專利名稱：一種固定化酸性脲酶酶膜的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
固定化酸性脲酶酶膜的制備方法及應(yīng)用，具體地說是從腸桿菌9043C12中分離純 化得到酸性脲酶；將酸性脲酶溶于一定量的殼聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37°C下自 然干燥脫水成膜，微量戊二醛交聯(lián)，得固定化酸性脲酶酶膜，屬于酶制劑、釀酒添加劑技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酸性脲酶(acid urease)是能將尿素(脲)分解為氨和二氧化碳或碳酸銨的酶。該 酶廣泛分布于植物的種子中，但以大豆、刀豆中含量豐富。也存在于動物血液、尿和微生物 體內(nèi)。能耐受酸性環(huán)境，在ΡΗ4.(Γ5.5的體系中仍具有活性。尿素是酒中由微生物代謝過 程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，是形成氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)。氨基甲酸乙酯(EC)是發(fā)酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪等)和酒精飲料(如葡 萄酒、蘋果酒、中國黃酒和日本清酒等)的伴隨產(chǎn)物。氨基甲酸乙酯對人的危害主要來自 酒精飲料的飲用。調(diào)查顯示，氨基甲酸乙酯含量大于30X10_6 Pg/L的酒，人飲用后易患 癌；在麥芽飲料中氨基甲酸乙酯幾乎不可測，而果酒白蘭地中平均含有10X10_9 73X10_9 Pg/L，黃酒及清酒中約20X 1(Γ9 300Χ10-9 Pg/L，多數(shù)威士忌酒中氨基甲酸乙酯的量為 50 X Kr9 200 X Kr9 Pg/L，餐飲葡萄酒中約 7 X 1(Γ9 12 X 1(T9 Pg/L。經(jīng)研究，氨基甲酸乙酯是由氨甲?；衔锱c乙醇自發(fā)反應(yīng)生成的
R-CO-NH2+ C2H5OH^KIH2-C-O-C2Hj+- R-H
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根據(jù)酒中尿素來源和尿素與乙醇反應(yīng)機理控制酒中EC含量可有三個途徑①適當(dāng)?shù)?控制發(fā)酵條件，比如溫度、PH值等；②選育低尿素的酵母菌；③在發(fā)酵后的酒中添加適量的 酒用酸性脲酶，以分解形成的EC前體物質(zhì)尿素。以上消除EC的三種方法中，尤以第三種方法最為可行。此法不但簡易、見效快，且 具有以下明顯特點不改變原酒的風(fēng)味特性；不改變原釀造酒的工藝條件，使生產(chǎn)不受影 響；降低酒中EC的含量可達90%左右；而且在成酒中不會檢測到活性酸性脲酶的存在。我國的紹興黃酒在國際上尤其在日本擁有廣闊的市場。1987年，日本有關(guān)部門提 出，紹興黃酒中有EC超標現(xiàn)象，希望廠家采取措施控制EC的含量。目前，酒用脲酶在我國 尚未形成生產(chǎn)能力，釀酒生產(chǎn)中需要的酒用脲酶需花費大
量外匯從國外進口。因此，研究酒用脲酶對我國釀酒業(yè)的發(fā)展，拓展國際市場等均有深 遠的意義。游離酸性脲酶由于活力不易保持、難于重復(fù)利用和難于長期貯存等缺點，其應(yīng)用 受到一定的限制。而固定化酸性脲酶可作為一個良好的反應(yīng)系統(tǒng)，使自然的酶結(jié)合于不溶 性的載體材料上.使酸性脲酶穩(wěn)定性得到加強，且可重復(fù)利用。酶膜將酶的催化功能與膜 的分離功能交叉融合，在降低成本的同時極大地提高了反應(yīng)效率。此外天然大分子殼聚糖 材料無毒，親水性好，具有適合酶催化反應(yīng)的天然微環(huán)境，并且價格低廉，來源豐富，可應(yīng)用于食品行業(yè)。故而該固定化酸性脲酶酶膜有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種固定化酸性脲酶酶膜的制備方法，從腸桿菌9043C12中 分離純化提取得到酸性脲酶，將酸性脲酶溶于一定量的殼聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板 中，37°C下自然脫水干燥成膜，用微量戊二醛交聯(lián)，得固定化酸性脲酶酶膜，該固定化酸性 脲酶的最適溫度為40°C，最適pH為4. 5，貯存半衰期為40天，酶活回收率為64. 3% ；本發(fā)明 還涉及這種固定化酸性脲酶酶膜的應(yīng)用，在黃酒中加入該固定化酸性脲酶酶膜后首次尿素 去除率能達到73%，連續(xù)使用10次后，尿素去除率仍可達50%。該酸性脲酶酶膜產(chǎn)品以膜 作為固定的載體，接觸面積大，可以重復(fù)使用，具有其他載體不可比擬的優(yōu)點；應(yīng)用于黃酒 中，可以不改變原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風(fēng)味，是目前較為理想的去除酒中尿素的 方法。本發(fā)明的技術(shù)方案固定化酸性脲酶酶膜的制備方法，從腸桿菌9043C12中分離純 化得到酸性脲酶，將酸性脲酶溶于一定量的殼聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37°C自然 脫水干燥成膜，用微量戊二醛交聯(lián)，得固定化酸性脲酶酶膜，其工藝為
A.酸性脲酶的提取
(1)菌種采用實驗室已有腸桿菌(Enterobacter sp. ) 9043C12，該菌株已在《浙江農(nóng)業(yè) 大學(xué)學(xué)報》22 (5) :493 498，1996公開。(2)種子培養(yǎng)
種子培養(yǎng)基成分g/L 葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5， NaAc 2，尿素5，用去離子水定容至1L，ρΗ7· 0 ； 接種量5%，35°C恒溫靜置培養(yǎng)18 20h ；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基成分g/L:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4 2, NaCl 5, NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0. 05，六水硫酸鎳0. 05，用去離子水定容至1L，pH5. 5 ； 接種量5%，35°C恒溫靜置培養(yǎng)28 32 h ；
(4)收集菌體將發(fā)酵液在8000r/min、4°C條件下離心IOmin后，棄上清，
將菌體用去離子水洗滌兩次，PH5. 5的檸檬酸緩沖液洗滌一次，離心后所得菌體最終溶 于PH5. 5的檸檬酸緩沖液中，Ig菌泥溶于35mL該檸檬酸緩沖液；
(5)高壓破碎850Pa條件下，處理量每次25mL，15min處理IOOmL的
菌泥溶液，回收率達到80%，適合規(guī)?；幚恚粚⑵扑橐河?°C下14500r/min離心 20min,收集上清液，即為所需酸性脲酶酶液；
B、固定化過程
(1)取0.8g殼聚糖溶解于IOOmL質(zhì)量濃度1%的乙酸中，將4 mL酸性脲酶酶液溶 于其 中，置于磁力攪拌器上，攪勻脫泡后，過濾，以0. 3-0. 5mL濾液/cm2的量傾倒在光滑的玻璃 板上，37°C下脫水干燥成膜，該膜用緩沖液浸泡后剝離。(2)將制好的膜剪成4 cmX4 cm 10 cmX 10 cm大小均勻的方塊，浸泡在質(zhì)量 濃度0. 02%的戊二醛溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2h，去離子水洗滌，去除游離戊二 醛，浙干，所得固定化膜貯存在4 V冰箱內(nèi)，備用。
制備的固定化酸性脲酶酶膜的應(yīng)用該固定化酸性脲酶的最適溫度為40°C，最適 PH為4. 5，貯存半衰期為40天，酶活回收率為64. 3% ；
在黃酒中加入該固定化酸性脲酶酶膜后，加酶膜的量固定化酶體積/黃酒體積為16 cm2/IOOmL 100 cm2/100mL，在攪拌的條件下，37°C作用24h，首次可去除酒樣中73%的尿 素，連續(xù)使用多次后，尿素去除率達50%。該固定化酒用酸性脲酶的性質(zhì)最適溫度、最適PH及貯存半衰期的確定 在20-80°C范圍內(nèi)，每隔5°C，分別測定酶活力，以最高酶活力為100%，計 算相對酶活力，最適溫度為40°C。 在pH 3. 0-7. 5范圍內(nèi)，每隔0.5 pH梯度，分別測定酶活，以最高酶活力為100%，計 算相對酶活力，最適pH*4.5。將固定化酸性脲酶酶膜放于檸檬酸緩沖液中，4°C冰箱內(nèi)保存，每隔三天測定固定 化酸性脲酶酶膜的酶活，貯存半衰期為40天。該固定化酒用酸性脲酶的應(yīng)用
將一定面積的固定化酸性脲酶酶膜置于黃酒中，在攪拌條件下，溫度37°C，作用24h 后，測定其尿素濃度，計算尿素去除率，首次使用后黃酒中的尿素去除率為73%，然后將膜取 出用緩沖液洗凈，再加入IOOmL的黃酒重復(fù)試驗，重復(fù)10次后尿素去除率仍然可達50%。酶活測定方法
游離酶活測定方法采用靛酚藍反應(yīng)(Berthelot reaction)比色法。酶活力定義在常壓，37°C，pH5. 5條件下，每分鐘分解底物尿素產(chǎn)生1 μ mol氨為 一個酶活力單位。固定化酸性脲酶酶活測定方法取Icm2膜浸入一定體積的檸檬酸緩沖液配制的 PH5. 5的3%尿素溶液中，在37°C恒溫水浴箱中保溫30min后，過濾取其濾液，余下的方法與 游離酶活力測定相同。尿素含量的測定方法二乙酰一肟法。蛋白含量測定方法考馬斯亮藍G-250法。戊二醛含量的測定紫外分光光度法。本發(fā)明的有益效果游離酶的提取方法采用易規(guī)?；姆椒?，固定化酸性脲酶酶 膜的制作過程可以用機器制作代替，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。該固定化酸性脲酶酶膜能在酒中穩(wěn) 定發(fā)揮作用，尿素去除率高，在黃酒中加入固定化酸性脲酶酶膜后尿素去除率能達到73%， 且固定化酸性脲酶酶膜便于回收，可重復(fù)利用多次。本發(fā)明可以不改變原釀造酒的工藝條 件，不改變酒的風(fēng)味，在勾兌，澄清酒的過程中，添加固定化酸性脲酶酶膜，就可以降低尿素 含量，是目前較為理想的去除酒中尿素的方法。


圖1固定化酸性脲酶酶膜制備工藝示意圖。
具體實施例方式實施例1 將4mL酸性脲酶溶于IOOmL的0. 8%的殼聚糖溶液中，用玻璃棒充分攪 拌，攪勻后置于4°C冰箱中冷藏至溶液中無氣泡為止，以0. 3mL/cm2的量倒入光滑的玻璃 板上，37°C下干燥成膜，用少量檸檬酸緩沖液浸泡后剝離，浙干，將膜 裁成均勻大小方塊后，置于0. 02%戊二醛溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2h (用不透明 容器蓋住，以防戊二醛見光變色)，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測)， 浙干，冷藏備用，得固定化酸性脲酶酶膜。取10 cmX 10 cm大小的膜，放入IOOmL的黃酒中， 37°C下作用24h，測定黃酒中尿素含量，計算尿素去除率，尿素含量從24. 8mg/L降至6. 7mg/ L，尿素去除率達到73%。 實施例2 將4mL酸性脲酶溶于IOOmL的0. 8%的殼聚糖溶液中，用玻璃棒充分攪 拌，攪勻后置于4°C冰箱中冷藏至溶液中無氣泡為止，以0. 5mL/cm2的量倒入光滑的玻璃板 上，37°C下干燥成膜，用少量檸檬酸緩沖液浸泡后剝離，浙干，將膜裁成均勻大小方塊后，置 于0. 02%戊二醛溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2h(用不透明容器蓋住，以防戊二醛見 光變色)，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測)，浙干，冷藏備用，得固定 化酸性脲酶酶膜。取4 cmX4 cm大小的膜，放入IOOmL的黃酒中，37°C下作用24h，測定尿 素含量，計算尿素去除率。尿素含量從24. 8mg/L降至9. 6mg/L。取出膜用緩沖液洗凈，重新 置于IOOmL的黃酒中，循環(huán)測定黃酒中尿素含量，循環(huán)10次后，尿素去除率還可達到50%。
權(quán)利要求
1.一種固定化酸性脲酶酶膜的制備方法，其特征在于從腸桿菌9043C12中分離純化提 取得到酸性脲酶；將酸性脲酶溶于一定量的殼聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37°C下自 然脫水干燥成膜，用微量戊二醛交聯(lián)，得固定化酸性脲酶酶膜；其工藝為A.酸性脲酶的提取(1)菌種采用實驗室已有腸桿菌(Enterobactersp. ) 9043C12;(2)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基成分g/L:葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2P04 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用去離子水定容至1L，pH7. 0 ；接種量5%，35°C恒溫靜置培養(yǎng)18 20h ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基成分g/L葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸錳0. 05，六水硫酸鎳0. 05，用去離子水定容至1L， ρΗ5· 5 ；接種量5%，35°C恒溫靜置培養(yǎng)觀 32 h ；(4)收集菌體將發(fā)酵液在8000r/min、4°C條件下離心IOmin后，棄上清，將菌體用去離 子水洗滌兩次，PH5. 5的檸檬酸緩沖液洗滌一次，離心后所得菌體最終溶于pH5. 5的檸檬酸 緩沖液中，Ig菌泥溶于35mL該檸檬酸緩沖液中；(5)高壓破碎8501 條件下，每次處理量25mL，15min處理IOOmL的菌泥溶液；將破碎 液于4°C下14500r/min離心20min，收集上清液，即為所需酸性脲酶酶液；B.固定化過程(1)取0.8g殼聚糖溶于IOOmL質(zhì)量濃度1%的乙酸中，將4mL酸性脲酶酶液溶于其中， 置于磁力攪拌器上，攪勻脫泡后，雙層紗布過濾，以0. 3-0. 5mL濾液/cm2的量傾倒在光滑的 玻璃板上，37°C自然脫水成膜，用檸檬酸緩沖液浸泡后剝離；(2)將制好的膜剪成4cmX4 cm 10 cmXIO cm大小均勻的方塊，浸泡在質(zhì)量濃度 0. 02%的戊二醛溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2h，去離子水洗滌，去除游離戊二醛， 浙干，所得固定化膜貯存在4 V冰箱內(nèi)，備用。
2.用權(quán)利要求1的方法制備的固定化酸性脲酶酶膜的應(yīng)用其特征是該固定化酸性脲 酶酶膜的最適溫度為40°C，最適pH為4. 5，貯存半衰期為40天；在黃酒中加入該固定化酸性脲酶酶膜后，加酶膜的量固定化酸性脲酶酶膜面積/黃 酒體積為16 cmVlOOmL 100 cm2/100mL,在攪拌的條件下，37°C作用Mh，首次可去除酒樣 中73%的尿素，連續(xù)使用10次后，尿素去除率達50%。
全文摘要
一種固定化酸性脲酶酶膜的制備方法及應(yīng)用，屬于酶制劑、釀酒添加劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將從腸桿菌9043C12中分離純化的酸性脲酶，溶于一定量的殼聚糖溶液中，倒入光滑的玻璃板中，37℃下自然脫水干燥成膜，用微量戊二醛交聯(lián)，得到固定化酸性脲酶酶膜，該固定化酸性脲酶的最適溫度為40℃，最適pH為4.5，貯存半衰期為40天，酶活回收率為64.3%；該固定化酸性脲酶酶膜的應(yīng)用在黃酒中加入該酶膜后尿素去除率能達到73%，連續(xù)使用10次后，尿素去除率依舊可達50%。該固定化酸性脲酶酶膜產(chǎn)品以膜作為固定的載體，接觸面積大，可以重復(fù)使用；應(yīng)用于黃酒中，可以不改變原釀造酒的工藝條件，不改變酒的風(fēng)味，是目前較為理想的去除酒中尿素的方法。
文檔編號C12G3/08GK102051355SQ201010572018
公開日2011年5月11日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者呂園園, 田亞平 申請人:江南大學(xué)