專利名稱：水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物領(lǐng)域，涉及一種水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體，具體涉及一種利用DNA分子重排方法和功能互補法對從來自水生拉恩氏菌中編碼 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)基因進行改造的多位點突變體，該改造后的多位點突變體對草甘膦的抗性能力大幅度提高。
背景技術(shù)：
草甘膦(glyphosate)的廣泛使用及其非選擇性的特點，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物成為研究熱點。我國作為草甘膦生產(chǎn)和出口的大國，目前尚沒有具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、適用于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[ 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase] (EPSP 合) (EC2. 5. 1. 19)基因，因而在國際競爭中處于不利地位。因此，尋找具自主知識產(chǎn)權(quán)的高抗草甘膦EPSP新基因，開展對EPSP活性位點的研究，對尋找抗草甘膦新基因中的專利保護位點以及改造、利用新基因培育新型抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物均具有積極意義。莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑，EPSP合酶是莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，即催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草劑草甘膦是PEP的結(jié)構(gòu)類似物，能與PEP競爭性抑制EPSP 的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，最終導(dǎo)致植物死亡。但迄今為止，成功用于商業(yè)化的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的基因只有CP4-EPSP基因，CP4-EPSP屬于II型EPSP，有不同于植物EPSP基因的核苷酸順序，轉(zhuǎn)錄翻譯后的EPSP合成酶對草甘膦不再敏感，因而具有對草甘膦的耐藥性，其催化活性介于植物和大腸桿菌之間。許多本身無抗性或抗性不高的EPSP合酶，通過突變其氨基酸而降低與草甘膦之間親和性來產(chǎn)生草甘膦抗性的同時，也降低了與PEP之間的親和性，使酶活性不足，難以應(yīng)付反應(yīng)所需。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因 AroA-Ra多位點突變體，具體是采用分子體外重組方法尋找一種EPSP合酶突變體，該突變體保持了對PEP之間的高親和性，同時降低了與草甘膦除草劑之間親和性，從而大幅度提高了對草甘膦的抗性能力。本發(fā)明所述的水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體，采用分子體外重組篩選高活性EPSP合酶基因AroA-Ra，通過載體構(gòu)建、功能互補菌株篩選、多位點突變技術(shù)驗證以及植物表達等步驟制備而成。首先，本發(fā)明通過基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)合成水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra，該基因全長1284bp。即以EPSP合酶基因為模板，P27，P^為引物擴增EPSP合酶基因?；厥誆PSP合酶基因片段以DNase I緩沖液(50mmol/LTris-Cl ρΗ7· 4+lmmol/LMgC12) 100 μ 1 溶解；加入 0. IU DNase I，25°C處理 15分鐘。70°C處理10分鐘。10%丙烯酰胺電泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。進行 Primerless PCR 擴增。反應(yīng)體系5 μ 1 小片段 DNA+4 μ 1 2. 5mmol/L dNTPs+4. 5 μ 1 25mmol/LMgCl2+Taq2U+ddH20 至 50μ 1 ；反應(yīng)程序為94°C 30s, 40°C 30s, 72°C 30s，共 45 個循環(huán)。將無引物PCR擴增片段以P27，P^為引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系5μ1 Primerless PCR 產(chǎn)物+Ρ27 0. 2ng+P28 0. 2ng+10XPCR Buffer 5 μ 1+2. 5mmol/L dNTPs 4μ l+Taq2U+ddH20 至 50μ 1。反應(yīng)程序為94°C 30s,70°C 30s，72°C 2. Omin，共；35 個循環(huán)， 回收1284bp重排EPSP合酶基因片段，命名為EPSP合酶基因AroA-Ra。將上述回收的重排EPSP合酶基因片段，即EPSP合酶基因AroA-Ra經(jīng)BamH I和 SacI雙酶切后，構(gòu)建入原核表達載體pG251啟動子和tlt2終止子之間，該載體帶有氨芐青霉素抗性基因。電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5 α獲得突變體表達文庫，庫容達到108，而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國Omega公司)進行質(zhì)粒提取。取1 μ 1大量提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2799(NEB公司)涂布與含有IOOmM草甘瞵的M9平板上培養(yǎng)48h，將生長良好菌落接種到含有200mM草甘瞵的M9平板上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有1個克隆能在含200mM草甘瞵的 M9平板上生長，其所含的質(zhì)粒命名為pmAroA-Ra。利用逐步序列測定方法對篩選獲得的高耐受草甘膦質(zhì)粒PmAroA-Ra全序列進行 DNA測序。以水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因為模版，按照測序即獲得本發(fā)明的水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體，其中，突變1 (C408E) =EPSP合酶氨基酸序列中第408位上的半胱氨酸被替換為谷氨酸；突變2(Q271K)第271位上的谷氨酰胺被替換為賴氨酸；突變3(HU8R)第1 位的組氨酸替換為精氨酸；突變4(P101Q 第101位上的脯氨酸被替換為絲氨酸；突變5 (T97A)第97位上的蘇氨酸被替換為丙氨酸；突變6 (G96A) 第96位上的甘氨酸被替換為丙氨酸(參看序列SEQ ID No 1、2)。所獲得的突變位點均為關(guān)鍵位點，突變EPSP合酶除對PEP之間的高親和性外，降低了與草甘膦除草劑之間親和性， 從而使該突變體對草甘膦的抗性能力大幅度提高。本發(fā)明通過偏愛密碼改造及DNA分子重排獲得水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因多位點突變體，其不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保持著與PEP較強的親和性，這些特性為其用于轉(zhuǎn)基因作物的培育提供了可能。本發(fā)明所述的術(shù)語與其一般概念相同。所述的“核苷酸”和“引物”序列均為5’端至3’端。所述的“生物細胞”指微生物、植物細胞或組織。所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要為細菌。


圖1為高草甘膦抗性EPSP合酶的篩選結(jié)果(mAroA-Ra為突變基因，AroA-Ra為野生型基因)。圖2為本發(fā)明的水生拉恩氏菌EPSP合酶基因多位點突變體在大腸桿菌中表達及純化，其中1為大腸桿菌表達的總蛋白，2為純化的蛋白，3為蛋白質(zhì)分子量。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但所述實施例不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1 EPSP合酶基因的DNA分子重排(DNA Shuffling)11水生拉恩氏菌的抗草甘磷除草劑基因AroA-Ra合成通過基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)合成水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra，所用的引物如下l.AraII-1
GTGGAATCCCTGACATTACAACCCGTTGCGCTGGTTAACGGCAGCATCAATTTACCTGGC
2. Aral 1-2
AAAAGCAGCCAGTAAAAGTGCGCGGTTAGAAACACTTTTTGAGCCAGGTAAATTGATGCT
3. Aral 1-3
CTTTTACTGGCTGCTTTTGCACAGGGTACTACCCGCCTGACTAACCTGCTCGACAGCGAT
4. Aral 1-4
GACACCCAGTTGAGTGAGTGCTGTCAACATATGACGCACATCATCGCTGTCGAGCAGGTT
5. Aral 1-5
CTCACTCAACTGGGTGTCACGCATCGTTTATCTGCATCCCGCACCGAGTGTGAAATCGAT
6.Aral1-6
AAACAGTTCCAGACCTTTAGCATTGGAAAAAGCCGTGCCCAGACCATCGATTTCACACTC
7. Aral 1-7
AAAGGTCTGGAACTGTTTCTTGGGAATGCAGGAACCGCAATGCGTCCGCTGGCGGCAGCA
8. Aral1-8
CGGCTCTCCGGTCAGTACAACATCCTGTTCGCCCAGGCATAATGCTGCCGCCAGCGGACG
9. Aral1-9
GTACTGACCGGAGAGCCGCGCATGAAAGAGCGCCCGATCGGGCATCTGGTTGATGCGCTT
10. AraII-IO
GTTTTCCTGCTCCAGATAATCAATCTGCGCACCGCCCTGACGAAGCGCATCAACCAGATG
ll.Arall-ll
TATCTGGAGCAGGAAAACTATCCGCCTTTGCGCCTGCAGGGTGGATTTAGTGGCGGTGAC
12. AraII-12
CGCTGTCAGAAACTGGCTGGAAACACTGCCATCAACACTGACGTCACCGCCACTAAATCC
13. AraII-13
AGCCAGTTTCTGACAGCGTTATTGATGACAGCTCCGCTGGCAGATAACGATACAACCATT
14.AraII-14
GATATCGATATAAGGTTTGGAAACCAGATCACCTTTAATCTGAATGGTTGTATCGTTATC
15. AraII-15
AAACCTTATATCGATATCACGCTGAACCTGATGAAAACCTTTGGTATTGAAGTGGAAAAC
16. AraII-16
ATAATGCTGACGTCCTTGGATGCTAAATCTCTGGTACTCGTGGTTTTCCACTTCAATACC
17. AraII-17 CAAGGACGTC AGCATTATGT GTCTCCGGGG GCATATCTGG TCGAAGGTGA TGCCTCTTCA18. AraII-18 CGTACCGCCC TTGATCGCCG CAGCGGCCAG GAAGTAGGAC GCTGAAGAGG CATCACCTTC19. AraII-19 GCGATCAAGG GCGGTACGGT TCGTGTGACC GGAATCGGCA AAAACAGCAT GCAGGGCGAT20. Aral1-20 AATAGTAGCA CCCATTTTTT CCAGCACGTC TGCAAAACGA ATATCGCCCT GCATGCTGTT21. AraII-21 GAAAAAATGG GTGCTACTAT TCACTGGGCT GATGATTATA TCGAATGTAC CCGCGGTGAA22. AraII-22 TGCATCAGGA ATATGGTTCA TGTCCATGTC AATGCCGTTC AGTTCACCGC GGGTACATTC23. AraII-23 AACCATATTC CTGATGCAGC AATGACCATT GCTACCGCTG CCTTGTTTGC TGAAGGCCCG24. Aral 1-24 GGTCTCTTTA ACACGCCAGT TGTAAATATT ACGCAACGTT GTCGGGCCTT CAGCAAACAA25. AraII-25 TGGCGTGTTA AAGAGACCGA TCGCCTGACG GCGATGGCGA CTGAGCTGCG TAAAGTCGGT26. Aral 1-26 CGGATCAATA CGAATGTAAT CTTCGCCCTC TTCCACTGTT GCACCGACTT TACGCAGCTC27. AraII-27 GATTACATTC GTATTGATCC GCCTCAATCG CTGAAATTTG CCGAGATTGG CACCTATAAT28. Aral 1-28 GGATAACGCC ACCAGCGAGA AACACATCGC CATGCGGTGA TCATTATAGG TGCCAATCTC29. Aral 1-29 TTCTCGCTGG TGGCGTTATC CGATACGCCG GTGACCATTC TTGATCCGAA GTGTACCGCA30. Aral 1-30 GCCGCCAGAC GGTCAAAATA GTCCGGGAAC GTTTTTGCGG TACACTTCGG ATCA31. Arall-31 CTATGCCAGT GTGCTGATTG CCGCCAGACG GTCAAAATA利用PCR進行EPSP合酶基因擴增，在100 μ 1反應(yīng)體系中，AraII-2-AraIIII-30共 30個引物的添加量為2ng，外側(cè)引物AraII-I和AraII-31添加量為30ng。以KOD FX taq 酶(Toyobo公司，日本)為Taq DNA聚合酶。擴增條件依次為94°C預(yù)熱Imin ；94°C 30s ； 500C 30s ；72°C lOmin，使用的，共 25 個循環(huán)。PCR結(jié)束后，1 % (w/v)瓊脂糖膠回收，取10 μ 1直接與Τ/Α克隆載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4°C連接過夜。高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，獲得陽性克隆。1.2 PCR擴增EPSP合酶基因及回收以EPSP合酶基因為模板，Ρ27, Ρ28為引物擴增EPSP合酶基因，Ρ27 :5，GAGAGAGGATCCATGGAATCCCTGACATTACAAC3，P28 :5’ GAGAGAGAGCTCTTATGCCAGTGTGCTGATTGC3，反應(yīng)條件為:94°C IOmin預(yù)變性，94°C變性30s, 72°C退火和延伸1. 5min,共30個循環(huán)，1 % Agrose 電泳，透吸袋法回收1284bp的基因片段。DNase I降解DNA及回收小片段回收 EPSP 合酶基因片段以 DNase I 緩沖液(50mmol/L Tris-Cl pH7. 4+lmmol/ LMgC12)100y 1溶解；加入0. IU DNase I，25°C處理15分鐘。70°C處理10分鐘。10%丙烯酰胺電泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μ 1 IOX無引物PCR緩沖液(Primerless PCR Buffer) (50mmol/L KCl+10mmol/LTris-Cl pH9. 0+1% Triton)溶解沉淀。無引物PCR(Primerless PCR)進行Primerless PCR 擴增。反應(yīng)體系5 μ 1 小片段 DNA+4 μ 1 2. 5mmol/L dNTPs+4. 5 μ 125mmol/LMgCl2+Taq2U+ddH20 至 50 μ 1 ；反應(yīng)程序為94 °C 30s, 40 "C 30s, 72°C 30s，共45個循環(huán)，2% Agrose電泳檢測PCR擴增結(jié)果。有引物PCR(Primer PCR)進行PrimerPCR 擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系5 μ 1 Primerless PCR 產(chǎn)物 +Ρ27 0. 2ng+P280. 2ng+10XPCR Buffer 5 μ 1+2. 5mmol/L dNTPs 4 μ l+Taq2U+ddH20 至 50 μ 1。反應(yīng)程序為:94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 2. Omin,共 35 個循環(huán)，1 % Agrose 電泳檢測，回收 1284bp 基因片段，將其命名為EPSP合酶基因AroA-Ra。實施例2高草甘膦抗性EPSP合酶篩選將上述回收重排的EPSP合酶基因片段，即EPSP合酶基因AroA-Ra經(jīng)BamH I和 SacI雙酶切后，構(gòu)建入原核表達載體pG251啟動子和tlt2終止子之間，該載體帶有氨芐青霉素抗性基因。電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5 α獲得突變體表達文庫，庫容達到108， 而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國Omega公司)進行質(zhì)粒提取。取1 μ 1大量提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2799 (NEB公司)涂布與含有IOOmM草甘瞵的Μ9平板上培養(yǎng)48h，發(fā)現(xiàn)有三個菌落生長良好。將這三個菌落分別接種到含有100mM、200mM草甘瞵(glyphosate)的 M9平板上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有1個克隆能在含200mM草甘瞵的M9平板上生長，其所含的質(zhì)粒命名為pmAroA-Ra(其中含有突變基因mAroA-Ra)。將含有突變基因mAroA-Ra、野生型基因 AroA-Ra，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ER2799 (NEB公司)中，轉(zhuǎn)化子在豐富培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)上生長不存在差異，而將轉(zhuǎn)化子用轉(zhuǎn)接到含200mM草甘瞵的M9固體培養(yǎng)基上，結(jié)果證明含突變基因mAroA-Ra的轉(zhuǎn)化子比野生型基因AroA-Ra轉(zhuǎn)化子生長良好，表明mAroA-Ra基因提高了大腸桿菌抗草甘膦特性(參看圖1)。實施例3高草甘膦抗性的EPSP表達3. 1高耐受草甘膦的DNA片斷的序列分析利用逐步序列測定方法對實施例2中所篩選獲得的高耐受草甘膦質(zhì)粒pmAroA-Ra 全序列進行DNA測序。分析結(jié)果表明，該高抗抗草甘膦突變體在同一分子上含有下述1至 6突變位點突變1 (C408E) =EPSP合酶氨基酸序列中第408位上的半胱氨酸被替換為谷氨酸；突變2 (Q271K)第271位上的谷氨酰胺被替換為賴氨酸；突變3 (H128R)第1 位的組氨酸替換為精氨酸；突變4(P101Q 第101位上的脯氨酸被替換為絲氨酸；突變5 (T97A) 第97位上的蘇氨酸被替換為丙氨酸；突變6(G96A)第96位上的甘氨酸被替換為丙氨酸 (參看序列表SEQ ID No 1、2)。
7
以上述篩選獲得的EPSP合酶基因突變體為模版，用引物P27 5，GAGAGAGGATCCATG GAATCCCTGACATTACAAC3，P28 5，GAGAGAGAGCTCTTATGCCAGTGTGCTGATTGC3，進行 PCR 擴增，以 KOD Plus (Toyobo 日本)為 Taq DNA聚合酶，擴增條件依次為-MV 30s, 55°C 30s, 72°C 90s, 擴增30個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，加入2U的rtaq酶(大連寶生物工程公司)，72°C延伸90s，擴增片段長1284bp。PCR產(chǎn)物用BamH I和Me I酶切后，連入相同酶切的載體pET48a(NEB 公司)得到重組質(zhì)粒pET-mAroA-Ra并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司)，將轉(zhuǎn)化子涂布在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh。用凝膠-蛋白純化試劑盒HisTrap HP (Amersham Biosciences公司)對其進行蛋白表達純化，SDS-PAGE電泳檢測。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測， 蛋白大小約48kDa，與預(yù)測值相符(參看圖2，其中1為大腸桿菌表達的總蛋白，2為純化的蛋白，3為蛋白質(zhì)分子量)。實施例4 EPSP合酶基因的回復(fù)突變測定以合成EPSP合酶基因突變體為模版，用引物P27 :GAGAGAGG ATCCATGGAATCCCTGACATTACAAC,P79F :TGCTCCTGCATT CCCAAGAAAC ；P79Z GTTTCTTGGGAATGCAGGAGCA,P80F :AGGGAACGCATTGCTGCTCCTGCATTCCCAA ；P80Z TTGGGAA TGCAGGAGCAGCAATGCGTTCCCT，P81F :ACGCCCGATCGGG CGCTCTTTC,P81Z GAAAGAGCGCCCGATCGGGCGT,P82F=CTTC ATGCTGT TTTTGCCGAT ；P82Z :ATCGGCAAAAACAGCATGAAG,P84F GTCTCCTTCGGATCAAGAATGGT ；P84Z:ACCATTCTTGAT CCGAAGGAGAC,P28 :GAGAGAGAGCTCTTATGCCAGTGTGC TGATTGC。取Ιμ EPSP合酶基因擴增片段為模板，以Ρ27和P79F;P79Z和P80F;P80Z和 P81F ；P81Z 和 P82F ；P82Z 和 P84F ；P84Z 和 P^ 進行 PCR 擴增，擴增條件為94°C預(yù)熱 Imin ； 94°C，30S，60°C，30S，72°C，lmin。共25個循環(huán)，PCR結(jié)束后，片斷用10%丙烯酰胺膠回收， 將上述7個回收片斷取IO-IOOng為模板混合，以P27和P28為引物將上述片斷拼接，擴增條件為94°C預(yù)熱 Imin ；94°C, 30s, 60°C, 30s, 72°C, 4min0 共 25 個循環(huán)。PCR結(jié)束后，酚、氯仿抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀。各加入McI和 BamHI酶切消化，DNA柱回收酶切片斷。將酶切處理好片段進行定向克隆，高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2799 (NEB公司)涂布與含有200mM草甘瞵的M9平板上培養(yǎng)48h。實施例5 EPSP合酶活測定和動力學(xué)參數(shù)的測定測定方法無機磷標準曲線IOmM無機磷按1 10稀釋，分別取0、1、2、3. . . 20 μ 1與1. 5ml Eppendorf離心管中，加入純水至100 μ 1混勻，加入MAT溶液0. 8ml混勻，計時三分鐘后加入SC溶液100 μ 1迅速混勻，室溫靜置20min后測定0D660值。重復(fù)三次。以無機磷濃度為橫坐標，0D660值為總縱坐標作圖得到無機磷標準曲線。1)酶活測定蛋白定量采用考馬斯亮藍G-250染色法(Bradford，1976)。在冰上與1. 5mlEppendorf離心管中加入以下溶液10mM PEP溶液2 μ 1，IOmM S3P溶液2μ1，0. 5Μ HEPES 溶液 2 μ 1，ImM(NH4)6MO7O24 · 4Η20 溶液 2 μ 1 和雙蒸水 12 μ 1 混勻，與 28°C溫浴 5min 后各管樣品間隔2s加入5μ 1純化蛋白并計時，2min后再間隔2s依次加入200 μ 1 MAT溶液，顯色:3min后再間隔2s依次加入20 μ 1 34% SC溶液迅速混勻，室溫顯色20min后測定 0D660值。對照除不加純化蛋白外，其余同樣品管。樣品管與對照管的0D660值相減后，對照無機磷標準曲線即可求得反應(yīng)釋放出的無機磷摩爾量，再除以反應(yīng)時間和酶蛋白量就得到酶的酶活力。2)半抑制量(IC50)測定上述反應(yīng)液中添加(ΚΙΟΛ ΟΛ Ο^ΚΚΚΚΚΚδΟΟπιΜ草甘膦，所得酶比活力數(shù)據(jù)以草甘膦濃度為X軸，采用對數(shù)坐標，以反應(yīng)速度(nkat/mg)為Y 軸作圖。3) Km (PEP)測定將S3P溶液濃度恒定于ImM，在不同PEP濃度(0. 05、 0. 067,0. 1,0. 2,0. 5,1. OmM)下按上述反應(yīng)體系測定酶反應(yīng)速度，所測數(shù)值按V_v/[S] (Eadic-Hofstee)法作圖。4)Ki(glyphosate)測定在不同草甘膦濃度(O、10、50、100 μ M)下測定PEP濃度為0. 05,0. 067,0. 1,0. 2,0. 5,1. OmM時EPSP的酶反應(yīng)速度。采取雙倒數(shù)作圖，得到1/V-1/ [S]直線，再將各直線的斜率作為縱坐標，草甘膦的濃度作為橫坐標得到一條新的直線，該直線與X軸的交點即為Ki (glyphosate)值。2.測定結(jié)果mAroA-Ra EPSP合酶對PEP底物的酶活性為21. 45士0. 12U/mg，其它的動力學(xué)參數(shù)如表1所示。表1 mAroA-Ra EPSP合酶動力學(xué)參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體，其核苷酸序列如SEQ IDNo 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體，其特征在于，在所述突變體氨基酸序列SEQ ID No 2上共有6處突變點，其中，突變1(C408E) 第408位上的半胱氨酸被替換為谷氨酸；突變2(Q271K)第271位上的谷氨酰胺被替換為賴氨酸；突變3(HU8R)第1 位的組氨酸替換為精氨酸；突變4(P101Q 第101位上的脯氨酸被替換為絲氨酸；突變5 (T97A)第97位上的蘇氨酸被替換為丙氨酸；突變6 (G96A) 第96位上的甘氨酸被替換為丙氨酸。
4.權(quán)利要求1所述的水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體在提高草甘膦抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位點突變體，具體涉及一種利用DNA分子重排方法和功能互補法對從來自水生拉恩氏菌中編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)基因進行改造后的多位點突變體，該改造后的多位點突變體對草甘膦的抗性能力大幅度提高。所述的多位點突變體的核苷酸序列如SEQ ID No1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示，該突變體在同一分子上含有6個不同突變位點。本發(fā)明的多位點突變體除保持原有EPSP合酶對PEP之間的高親和性外，還降低了與草甘膦除草劑之間親和性，從而使該突變體對草甘膦的抗性能力大幅度提高。
文檔編號C12N15/82GK102559708SQ20101059848
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 陳晨, 韓紅娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院