專利名稱：木質(zhì)纖維素材料在亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽和/或二硫蘇糖醇存在下的酶水解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的糖化中改善酶水解的方法。該方法提供在制造各種目標(biāo)化合物中作為基質(zhì)(substrate)有用的糖。該方法尤其在從木質(zhì)纖維素材料制造發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇中是有用的。
背景技術(shù)：
從可再生資源生產(chǎn)商品的生物精煉提供對于基于減少的石油供應(yīng)的油精煉的替代，并且允許向改善的能源安全性的前進。來自林業(yè)和農(nóng)業(yè)的木質(zhì)纖維素材料作為原料是有吸引力的，因為它們充裕、相對便宜并且不用于食物。木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素和兩類多糖(纖維素和半纖維素)組成。多糖可水解成糖并且在基于生物催化劑如工業(yè)上重要的面包酵母(釀酒酵母)的工藝中轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N發(fā)酵產(chǎn)物、如生物醇。預(yù)處理典型地在纖維素的水解之前，其中將半纖維素降解，并且使纖維素對于水解纖維素的酶或酸水解愈加易使用(accessible)。木質(zhì)纖維素材料的酶水解被認(rèn)為是從纖維素獲得高產(chǎn)率葡萄糖的最有前途的方法。通過利用酶水解，水解和發(fā)酵可在同時的糖化和發(fā)酵(SSF)方法或在合并的(consolidated)生物方法(CBP)中同時進行。或者，可以使用分開的水解和發(fā)酵(SHF)，即還可包括該纖維素的基于酶的水解的方法配置。為了從木質(zhì)纖維基質(zhì)獲得高產(chǎn)率的糖，稀酸水解預(yù)處理和/或使用酸催化劑的蒸汽預(yù)處理被認(rèn)為是合適的預(yù)處理方法。而且，在將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)物如纖維素乙醇的工業(yè)過程中，預(yù)處理之后獲得的全部漿料將可能以高固體濃度使用。然而，已知預(yù)處理液體抑制酶水解。

以前，已經(jīng)考慮添加表面活性劑用于改善纖維素基質(zhì)的酶糖化。表面活性劑可能防止酶與復(fù)雜木質(zhì)纖維基質(zhì)如預(yù)處理的木材的非生產(chǎn)性連接(結(jié)合，binding)。然而，向用于生產(chǎn)產(chǎn)率敏感的低附加值產(chǎn)物如液體生物燃料的反應(yīng)混合物中添加表面活性劑的經(jīng)濟效益具有爭議。酶的添加構(gòu)成從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)產(chǎn)物的方法的總成本的相當(dāng)大的部分。酶的成本例如被認(rèn)為是將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為液體生物燃料的工業(yè)實踐中的主要障礙之一。因此，希望改善木質(zhì)纖維素材料的酶水解的效率，例如希望從一定酶劑量和時間期間獲得更多的糖，或希望在相同的時間期間從較少的酶劑量獲得相同量的糖。還希望實現(xiàn)用一定酶劑量在較短的時間期間內(nèi)獲得一定量的糖，因為這增加生產(chǎn)能力，并且由此允許改善產(chǎn)量和/或減少投資成本。改善纖維素的酶水解的效率可明顯有助于基于源自木質(zhì)纖維素的糖的產(chǎn)品的商業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是改善在從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)糖和下游產(chǎn)物的方法中的效率。本發(fā)明的目的還在于改善在木質(zhì)纖維素材料的糖化中的酶水解的效率。
本發(fā)明的一個目的是增加在木質(zhì)纖維素材料的糖化中的生產(chǎn)能力。進一步目的是在預(yù)處理的液體存在下改善在木質(zhì)纖維素材料的糖化中的酶水解。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將從以下公開內(nèi)容明白的這些或其它目的，本發(fā)明根據(jù)第一方面提供用于改善木質(zhì)纖維素材料的糖化中的酶水解的方法，所述方法包括:預(yù)處理所述木質(zhì)纖維素材料以獲得經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料；向經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分(部分，fraction)添加至少一種還原劑，以降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解抑制性能；和使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分在所述至少一種還原劑存在下經(jīng)歷酶水解。在優(yōu)選實施方式中，將所述至少一種還原劑添加到經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料中；和使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料在所述至少一種還原劑的存在下經(jīng)歷酶水解。在一個優(yōu)選實施方式中，所述方法用于從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)一種或多種所需的目標(biāo)化合物，并且還包括將經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料用作用于生產(chǎn)目標(biāo)化合物的基質(zhì)的步驟。在一些優(yōu)選實施方式 中，所述一種或多種所需de目標(biāo)化合物是發(fā)酵產(chǎn)物，并且利用經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料的步驟包括使經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷發(fā)酵。在具體的實施方式中，酶水解步驟與發(fā)酵步驟獨立進行。在其它實施方式中，酶水解和發(fā)酵在單一步驟中同時進行。在一些實施方式中，所述發(fā)酵產(chǎn)物包括選自乙醇、丁醇和丁二酸的發(fā)酵產(chǎn)物，并且優(yōu)選為乙醇。在本發(fā)明的方法的一些其它的優(yōu)選實施方式中，目標(biāo)化合物是乙酰丙酸。在一個優(yōu)選實施方式中，所述至少一種還原劑選自硫氧陰離子(sulfuroxyanion)、巰基試劑(reagent)、氫化物和氧化還原酶。在具體的實施方式中，所述至少一種還原劑選自亞硫酸鹽(亞硫酸根，sulfite)、連二亞硫酸鹽(連二亞硫酸根,dithionite)和二硫蘇糖醇。本發(fā)明根據(jù)第二方面還提供至少一種還原劑用于降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解抑制性能的新用途。在優(yōu)選實施方式中，所述用途用于降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料的酶水解抑制性能。在一個優(yōu)選實施方式中，所述至少一種還原劑選自硫氧陰離子、巰基試劑、氫化物和氧化還原酶。在具體的實施方式中，所述至少一種還原劑選自亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽和二硫蘇糖醇。


圖1是顯示添加不同還原劑(15mM)在120小時之后對Avicel (微晶纖維素)的糖化的影響的圖。圖2是顯示添加15mM連二亞硫酸鹽對經(jīng)預(yù)處理的云杉漿料的糖化的影響的圖。
具體實施例方式本發(fā)明總體上基于如下發(fā)現(xiàn):通過添加還原劑可增強纖維素基質(zhì)在木質(zhì)纖維素預(yù)處理之后獲得的液體級分的存在下的酶水解。該方法不同于已知的向預(yù)處理中添加試劑如硫酸、二氧化硫和亞硫酸鹽，以使在高溫下進行的預(yù)處理更有效。在預(yù)處理中添加這些試劑利用它們的酸性性能并且將木質(zhì)纖維基質(zhì)和其對酶水解的易感性(susceptibility)作為目標(biāo)，而根據(jù)本發(fā)明在預(yù)處理之后添加還原劑意在將預(yù)處理液體中的酶抑制物(inhibitor)作為目標(biāo)。本方法還不同于添加還原劑以獲得木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的改善的發(fā)酵性能，因為后者情況中的目的是減輕抑制物對發(fā)酵生物(organism)的影響，而不是如本文中所述的抑制物對酶水解的影響。根據(jù)第一方面，提供在木質(zhì)纖維素材料的糖化中改善酶水解的方法。糖化指將木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化或水解成單和二糖。所述改善可包括例如，增加纖維素消耗率，增加預(yù)處理和水解過程中產(chǎn)生的糖的總量，增加在預(yù)處理和水解過程中在所使用的木質(zhì)纖維素上的糖產(chǎn)率，或增加體積目標(biāo)化學(xué)品的生產(chǎn)率，例如以(g目標(biāo)化合物Xr1XtT1)測量。還可包括在水解步驟中使用更低濃度的酶或更短的時間期間維持這些參數(shù)中的一種或多種。在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)，“糖”指可發(fā)酵的糖如單糖和二糖。該方法包括如下步驟:預(yù)處理所述木質(zhì)纖維素材料以獲得經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料；向經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分添加至少一種還原劑以降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解抑制性能；和使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分在至少一種還原劑的存在下經(jīng)歷酶水解。本發(fā)明的方法涉及木質(zhì)纖維素材料如木屑的處理。術(shù)語木質(zhì)纖維素材料包括源自木質(zhì)纖維素的材料，即可從木質(zhì)纖維素材料獲得的材料，其包括纖維素、木質(zhì)素和可能的半纖維素。源自木質(zhì)纖維素的材料可例如源自木材材料或林業(yè)殘余物如木屑、鋸木廠或造紙廠廢棄物，或農(nóng)業(yè)殘余物例如玉米(corn)。作為實例,源自木質(zhì)纖維素的材料可是源自木材的材料或源自甘蔗渣的材料。取決于地理位置，木材或甘蔗渣可以大批量獲得，使它們作為原材料是有吸引力的。木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素和兩類多糖(纖維素和半纖維素)組成。在木質(zhì)纖維素的糖化中，多糖水解成糖，包括二糖和單糖。如在本文中使用的，水解指使木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷水解條件，使得游離糖在水解產(chǎn)物中對于進一步處理例如發(fā)酵變得易使用的(accessible)。游離糖在制造所需產(chǎn)物如醇、優(yōu)選乙醇中是有用的。在本發(fā)明的方法中，使木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷預(yù)處理，其中半纖維素被降解，并且使纖維素對于水解纖維素的酶或酸水解是愈加易使用的。預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料是指使木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷使得纖維素在隨后的水解過程中變得更易使用的條件。預(yù)處理可以包括一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的預(yù)處理方法。作為實例，可在升高的溫度下用酸、典型地稀釋的無機酸如硫酸或堿進行預(yù)處理。預(yù)處理可以包括浸潰，其指用浸潰流體浸潰纖維素材料，隨后進行加熱。在酸預(yù)處理的情況中，浸潰流體可是酸溶液如無機酸溶液。浸潰也可以用氣體如SO2氣體或CO2氣體，或用氣體與液體的組合以獲得例如亞硫酸或碳酸而進行。升高的溫度可通過汽蒸實現(xiàn)，所述汽蒸是用于將氣體從纖維素生物質(zhì)排出以促進纖維素水解的方法。汽蒸是預(yù)處理例如木質(zhì)纖維生物質(zhì)的眾所周知的方法。作為另一實例，預(yù)處理可包括蒸汽爆發(fā)，其是組合蒸汽、快速的壓力釋放和水解以使纖維素纖維斷裂的工藝。根據(jù)預(yù)處理類型，在隨后的 酶水解之前中和經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料可是期望的。例如，經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料可通過緩沖劑或添加NaOH或氨進行中和。同樣，可使用CaOH2。
優(yōu)選的預(yù)處理包括在升高的溫度例如120_220°C的范圍下使木質(zhì)纖維素材料經(jīng)受硫酸、亞硫酸或二氧化硫，典型地進行1-60分鐘。該預(yù)處理提供經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料，其中半纖維素被降解，并且使纖維素對于水解纖維素的酶或酸水解是愈加易使用的。漿料的懸浮固體含量典型地在5-40%(w/v)Jn8-30%(w/v)Jni2-20%(w/v)的范圍內(nèi)。本發(fā)明基于以下觀測:漿料具有酶水解抑制性能，并且這些抑制性能存在于該漿料的液體級分中?？稍谀举|(zhì)纖維原料預(yù)處理之后將獲得的漿料的液體和固體級分分離，并且在無液體級分存在下進行酶水解。然而，為了實際目的和總體工藝效率和經(jīng)濟性，期望在隨后的酶水解過程中使用經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的全部漿料。在預(yù)處理后，使木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷酶水解。酶水解指被至少一種酶催化的水解反應(yīng)。所述至少一種酶可是至少一種糖化酶，其指可將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化或水解成可發(fā)酵糖如單糖和/或二糖的至少一種酶。這樣的糖化酶可是糖苷酶，其水解多糖。糖苷酶的實例包括纖維素水解糖苷酶，如纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β -葡糖苷酶；半纖維素水解糖苷酶，如木聚糖酶、木聚糖內(nèi)切酶、木聚糖外切酶、β -木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、果膠酶和葡萄糖醛酸酶；和淀粉水解糖苷酶，如淀粉酶、α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶和異淀粉酶；或在EC3.2.1.X如EC3.2.1.4中找到的酶的組中的任何酶，其中EC是酶學(xué)委員會(EnzymeCommission)號。在一個實施方式中，所述至少一種酶來源于包括Hypocreajecorina (Trichoderma reseei)的絲狀真菌?，F(xiàn)在令人驚訝地意識到:在酶水解中包含還原劑使得可在經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分中獲得更有效的酶糖化過程。因此，經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解抑制性能可通過向經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分添加至少一種還原劑而降低。
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在本發(fā)明的方法中，經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分隨后在至少一種還原劑的存在下經(jīng)歷酶水解。該步驟提供經(jīng)糖化的木質(zhì)纖維素材料，例如單和二糖，其可以被發(fā)酵，或用作生產(chǎn)所需目標(biāo)化合物的基質(zhì)。液體級分可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式，例如通過允許固體沉淀并且將液體級分傾析、通過離心、通過過濾或這些方法的結(jié)合，從經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料中分離。液體級分的懸浮固體含量典型地低于1.0%(w/v)，如低于0.5%(w/v)，如低于0.l%(w/v)。在一個實施方式中，將所述至少一種還原劑添加到經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料的液體級分。注意:雖然纖維素酶通常對固相材料起作用，但纖維二糖酶在液相中是活性的。因此，在一個實施方式中，將所述至少一種還原劑添加到經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料的液體級分，并且然后在所述至少一種還原劑的存在下通過纖維二糖酶使液體級分經(jīng)歷酶水解。實際上，避免對于經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的不同部分的分離程序和單獨的處理是方便的。在優(yōu)選實施方式中，將所述至少一種還原劑添加到經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料。然后使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料在所述至少一種還原劑的存在下經(jīng)歷酶水解。如以下實施例中所示，向經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料(其經(jīng)歷酶水解)中添加至少一種還原劑的有益影響在至少兩方面是令人驚訝的:首先，觀察到在其中液相由含水檸檬酸鹽緩沖劑組成的實驗中添加還原劑對纖維素的酶水解具有消極影響，但在經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料中或在其液體部分存在下具有積極影響。不希望局限于任何具體的理論，該結(jié)果表明所述還原劑通過保護酶不受在預(yù)處理液體中存在的化合物而起作用。第二，不管二氧化硫/亞硫酸鹽是否被用于預(yù)處理過程中，在預(yù)處理之后添加還原劑對經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解是有益的?！斑€原劑”指能使其它物質(zhì)還原而其本身被氧化的化學(xué)試劑，即能在氧化還原反應(yīng)中給電子的化學(xué)試劑。還原劑與發(fā)酵生物如酵母是相容的。在優(yōu)選實施方式中，所述至少一種還原劑選自硫氧陰離子、巰基試劑、氫化物和氧化還原酶。在一個優(yōu)選實施方式中，所述至少一種還原劑包括硫。作為實例，所述至少一種還原劑可選自連二亞硫酸鹽(根)、亞硫酸鹽(根)和二硫蘇糖醇。這些還原劑已經(jīng)顯示適用于降低酶水解的抑制，如本公開內(nèi)容的實施例所示。連二亞硫酸根和亞硫酸根(在用于酶糖化的PH下的亞硫酸氫根)是硫氧陰離子。來源于二氧化硫氣體或添加的鹽的亞硫酸根(S032_)用 在若干包括木質(zhì)纖維素基質(zhì)的預(yù)處理的大規(guī)模工業(yè)過程中。連二亞硫酸根(S2O42O是在紙漿和紙工業(yè)中用于還原性的漂白和在紡織工業(yè)用作染色工藝中的還原劑的工業(yè)化學(xué)品。因此，亞硫酸根和連二亞硫酸根兩者均可大量獲得。進一步，理解:還原劑可以包括鹽形式的亞硫酸根和/或連二亞硫酸根，即與不同陽離子絡(luò)合。實例包括Na2S03、NaHS03、KHSO3和Na2S204。二硫蘇糖醇(DTT)(也稱為Cleland試劑)表示巰基化合物。考慮到已知DTT有效減少蛋白質(zhì)中二硫鍵，其在本文中是令人感興趣的。因此，還原劑如DTT由于使具有二硫橋的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定而試驗性地具有不利影響。作為實例，還原劑可是連二亞硫酸鹽，并且連二亞硫酸鹽可以使得酶水解過程中的連二亞硫酸鹽的濃度高于ImM、如高于5mM，或在l_30mM、如5_25mM、如7.5_20mM的范圍內(nèi)的量添加。作為進一步實例，還原劑可以是亞硫酸鹽，并且亞硫酸鹽可以使得酶水解過程中的亞硫酸鹽的濃度高于ImM、如高于5mM，或在l_30mM、如5_25mM、如7.5-20mM的范圍內(nèi)的量添加。作為又一實例，還原劑可以是二硫蘇糖醇，并且二硫蘇糖醇可以使得酶水解過程中的二硫蘇糖醇的濃度高于ImM、如高于5mM，或在l_30mM、如5_25mM、如7.5_20mM的范圍內(nèi)的量添加。如本公開內(nèi)容的實施例所示，連二亞硫酸鹽、亞硫酸鹽和二硫蘇糖醇的這些濃度已經(jīng)分別顯示適用于降低酶水解的抑制。然而，添加超過IOOmM的亞硫酸鹽對隨后的發(fā)酵過程可為不利的。因此，實現(xiàn)降低酶水解抑制性能所需要的還原劑的量相對低，并且來自本公開內(nèi)容的實施例的結(jié)果顯示:還原劑的這樣的量允許生產(chǎn)高水平的糖?？梢杂米鬟€原劑的其它化合物包括硫代硫酸鹽(S2 032_)如Na2S2O3.5Η20和Na2S203、堿分解的糖、抗壞血酸、半胱氨酸、二乙醇胺、三乙醇胺和還原的谷胱甘肽。硫氧陰離子，如亞硫酸根和連二亞硫酸根，也可將木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的發(fā)酵能力有效地改善到給予與基于合成糖溶液的參比發(fā)酵所獲得的類似的發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率的水平。硫氧陰離子用于改善預(yù)處理和發(fā)酵能力的有效性使本文提出的增加酶水解效率的方法從工業(yè)角度看甚至更有吸引力，因為相同的化學(xué)品可用于所述工藝的不同部分中的不同目的。如上所述，本方法提供經(jīng)糖化的木質(zhì)纖維素材料，例如單和二糖，其可以被發(fā)酵，或用作生產(chǎn)所需目標(biāo)化合物的基質(zhì)?？蓪⑦@些糖在各種化學(xué)和生化(例如酶催化的)方法中用作用于生產(chǎn)所需的目標(biāo)化合物的基質(zhì)。舉例來說，所述糖可用于熱化學(xué)法以生產(chǎn)乙酰丙酸，其轉(zhuǎn)而是合成聚合物、塑料和藥物的中間體。它還是其它化學(xué)商品如甲基四氫呋喃、戊內(nèi)酯和乙酰丙酸乙酯的工業(yè)生產(chǎn)中的前體。根據(jù)一個實施方式，所述方法還包括如下步驟:將經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料用作用于生產(chǎn)目標(biāo)化合物的基質(zhì)。如果在酶水解之前將已經(jīng)液體級分從經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料中分離，進一步將該經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料用作用于生產(chǎn)目標(biāo)化合物的基質(zhì)可用單獨的液體級分進行?；蛘?，液體級分可與其來源于的原始漿料組合，該漿料也已經(jīng)經(jīng)歷酶水解，然后進行進一步的使用。本方法還提供在從木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物制造發(fā)酵產(chǎn)物中獲得木質(zhì)纖維素的更有效的糖化的方法。本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物的實例包括醇、酸、烷烴、烯烴、芳族化合物、醛、酮、生物聚合物、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、維生素、抗生素和其它藥物。在一個實施方式中，該發(fā)酵產(chǎn)物選自乙醇、丁醇和丁二酸。優(yōu)選的發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。因此，本發(fā)明的方法還提供從木質(zhì)纖維素材料有效生產(chǎn)燃料如乙醇和其它化學(xué)品。根據(jù)一個實施方式，所述方法用于在從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物中改善木質(zhì)纖維素的糖化，并且進一步包括使經(jīng)預(yù)處理和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷發(fā)酵的步驟。如果在酶水解之前已經(jīng)將液體級分從經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料中分離，該經(jīng)預(yù)處理和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料的進一步的發(fā)酵可用單獨的液體級分進行。任選地，使經(jīng)發(fā)酵的液體級分隨后返回到原始的漿料，并且促進單糖從漿料的固體中釋放(liberation)?；蛘?，可將液體級分與原始漿料組合，該漿料也已經(jīng)經(jīng)歷酶水解，然后進行發(fā)酵。經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料的發(fā)酵可通過發(fā)酵生物進行，所述發(fā)酵生物指能將糖例如單或二糖發(fā)酵成發(fā)酵產(chǎn)物的生物。發(fā)酵生物可是至少一種真核或原核微生物如細(xì)菌和/或酵母。能將糖發(fā)酵成其它化學(xué)化合物的細(xì)菌和酵母的實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。來自酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和假絲酵母屬(Candida)的酵母可用可作發(fā)酵生物。發(fā)酵生物可例如為野生型、突變或重組釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。使用用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的釀酒酵母(S.cerevisiae)是有利的，因為釀酒酵母(S.cerevisiae)相對于工業(yè)發(fā)酵是沿用已久的，并且提供高的產(chǎn)物產(chǎn)率。在一個實施方式中，發(fā)酵是經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的同時糖化和發(fā)酵(SSF)。SSF工藝指其中酶水解和發(fā)酵在發(fā)酵罐中同時進行的工藝。因此，在SSF工藝中，可發(fā)酵的糖通過經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的酶水解在發(fā)酵罐中直接制備，并且將所得的糖轉(zhuǎn)化為發(fā)酵產(chǎn)物。進一步，發(fā)酵可是合并的生物工藝(CBP)，其中轉(zhuǎn)化單糖的生物催化劑還產(chǎn)生使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料水解的酶。在另一實施方式中，經(jīng)歷發(fā)酵的水解產(chǎn)物在 與發(fā)酵步驟分開的步驟中從經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的酶水解獲得。因此，酶水解和發(fā)酵可以兩個分開的工藝步驟進行(分開的水解和發(fā)酵，SHF)。如果發(fā)酵反應(yīng)和酶促反應(yīng)具有不同的最佳的溫度，這可例如是有利的。作為實例，在酶水解過程中的溫度可維持高于發(fā)酵過程中的溫度，因此促進嗜熱酶的使用。雖然酶水解通常在發(fā)酵步驟之前進行，注意:可使發(fā)酵材料或其部分例如液體級分返回到原始漿料，并且促進單糖從漿料中的固體釋放，其可隨后經(jīng)歷發(fā)酵。根據(jù)第二方面，提供至少一種還原劑用于降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解抑制性能的新用途。在優(yōu)選實施方式中，所述至少一種還原劑特別地對于降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料的酶水解抑制性能是有用的。如上所述，所述至少一種還原劑優(yōu)選地選自硫氧陰離子、巰基試劑、氫化物和氧化還原酶，如亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽和二硫蘇糖醇。用以下非限制性實施例舉例說明本發(fā)明。實施例實施例1-預(yù)處理來自云杉的木質(zhì)纖維素材料挪威云杉(Picea abies)的剝皮(unbarked)木屑的預(yù)處理通過在203°C的溫度下在30升反應(yīng)器中用二氧化硫以連續(xù)模式處理5分鐘而進行。每40公斤木屑使用Ikg 二氧化硫。在預(yù)處理之后，該漿料的PH是2，并且干物質(zhì)含量為16%。將經(jīng)預(yù)處理的材料的漿料冷卻到室溫，并且在4°C下存儲直至進一步使用。在包含于反應(yīng)混合物以前，利用5M的NaOH溶液將漿料的pH調(diào)節(jié)到5.2，并且用水稀釋該漿料，以獲得所需的纖維素基質(zhì)濃度。經(jīng)預(yù)處理的云杉的液體級分，下文被稱為預(yù)處理液體，通過過濾獲得。在預(yù)處理液體中的單糖、乙酸和呋喃醛的濃度是:22.7g/l甘露糖、18.4g/l葡萄糖、11.3g/l木糖、
5.6g/l半乳糖、3.6g/l阿拉伯糖、5.6g/l乙酸、3.6g/15_羥甲基糠醛(HMF)和2.lg/Ι糠醛。在包含于反應(yīng)混合物中前，利用5M的NaOH溶液將經(jīng)預(yù)處理的液體的pH調(diào)節(jié)到5.2。經(jīng)預(yù)處理的云杉木材的濾餅通過漿料的過濾并且用4-5體積的蒸餾水洗滌固體級分而獲得。然后將得到的濾餅在爐中在70°C干燥過夜，通過使用IKA All基礎(chǔ)(basic)分析研磨機(IKA，Staufen，德國)進行研磨，并且在室溫下存儲直至使用。濾餅的干物質(zhì)含量利用濕度分析器(MJ33, Mettler Toledo,瑞士)進行分析。實施例2-微晶纖維素的酶糖化水解實驗在IOOml裝備有棉塞并且包含具有25g的總質(zhì)量的反應(yīng)混合物的E-燒瓶中進行。所述混合物包含:反應(yīng)介質(zhì)，實施例1的預(yù)處理液體或0.05M朽1檬酸鹽緩沖溶液，pH5.2 ；10%(w/w)微晶纖維素 Avicel PHlOl (Fluka, BuchsJgi);和由等量 Celluclastl.5L 和 Novozymel88 (兩者均來自 Sigma-Aldrich, St.Louis, MO,USA)組成的2%(w/w)酶混合物。所述酶制劑(preparation)的規(guī)定活性(activity)為Celluclastl.5L, 700內(nèi)切葡聚糖酶單元(EGU) / g ；Novozymel88, 250纖維二糖酶單元(CBU)/g。一些混合物還包含以下還原劑(所有為試劑級別)中的一種:連二亞硫酸鈉(Na2S2O4) (Merck, Darmstadt,德國)、亞硫酸鈉(Na2SO3) (Merck)和二硫蘇糖醇(DTT)(Sigma-Aldrich),其添加到最終濃度為15mM。該E-燒瓶在45 °C下在設(shè)置為170rpm的定軌振蕩器(Ecotron培養(yǎng)箱振蕩器，Infors，BottmingenJi^i)中培養(yǎng) 120 小時。在水解過程中，在 0、6、12、18、24、36、48、72、96、和120小時之后收集100 μ I樣品。在水解開始和完成之后(即在O和120小時)，也取
1.5ml樣品。將樣品在冰上冷凍，并且在14100g下離心5分鐘。收集上清液并且使用葡萄糖計(Glucometer Elite XL, Bayer AG, Leverkusen,德國)分析它們的葡萄糖濃度。所選樣品的糖含量分析還用離子色譜法(IC)和高效液相色譜法(HPLC)進行。具有令人滿意的精度但低的準(zhǔn)確性的葡萄糖計數(shù)值利用通過葡萄糖的色譜測定獲得的數(shù)據(jù)進行校正。不同的還原劑對Avicel的酶糖化的影響表示在表I和圖1中。圖1表示在120小時之后不同的還原劑(15mM)對Avicel的糖化的影響,其中PT液體表示預(yù)處理液體,并且誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

權(quán)利要求
1.用于在木質(zhì)纖維素材料的糖化中改進酶水解的方法，包括 預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料以獲得經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料； 向經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分添加至少一種還原劑，以降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解抑制性能；和 使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分在所述至少一種還原劑的存在下經(jīng)歷酶水解。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中將所述至少一種還原劑添加到經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料；并且使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料在所述至少一種還原劑的存在下經(jīng)歷酶水解。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中所述方法用于從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)一種或多種所需目標(biāo)化合物，并且還包括如下步驟將經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料用作用于生產(chǎn)所述目標(biāo)化合物的基質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述一種或多種目標(biāo)化合物是發(fā)酵產(chǎn)物，并且利用所述經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料的步驟包括使經(jīng)預(yù)處理的和經(jīng)酶水解的木質(zhì)纖維素材料經(jīng)歷發(fā)酵。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中酶水解步驟與發(fā)酵步驟分開進行。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中酶水解是和發(fā)酵在單一步驟中同時進行。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物包括選自乙醇、丁醇和丁二酸的發(fā)酵產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述目標(biāo)化合物是乙酰丙酸。
10.根據(jù)在前權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少一種還原劑選自硫氧陰離子、巰基試劑、氫化物和氧化還原酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述至少一種還原劑選自亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽和二硫蘇糖醇。
12.至少一種還原劑用于降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解抑制性能的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，用于降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料的酶水解抑制性能。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的用途，其中所述至少一種還原劑選自硫氧陰離子、巰基試劑、氫化物和氧化還原酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中所述至少一種還原劑選自亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽和二硫蘇糖醇。
全文摘要
提供在木質(zhì)纖維素材料的糖化中改善酶水解的方法。該方法包括預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料以獲得經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料；向經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分添加至少一種還原劑以降低經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分的酶水解抑制性質(zhì)；和使經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的漿料或其液體級分在至少一種還原劑的存在下經(jīng)歷酶水解。
文檔編號C12P19/02GK103237896SQ201080070532
公開日2013年8月7日 申請日期2010年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月6日
發(fā)明者B.奧里克森, L.瓊森, V.P.蘇德哈姆 申請人:瑞典乙醇化工技術(shù)有限公司