專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及哺乳動(dòng)物體外胚胎生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(insulin，transferrinand selenium, ITS)主要由胰島 素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒組成。胰島素能刺激DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成，促進(jìn)對(duì)葡萄糖和氨 基酸的利用，并通過(guò)對(duì)質(zhì)膜，細(xì)胞骨架，細(xì)胞內(nèi)酶和細(xì)胞核的作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。同時(shí)，胰 島素還有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的作用。轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種血清球蛋白，與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞 表面的受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合后，可將鐵轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)；而細(xì)胞內(nèi)參與02和0)2的代謝和細(xì)胞呼 吸過(guò)程的肌紅蛋白和血紅蛋白的合成主要依賴于蛋白質(zhì)和鐵。另外，轉(zhuǎn)鐵蛋白還可作為分 解培養(yǎng)液中有毒金屬物質(zhì)的解毒蛋白。硒是胚胎發(fā)育過(guò)程中的一種必需微量元素，可通過(guò) 調(diào)節(jié)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性起著抗氧化作用；同時(shí)，還有消除自由基，維持核酸、質(zhì)膜 和蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)與功能的作用。研究證明這三種物質(zhì)的聯(lián)合對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育 起著協(xié)同作用。ITS具有增強(qiáng)游離氨基酸的作用，而一些特殊氨基酸載體，內(nèi)源性氨基酸池 存在于早期胚胎中；ITS具有催化游離氨基酸的作用，而氨基酸又有助于早期胚胎克服發(fā) 育阻滯現(xiàn)象。因此在卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育過(guò)程中添加ITS有利于早期胚胎的發(fā)育。水牛是我國(guó)南方特有的品種，水牛奶具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但就目前我國(guó)奶水牛 的現(xiàn)狀來(lái)看，其數(shù)量和奶產(chǎn)量，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)的需求。通過(guò)體外培養(yǎng)，生產(chǎn)大量?jī)?yōu)質(zhì) 的胚胎用于移植，產(chǎn)下更多的后代，既可以降低繁育成本，也可以在短期內(nèi)迅速擴(kuò)充水牛種 群，從而推動(dòng)水牛產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率的方法。在體外條件下， 于成熟培養(yǎng)液和胚胎培養(yǎng)液中分別添加lOyL/ml ITS(各物質(zhì)的終濃度分別為胰島素 10 μ g/mL,轉(zhuǎn)鐵蛋白5. 5 μ g/mL,硒5 μ g/mL)和20 μ L/mL ITS (各物質(zhì)的終濃度分別為胰 島素20μ g/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白11 μ g/mL，硒10 μ g/mL)，可以顯著提高水牛卵母細(xì)胞體外成熟率 及囊胚發(fā)育率。通過(guò)該方法能顯著地增加胚胎移植的數(shù)量及質(zhì)量，從而能加速良種水牛的 繁育速度，促進(jìn)水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本發(fā)明的工藝步驟包括以下幾步(1)從屠宰場(chǎng)回收水牛卵巢，置于無(wú)菌生理鹽水中，用保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室。從清洗 干凈的卵巢表面抽取卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞置于收集液中，在體視顯微鏡下挑選出包裹有 三層或三層以上致密卵丘細(xì)胞、外形明亮、且細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，用收集液洗滌2 3 次。(2)將收集到的卵母細(xì)胞用成熟培養(yǎng)液洗3次后移入含10 μ L/mL ITS的成熟培 養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)22 M小時(shí)，培養(yǎng)箱內(nèi)條件為39°C，5% CO2及最大飽和濕 度；成熟培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞的成熟率。
(3)將體外培養(yǎng)成熟后的卵母細(xì)胞從成熟培養(yǎng)液中揀出，用移液槍輕輕抽打去掉 大部分卵丘細(xì)胞，用受精液洗滌2次后轉(zhuǎn)入受精滴中。將經(jīng)上浮、離心處理后的精子加入到 含有卵母細(xì)胞的受精滴中，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外受精培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)條件為39°C，5% CO2 及最大飽和濕度。(4)體外受精培養(yǎng)18 20小時(shí)后，將假定的受精卵洗滌干凈，然后置于含有10% 胎牛血清和20μ L/mL ITS的黃牛顆粒細(xì)胞單層中進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)條件為39°C，5% CO2及最大飽和濕度；體外培養(yǎng)時(shí)間為8天。受精后第2天統(tǒng)計(jì)卵裂率，第8天統(tǒng)計(jì)囊胚率。與目前的體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)ITS對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外胚胎生產(chǎn)方面的報(bào)道。因此，本發(fā) 明將有望提高水牛體外胚胎的生產(chǎn)效率。(2)成熟培養(yǎng)液中添加10 μ L/mL ITS有利于卵母細(xì)胞的體外成熟和受精后早期 胚胎的發(fā)育。成熟液中添加1(^171^幾3成熟率高達(dá)65.61%。卵母細(xì)胞體外成熟是胚胎 體外生產(chǎn)技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響到卵母細(xì)胞體外成熟率和受精率的高低及受精卵早 期發(fā)育的狀況。在本試驗(yàn)體系下，成熟液中添加lOyL/mL ITS顯著地提高了卵母細(xì)胞的成 熟率，其不僅為體外受精提供了更多優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞，也是囊胚發(fā)育率及囊胚的質(zhì)量得以 提高的先決條件。(3)胚胎培養(yǎng)液中添加20 μ L/mL ITS有利于受精后水牛早期胚胎的發(fā)育。胚胎培 養(yǎng)液中添加20yL/mL ITS的囊胚發(fā)育率高達(dá)29. 93%，高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道的平均囊胚率。這 說(shuō)明，在本試驗(yàn)體系下，培養(yǎng)液中添加20μ L/mL ITS可以顯著提高水牛囊胚發(fā)育率，從而提 高了體外胚胎的生產(chǎn)效率。


圖1本發(fā)明中水牛卵母細(xì)胞成熟后排出第一極體樣2本發(fā)明中第7天的水牛胚胎發(fā)育情況樣圖
具體實(shí)施例方式從屠宰場(chǎng)采集水牛卵巢，置于30 35°C生理鹽水的保溫瓶帶內(nèi)于4小時(shí)內(nèi)送回 實(shí)驗(yàn)室。卵巢送回實(shí)驗(yàn)室后，用滅菌的生理鹽水清洗卵巢3 4次。然后用裝有18號(hào)針頭 的一次性IOmL注射器，從卵巢表面直徑為2 8mm卵泡中抽取卵母細(xì)胞。在體視顯微鏡下 挑選出包裹有三層或三層以上致密卵丘細(xì)胞，外形明亮，且細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，用收集 液清洗卵母細(xì)胞2 3次，再用成熟液洗2次，然后放入含有ImL成熟培養(yǎng)液的玻璃培養(yǎng)皿 (20X IOmm)中，在38. 5°C,5% CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)22 M 小時(shí)。卵母細(xì)胞收集液的成分為T(mén)CM-199 緩沖液 +20mmol/L Hepes+5mmol/L NaHC03+3%胎牛血清 +0. 05mg/L 硫酸 慶大霉素，PH值為7. 2 7. 4。成熟培養(yǎng)液的成分為T(mén)CM-199 緩沖液+5mmol/L Hepes+26. 2mmol/L NaHC03+10%發(fā)青牛血清+3%牛卵 泡液+0. 5 μ g/mL促卵泡素+5 μ g/mL促黃體素+10 μ L/mLITS, PH值為7. 2 7. 4。
本發(fā)明所用精液為水牛細(xì)管冷凍精液，精子洗滌采用上浮法。將活力良好的解凍 精液注入到預(yù)先平衡好的裝有2mL受精液的離心管中，于培養(yǎng)箱內(nèi)傾斜45°C放置約30分 鐘，使離心管底部活力強(qiáng)的精子盡可能上浮至上層受精液中。取出離心管，吸取離心管上層 含有精子的受精液，注入另一無(wú)菌離心管中，再加入2mL受精液，1500xg離心5分鐘，棄掉上清液。當(dāng)卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)結(jié)束后，用移液槍在成熟液中輕輕抽打卵母細(xì)胞以去掉大部 分卵丘細(xì)胞，用收集液洗滌2次后在體視顯微鏡下檢查第一極體的排出率(即成熟率)。統(tǒng) 計(jì)成熟率后，挑選胞質(zhì)均勻、排出第一極體的質(zhì)量較好的卵母細(xì)胞，經(jīng)受精液洗滌3次后， 移入受精滴中。受精滴為45 50 μ L，每滴放入約20枚卵母細(xì)胞。將精子加到受精滴中， 使其終濃度達(dá)1 2Χ 106/mL，在39°C、5% CO2，最大飽和濕度條件下孵育18 20小時(shí)。受精液的成分為改良的Tyrodes培養(yǎng)液+0. 6%牛血清白蛋白+2. OmmoL/L咖啡因+20 μ g/mL的肝 素，PH值為7. 5 7.8。受精18 20小時(shí)后，在受精滴中用吸管反復(fù)吹打假定的受精卵，去掉卵丘細(xì)胞和 附著的精子。將假定的受精卵從受精滴中吸出，用培養(yǎng)液洗滌3遍后，移入預(yù)先制備好的黃 牛顆粒細(xì)胞單層培養(yǎng)滴中進(jìn)行共培養(yǎng)培養(yǎng)。每滴放入15 20枚受精卵，培養(yǎng)期間每?jī)商?換液一次，每次換掉1/2液，培養(yǎng)條件為39°C、5% CO2，最大飽和濕度。第2天統(tǒng)計(jì)卵裂率， 第8天統(tǒng)計(jì)囊胚率。胚胎培養(yǎng)液的成分為T(mén)CM-199 緩沖液 +10%胎牛血清 +20 μ L/mL ITS, PH 值為 7. 2 7. 4。上述所有的培養(yǎng)液均添加60mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素。所有試劑均用孔徑 0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾消毒。采用上述方法，在水牛體外胚胎生產(chǎn)的過(guò)程中，卵母細(xì)胞的體外成熟率為65%以 上，卵母細(xì)胞體外受精后的卵裂率為60%左右，囊胚的發(fā)育率為30%左右。實(shí)施例子2009年11月1日，從當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)獲得卵巢后，置于保溫瓶中4小時(shí)內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。 按照本發(fā)明提供的方法將收集到的150個(gè)卵母細(xì)胞置于含10 μ L/mL ITS的成熟培養(yǎng)液中 進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)22 Mh。11月2日，將成熟后的卵母細(xì)胞用移液槍輕輕抽打，去除大 部分卵丘細(xì)胞，挑選成熟質(zhì)量較好(排出第一極體，胞質(zhì)均勻)的105個(gè)卵母細(xì)胞進(jìn)行體外 受精。11月3日，將受精18 20小時(shí)的假定受精卵用胚胎培養(yǎng)液洗3遍后，移入20 μ L 體積的黃牛顆粒細(xì)胞單層中進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)液含20 μ L/mL ITS。11月4日早上統(tǒng)計(jì)分裂 率，分裂了 65個(gè)，分裂率約為61.9%。培養(yǎng)期間每隔一天換掉1/2培養(yǎng)液。11月9日開(kāi)始 觀察囊胚發(fā)育情況。最后，于11月11日統(tǒng)計(jì)囊胚率，這次培養(yǎng)共出囊胚34個(gè)，囊胚率為 32.38%。按照此方法進(jìn)行10次重復(fù)，最終的囊胚率為這10次重復(fù)的平均數(shù)。經(jīng)試驗(yàn)證 明成熟培養(yǎng)液中添加10 μ L/mLITS、胚胎培養(yǎng)液中添加20 μ L/mLITS可使水牛平均囊胚發(fā) 育率約為30%。
權(quán)利要求
1.一種提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率的方法，其特征包括下列步驟(1)從屠宰場(chǎng)回收水牛卵巢，置于30 35°C無(wú)菌生理鹽水中，用保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室；從 清洗干凈的卵巢表面抽取卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞置于收集液中，在體視顯微鏡下挑選出包 裹有三層或三層以上致密卵丘細(xì)胞、外形明亮、細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，用收集液洗滌2 3次。(2)將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入添加有血清、激素、卵泡液、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(insulin， transferrin and selenium，ITS)及含N_2_羥乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸 Ofepes)的TCM199 成熟培養(yǎng)液中洗2次，然后移入含有1. OmL成熟培養(yǎng)液的玻璃培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行 體外成熟培養(yǎng)；成熟培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率。(3)體外受精使用細(xì)管凍精，37°C水浴解凍后采用上浮法分離精子；將體外培養(yǎng)成熟 后的卵母細(xì)胞從成熟培養(yǎng)液中揀出，用受精液洗滌2次后移入用受精液制成的受精滴中； 將離心后的精子加入到含有卵母細(xì)胞的受精滴中，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外受精培養(yǎng)。(4)體外受精培養(yǎng)18 20小時(shí)后，將假定的受精卵洗滌干凈，然后置于預(yù)先制備好的、 含有胎牛血清及ITS的黃牛顆粒細(xì)胞單層中進(jìn)行共培養(yǎng)，體外培養(yǎng)時(shí)間為8天；受精后第2 天統(tǒng)計(jì)卵裂率，第8天統(tǒng)計(jì)囊胚率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率的方法，其特征是步驟(1)中 的收集液為T(mén)CM-199緩沖液，并添加有20mmol/L H印es、5mmol/L NaHC03、3 %胎牛血清和 0. 05mg/L的硫酸慶大霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率的方法，其特征是步驟(2)中成 熟培養(yǎng)液為 TCM199+5mmol/L Hepes+26. 2mmol/L NaHC03+10 % 發(fā)情牛血清 +0. 5 μ g/mL 促 卵泡素+5 μ g/mL促黃體素+3%牛卵泡液+10 μ L/mL ITS (各物質(zhì)的終濃度分別為胰島素 10 μ g/mL,轉(zhuǎn)鐵蛋白5. 5 μ g/mL,硒5 μ g/mL)，培養(yǎng)時(shí)間為22 24小時(shí)，培養(yǎng)箱內(nèi)條件為 39°C,5% CO2及最大飽和濕度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率的方法，其特征是步驟(3)受精 液為改進(jìn)的Tyrodes培養(yǎng)液，添加有0. 6%牛血清白蛋白、2. OmmoL/L咖啡因、20 μ g/mL的 肝素，將活力良好的解凍精液注入到預(yù)先平衡好的裝有2mL受精液的離心管中，于培養(yǎng)箱 內(nèi)傾斜45°C放置約30分鐘，使離心管底部活力強(qiáng)的精子盡可能上浮至上層受精液中；取出 離心管，吸取離心管上層含有精子的受精液，注入另一無(wú)菌離心管中，再加入2mL受精液， 1500g離心5分鐘，棄掉上清液；受精滴大小為45 50 μ L，每滴放入卵母細(xì)胞約20枚，將 精子加到受精滴中，使精子濃度達(dá)到1 2\106/!^，培養(yǎng)條件391，5% CO2及最大飽和濕 度，培養(yǎng)時(shí)間為18 20小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率的方法，其特征是步驟(4)中的 胚胎培養(yǎng)液為T(mén)CM199緩沖液+10%胎牛血清+20 μ L/mL ITS (各物質(zhì)的終濃度分別為胰 島素20 μ g/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白11 μ g/mL，硒10 μ g/mL)，并用黃牛顆粒細(xì)胞作為單層與水牛胚胎 進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件39°C，5% CO2及最大飽和濕度，體外培養(yǎng)時(shí)間為8天，培養(yǎng)期間每?jī)?天換液一次，每次換掉1/2液。
全文摘要
一種提高水牛胚胎體外生產(chǎn)效率的方法，在卵母細(xì)胞成熟液和培養(yǎng)液中分別添加10μL/mL和20μL/mL胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)進(jìn)行體外成熟、體外培養(yǎng)。本發(fā)明表明，在成熟液中添加10μL/mL的ITS有效地提高了水牛卵母細(xì)胞的體外成熟率，第一極體的排出率高達(dá)65.61％。在胚胎培養(yǎng)液中添加20μL/mL ITS有利于受精后水牛早期胚胎的發(fā)育，囊胚發(fā)育率高達(dá)29.93％。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提高了水牛卵母細(xì)胞的體外成熟率和囊胚發(fā)育率，從而提高了水牛胚胎的體外生產(chǎn)效率，為胚胎移植提供了大量?jī)?yōu)質(zhì)的胚胎。
文檔編號(hào)C12N5/073GK102140435SQ20101055326
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者付強(qiáng), 張明, 陳煥華, 黃怡 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)