專利名稱：IgA腎病的預(yù)測方法和IgA腎病患者的選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IgA腎病的預(yù)測方法和IgA腎病患者的選擇方法，具體而言，涉及在確診IgA腎病前能夠以高概率預(yù)測為IgA腎病的方法以及選擇出扁桃體摘除有效的IgA腎病患者的方法。
背景技術(shù)：
IgA腎病是一種慢性腎小球性腎炎，其特征在于，可觀察到IgA在腎臟的腎小球系膜區(qū)域的優(yōu)勢沉積。IgA腎病占日本的慢性腎小球性腎炎的一大半，作為單一的腎病是最多的，其中15 30%預(yù)后不良而轉(zhuǎn)為腎功能衰竭。但是，IgA腎病的病因尚未明確，因此沒有根本性的治療方法。IgA腎病的確診使用對腎臟的一部分進(jìn)行活檢，通過免疫學(xué)染色確認(rèn)腎小球系膜中的IgA免疫復(fù)合物的沉積的方法，因此存在對患者造成的負(fù)擔(dān)大的問題。因而， 期望開發(fā)出能夠在實(shí)施腎活檢前、在不對被測者造成軀體上的負(fù)擔(dān)的情況下簡便且迅速地實(shí)施，而且能夠以高概率預(yù)測IgA腎病的方法。另外，已知IgA有IgAl和IgA2這兩種，IgAl在上消化道、呼吸道、扁桃體產(chǎn)生， IgA2在下消化道產(chǎn)生。IgA腎病中沉積于腎臟的是IgAl，因而近年來進(jìn)行了摘除IgA腎病患者的扁桃體的治療方法。非專利文獻(xiàn)1中報(bào)道對16名IgA腎病患者進(jìn)行扁桃體摘除，3年后56. 3%的患者的蛋白尿得到緩解。另外，非專利文獻(xiàn)2中報(bào)道對M名IgA腎病患者進(jìn)行扁桃體摘除， 6個月后41. 7%的患者的蛋白尿得到緩解，2年后50%的患者的蛋白尿得到緩解。此外，非專利文獻(xiàn)3中報(bào)道通過并用扁桃體摘除和類固醇脈沖治療，約60%的IgA腎病患者的尿蛋白和尿潛血兩者同時(shí)得到緩解。但是，扁桃體摘除對于約40%的IgA腎病患者是無效的，存在無法預(yù)先預(yù)測扁桃體摘除的有效性的問題。由于扁桃體摘除需要伴隨全身麻醉的手術(shù)，軀體上的負(fù)擔(dān)大，因而期望建立一種以高概率選擇扁桃體摘除有效的患者的方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 Tokuda M et al. Acta Otolaryngol Suppl 523 ； 182—184，1988.非專利文獻(xiàn) 2:Akagi H et al. Acta Otolaryngol Suppl 540 ；64-66,1999.非專利文獻(xiàn)3 =Hotta et al. Am J Kid Dis 38，pp736_743，2001.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠在不對被測者造成軀體上的負(fù)擔(dān)的情況下簡便且迅速地實(shí)施、而且能夠以高概率預(yù)測IgA腎病的方法。另外，本發(fā)明的目的在于提供一種以高概率選擇對于IgA腎病的治療扁桃體摘除有效的IgA腎病患者的方法。本發(fā)明為了解決上述課題，包含以下技術(shù)方案。[1] 一種IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，包括對來自被測者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬(Ti^ponema)細(xì)菌或彎曲桿菌屬(Campylobacter)細(xì)菌進(jìn)行檢測的步
馬聚ο[2]如上述[1]所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，所述步驟中，對密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性的核酸進(jìn)行檢測。[3]如上述[1]所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，所述步驟中，使用與密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體。[4]如上述[1]所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其中，密螺旋體屬細(xì)菌選自通過以下 PCR檢測出的細(xì)菌中的一種以上所述PCR中，以從密螺旋體屬細(xì)菌提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA作為模板，并且使用序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的引物和序列號2表示的堿基序列構(gòu)成的引物組合而成的引物組。[5]如上述[1]所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其中，密螺旋體屬細(xì)菌為選自由齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、文氏密螺旋體(Ti^ponema vincentii)、媒介密螺旋體(Ti^ponema medium)、索氏密螺旋體(Ti^ponema socranskii)、蝕瘡潰瘍密螺旋體 (Treponema phagedenis)、食果月交密il旋體(Treponema pectinovorum)、食淀粉密il旋體 (Treponema amylovorum)、 嗜麥芽糖密螺旋體(Tr印onema maltophilum)、布氏密螺旋體 (Treponema bryantii)、梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)、嗜糖密螺旋體(Treponema saccharophilum)和產(chǎn)琥珀酸密螺旋體(Treponema succinifaciens)組成的組中的一種以上。[6]如上述[1]所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其中，彎曲桿菌屬細(xì)菌為選自由直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、結(jié)腸 ^ ffiff S‘ (Campylobacter coli)、·明胃曲 ff (Campylobacter concisus)、 曲桿菌(Campylobacter curvus)、昭禾口彎曲桿菌(Campylobacter showae)、粘膜彎曲桿菌(Campylobacter mucosalis)、月臺兒彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、豬腸彎曲桿菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液彎曲桿菌(Campylobacter sputorum)、瑞士彎曲桿菌(Campylobacter helveticus)、烏普薩拉彎曲桿菌(Campylobacter upsaliensis)禾口紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)組成的組中的一種以上。[7]如上述[1] W]中任一項(xiàng)所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，被測者在尿蛋白檢查和尿潛血檢查的至少一項(xiàng)中被判斷為陽性。[8] 一種試劑盒，用于預(yù)測IgA腎病，其特征在于，包含以下(a) (d)的至少一種以上(a)用于特異性檢測密螺旋體屬細(xì)菌的引物組；(b)用于特異性檢測彎曲桿菌屬細(xì)菌的引物組；(c)與密螺旋體屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體；和(d)與彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體。[9] 一種IgA腎病患者的選擇方法，用于選擇對于IgA腎病的治療進(jìn)行扁桃體摘除有效的IgA腎病患者，其特征在于，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行檢測的步驟。[10] 一種IgA腎病患者的選擇方法，用于選擇對于IgA腎病的治療進(jìn)行扁桃體摘除和類固醇脈沖療法有效的IgA腎病患者，其特征在于，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行檢測的步驟。[11]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其特征在于，所述步驟中，對密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性的核酸進(jìn)行檢測。[12]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其特征在于，所述步驟中，使用與密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體。[13]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，密螺旋體屬細(xì)菌選自通過以下PCR檢測出的細(xì)菌中的一種以上所述PCR中，以從密螺旋體屬細(xì)菌提取的總 RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA作為模板，并且使用序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的引物和序列號2表示的堿基序列構(gòu)成的引物組合而成的引物組。[14]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，密螺旋體屬細(xì)菌為選自由齒垢密螺旋體、文氏密螺旋體、媒介密螺旋體、索氏密螺旋體、蝕瘡潰瘍密螺旋體、 食果膠密螺旋體、食淀粉密螺旋體、嗜麥芽糖密螺旋體、布氏密螺旋體、梅毒密螺旋體、嗜糖密螺旋體和產(chǎn)琥珀酸密螺旋體組成的組中的一種以上。[15]如上述[9]或[10]所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，彎曲桿菌屬細(xì)菌為選自由直腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌、簡明彎曲桿菌、曲形彎曲桿菌、昭和彎曲桿菌、粘膜彎曲桿菌、胎兒彎曲桿菌、豬腸彎曲桿菌、痰液彎曲桿菌、瑞士彎曲桿菌、烏普薩拉彎曲桿菌和紅嘴鷗彎曲桿菌組成的組中的一種以上。[16] 一種試劑盒，用于選擇對于IgA腎病的治療進(jìn)行扁桃體摘除有效的IgA腎病患者，其特征在于，包含以下(a) (d)的至少一種以上(a)用于特異性檢測密螺旋體屬細(xì)菌的引物組；(b)用于特異性檢測彎曲桿菌屬細(xì)菌的引物組；(c)與密螺旋體屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體；和(d)與彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體。根據(jù)本發(fā)明，能夠在不對被測者造成軀體上的負(fù)擔(dān)的情況下簡便且迅速地、而且以高概率預(yù)測被測者是否為IgA腎病。另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠在不對被測者造成軀體上的負(fù)擔(dān)的情況下簡便且迅速地、而且以高概率選擇對于IgA腎病的治療扁桃體摘除有效的 IgA腎病患者。


圖1是表示通過DGGE法網(wǎng)羅性地分析扁桃體菌群的結(jié)果的電泳圖。圖2是表示通過RT-PCR法檢測摘除的扁桃體中的密螺旋體屬細(xì)菌的結(jié)果的電泳圖。圖3是表示通過RT-PCR法檢測摘除的扁桃體中的直腸彎曲桿菌的結(jié)果的電泳圖。圖4(A)是表示扁桃體中密螺旋體屬細(xì)菌的有無和扁桃體摘除+類固醇脈沖療法的治療效果的圖。圖4(B)是表示扁桃體中嗜血桿菌屬細(xì)菌的有無和扁桃體摘除+類固醇脈沖療法的治療效果的圖。圖4(C)是表示扁桃體中彎曲桿菌屬細(xì)菌的有無和扁桃體摘除+類固醇脈沖療法的治療效果的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人對從經(jīng)腎活檢診斷為IgA腎病的患者和慢性扁桃體炎患者體內(nèi)摘除的扁桃體中的菌群進(jìn)行了網(wǎng)羅性的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者與慢性扁桃體炎患者之間扁桃體菌群不同，并且發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者中存在密螺旋體屬細(xì)菌、嗜血桿菌屬細(xì)菌、彎曲桿菌屬細(xì)菌的概率高。由該發(fā)現(xiàn)可知，如果扁桃體中存在密螺旋體屬細(xì)菌、嗜血桿菌屬細(xì)菌、彎曲桿菌屬細(xì)菌的任一種，則為IgA腎病的概率高。其中，關(guān)于嗜血桿菌屬細(xì)菌與IgA腎病的關(guān)聯(lián)在本申請?zhí)岢鲋耙延袉⑹?，但是，IgA腎病患者的扁桃體中密螺旋體屬細(xì)菌和彎曲桿菌屬細(xì)菌的陽性率高是由本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在IgA腎病患者中，對扁桃體檢測出密螺旋體屬細(xì)菌的患者或檢測出彎曲桿菌屬細(xì)菌的患者進(jìn)行扁桃體摘除療法是非常有效的，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，包括對來自被測者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行檢測的步驟。另外，本發(fā)明涉及一種 IgA腎病患者的選擇方法，用于選擇對于IgA腎病的治療進(jìn)行扁桃體摘除、或者進(jìn)行扁桃體摘除和類固醇脈沖療法有效的IgA腎病患者，其特征在于，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行檢測的步驟。作為本發(fā)明的IgA腎病的預(yù)測方法的對象的被測者沒有特別限制，優(yōu)選為疑似患 IgA腎病的人。作為疑似患IgA腎病的人，可列舉出在尿蛋白檢查和尿潛血檢查的至少一項(xiàng)中被判斷為陽性的人。更具體而言，例如，可列舉出在學(xué)校體檢、公司體檢等體檢時(shí)或門診診察時(shí)等實(shí)施的尿檢中被查出蛋白尿和血尿且即使復(fù)查也持續(xù)尿檢異常的人。IgA腎病多同時(shí)伴有蛋白尿和血尿，但也有僅呈現(xiàn)血尿的情況，因此優(yōu)選將任一項(xiàng)持續(xù)陽性的人作為被測者。尿蛋白陽性(蛋白尿)的判斷和尿潛血陽性(血尿)的判斷例如可以通過使用通常的尿檢中使用的公知的尿檢試紙來進(jìn)行。以往，在疑似患IgA腎病時(shí)，如果不通過腎活檢來進(jìn)行組織學(xué)檢查則無法診斷，因而其結(jié)果是，被診斷為不是IgA腎病的被測者會承受不必要的軀體上的負(fù)擔(dān)。如果使用本發(fā)明的IgA腎病的預(yù)測方法，則可以僅對患IgA腎病的概率高的被測者進(jìn)行腎活檢，從而能夠避免不必要的軀體上的負(fù)擔(dān)。作為本發(fā)明的IgA腎病患者的選擇方法的對象的IgA腎病患者沒有限制。優(yōu)選為過去未進(jìn)行過扁桃體摘除術(shù)的IgA腎病患者。以往，對于約40%的IgA腎病患者而言，扁桃體摘除是無效的，但是，如果使用本發(fā)明的IgA腎病患者的選擇方法，則可以僅對扁桃體摘除有效的概率高的患者進(jìn)行扁桃體摘除，因而能夠避免不必要的軀體上的負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。以下，將本發(fā)明的IgA腎病的預(yù)測方法和本發(fā)明的IgA腎病患者的選擇方法并稱為“本發(fā)明的方法”，對兩方法中共有的項(xiàng)目進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明的方法中，作為檢測對象的密螺旋體屬細(xì)菌沒有特別限制，只要是扁桃體中可能存在的密螺旋體屬細(xì)菌均可作為檢測對象。作為這樣的密螺旋體屬細(xì)菌，例如可列舉出通過以下PCR檢測出的細(xì)菌該P(yáng)CR中，以從密螺旋體屬細(xì)菌提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA作為模板，并且使用由正向引物(TTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAC、序列號1)和反向引物(GTCRYMGGCAGTTCCGCCWGAGTC、序列號2)構(gòu)成的引物組。這里，堿基符號R表示鳥嘌呤(G)或腺嘌呤(A)，Y表示胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)，M表示腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)，W表示腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)。具體而言，例如，可列舉出齒垢密螺旋體(Tr印onema denticola)、文氏密螺旋體 (Treponema vincentii)、媒介密螺方寵體(Treponema medium)、索氏密螺方寵體(Treponema socranskii)、蝕瘡潰瘍密螺旋體(Tr印onema phagedenis)、食果膠密螺旋體(Treponema pectinovorum)、食淀粉密螺旋體(Treponema amylovorum)、嗜麥芽糖密螺旋體(Treponema maltophilum)、布氏密螺旋體(Treponema bryantii)、梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)、嗜糖密螺旋體(Treponema saccharophilum)、產(chǎn)琥珀酸密螺旋體(Treponema succinifaciens)等。本發(fā)明的方法中，作為檢測對象的彎曲桿菌屬細(xì)菌沒有特別限制，只要是扁桃體中可能存在的彎曲桿菌屬細(xì)菌均可作為檢測對象。作為這樣的彎曲桿菌屬細(xì)菌，例如，可列舉出直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、 結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、簡明彎曲桿菌(Campylobacter concisus)、曲形彎曲桿菌(Campylobacter curvus)、昭禾口彎曲桿菌(Campylobacter showae)、粘膜彎曲桿菌(Campylobacter mucosalis)、月臺兒彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、豬腸彎曲桿菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液彎曲桿菌(Campylobacter sputorum)、瑞士彎曲桿菌(Campylobacter helveticus)、烏普薩拉彎曲桿菌(Campylobacter upsaliensis)、紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)等。其中，優(yōu)選直腸彎曲桿菌。供于本發(fā)明的方法中的試樣只要是來自被測者或患者的扁桃體的試樣即可。例如，可列舉出由扁桃體組織、扁桃體拭子液等制備的DNA、RNA、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞破碎液等。 這些試樣均可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。檢測密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌的方法只要是能夠特異性檢測密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌的方法則沒有特別限制。例如，可列舉出對密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性的核酸進(jìn)行檢測的方法、使用與密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體的方法等。檢測上述核酸的方法中的核酸可以是DNA，也可以是RNA。本發(fā)明中，可以適當(dāng)使用公知的核酸檢測方法。具體而言，例如，可列舉出PCR法、DNA印跡法、RNA印跡法、RT-PCR 法、原位雜交法、原位PCR法、DNA陣列法等。其中，從檢測靈敏度、操作的簡便性、快速性、 低成本性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選使用RT-PCR法。在使用RT-PCR法檢測密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌時(shí)，使用由扁桃體組織、扁桃體拭子液等制備的總RNA作為試樣?？俁NA可以通過公知的方法制備。RT-PCR法可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實(shí)施。例如，可列舉出以下方法 由扁桃體組織、扁桃體拭子液等制備總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶由該總RNA合成cDNA，以該cDNA 為模板，利用對來自檢測對象細(xì)菌的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增的引物組進(jìn)行PCR。對來自檢測對象細(xì)菌的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增的引物組沒有特別限制，只要由公知的數(shù)據(jù)庫(例如，GenBank等)獲取檢測對象細(xì)菌的基因組序列信息或核糖體RNA的序列信息，根據(jù)公知的方法設(shè)計(jì)引物即可。以下，例示出可以適用于本發(fā)明的方法的引物組，但不限于此。作為能夠特異性檢測密螺旋體屬細(xì)菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物TTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAC(序列號1)
反向引物GTCRYMGGCAGTTCCGCCWGAGTC (序列號 2)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增657bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作為能夠特異性檢測齒垢密螺旋體的引物組，可列舉出以下引物組正向引物TAATACCGAATGTGCTCATTTACAT(序列號 3)反向引物CTGCCATATCTCTATGTCATTGCTCTT(序列號 4)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增860bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作為能夠特異性檢測文氏密螺旋體的引物組，可列舉出以下引物組正向引物GTCTCAATGGTTCATAAGAA(序列號 5)反向引物CAAGCCTTATCTCTAAGACT(序列號 6)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增851bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作為能夠特異性檢測媒介密螺旋體的引物組，可列舉出以下引物組正向引物CACTCAGTGCTTCATAAGGG(序列號 7)反向引物CCGGCCTTATCTCTAAGACC(序列號 8)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增851bp的DNA片段(J Clin Microbiol, 2002. 40(9) :p. 3334-40.)。作為能夠特異性檢測直腸彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC(序列號 9)反向引物TTTCTGCAAGCAGACACTCTT(序列號 10)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增598bp的DNA片段(Archives of Oral Biology,2006. 51 :ρ·10—14.)。作為能夠特異性檢測空腸彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGAATGGGTTTAACTCGTGTGATAAGT(序列號 11)
反向引物TACCACGCAAAGGCAGTATAGCT (序列號 12)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增493bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測結(jié)腸彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AAATGCTAGTGCTAGGGAAAAAGACTCT(序列號 13)反向引物TGAGGTTCAGGCACTTTTACACTTACTAC(序列號14)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增96bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測簡明彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGCGGGCCTAACAAGAGTTATTACA(序列號反向引物TGTAAGCACGTCAAAAACCATCTTT(序列號 16)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增217bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測曲形彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組
正向引物CTGCCAAAGTAAGGACGCAAGTATA(序列號 17)反向引物GGCAAGATCGCCTGAAATACG(序列號 18)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增108bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測昭和彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGGGTTTAAGCATAGGAACGCTG(序列號 19)反向引物CACCAGATAAAGCTCGCTGATCG(序列號20)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增86bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測粘膜彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物TGCGATTATGAACAAGGCCCTA(序列號21)反向引物TCGCTTGAAACACACGGTCA(序列號22)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增224bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測胎兒彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGAGCTGGGCTTACAAGAGCTATTACA(序列號 2 反向引物GGTAAAATCGCTTGAAACGCTCTAT(序列號 24)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增482bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測豬腸彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物CGGTCAAAAGATGACTTTTGAAGTACTT(序列號 25)反向引物GCTTCCCTGCCACGAGCT(序列號26)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增108bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測痰液彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物AGCTTTACTTGCTGCAAGAGGAAGA(序列號 27)反向引物AGGAAGCGTTCCAACAGAAAAGTT(序列號 28)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增94bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測瑞士彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物CAATAACATACGCACACCAGATGGA(序列號四)反向引物CAGGCACTTTAACGCTCACTATGG(序列號 30)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增176bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。作為能夠特異性檢測烏普薩拉彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物GCTTACGCGTGTAATTACAAACTATGTC(序列號 31)反向引物AATTGCCTTAGCCTCGATAGGG(序列號 32)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增250bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。
作為能夠特異性檢測紅嘴鷗彎曲桿菌的引物組，可列舉出以下引物組正向引物CTATGTTCGTCCTATAGTTTCTAAGGCTTC(序列號33)反向引物CCAGCACTATCACCCTCAACTAAATAA(序列號 34)通過使用該引物組，可以期待擴(kuò)增250bp的DNA片段(Appl Environ Microbiol, 2008. 74(8) :p. 2529-33.)。關(guān)于使用與密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體的方法中的抗體，在檢測密螺旋體屬細(xì)菌時(shí)只要是與密螺旋體屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體即可，在檢測彎曲桿菌屬細(xì)菌時(shí)只要是與彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體即可?？贵w可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。另外，可以是完整的抗體分子，也可以是能夠特異性結(jié)合的抗體片段(例如，F(xiàn)ab片段、F(ab' )2片段等)。與密螺旋體屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體(多克隆抗體、單克隆抗體、抗體片段)和與彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體(多克隆抗體、單克隆抗體、抗體片段)，可以通過使用檢測對象細(xì)菌的構(gòu)成成分作為免疫原，利用公知的方法制作、獲取。作為使用與密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體的方法，例如， 可列舉出酶免疫測定法(EIA法)、固相酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)、放射免疫測定法(RIA 法)、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀法、免疫組化法、抗體陣列法等。其中，從檢測靈敏度、操作的簡便性、快速性、低成本性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選使用ELISA法。在使用ELISA法檢測密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌時(shí)，適合使用由扁桃體組織、扁桃體拭子液等制備的細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞破碎液等作為試樣。ELISA法可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實(shí)施。例如，可列舉出以下方法使與檢測對象細(xì)菌特異性結(jié)合的一次抗體結(jié)合到微孔板的孔或塑料管等固相上，向其中添加來自扁桃體的試樣(細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞破碎液等)，清洗后添加酶標(biāo)記的二次抗體；清洗、 除去未結(jié)合的二次抗體后，添加顯色底物，用分光光度計(jì)測定生成的顯色物質(zhì)的量，從而測定吸光度。本發(fā)明的方法通過使用試劑盒，能夠簡便且迅速地實(shí)施。因此，本發(fā)明提供用于預(yù)測IgA腎病的試劑盒、以及用于選擇扁桃體摘除有效的IgA腎病患者的試劑盒(以下，將兩試劑盒并稱為“本發(fā)明的試劑盒”)。作為本發(fā)明的試劑盒的一個實(shí)施方式，可以提供以下RT-PCR用試劑盒，該試劑盒包含選自用于特異性檢測密螺旋體屬細(xì)菌的引物組和用于特異性檢測彎曲桿菌屬細(xì)菌的引物組中的至少一種以上的引物組。除引物組以外的試劑盒的構(gòu)成品沒有特別限制，例如， 優(yōu)選含有用于由組織或細(xì)胞制備RNA的試劑、反轉(zhuǎn)錄酶、用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液、耐熱性 DNA聚合酶、PCR用試劑、PCR用管、PCR用板等。作為本發(fā)明的試劑盒的另一實(shí)施方式，可以提供以下ELISA用試劑盒，該試劑盒包含選自與密螺旋體屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體和與彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體中的至少一種以上的抗體。除抗體以外的試劑盒的構(gòu)成品沒有特別限制，例如，優(yōu)選含有已標(biāo)記的二次抗體、顯色用試劑、清洗用緩沖液、ELISA用板等。此外，作為本發(fā)明的試劑盒的其他實(shí)施方式，可列舉出包含DNA陣列的試劑盒、包含抗體陣列的試劑盒等。實(shí)施例
以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限定于這些例子。[實(shí)施例1:IgA腎病患者的扁桃體菌群的研究](1)患者的登記對于在大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬醫(yī)院住院的、經(jīng)腎活檢被診斷為IgA腎病的68名患者和因慢性扁桃體炎而進(jìn)行了扁桃體摘除的觀名患者，得到書面同意書后，獲得了扁桃體摘除時(shí)的扁桃體樣品。扁桃體摘除后，立即使用iTrizol (invitrogen)進(jìn)行RNA提取，以RNA 形式進(jìn)行保存。關(guān)于IgA腎病患者的扁桃體的研究，在得到大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬醫(yī)院倫理委員會的許可后實(shí)施。(2)基于DGGE(變性梯度凝膠電泳)法的扁桃體菌群的網(wǎng)羅性分析將由IgA腎病的患者以及慢性扁桃體炎的患者的扁桃體得到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 以所得到的cDNA為模板，使用針對細(xì)菌的16S核糖體RNA的V6 · V8區(qū)域的PCR引物組通用細(xì)菌引物卯4f (CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG G、序列號 35)禾Π 1369r (GCCCGGGAACGTATTCACCG、序列號 36)進(jìn)行 PCR(參考文獻(xiàn)Yu，Z. and Μ. Morrison, Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol, 2004. 70(8) :p. 4800-6.)。各 PCR 反應(yīng)液含有 IOOng的DNAUOpmol的各引物、0. 16mM的三磷酸脫氧核苷酸、5 μ L的IOXBlend Taq緩沖液(東洋紡)和1.25U的Blend Taq聚合酶(東洋紡)，用蒸餾水調(diào)節(jié)最終容量為50 μ L。 PCR的條件為第1次在95°C下進(jìn)行4分鐘的融化、在95°C下進(jìn)行30秒鐘的變性、在61°C 下進(jìn)行30秒鐘的退火并在72°C下進(jìn)行1分鐘的延伸，然后，以0. 5°C的間隔降低退火溫度， 同時(shí)在95°C下進(jìn)行4分鐘的融化、在95°C下進(jìn)行30秒鐘的變性、在各循環(huán)的溫度下進(jìn)行30 秒鐘的退火并在72°C下進(jìn)行1分鐘的延伸，共進(jìn)行10個循環(huán)。進(jìn)而，使用56°C的延伸
夕；^〒> * 3 >)進(jìn)行25個循環(huán)，最后在72°C下進(jìn)行2小時(shí)的延伸。使用DCode 通用突變檢測系統(tǒng)(Bio-Rad laboratories)，將 PCR 產(chǎn)物在 82V、60°C 下進(jìn)行15小時(shí)的電泳。電泳用凝膠使用丙烯酰胺/N，N’ -甲叉雙丙烯酰胺30%溶液四 1 (Bio-Rad laboratories，目錄號161-0156)制作。標(biāo)志物使用 DGGE Marker 11(10 片段) (株式會社日本基因，目錄號:315-06404)。電泳后的凝膠用STOR Green I(LonZa，羅克蘭， 緬因州，美國)染色，然后使用凝膠攝影裝置GelDoc XR(Bio-Rad laboratories)得到各樣品的條帶的位置和強(qiáng)度(條帶的濃度)的數(shù)據(jù)(參考文獻(xiàn)MuyZer，G· , et al. ,Denaturant gradient gel electrophoresis in microbial ecology. Molecular Microbial Ecology Manual, Vol. 3. 4. 4，1998 :p. pp. 1-27.)。對于所得到的條帶的位置和強(qiáng)度的數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量分析(PLS-DA)，由此顯示出在 IgA腎病和慢性扁桃體炎之間扁桃體菌群是不同的。另外，通過進(jìn)行加載繪圖分析(Loading plot analysis)，發(fā)現(xiàn)了 IgA腎病的特征性條帶。電泳的結(jié)果示于圖1。圖1中，染色的條帶分別表示存在于扁桃體中的菌，箭頭A、B和C所示的條帶是IgA腎病的特征性條帶。將這些條帶切出，進(jìn)行TA克隆，根據(jù)常規(guī)方法確定堿基序列，與公知的基因數(shù)據(jù)庫收錄的堿基序列進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果可知，A的條帶與密螺旋體屬細(xì)菌(Tr印onema sp.)顯示出高同源性，B的條帶與惰性嗜血桿菌(Haemophilus segnis)顯示出高同源性，C的條帶與直腸彎曲桿菌(CampylcAacterrectus)顯示出高同源性。對于68名IgA腎病患者和28名慢性扁桃體炎患者，將上述A、B、C的條帶所對應(yīng)的細(xì)菌的陽性率示于表1。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由表1可知，IgA腎病患者的扁桃體中存在密螺旋體(Ti^ponema)屬的細(xì)菌、嗜血桿菌(Haemophilus)屬的細(xì)菌、彎曲桿菌(Campylobacter)屬的細(xì)菌的概率高。其中，關(guān)于嗜血桿菌(Haemophilus)屬的細(xì)菌，已經(jīng)報(bào)道了在IgA腎病患者的腎小球內(nèi)和血清中檢測到副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)的構(gòu)成成分(Suzuki, et al. Lancet 1994)，從而暗示出其與IgA腎病的關(guān)聯(lián)，但是，IgA腎病患者的扁桃體中密螺旋體屬的細(xì)菌和彎曲桿菌屬的細(xì)菌的陽性率高是本次才獲知的，由此證實(shí)了檢測扁桃體中的密螺旋體屬的細(xì)菌或彎曲桿菌屬的細(xì)菌的存在對于IgA腎病的診斷是有用的。[表1]
權(quán)利要求
1.一種IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，包括對來自被測者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬(Ti^ponema)細(xì)菌或彎曲桿菌屬(Campylobacter)細(xì)菌進(jìn)行檢測的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，所述步驟中，對密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性的核酸進(jìn)行檢測。
3.如權(quán)利要求1所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，所述步驟中，使用與密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其中，密螺旋體屬細(xì)菌選自通過以下PCR 檢測出的細(xì)菌中的一種以上所述PCR中，以從密螺旋體屬細(xì)菌提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA作為模板，并且使用序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的引物和序列號2表示的堿基序列構(gòu)成的引物組合而成的引物組。
5.如權(quán)利要求1所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其中，密螺旋體屬細(xì)菌為選自由齒垢密螺旋體(Ti^ponema denticola)、文氏密螺旋體(Ti^ponema vincentii)、媒介密螺旋體(Ti^ponema medium)、索氏密螺旋體(Ti^ponema socranskii)、蝕瘡潰瘍密螺旋體 (Treponema phagedenis)、食果月交密il旋體(Treponema pectinovorum)、食淀粉密il旋體 (Treponema amylovorum)、 嗜麥芽糖密螺旋體(Tr印onema maltophilum)、布氏密螺旋體 (Treponema bryantii)(Treponema pallidum) >Bf(Treponema saccharophilum)和產(chǎn)琥珀酸密螺旋體(Treponema succinifaciens)組成的組中的一種以上。
6.如權(quán)利要求1所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其中，彎曲桿菌屬細(xì)菌為選自由直腸彎曲桿菌(Campylobacter rectus)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、結(jié)腸彎 ffiff ^ (Campylobacter coli) > M BJ ^ ffi ff ^ (Campylobacter concisus)、曲胃曲桿菌(Campylobacter curvus)、昭禾口彎曲桿菌(Campylobacter showae)、粘膜彎曲桿菌(Campylobacter mucosalis)、月臺兒彎曲桿菌(Campylobacter fetus)、豬腸彎曲桿菌 (Campylobacter hyointestinalis)、痰液彎曲桿菌(Campylobacter sputorum)、瑞士彎曲桿菌(Campylobacter helveticus)、烏普薩拉彎曲桿菌(Campylobacter upsaliensis)禾口紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)組成的組中的一種以上。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的IgA腎病的預(yù)測方法，其特征在于，被測者在尿蛋白檢查和尿潛血檢查的至少一項(xiàng)中被判斷為陽性。
8.一種試劑盒，用于預(yù)測IgA腎病，其特征在于，包含以下(a) (d)的至少一種以上(a)用于特異性檢測密螺旋體屬細(xì)菌的引物組；(b)用于特異性檢測彎曲桿菌屬細(xì)菌的引物組；(c)與密螺旋體屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體；和(d)與彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體。
9.一種IgA腎病患者的選擇方法，用于選擇對于IgA腎病的治療進(jìn)行扁桃體摘除有效的IgA腎病患者，其特征在于，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行檢測的步驟。
10.一種IgA腎病患者的選擇方法，用于選擇對于IgA腎病的治療進(jìn)行扁桃體摘除和類固醇脈沖療法有效的IgA腎病患者，其特征在于，包括對來自IgA腎病患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行檢測的步驟。
11.如權(quán)利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其特征在于，所述步驟中，對密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性的核酸進(jìn)行檢測。
12.如權(quán)利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其特征在于，所述步驟中，使用與密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體。
13.如權(quán)利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，密螺旋體屬細(xì)菌選自通過以下PCR檢測出的細(xì)菌中的一種以上所述PCR中，以從密螺旋體屬細(xì)菌提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA作為模板，并且使用序列號1表示的堿基序列構(gòu)成的引物和序列號2 表示的堿基序列構(gòu)成的引物組合而成的引物組。
14.如權(quán)利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，密螺旋體屬細(xì)菌為選自由齒垢密螺旋體、文氏密螺旋體、媒介密螺旋體、索氏密螺旋體、蝕瘡潰瘍密螺旋體、食果膠密螺旋體、食淀粉密螺旋體、嗜麥芽糖密螺旋體、布氏密螺旋體、梅毒密螺旋體、嗜糖密螺旋體和產(chǎn)琥珀酸密螺旋體組成的組中的一種以上。
15.如權(quán)利要求9或10所述的IgA腎病患者的選擇方法，其中，彎曲桿菌屬細(xì)菌為選自由直腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌、簡明彎曲桿菌、曲形彎曲桿菌、昭和彎曲桿菌、粘膜彎曲桿菌、胎兒彎曲桿菌、豬腸彎曲桿菌、痰液彎曲桿菌、瑞士彎曲桿菌、烏普薩拉彎曲桿菌和紅嘴鷗彎曲桿菌組成的組中的一種以上。
16.一種試劑盒，用于選擇對于IgA腎病的治療進(jìn)行扁桃體摘除有效的IgA腎病患者， 其特征在于，包含以下(a) (d)的至少一種以上(a)用于特異性檢測密螺旋體屬細(xì)菌的引物組；(b)用于特異性檢測彎曲桿菌屬細(xì)菌的引物組；(c)與密螺旋體屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體；和(d)與彎曲桿菌屬細(xì)菌特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
通過檢測來自在尿蛋白檢查和尿潛血檢查的至少一項(xiàng)中被判斷為陽性的被測者或者被診斷為IgA腎病的患者的扁桃體的試樣中存在的密螺旋體屬細(xì)菌或彎曲桿菌屬細(xì)菌，能夠在不對被測者造成軀體上的負(fù)擔(dān)的情況下，簡便且迅速地以高概率預(yù)測IgA腎病。另外，能夠在不對被測者造成軀體上的負(fù)擔(dān)的情況下，簡便且迅速地以高概率選擇出對于IgA腎病的治療扁桃體摘除有效的IgA腎病患者。
文檔編號C12N15/09GK102317453SQ20108000770
公開日2012年1月11日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日
發(fā)明者大野博司, 豬阪善隆, 福田真嗣, 長澤康行, 飯尾健一郎 申請人:國立大學(xué)法人大阪大學(xué)