專利名稱：一種利用尿苷提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增效果的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的方法，尤其是利用尿苷 (Uridine)提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增效果的方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，又稱體外酶促基因擴(kuò)增，是一種在體外模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)由K. Mullis于1985年發(fā)明，能在耐熱DNA聚合酶的作用及特異性引物的引導(dǎo)下，在很短的時(shí)間里就能在一個(gè)試管內(nèi)實(shí)現(xiàn)只有在生物體細(xì)胞分裂增殖時(shí)才出現(xiàn)的基因的大量復(fù)制，一般來說，在數(shù)小時(shí)內(nèi)就可以將目的基因擴(kuò)增至百萬(wàn)倍。在過去的20多年的時(shí)間里，PCR技術(shù)在不斷進(jìn)步和發(fā)展中逐漸成熟，形成了一整套完整的技術(shù)體系。常規(guī)PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便，成功率很高，因而其在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中都得到了廣泛應(yīng)用。但是PCR技術(shù)仍存在著不可避免的缺點(diǎn)， 如擴(kuò)增的副反應(yīng)多，擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量少，保真度不高等。但對(duì)PCR反應(yīng)影響最大的是擴(kuò)增過程中的副反應(yīng)的發(fā)生，這種情況輕則帶來在PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)少量非目的產(chǎn)物，電泳圖上表現(xiàn)為明顯的非目的帶和少量拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)，重則帶來大量的非目的產(chǎn)物出現(xiàn)，在電泳圖上表現(xiàn)為干擾很嚴(yán)重的拖尾和大量的彌散，導(dǎo)致主帶模糊或根本無(wú)主帶，整個(gè)擴(kuò)增失效。雖然近年來一個(gè)又一個(gè)功能強(qiáng)大的引物設(shè)計(jì)軟件被開發(fā)出來，但高特異性引物只是提高PCR 反應(yīng)效率的一個(gè)方面，對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化組合則是解決這一問題的主要方面。根據(jù)多年來各國(guó)科學(xué)家的研究成果我們發(fā)現(xiàn)，通過向PCR反應(yīng)體系中添加一定量的添加劑可以在不同程度上減少或消除副反應(yīng)的發(fā)生。這些添加劑包括DMSO，Betain, BSA，甘油，Tween-20, NP-40,甲酰胺等。但這些添加劑都有各自的局限性，在各種不同的情況下效果差異很大，給應(yīng)用帶來不便。因此開發(fā)更多更新的PCR反應(yīng)優(yōu)化劑是發(fā)展PCR技術(shù)過程中一項(xiàng)很重要的工作。鑒于PCR反應(yīng)本身是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增方法，因此在本發(fā)明的摸索過程中，試圖從模擬細(xì)胞核內(nèi)環(huán)境出發(fā)，尋找參與釀酒酵母細(xì)胞代謝的核內(nèi)，并設(shè)計(jì)將這些核內(nèi)以接近核內(nèi)濃度的條件下添加入PCR反應(yīng)體系中，以期獲得更為有效的PCR添加齊IJ。 尿苷就是通過這個(gè)思路被我們發(fā)現(xiàn)有明顯增進(jìn)PCR反應(yīng)特異性的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了利用尿苷Uridine)提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增效果的方法。該方法通過在PCR反應(yīng)體系中添加尿苷達(dá)到對(duì)DNA片段的有效擴(kuò)增。此方法明顯提高了反應(yīng)特異性，應(yīng)用成本低，使用簡(jiǎn)便，易于掌握。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的利用尿苷提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增效果的方法是(1).尿苷溶液的配制40-50mg/mL的尿苷水溶液；(2).尿苷溶液的滅菌；
(3) .PCR體系的配置；(4). PCR體系的優(yōu)化在PCR反應(yīng)體系中添加尿苷溶液，尿苷終濃度為20_40mg/ mL ；(5). PCR條件的設(shè)定與運(yùn)行；(6) .PCR 產(chǎn)物檢測(cè)。而且，所述的PCR體系的優(yōu)化是尿苷終濃度的優(yōu)選濃度范圍為20-30mg/mL。而且，所述的尿苷溶液是指尿苷完全溶解于純水、10XPCR緩沖液或者其它一切適用于PCR反應(yīng)的液相中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是1.本發(fā)明作為PCR增效劑的新成果，與已有方法相比，尿苷優(yōu)化擴(kuò)增的效果明顯， 確實(shí)提高了 PCR擴(kuò)增的特異性，且尿苷較為低廉的價(jià)格使得其應(yīng)用沒有增加很多成本。2.本發(fā)明中使用的PCR優(yōu)化試劑尿苷，添加到體系中基本不影響PCR反應(yīng)后的一般后續(xù)操作如電泳分離DNA產(chǎn)物。3.該尿苷提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增效果的優(yōu)化方法易于掌握，使用簡(jiǎn)便。


圖1為本發(fā)明中利用尿苷優(yōu)化擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為900bp左右的非高GC-DNA片段的結(jié)果電泳圖與不添加尿苷的反應(yīng)結(jié)果電泳圖的對(duì)比圖；圖2為本發(fā)明中利用尿苷優(yōu)化擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為750bp左右的高GC-DNA片段的結(jié)果電泳圖，與不添加尿苷的反應(yīng)結(jié)果電泳圖的對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述，但不局限于下述實(shí)施例。本發(fā)明所涉及的PCR技術(shù)的優(yōu)化方法是通過向PCR體系中添加尿苷來實(shí)現(xiàn)的，其具體操作方法如下1.尿苷Uridine)溶液的制備尿苷又名尿嘧啶核苷(Uridine)，1-β-D-Ribofuranosyl uracil,分子式為 C9H12N206分子量為M4. 20。尿苷固體粉末可以用市售產(chǎn)品，屬于現(xiàn)有技術(shù)，不再詳細(xì)敘述。所述的尿苷溶液的濃度為可以根據(jù)需要配置不同濃度大小的溶液，濃度的單位為質(zhì)量體積比(W/V)，范圍在40-50mg/mL。一般推薦濃度為40mg/mL。以配置濃度為(W/V)40mg/ mL的尿苷溶液為例，先精確稱取40mg尿苷粉末，置于已滅菌的1. 5mL的小離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水，使其溶解，最后定容至lmL。2.尿苷溶液的滅菌溶液均需用高溫滅菌(12rC，40min)。3. PCR體系的配置PCR體系根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)，由待擴(kuò)增DNA片斷的不同而各不相同。具體表現(xiàn)在 dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量應(yīng)根據(jù)不同的模板和不同的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度來選擇；PCR反應(yīng)體系中的H2O為雙蒸水及以上級(jí)別水，體系中水的添加量應(yīng)根據(jù)尿苷溶液添加的體積進(jìn)行調(diào)整，即應(yīng)扣除相應(yīng)添加的尿苷溶液的體積。4. PCR體系的優(yōu)化
在上述PCR反應(yīng)體系中加入一定體積的尿苷溶液。5. PCR條件的設(shè)定與運(yùn)行PCR反應(yīng)條件中的預(yù)變性，變性及退火各階段的溫度和對(duì)應(yīng)時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同模板和引物融解溫度來選擇；其中的延伸溫度根據(jù)所用聚合酶的合適溫度來選擇；其中的延伸時(shí)間根據(jù)所擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度來選擇；其中的循環(huán)次數(shù)根據(jù)個(gè)人試驗(yàn)?zāi)康暮托枰M(jìn)行選擇。6. PCR產(chǎn)物的檢測(cè)一般用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠的濃度及PCR產(chǎn)物的上樣體積需根據(jù)具體情況而定。所述的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)依照已有方法概括如下(1)制備所需要濃度的瓊脂糖凝膠，具體濃度大小應(yīng)根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的大小來確定。(2)吸取一定體積的PCR產(chǎn)物上電泳槽點(diǎn)樣，同時(shí)點(diǎn)上合適分子量標(biāo)記作為參照。(3)加上3-4V/cm的電壓進(jìn)行電泳。(4)待指示劑到合適位置時(shí)，取出膠板于凝膠成象系統(tǒng)下觀察并照相記錄。實(shí)施例1尿苷對(duì)一般PCR (非高GC)的增效作用1)尿苷溶液配制40mg/ml ；2)尿苷溶液滅菌高溫滅菌(121°C，30min)；3) PCR反應(yīng)體系的配置按以下順序和添加量配置體系于薄壁PCR管中10 X PCR 緩沖液1. 2 μ LdNTPs (25mM)0. 1 μ L模板(100ng/ul)0. 2 μ L引物 1(2.0 μ Μ)0· 75 μ L引物 2 O. 0 μ Μ)0· 75 μ LMg2+ (25mM)1. 2μ LTaq (5U/ μ L)0. 2 μ L尿苷0Omg/ml)or H2O 7. 6 μ L
引物1引物2擴(kuò)增長(zhǎng)度1TTTATGGTTGTTGCCCTCTCCTAAGAAGAAAAAGCCTGAGCTTGGT881其中，模板為人類Genome DNA，由本實(shí)驗(yàn)室自行提取。Taq酶及PCR緩沖液購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志生物工程公司。共配置PCR體系2管，使用一對(duì)引物，編號(hào)分別為1，添加尿苷的編號(hào)分別為1’。其擴(kuò)增的目的產(chǎn)物大小為900bp左右。4) PCR體系優(yōu)化在上述12微升PCR反應(yīng)體系中包含加入7. 6微升尿苷GOmg/ ml)溶液，這樣肌苷的終濃度為25. 3mg/ml。5)PCR條件的設(shè)定與運(yùn)行。按以下條件在PCR儀上設(shè)定循環(huán)條件進(jìn)行PCR熱循環(huán)預(yù)變性94 °C 4min
權(quán)利要求
1.利用尿苷提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增效果的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1).尿苷溶液的配制40-50mg/mL的尿苷水溶液；(2).尿苷溶液的滅菌；(3).PCR體系的配置；(4).PCR體系的優(yōu)化在PCR反應(yīng)體系中添加尿苷溶液，尿苷終濃度為20-40mg/mL ；(5).PCR條件的設(shè)定與運(yùn)行；(6).PCR產(chǎn)物檢測(cè)。
全文摘要
一種利用尿苷(Uridine)提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增效果的方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，該方法是在原有的PCR擴(kuò)增方法基礎(chǔ)上，通過向體系中添加一定量的尿苷來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明優(yōu)化擴(kuò)增的效果明顯，操作簡(jiǎn)便，易于掌握。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102181427SQ20101062236
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者呂志偉, 張治洲, 徐仲, 王有志, 鄭嘉祺 申請(qǐng)人:山東大正醫(yī)療器械股份有限公司