損傷處更好地分化為神經(jīng)元。如 果將這種能分化為骨髓源性神經(jīng)元的MSCs種植在可降解的組織工程材料內(nèi)，它們就有 可能在脊髓移植處更好地形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在上述研究基礎(chǔ)上，本項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利擬從大鼠骨髓獲取MSCs，將NT-3受體 (TrkC)基因轉(zhuǎn)染到MSCs;從大鼠坐骨神經(jīng)獲取雪旺細(xì)胞，將NT-3基因轉(zhuǎn)染到雪旺細(xì) 胞，用多孔隙明膠海綿圓柱體支架吸咐這兩種基因修飾細(xì)胞。在體外培養(yǎng)條件下讓NT-3 基因修飾雪旺細(xì)胞分泌更多的NT-3，更好地促進(jìn)TrkC基因修飾MSCs分化為具有形成突 觸潛能的骨髓源性神經(jīng)元數(shù)量增多，這些分化的骨髓源性神經(jīng)元之間建立突觸聯(lián)系，形 成一種具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)管支架，為臨床治療急性脊髓損傷患者研制出一種具 有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的組織工程支架材料。

發(fā)明內(nèi)容
目前，在國(guó)內(nèi)、外尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)資料報(bào)道用多孔隙明膠海綿圓柱體支架構(gòu)建的 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管的方法，尤其是一種具有功能的用多孔隙明膠海綿圓柱體支架構(gòu)建 的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是想克服現(xiàn)有臨床上治療脊髓損 傷所用的方法上的不足，應(yīng)用我們自行構(gòu)建的具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管移植治療 脊髓創(chuàng)傷性疾病，更好地促進(jìn)受損傷脊髓神經(jīng)通路及其功能的修復(fù)。本發(fā)明的基本方案包括以多孔隙明膠海綿為主體，外面應(yīng)用PLGA薄膜包裹，形成一種形貌像圓柱體 的支架材料。在此基礎(chǔ)上種植NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和TrkC基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞(MSCs)，構(gòu)建成具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管。應(yīng)用時(shí)，將其移植到橫斷性脊髓損 傷處。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)顯著。本研究選擇一種含有NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞和TrkC基因 修飾MSCs的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管來(lái)促進(jìn)受損傷的脊髓神經(jīng)通路修復(fù)，對(duì)危害人民健康 較大的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病如脊髓損傷等進(jìn)行治療性基礎(chǔ)研究，這將有力地推動(dòng)整個(gè)創(chuàng) 傷性中樞神經(jīng)疾病治療研究領(lǐng)域的發(fā)展。這對(duì)延長(zhǎng)人類(lèi)壽命，提高傷病者生存質(zhì)量，減 輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)，促進(jìn)我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有重要意義。本發(fā)明將使我國(guó)的創(chuàng)傷性 中樞神經(jīng)疾病防治水平居于國(guó)際領(lǐng)先水平。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所用的主要儀器、可降解的生物材料支架、實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑作詳盡的描述1.主要儀器超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、普通離心機(jī)(日本久保田制作所)、低 溫高速離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)、5% CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Queue公司)、倒置熒光 顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、顯微手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江光學(xué)儀器廠)、恒冷箱切片機(jī)(英國(guó) Shandon公司)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、Philips CM 10透射電鏡(荷蘭 Eindhoven公司)和HEKAEPC-10膜片鉗放大器(德國(guó)HEKA公司)。2.可降解的生物材料支架按申請(qǐng)人另一項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?009100401769)所描述的方法，制備明膠
海綿圓柱體支架。3.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、病毒載體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(自行分離培養(yǎng)獲取)、雪旺細(xì)胞(自行分離培養(yǎng)獲取)、 人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3基因(人NT-3基因)重組腺病毒表達(dá)載體(Ad-NT_3)(中山大學(xué)黃 文林、王俊梅申請(qǐng)的發(fā)明專(zhuān)利200610034981.7)、人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素_3受體基因(人TrkC 基因)重組腺病毒表達(dá)載體(Ad-TrkC)(中山大學(xué)曾園山、王俊梅獲授權(quán)的發(fā)明專(zhuān)利 ZL200510033569.9)、綠色熒光蛋白基因重組腺病毒表達(dá)載體(Ad-GFP)(北京寶賽生物 技術(shù)有限公司)和新生和幼年SD大鼠(由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。4.主要試劑
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DMEM-LG (Gibico)、優(yōu)級(jí)胎牛血清(TBD)、多聚賴氨酸(Sigma)、D-Hank' s 平衡液(自配)、胰蛋白酶(Sigma)、EDTA (Sangon)、0.01mol/l PBS (中杉金橋)、 Hoechst33342 (Sigma)、山羊血清(中杉金橋)、Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG和Cy3標(biāo)記 羊抗兔 IgG (JacksonImmunoResearch)、巢蛋白(Nestin)多克隆抗體(Sigma)、神經(jīng)絲 (NF)多克隆抗體(Sigma)、微管相關(guān)蛋白2 (Map2)單克隆抗體(Sigma)、突觸后致 密物95(PSD95)單克隆抗體(Sigma)、突觸素(Synaptophysin)多克隆抗體(Sigma)、 生長(zhǎng)相關(guān)蛋白_43(GAP-43)多克隆抗體(R&D)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Chat)多克隆抗體 (Chemicon)、谷氨酰胺(Glutamine)多克隆抗體(Boster)、Y-氨基丁酸(GABA)多克 隆抗體(Boster)、β -III微管蛋白(β -III tubulin)多克隆抗體(Millipore)、HRP標(biāo)記的 β -肌動(dòng)蛋白(β -actin)單克隆抗體(康成)、RIPA細(xì)胞裂解液(含PMSF)(申能博采)、 PVDF膜(Millipore)、ECL發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒(康成)、Epon_812 (Ted Pella)、X感光 膠片(Kodak)和 1640 培養(yǎng)基(Gibico)。本發(fā)明詳細(xì)的具體操作技術(shù)說(shuō)明如下1.多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架的構(gòu)建按本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)人的另一項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)(申請(qǐng)?zhí)?009100401769)上描 述的方法構(gòu)建多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架。即所述的多孔隙明膠海綿PLGA圓 柱體支架可分為兩部分第一部分外殼薄壁是環(huán)繞圓柱體的聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物 (poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)，其由可降解的高分子材料PLGA(聚乳酸與 聚羥基乙酸比值為50 50，分子量為100000)構(gòu)成。0.02毫米厚PLGA薄膜購(gòu)自山東 濟(jì)南岱罡生物技術(shù)公司，材料的構(gòu)建方法如下取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中， 配成5%溶液，待PLGA完全溶解后，澆注與已調(diào)水平的聚四氟模具中，室溫(控制溫度 在20°C)，揮發(fā)24小時(shí)，第二天小心揭下薄膜，反置于模具中24小時(shí)，剪裁到適宜大小 后干燥保存。將薄膜包繞在直徑為3毫米的不銹鋼圓柱磨具上一圈，邊緣用丙酮粘貼， 形成直徑為3毫米的圓筒狀PLGA外殼。使用時(shí)將PLGA外殼剪成2毫米長(zhǎng)度，酒精浸 泡15分鐘，隨后用無(wú)菌D-Hank，s清洗三次，每次10分鐘。第二部分是位于圓柱體中央的無(wú)菌明膠海綿購(gòu)自金陵藥業(yè)公司，在超凈工作臺(tái) 中將其剪成直徑3mm，厚度2mm大小(約l.Omg)，其形貌呈圓柱體，其中的孔隙直徑約 200 600 μ m。將明膠海綿用尖嘴鑷小心塞入消毒好PLGA外殼中。材料無(wú)菌干燥保 存待用。2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定10天SD大鼠窒息處死，經(jīng)碘酒、酒精消毒后，無(wú)菌條件下快速取出兩側(cè)股骨， 放置D-Hanks’平衡液中，清除股骨周?chē)能浗M織，剪去股骨兩端，用含10%胎牛血清 (FBS)的L-DMEM培養(yǎng)液的2ml注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸浮液，并用吸 管輕輕吹打混合成單細(xì)胞懸液，接種至一個(gè)預(yù)先鋪被有多聚賴氨酸的50ml的玻璃培養(yǎng)瓶 中，于37°C，5% CO2中培養(yǎng)。第3天半量換液，以后每隔2 3天全量換液。大約 7 10天細(xì)胞長(zhǎng)至接近融合時(shí)(70% 80%)，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化2min， 按1 3接種傳代(P1R)后繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞再長(zhǎng)至接近融合時(shí)，同樣按照上述方法 1 2進(jìn)行傳代。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，MSCs)的鑒定采用
6成脂成骨誘導(dǎo)檢測(cè)MSCs的多能分化潛能，P3 P5代MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)液(1 μ mol/L 的地塞米松，0.5mmol/L的1_甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)，10 μ g/ml的牛胰島素， 100mmol/L的indomethacin，10 % FBS的H-DMEM)誘導(dǎo)14天后行加入油紅O染色，光
學(xué)顯微鏡下觀察。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(含10_7mol/L地塞米松，lOmmol/L β -甘油磷酸鈉， 50 μ g/ml Vitamin C),誘導(dǎo)分化的第21天進(jìn)行茜素紅S法染色，顯微鏡下觀察結(jié)果。3.大鼠坐骨神經(jīng)中的雪旺細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定選用新生大鼠，分離坐骨神經(jīng)，經(jīng)胰蛋白酶和膠原酶消化后制成分離細(xì)胞懸 液，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清的混合培養(yǎng)液條件下于37°C，CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，加 入阿糖胞苷抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。將原代培養(yǎng)貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶等混合液消化分離， 進(jìn)行傳代培養(yǎng)。從第2代細(xì)胞培養(yǎng)中取部分細(xì)胞進(jìn)行S-IOO免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。4.兩種基因修飾細(xì)胞的制備4.1MSCS和雪旺細(xì)胞的腺病毒載體感染率的測(cè)定用不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的Ad_GFP (報(bào)告基因重組腺病
毒載體)在無(wú)血清培養(yǎng)液中分別感染MSCs和雪旺細(xì)胞3小時(shí)，棄病毒殘液，加入正常培 養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 24小時(shí)，然后用光鏡觀察陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比(感染率)，確定一 個(gè)感染率在80%以上的病毒劑量。4.2TrkC基因修飾MSCs的制備用一定劑量(按測(cè)定感染率的)Ad-TrkC在無(wú)血清培養(yǎng)液中感染MSCs 3小時(shí)， 棄病毒殘液，加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。取少量細(xì)胞用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色 鑒定TrkC基因修飾MSCs的比例，并檢測(cè)其生物活性，結(jié)果見(jiàn)于發(fā)明人發(fā)表的論文 ZhangYQ, Zeng X, HeLM, DingY, LiYan, Zeng YS.NT-3 gene modified Schwann cells promote TrkC gene modified mesenchymal stem cells to differentiate into neuron-like cells in vitro.Anat Scie Inter, 2010，85(2) 61-67。4.3NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞的制備方法基本同上，但改用ELISA方法測(cè)定NT-3基因修飾雪旺細(xì)胞培養(yǎng)液上清中 NT-3的含量，并檢測(cè)其生物活性，結(jié)果見(jiàn)于發(fā)明人發(fā)表的論文ZhangYQ，Zeng X, He LM, Ding Y, Li Yan, Zeng YS.NT-3 gene modified Schwann cells promote TrkC gene modified mesenchymal stem cells to differentiate into neuron-like cells in vitro.Anat Scie Inter, 2010， 85(2) 61-67。5.將上述兩種基因修飾細(xì)胞一起種植在明膠海綿圓柱體支架內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)將明膠海綿圓柱體支架固定在培養(yǎng)皿內(nèi)，按1 1的比例將NT-3基因修飾雪旺 細(xì)胞及TrkC基因修飾MSCs懸液種植在支架內(nèi)，加入常規(guī)培養(yǎng)液，于37°C、5%032培
養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6.在體外用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和電鏡等技術(shù)觀察明膠海綿圓柱體支架內(nèi)TrkC基 因修飾MSCs分化為具有形成突觸潛能的MSCs源性神經(jīng)元及其之間建立突觸聯(lián)系過(guò)程， 以及合成神經(jīng)遞質(zhì)情況取出培養(yǎng)14天含有兩種基因修飾細(xì)胞的明膠海綿圓柱體支架，應(yīng)用免疫熒光細(xì) 胞化學(xué)染色和Western blot等技術(shù)，檢測(cè)已分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞的β -III tubulin、PSD95 和Map2等蛋白表達(dá)。另取標(biāo)本做常規(guī)透射電鏡觀察；用戊二醛固定標(biāo)本，做超薄切片，在電鏡下觀察已分化的MSCs之間形成突觸的情況。7.在體外用電生理技術(shù)檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)MSCs源性神經(jīng)元的電活動(dòng)特 性利用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)自發(fā)性MSCs源性神經(jīng) 元突觸后電位。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析相關(guān)數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Jtis)表示，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent samples t test)分析。P < 0.05表示差異有顯著性意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示l.MSCs和雪旺細(xì)胞的腺病毒感染率測(cè)定結(jié)果用熒光顯微鏡觀察不同MOI感染的情況下，Ad-GFP-MSCs和Ad-GFP-雪旺細(xì)
胞表達(dá)綠色熒光蛋白的情況。在熒光顯微鏡下，綠色熒光蛋白的細(xì)胞顯影呈綠色。流式 細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示，綠色熒光細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比如下表1，隨著MOI的逐漸 增高，這兩種細(xì)胞的感染率都逐漸增高。當(dāng)MOI為80時(shí)，MSCs的感染率為78.5% ； 當(dāng)MOI為10時(shí)，雪旺細(xì)胞的感染率為88.1%，說(shuō)明Ad-GFP在NSCs和雪旺細(xì)胞中獲得 了高效表達(dá)。表1各種感染復(fù)數(shù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和雪旺細(xì)胞(SCs)的感染率(％)
細(xì)胞MOI (pfu/cells)1050100150200300MSCs35.32±4.6341.64 士 8.5261.53±7.7672.05士4.9871.80±9.3273.63±1.56SCs45.99±8.7663.74士7.3489.67±2.5196.64±2.6595.32±3.3293.39±4.252.明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs分化的檢測(cè)Ad-TrkC-MSCs與Ad_NT_3-雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)14天后，支架材料內(nèi) Ad-TrkC-MSCs可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，表現(xiàn)為Nestin (圖IA —所示，陽(yáng)性率為 30.32士 12.50%)、β-III tubulin (圖 IB—所示，陽(yáng)性率為 73.69士 19.72% )、NF (圖 IC 一 所示，陽(yáng)性率為83.85 士 9.27% )和Map2 (圖ID —所示，陽(yáng)性率為85.57 士 7.74% )陽(yáng)性染色。3.檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞突觸形成潛 能Ad-TrkC-MSCs與Ad_NT_3-雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)14天后，支架材料內(nèi) Ad-TrkC-MSCs能分化為具有突觸潛能的神經(jīng)元樣細(xì)胞，其突觸后膜標(biāo)記物PSD95 (圖 2A—所示)的陽(yáng)性率為75.59士6.62%。此外，突觸前膜的標(biāo)記物Synaptophosin為陽(yáng)性染 色(圖2B —所示)、神經(jīng)突起生長(zhǎng)錐的標(biāo)記物GAP-43也為陽(yáng)性染色(圖2C —所示)。4.檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)β "III tubulin、MAP2 禾口 PSD95Ad-TrkC-MSCs與Ad_NT_3-雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)14天后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果 證實(shí)，Ad-TrkC-MSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞均有β -III tubulin (圖3A)、Map2 (圖3B)和PSD95 表達(dá)(圖 3C)。5.明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞間形成的突觸樣
結(jié)構(gòu)Ad-TrkC-MSCs與Ad-NT-3-雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)14天后，透射電鏡結(jié)果顯示，支 架材料內(nèi)的Ad-TrkC-MSCs能夠分化為具有突觸樣結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元樣細(xì)胞。電鏡下，可見(jiàn) 突觸樣結(jié)構(gòu)為不對(duì)稱(chēng)性突觸的特征，突觸前膜內(nèi)有少量中等電子密度的小泡，大小約為 30 50nm ；突觸間隙約為50 80nm，突觸后膜增厚(圖4)。6.檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs源性神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)合成Ad-TrkC-MSCs與Ad_NT_3-雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)14天后，我們檢測(cè)了 Ad-TrkC-MSCs源性神經(jīng)元的膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶Chat(圖5A—所示)、Y-氨基丁酸 GABA (圖5B —所示)和谷氨酰胺Glutamine (圖5C —所示)，發(fā)現(xiàn)這3種神經(jīng)遞質(zhì)均有 陽(yáng)性表達(dá)；其中Chat陽(yáng)性率最高，為70.93士5.14%。7.檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs源性神經(jīng)元的電活動(dòng)特性Ad-TrkC-MSCs與Ad_NT-3_雪旺細(xì)胞共培養(yǎng)14天后，我們應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗 技術(shù)檢測(cè)了 Ad-TrkC-MSCs源性神經(jīng)元的電活動(dòng)特性，觀察到Ad_TrkC_MSCs源性神經(jīng) 元的膜靜息電位為自發(fā)性突觸后電流(圖6)，證實(shí)Ad-TrkC-MSCs源性神經(jīng)元已經(jīng)具有 神經(jīng)元電活動(dòng)功能。


圖1 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs分 化。A.巢蛋白(Nestin) ； B. β-III 微管蛋白(β-III tubulin) ； C.神經(jīng)絲(NF) ； D.微管 相關(guān)蛋白2(Map2)。A、B、C和D中標(biāo)尺=40 μ m。圖2:免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs 分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞突觸形成潛能。A.突觸后致密物95(PSD95) ； B.突觸素 (Synaptophysin) ； C.生長(zhǎng)相關(guān)蛋白 _4；3 (GAP-43)。A、B 和 C 中標(biāo)尺=40 μ m。圖3 Western blot法檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad_TrkC_MSCs分化的神經(jīng)元 樣細(xì)胞表達(dá) β -IIItubulin> Map2 和 PSD95。Α. β -III tubulin ； B.Map2 ； C.PSD95。A、 B和C中內(nèi)參為β -肌動(dòng)蛋白(β -actin)。圖4 透射電鏡檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì) 胞間形成的突觸樣結(jié)構(gòu)。圖5:免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs源 性神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)合成。A.膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(Chat) ； B.谷氨酰胺(Glutamine)； C. Y -氨基丁酸(GABA)。A、B和C中標(biāo)尺為40 μ m。圖6 全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs源性神經(jīng)元的 電活動(dòng)特性。A.玻璃微吸管與明膠海綿圓柱體支架內(nèi)Ad-TrkC-MSCs源性神經(jīng)元形成巨 阻封接。B.膜片鉗記錄到Ad-TrkC-MSCs源性神經(jīng)元產(chǎn)生的自發(fā)性突觸后電流。
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權(quán)利要求
1.一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管支架，尤其是一種用于修復(fù)橫斷性 脊髓損傷的具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管支架材料，其形貌特征是圓柱體支架表面 包裹著由聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)薄膜構(gòu) 成的薄壁，圓柱體中央填充著多孔隙明膠海綿；通過(guò)明膠海綿吸附種植的基因修飾的干 細(xì)胞及其分化細(xì)胞和雪旺細(xì)胞，建造成有利于受損傷神經(jīng)再生及其功能修復(fù)的具有功能 的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修復(fù)神經(jīng)損傷的具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管，其特征 是所吸附種植的細(xì)胞為基因修飾的成體干細(xì)胞及其分化細(xì)胞和雪旺細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管的構(gòu)建方法，尤其是一種用多孔隙明膠海綿圓柱體支架構(gòu)建的具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管的方法及其應(yīng)用。應(yīng)用時(shí)將這種具有功能的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)樣導(dǎo)管移植到全橫斷或半橫斷脊髓的損傷處，可更好地促進(jìn)受損傷中樞神經(jīng)再生和功能修復(fù)。本發(fā)明在生物組織工程水平上加強(qiáng)對(duì)脊髓創(chuàng)傷后保護(hù)受損傷神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建、提高傷病者生存質(zhì)量、減輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)，促進(jìn)我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。
文檔編號(hào)A61F2/04GK102008360SQ20101050613
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者曾園山, 曾湘 申請(qǐng)人:中山大學(xué), 廣州中大中山醫(yī)科技開(kāi)發(fā)有限公司