專利名稱：一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片，特別涉及一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抑郁癥(Major depression disorder, MDD)是一種情感障礙性精神疾病，主要表 現(xiàn)持續(xù)的情感低落、思維遲緩和意志減退，常伴有認(rèn)知障礙、行為紊亂及軀體癥狀。其終生 患病率為10% 20%，自殺率高達(dá)10% 25%。抑郁癥引起的精神殘疾給患者、家庭和社會(huì) 帶來(lái)了精神上和經(jīng)濟(jì)上沉重的負(fù)擔(dān)，自傷自殺等行為更是危害巨大，且許多患者為反復(fù)發(fā) 作病程，因此有效、規(guī)范、全程抗抑郁治療的重要性不言而喻。目前，以選擇性5-HT和5-HT/NE再攝取抑制劑(SSRIs/SNRIs)為代表的各種新型 抗抑郁藥物以其臨床總體的安全性和耐受性較好而得到廣泛應(yīng)用。但是抗抑郁治療的個(gè)體 差異非常顯著，部分患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，30 50%患者治療無(wú)顯效，20%成為難治性 抑郁；而且，應(yīng)用抗抑郁藥物治療后即刻導(dǎo)致突觸間隙5-HT/NE水平增高，給藥1周后腦內(nèi) 藥物濃度穩(wěn)定維持在有效水平，但是臨床起效通常需2 3周，充分顯效更需4 6周以 上，還有部分患者因不良反應(yīng)而提早停止藥物治療，造成早期復(fù)發(fā)率增加，病程期間自殺風(fēng) 險(xiǎn)顯著增加?？挂钟羲幬锱R床療效差異顯著和延遲起效造成的療效早期預(yù)測(cè)困難是臨床存 在的極為普遍而突出的問(wèn)題，亟待解決！
本發(fā)明提供一種生物芯片，可以根據(jù)患者遺傳基因的特征(單核苷酸多態(tài)性)，，從選用 藥物的種類、接受治療患者的性別、藥物發(fā)揮療效的推定時(shí)間點(diǎn)，以及可能產(chǎn)生的不良反應(yīng) 等方面，早期預(yù)測(cè)抗抑郁劑對(duì)于患者的治療效應(yīng)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定和實(shí)施個(gè)體化的 治療方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于本發(fā)明提供一種生物芯片，可以根據(jù)患者的遺傳基因的特征 (單核苷酸多態(tài)性)，從選用藥物的種類、接受治療患者的性別、藥物發(fā)揮療效的推定時(shí)間 點(diǎn)，以及可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)等方面，早期預(yù)測(cè)抗抑郁劑對(duì)于患者的治療效應(yīng)，從而指導(dǎo)臨 床醫(yī)生制定和實(shí)施個(gè)體化的治療方案。一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁藥物影響的生物芯片，由載體與生物探針構(gòu)成，其特征在于 所述的生物探針含有序列為NO :1-20任意一種或多種，所述的序列末端經(jīng)熒光標(biāo)記修 飾。具體來(lái)說(shuō)根據(jù)前期科研成果獲得的與抗抑郁劑療效相關(guān)的易感基因單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)(SNP)，采用I^rimer Primer 5.0軟件，針對(duì)每一個(gè)SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)并合成一對(duì)上下游 引物和一對(duì)寡核苷酸序列標(biāo)簽探針(野生型標(biāo)簽探針和突變型標(biāo)簽探針)，且一對(duì)寡核苷酸 序列標(biāo)簽探針的序列末端經(jīng)熒光標(biāo)記修飾。一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片的制備方法為，包括原位合成或預(yù)合 成后點(diǎn)樣。
有益效果
本發(fā)明可以通過(guò)生物芯片技術(shù)可以根據(jù)患者的遺傳基因的特征(單核苷酸多態(tài)性)，從 選用藥物的種類、接受治療患者的性別、藥物發(fā)揮療效的推定時(shí)間點(diǎn)，以及可能產(chǎn)生的不良 反應(yīng)等方面，早期預(yù)測(cè)抗抑郁劑對(duì)于患者的治療效應(yīng)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定和實(shí)施個(gè)體 化的治療方案。同時(shí)，本發(fā)明涉及生物芯片基因分型技術(shù)是一種特異性強(qiáng)、高通量的基因分 型技術(shù)，適用于臨床快速基因分型，在臨床方面具有很大應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
一、臨床患者的入組和評(píng)估 1.入組標(biāo)準(zhǔn)
入組符合DSM-IV單相抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)、漢密爾頓抑郁量表(HAMD-17)評(píng)分> 18分、 18 60歲、男女首發(fā)或復(fù)發(fā)的中國(guó)漢族抑郁癥患者，均簽寫知情同意書，經(jīng)倫理委員會(huì)同
辰、ο2.排除標(biāo)準(zhǔn)
嚴(yán)格排除有精神分裂癥、酒精和藥物依賴病史；有腦器質(zhì)性疾病和內(nèi)分泌疾病史；經(jīng) 檢查血象、心、肝、腎功能異常者；妊娠期和哺乳婦女；有躁狂或輕躁狂發(fā)作史；抑郁發(fā)作過(guò) 程中伴有精神病性癥狀者；電休克治療者。3.臨床評(píng)估 3. 1.抑郁癥狀
采用HAMD (17項(xiàng)版本)量表評(píng)定抑郁癥狀嚴(yán)重程度。3. 2.藥物治療和評(píng)價(jià)
3. 2. 1.共入組首發(fā)或反復(fù)發(fā)作患者400例，隨機(jī)分入SSRI治療組和SNRI治療組各200 例，治療前和治療后每?jī)芍?第2、4、6、8、10、12周)均采用HAMD量表(17項(xiàng)版本)評(píng)定治療效應(yīng)。3. 2. 2.治療效應(yīng)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)
第6周時(shí)HAMD-17減分率》50%，為藥物治療有效 < 50%，為藥物治療無(wú)效
第8周時(shí)HAMD-17得分< 7分，為病情緩解(痊愈) > 7分，為病情未緩解(未愈)
3. 2. 3.隨訪結(jié)束后的半年到一年期間，對(duì)所有入組患者進(jìn)行門診或電話回訪，此間出 現(xiàn)轉(zhuǎn)躁、轉(zhuǎn)精神分裂癥、轉(zhuǎn)其他精神疾病的患者，均不納入本研究。4.血液標(biāo)本采集和基因組DNA提取
患者入院后第2天晨6 8點(diǎn)，取肘靜脈血5ml，以2g/L EDTA抗凝。采用基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN-DP318-03，北京天根公司)提取患者血液基因組DNA，采用紫外分光光 度計(jì)(T6，北京普析通用儀器有限公司)測(cè)定濃度和純度，于-20°C儲(chǔ)存。二.藥物基因組學(xué)研究 1.遺傳標(biāo)記篩選1.1.功能SNP (fSNP):主要通過(guò)物種間保守序列的比對(duì)，篩選原則包括a.改變氨基 酸理化性質(zhì)的SNPs ；b.改變內(nèi)含子剪切位點(diǎn)的SNPs ；c.啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域可能會(huì)影響 表達(dá)的SNPs。采用dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合Hapmap Project,篩選fSNPs.
1. 2.標(biāo)簽SNP (tSNP)染色體上某一個(gè)SNP往往傾向于與其附近的若干個(gè)SNPs組合 在一起共同遺傳，這樣形成的組合稱為單倍域。單倍域內(nèi)SNP的變化較少，基因的遺傳多態(tài) 性主要表現(xiàn)為單倍域之間的重組改變。因此tSNP的遺傳特征可以代表其所屬的整個(gè)單倍 域(其中包含了除tSNP外的多個(gè)SNPs)的遺傳特征，具有簡(jiǎn)化并且優(yōu)化遺傳關(guān)聯(lián)分析的優(yōu) 勢(shì)。采用Haploview 4. O軟件篩選tSNPs。2.候選基因位點(diǎn)分型采用Illumina Golden Gate定制芯片進(jìn)行分型檢測(cè)。3.藥物療效相關(guān)易感基因確定應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件及建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行SNPs與療 效的關(guān)聯(lián)分析、單倍型分析以及基因-基因交互模型分析，以此來(lái)確定精神藥物療效相關(guān) 的易感基因。4. 1.統(tǒng)計(jì)分析
4. 1. 1.運(yùn)用t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)分析比較(有效/無(wú)效，緩解/未緩解)兩組的性別、年 齡、病程、發(fā)病次數(shù)、有無(wú)家族史等一般資料，采用SPSS13.0軟件。兩組間上述一般資料的 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4. 1.2.計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型檢出率(call rate)、最小等位基因頻率 (MAF)、哈迪溫伯格頻率(HWE)，采用Haploview 4. 0軟件。篩選保留同時(shí)符合以下條件的 SNP 位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)call rate 彡 95%、MAF 彡 5%、HWE 彡 0. 001%。4.1.3.運(yùn)用Multinomial Logistic model EM方法進(jìn)行SNP基因型頻率、等位基 因頻率與療效的關(guān)聯(lián)分析，采用Unphased 3. 0. 13軟件。4. 1. 4.單倍型分析，采用 Unphased 3. 0. 13 軟件。4. 2.分析篩選出與抗抑郁藥物療效相關(guān)的易感基因和多態(tài)性位點(diǎn)。三、探針的制備方法
一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片，由載體與生物探針構(gòu)成，其特征在于所 述的生物探針含有序列為NO :1-20任意一種或多種，所述的序列末端經(jīng)熒光標(biāo)簽修 飾。根據(jù)前期科研成果獲得的與抗抑郁劑療效相關(guān)的易感基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)， 采用I^rimer Primer 5.0軟件，針對(duì)每一個(gè)SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)并合成一對(duì)上下游引物和一 對(duì)寡核苷酸序列標(biāo)簽探針(野生型標(biāo)簽探針和突變型標(biāo)簽探針)，且一對(duì)寡核苷酸序列標(biāo)簽 探針的序列末端經(jīng)熒光標(biāo)記修飾。四、生物芯片的制備方法
將丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物核酸片段、丙烯酰胺單體、過(guò)硫酸銨、丙三醇和水混合成 預(yù)聚合物，其中，PCR產(chǎn)物核酸片段的濃度在0. OOl-lOOuM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在 1-30%之間，過(guò)硫酸銨重量濃度在0.01-5%之間，丙三醇的重量濃度為10-50%。充分振蕩 后離心靜置，移入96孔板，用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣至經(jīng)丙烯?；柰樾揎椀墓腆w基片(玻片) 的反應(yīng)槽內(nèi)。點(diǎn)樣完后將點(diǎn)樣基片置于一放置有四甲基乙二胺(TEMED)的密閉盒中，使四 甲基乙二胺揮發(fā)，揮發(fā)的四甲基乙二胺與固體基板上預(yù)聚合物陣點(diǎn)接觸并使其發(fā)生聚合反 應(yīng)，使各陣點(diǎn)上的核酸通過(guò)共聚反應(yīng)在固體基板上固定。保存于4°C備用。五、生物芯片雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè)配制雜交反應(yīng)液，每一種雜交反應(yīng)液只包含單個(gè)SNP位點(diǎn)的成對(duì)Cy3/cy5雙色熒光標(biāo) 記的探針各2mmol/L (MicroHybTM雜交液成分購(gòu)自iTeleChem公司)。固定好的三維凝膠核酸芯片置于0. lmmol/L NaOH溶液中5V/cm電泳lOmin，變性 處理為單鏈DNA陣列。每一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)只加入一種含單個(gè)SNP成對(duì)熒光標(biāo)記探針的雜交反應(yīng)液IOul。然 后其上覆蓋疏水化蓋玻片，使雜交液在反應(yīng)槽內(nèi)充分展開(kāi)，同時(shí)反應(yīng)槽之間彼此隔離。雜 交反應(yīng)在37°C持續(xù)2h，反應(yīng)槽保持潮濕密閉狀態(tài)。完成雜交的芯片置于含有MgC12的IXTBE中5V/cm電泳8min，清除非特異吸附 探針。氮?dú)獯蹈尚酒?，設(shè)置掃描儀Lux Scan IOK (北京博奧生物芯片公司)的激光功率 (Power) 70%,光電倍增管效率(PMT Gain) 70 %,對(duì)微陣列進(jìn)行掃描，分別得到Cy3掃描圖 與Cy5掃描圖，可得到綠、黃、紅三種顏色的圖像，分別對(duì)應(yīng)于野生純合子、雜合子和突變 純合子，通過(guò)顏色的區(qū)分可很容易地對(duì)SNP進(jìn)行分型。進(jìn)一步使用Quant Array軟件分析 每一樣本點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，得到樣本在兩種激光源掃描下的熒光強(qiáng)度及背景強(qiáng)度，據(jù)此求得 樣品的基因型，修正肉眼直接觀察的結(jié)果。其中患者的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物制備方法為多重PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50ul，其 中含 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 3)，50mmol/L KCl, 2. 0mmol/L MgCl2, 200umol/L dNTPs，各 60pmol/每一對(duì)上游和下游引物，5U Taq DNA聚合酶(Promaga公司)，患者血液樣本抽提基 因組DNA 250ng。將PCR反應(yīng)體系在PTC220型擴(kuò)增儀上進(jìn)行如下程序94°C預(yù)變性5min， 然后94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共；35個(gè)循環(huán)，最后72°C再延伸5min。其中上、下游引物為kq NO :21_40。六、生物芯片的效果驗(yàn)證試驗(yàn)
為驗(yàn)證芯片的分型結(jié)果，隨機(jī)抽取20份標(biāo)本使用普通引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物 純化后通過(guò)3730XL自動(dòng)測(cè)序儀(ABI公司)直接測(cè)序驗(yàn)證。20份標(biāo)本的直接測(cè)序結(jié)果與基 因芯片分型結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片，由載體與生物探針構(gòu)成，其特征在于 所述的生物探針含有序列為kq NO :1-20任意一種或多種，所述的序列末端經(jīng)熒光標(biāo)記修 飾。
2.根據(jù)一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片的制備方法，其特征在于包括原位 合成或預(yù)合成后點(diǎn)樣。
3.一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物芯片，特別涉及一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片及應(yīng)用。一種用于預(yù)測(cè)抗抑郁劑治療效應(yīng)的生物芯片，由載體與生物探針構(gòu)成，其特征在于所述的生物探針含有序列為SeqNO1-20任意一種或多種，所述的序列末端經(jīng)熒光標(biāo)記修飾。本發(fā)明通過(guò)生物芯片技術(shù)，可以根據(jù)患者的遺傳基因的特征(單核苷酸多態(tài)性)，從選用藥物的種類、接受治療患者的性別、藥物發(fā)揮療效的推定時(shí)間點(diǎn)，以及可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)等方面，早期預(yù)測(cè)抗抑郁劑對(duì)于患者的治療效應(yīng)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定和實(shí)施個(gè)體化的治療方案。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102071254SQ201010581089
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者史艷艷, 張志珺, 徐治, 浦夢(mèng)佳, 耿磊鈺 申請(qǐng)人:東南大學(xué)