專利名稱：一種檢測牛瓜氨酸血癥有害基因的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測牛瓜氨酸血癥有害基因的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
隨著人工授精和胚胎移植技術(shù)在奶牛育種中的應用，種質(zhì)產(chǎn)品(個體、凍精、胚胎等)在世界范圍內(nèi)廣泛流通，使得優(yōu)秀公牛種質(zhì)資源充分利用。但在獲得優(yōu)秀生產(chǎn)性能的同時，往往會將遺傳疾病也進行擴散，尤其是常染色體隱性遺傳疾病。常染色體單基因隱性遺傳病是由常染色體上的一對等位基因控制的，只有在該基因為隱性純合的基因型時，個體才會患病。而隱性有害基因攜帶個體表型正常，但是其一旦與攜帶者交配，就會有0. 25的可能性出現(xiàn)患病個體，而且攜帶者個體即使與正常個體交配，也會有0. 5的可能性將有害基因傳遞給后代。這種特點導致它傳播有害基因的幾率非常大。一旦種用個體為常染色體有害基因的攜帶者，并且有良好的生產(chǎn)性能，在盲目追求提高生產(chǎn)性能的目的下，廣泛利用其種用價值，就會導致有害基因的大面積擴散。瓜氨酸血癥(citrullinemia，CN)最早由Harper等在澳大利亞荷斯坦牛群中發(fā)現(xiàn)的一種常染色體單基因隱性遺傳疾病。其分子遺傳學基礎(chǔ)是奶牛11號染色體 (BTAll)上精氨酸合成酶(argininosuccinate synthetase, ASS)基因編碼的第86個氨基酸密碼子發(fā)生無義突變(CGA — TGA)，終止信號提前出現(xiàn)，從而使成隱性純合個體 ASS 功能缺失(Dennis J A, Healy P J, Beaudet A L, et al. Molecular Definition of BovineArgininosuccinate Synthetase Deficiency.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America, 1989,86 :7947-7951. )。ASS參與肝臟的尿素循環(huán)，尿素循環(huán)受阻導致氨代謝障礙，使得血液中瓜氨酸濃度升高，個體產(chǎn)生氨中毒的現(xiàn)象。隱性純合子犢牛一般在M小時內(nèi)開始發(fā)病，出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、以頭頂墻等逐漸加重的神經(jīng)癥狀，最后死亡。病理學研究發(fā)現(xiàn)患病個體大腦皮層受到不同程度的損傷，犢牛從出生到發(fā)病再到死亡的全過程不超過一周(Harper P A W,Healy P J,Dennis J A. Animal Model of Human Disease-Citrullinemia(Argininosuccinate Synthetase Deficiency). American Journal of Pathology, 1989,135 :1213-1215 ；Healy P J,Harper P A W, Dennis J A. Bovine Citrullinaemia-A Clinical, Pathological, Biochemical and GeneticStudy. Australian Veterinary Journal 1，1990，67 :255_258.)。 _ 力禾O 亞科學家通過系譜分析發(fā)現(xiàn)幾乎所有CN患病犢牛都可以追溯到一個共同祖先-澳大利亞優(yōu)秀種公牛Linmack CrissKing，其致病基因來自它的父親Gray View Crisscross。 Linmack Criss King公牛由于其女兒在乳脂率上的良好表現(xiàn)，其凍精在澳大利亞、新西蘭等英聯(lián)邦國家廣泛使用，產(chǎn)生很多攜帶者后代(Healy PJ, Harper P A W, Dennis J A.Bovine Citrullinaemia-A Clinical， Pathological， Biochemical and Genetic Study. Australian Veterinary Journal 1，1990,67 :255-258 ；Healy P J，Dennis J A.， Camilleri L M，et al. Bovine Citrullinaemia Traced to the Sire of Linmack Kriss King. Australian VeterinaryJournal 1，1991,68 :155.)。
目前對CN的分子檢測方法主要是PCR-RFLP，其主要內(nèi)容是1.圍繞突變位點設(shè)計上下游引物，進行分析片段的擴增。2.利用限制性內(nèi)切酶Avail消化擴增片段。3.將消化好的片段進行瓊脂糖電泳檢測分型。如果原擴增片段不被Avail消化成更小的片段，說明存在著有害基因。PCR-RFLP方法雖比較準確實用，但仍存在一定的假陽性，需要重復驗證并結(jié)合系譜和測序結(jié)果進一步驗證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種引物組合物。本發(fā)明提供的檢測瓜氨酸血癥有害基因的引物組合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。序列1所示的引物1由19個核苷酸組成，其對應于序列表中序列6所示的第66 位-84位；其中序列1的第15位是堿基T、這樣人為錯配防止引物間配對用；序列1的第19 位是堿基T，是對應序列6第84位的堿基C突變成的T。序列2所示的引物2由17個核苷酸組成，其對應于序列表中序列6所示的第68 位-84位；其中序列1的第13位是堿基T、這樣人為錯配防止引物間配對用。進一步講，上述瓜氨酸血癥有害基因可以是精氨酸合成酶基因的第86個氨基酸密碼子發(fā)生無義突變的基因，該有害基因的第4個外顯子的核苷酸序列優(yōu)選如序列表中序列6所示。更進一步講，上述引物組合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2 所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3組成。在另一實施例中，上述引物組合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4和序列表中序列5所示的引物5組成，其中所述引物4和引物5為一對內(nèi)標引物。上述引物1和引物3為整體包裝、引物2和引物3為整體包裝，或所述引物1、引物 2和引物3分別單獨包裝。優(yōu)選地，上述引物1、引物2和引物3的摩爾比為1 1 2。一種含有上述的引物組合物的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。上述的引物組合物或上述的試劑盒在檢測牛瓜氨酸血癥有害基因中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。上述應用是通過等位特異性PCR進行檢測的，所述等位特異性PCR包括兩輪PCR 擴增。上述兩輪PCR擴增的1個PCR體系中引物1、引物3的終濃度均為0. 4μ mol/L ；另 1個PCR體系中引物2、引物3的終濃度均為0. 4 μ mol/L。本發(fā)明的試劑盒是采用等位特異性PCR的方法(AS-PCR)，它是一種比較簡單的單堿基位點分型的方法，它通過根據(jù)突變位點設(shè)計兩條3，末端與突變位點分別一致的特異性引物和突變點另一邊的公共引物，特異性引物只能與3，末端堿基嚴格配對的模板結(jié)合，并擴增出相應產(chǎn)物，而不配對的模板不被擴增。這樣通過兩輪不同特應性引物的PCR擴增，就能知道模板鏈的堿基組成。從而對位點進行分型。本發(fā)明的試劑盒進行AS-PCR與PCR-RFLP 結(jié)果比較，其結(jié)果更準確有效。
用本發(fā)明的試劑盒篩查荷斯坦奶牛瓜氨酸血癥(CN)有害基因的攜帶者時，可以待測荷斯坦奶牛的基因組DNA為模板，利用特異性引物(其核苷酸序列分別為序列表中的序列1或序列2)和公共引物(其核苷酸序列分別為序列表中的序列3所示)進行2次PCR 擴增，同時在PCR體系中加入一對內(nèi)標引物(其核苷酸序列分別為序列表中的序列4和序列5所示)來擴增出一條內(nèi)標條帶，然后按照下述方法對AS-PCR結(jié)果進行2%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果分析如果內(nèi)標條帶出現(xiàn)，說明PCR體系和模板沒有問題。如果內(nèi)標條帶沒出現(xiàn)， 則更換PCR體系或模板，直到內(nèi)標條帶出現(xiàn)。然后看特異性引物的目的條帶是否出現(xiàn)，如果出現(xiàn)表明突變位點的堿基與特異性引物3’末端的堿基一樣，如果沒有出現(xiàn)，就說明該位點與引物3’末端的堿基不符。采用本發(fā)明的試劑盒對瓜氨酸血癥(CN)有害基因的攜帶者和正常個體(非CN有害基因攜帶者)分別進行AS-PCR檢測，實驗證明=AS-PCR擴增分型結(jié)果和測序結(jié)果與預期沒有偏差，說明特異性引物的擴增特異性很高，可以分辨單堿基變化；且內(nèi)標條帶也能夠指示DNA和PCR體系質(zhì)量，排除假陰性存在的可能性，說明本發(fā)明試劑盒檢測CN有害基因的準確性很高。本發(fā)明試劑盒的應用克服了上述PCR-RFLP檢測方法存在的缺陷。具有操作更簡便、快速；成本更低廉；準確性更高，更可靠、穩(wěn)定；實用性更強，適合大規(guī)模應用的優(yōu)點。


圖1為本發(fā)明的試劑盒進行檢測的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。M表示MarkeH依次為 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，4、8、21 為有害基因攜帶者(21 和 4 的 DNA 樣品一致)，其余21個為正常個體；圖1-1的388bp目標條帶是由引物序列1和序列3擴增，目標條帶出現(xiàn)表明突變位點堿基為T，不出現(xiàn)堿基不為T ；圖1-2的386bp目標條帶是由引物序列2和序列3擴增，目標條帶出現(xiàn)表明突變位點堿基為C，不出現(xiàn)堿基不為C。157bp內(nèi)標條帶用于檢測PCR體系和DNA模板是否存在問題，如1-1圖中13內(nèi)標條帶弱，需要重新擴增，排除假陰性問題(模板和體系問題導致目標條帶擴增不出來)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、利用檢測瓜氨酸血癥(CN)有害基因攜帶者的試劑盒篩查CN有害基因攜帶者—、檢測瓜氨酸血癥有害基因攜帶者的試劑盒檢測瓜氨酸血癥有害基因攜帶者的試劑盒包含PCR反應試劑、瓊脂糖凝膠電泳試劑和溴化乙啶貯存液。其中，PCR反應試劑包括Taq DNA聚合酶(5U/μ L)、10XPCR緩沖液(含Mg2+， 15mmol/L) ,dNTPs(4X2. 5mmol/L)，其中，iTaq DNA 聚合酶、PCR 緩沖液、dNIPs 均購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司(TaKaRa產(chǎn)品代理商)，上述試劑的商品目錄號為DR001B。每條引物的濃度均為20ymol/L。該引物是2條特異性引物、1條公共引物和1對內(nèi)標引物，其中特異性引物為序列表中序列1和序列2所示的引物1和引物2 ；公共引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示；內(nèi)標引物的正向引物的序列為序列表中序列4所示的核苷酸序列，反向引物的序列為序列表中序列5所示的核苷酸序列。 瓊脂糖水平凝膠電泳試劑50 X TAE =Tris堿242g、冰乙酸57. lmL、0. 5mol/ LEDTA (pH = 8. 0) lOOmL，加水充分溶解，定容至1L。
瓊脂糖購自北京東勝泰博科技有限公司。溴化乙啶貯存液Ig溴化乙啶溶于IOOmL蒸餾水中。二、利用上述步驟一的試劑盒篩查荷斯坦奶牛CN有害基因攜帶者1、精液DNA的提取根據(jù)前期利用PCR-RFLP方法對參加青年公牛后裔測定和國家良種補貼項目的中國荷斯坦公牛進行的CN檢測結(jié)果，選取21頭正常公牛和2頭CN有害基因攜帶者公牛的管制凍精用于提取基因組DNA，獲得提取好的精液DNA。2、AS-PCR 擴增檢測AS-PCR擴增的特異性引物的序列為兩個正向引物序列，分別為AGC GCA CTG TACGAT GAC T (如序列表中序列1所示)禾Π CGC ACT GTA CGA TGA CC (如序列表中序列2 所示)，公共引物的序列(即反向引物序列)為GCG GGA ACA TGG GAG AC(如序列表中序列3所示)。另外還有內(nèi)標條帶的引物，即內(nèi)標引物，內(nèi)標引物的正向引物序列為TGC TTA TGG GAG AA6GG(如序列表中序列4所示)，內(nèi)標引物的反向引物序列為AGTTAA CCA CAC CAA ACG(如序列表中序列5所示)。上述引物均由英濰捷基公司合成。采用上述步驟一的試劑盒進行2輪PCR擴增檢測。2輪PCR擴增反應總體系均為 20 μ L，其中精液的基因組DNA均大于50ng ；—個PCR體系的加入上游特異性引物(引物1/ 引物2)和下游公共引物(引物3)各0.4yL(也即特異性引物和公共引物在一個PCR體系中的終濃度均為0. 4μ mol/L)，內(nèi)標條帶上下游引物各為0. 8 μ L ；四種dNTPl. 6 μ L ；Taq DNA聚合酶1.5U;10XPCR緩沖液(含Mg2+)2yL。擴增條件為先94°C預變性5min ；然后 940C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30min，共；35 個循環(huán)；最后 72°C 延伸 7min。將PCR擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，對 2頭CN攜帶者ASS基因的2輪PCR擴增分別得到388bp和386bp的目的條帶，并且同時都得到清晰的內(nèi)標條帶擴增產(chǎn)物。健康個體(21頭正常公牛)的針對ASS基因的2輪PCR擴增，僅包含3’末端為C的特異性引物的擴增體系獲得386bp的目的條帶，而包含另一特異性引物的擴增體系未出現(xiàn)388bp的擴增產(chǎn)物，但是內(nèi)標條帶在兩個體系中均出現(xiàn)。在實驗中如果內(nèi)標條帶不出現(xiàn)，則說明DNA或PCR體系存在問題，要檢測DNA樣品和PCR試劑。直到能擴增出內(nèi)標條帶，比較著看目的條帶的有無，來排除假陰性。3、檢測結(jié)果的序列分析將上述步驟2中得到的2頭CN攜帶者ASS基因的388bp和的PCR擴增產(chǎn)物，以及其中3頭正常個體ASS基因的386bp PCR產(chǎn)物進行序列分析。測序采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法，由北京優(yōu)博奧生物技術(shù)有限公司完成。測序結(jié)果表明388bpPCR產(chǎn)物顯示ASS基因外顯子4的第82位(即GenBank Accession Number NC_007309的自5'端第 11484位)堿基為單堿基T (有害基因)，386bpPCR產(chǎn)物顯示ASS基因外顯子4的第82位 (即 GenBank Accession Number NC_007309 的自 5'端第 11484 位)堿基為單堿基 C(正?；?。當個體擴增出內(nèi)標條帶，并且通過2個PCR體系獲得388和386bp兩條時，則該個體為CN有害基因攜帶者(CT)。如果內(nèi)標條帶出現(xiàn)，但是只擴增出386bp的目的條帶，那么該個體為正常個體(CC)。該測序結(jié)果與AS-PCR擴增結(jié)果一致。 綜上通過測序進一步驗證，可知AS-PCR擴增分型結(jié)果和測序結(jié)果與預期沒有偏差，說明特異性引物的擴增特異性很高，可以分辨單堿基變化。而且，內(nèi)標條帶也能夠指示 DNA和PCR體系質(zhì)量，排除假陰性存在的可能性。說明該試劑盒檢測CN有害基因的準確性很高。并且操作簡單，適合大規(guī)模應用。
權(quán)利要求
1.一種檢測瓜氨酸血癥有害基因的引物組合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。
2.如權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于所述瓜氨酸血癥有害基因是精氨酸合成酶基因的第86個氨基酸密碼子發(fā)生無義突變的基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的引物組合物，其特征在于所述引物組合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3組成。
4.如權(quán)利要求1或2所述的引物組合物，其特征在于所述引物組合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4和序列表中序列5所示的引物5組成。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的引物組合物，其特征在于所述引物1和引物3為整體包裝、引物2和引物3為整體包裝，或所述引物1、引物2和引物3分別單獨包裝。
6.如權(quán)利要求1-5中任一所述的引物組合物，其特征在于所述引物1、引物2和引物 3的摩爾比為1:1:2。
7.一種含有權(quán)利要求1-6中任一所述的引物組合物的試劑盒。
8.權(quán)利要求1-6所述的引物組合物或權(quán)利要求7所述的試劑盒在檢測所述瓜氨酸血癥有害基因中的應用。
9.如權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于所述應用是通過等位特異性PCR進行檢測的，所述等位特異性PCR包括兩輪PCR擴增。
10.如權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于所述兩輪PCR擴增的1個PCR體系中引物1、引物3的終濃度均為0. 4 μ mol/L ；另1個PCR體系中引物2、引物3的終濃度均為 0. 4μ mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測牛瓜氨酸血癥有害基因的方法及其專用引物。本發(fā)明提供的檢測瓜氨酸血癥有害基因的引物組合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。采用本發(fā)明的專用引物對瓜氨酸血癥(CN)有害基因的攜帶者和正常個體(非CN有害基因攜帶者)分別進行AS-PCR檢測，實驗證明AS-PCR擴增分型結(jié)果和測序結(jié)果與預期沒有偏差，說明特異性引物的擴增特異性很高，可以分辨單堿基變化；且內(nèi)標條帶也能夠指示DNA和PCR體系質(zhì)量，排除假陰性存在的可能性，說明本發(fā)明試劑盒檢測CN有害基因的準確性很高。
文檔編號C12N15/11GK102181529SQ20111006511
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者孫東曉, 張毅, 張沅, 楊鳴洲, 謝巖 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學