專利名稱：微生物檢測與定量的制作方法
微生物檢測與定量相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是2004年12月16日提交的PCT/US2004/042461號(hào)國際申請(qǐng)的部分繼續(xù)申 請(qǐng)，該國際申請(qǐng)要求2003年12月16日提交的美國專利申請(qǐng)第10/737，574號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及檢測微生物如細(xì)菌、酵母、霉菌和病毒的方法和產(chǎn)品。在我們的日常生活中，我們不知不覺地暴露于受微生物污染的物體表面，這會(huì)導(dǎo) 致發(fā)生疾病。已有研究表明，具體的細(xì)菌污染“熱點(diǎn)”包括公用電話、門把手、醫(yī)生候診室和 兒童看護(hù)場所中的玩具、干手用熱風(fēng)干燥機(jī)、廚房中使用的毛巾和海綿、進(jìn)行日常患者護(hù)理 的醫(yī)護(hù)人員的手以及混合生肉和蔬菜的食品制作表面和刀具的交叉污染。最近單在美國幾個(gè)地方發(fā)生的細(xì)菌污染爆發(fā)事件，就已導(dǎo)致一些兒童和老年人死 亡和其它人得病。食品的微生物污染也是全世界的主要問題。沙門氏菌、大腸桿菌和其它 食品傳染細(xì)菌每年造成數(shù)不清的病例。急性癥狀包括惡心、嘔吐、腹部絞痛、腹瀉、發(fā)燒和頭 痛。急性癥狀發(fā)作后接著可能就是慢性后果。由于物體表面的交叉污染會(huì)引起細(xì)菌從內(nèi)、 魚和家禽向未煮熟食品如蔬菜的轉(zhuǎn)移，容易地檢測出細(xì)菌在食品制作表面上的存在的能力 將具有極大益處。同樣，食品加工企業(yè)中對(duì)有害水平的微生物的檢測，對(duì)于保持各個(gè)家庭和消費(fèi)者 的健康是十分重要的。在食品加工工業(yè)中，細(xì)菌監(jiān)測是至關(guān)重要的。幾乎所有的食品的加 工，無論從肉類包裝到干酪生產(chǎn)，都涉及到監(jiān)測微生物水平，以確保食品供應(yīng)的安全性。微生物污染帶來的災(zāi)難不僅限于食品工業(yè)。最近幾十年見證了“超級(jí)細(xì)菌 (superbug)，，的急劇增多，這個(gè)問題就集中出現(xiàn)在醫(yī)院和保健機(jī)構(gòu)中。抗生素的過度使用 和醫(yī)院清潔的不足已催生了甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(S. aureus) (MRSA)和艱難梭 菌(Clostridiumdifficile)以及萬古霉素耐藥腸球菌和其它革蘭氏陰性桿菌(Dancer， 2004)。最近英國廣播公司(BBC)的報(bào)告說到，MRSA每年估計(jì)奪走5000條生命。報(bào)告文章 接著斷言“清潔仍然是主要的患者關(guān)注問題，MRSA是個(gè)越來越嚴(yán)重的問題?！痹囅脶t(yī)院里的 許多患者已經(jīng)無免疫應(yīng)答作用，因此發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)更高，醫(yī)院環(huán)境中的惡毒細(xì)菌所造成 的威脅會(huì)變得越加險(xiǎn)惡。有許多報(bào)告和研究在探討醫(yī)院清潔和醫(yī)院傳染防治的課題。同樣，已知霉菌如麥角菌能在某些谷物如黑麥中生長，它們由于會(huì)產(chǎn)生與麥角酸 相似的毒性生物堿而具有潛在的危害性。已知黑曲霉(Aspergillus niger)和其它霉菌產(chǎn) 生的孢子會(huì)造成過敏反應(yīng)及加重呼吸道病癥如哮喘。如果黑曲霉在潮濕墻壁上或者在家庭 或商業(yè)建筑中的空調(diào)設(shè)備中開始生長，就會(huì)特別成問題。某些酵母如白色念珠菌(Candida albicans)可代表另一類討厭的微生物。已將白 色念珠菌與嬰兒尿布疹、兒童和無免疫應(yīng)答成人的鵝口瘡以及陰道酵母感染聯(lián)系起來。酵 母還會(huì)感染身體的口咽區(qū)以及胃腸道。目前的細(xì)菌檢測方法涉及到從設(shè)備表面采集樣品。在食品加工環(huán)境中，設(shè)備可能 是切肉機(jī)械，而在食品制作環(huán)境如餐館中或在家庭里，表面可能是桌子、砧板、冰箱內(nèi)部或工作表面。然后將樣品溫育過夜以生長出培養(yǎng)物。過夜生長培養(yǎng)是讓樣品在瓊脂平板上于 適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸认律L，使細(xì)菌生長和繁殖至形成大得足以肉眼可見的菌落。在溫育了 規(guī)定的時(shí)間和讓細(xì)菌菌落生長出來后，由經(jīng)過訓(xùn)練的技術(shù)人員人工檢查瓊脂平板樣品并估 計(jì)菌落形成單位(CFU)。這個(gè)方法花費(fèi)有些高，且時(shí)間上極大滯后；在滯后時(shí)間當(dāng)中污染產(chǎn) 品可能已被運(yùn)輸出去或者人們已暴露于所存在的微生物。由上可知，需要有便于快速檢測有害微生物的方法和產(chǎn)品。發(fā)明概述為應(yīng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員碰到的前述困難，我們開發(fā)出了一種指示組合物，它包括 流動(dòng)相和在微生物存在下會(huì)發(fā)生明顯可檢測變化的微生物靈敏色料(colorant)。所述組合 物可施加到表面以顯示微生物的存在。流動(dòng)相可以是消毒劑。色料在微生物存在下提供肉 眼可見的顏色變化。流動(dòng)性可以是液體或凝膠，色料可以是染料(dye)。在一些實(shí)施方案 中，色料改變顏色的程度與微生物的濃度成比例。在其它實(shí)施方案中，所存在的微生物的數(shù) 量與發(fā)生顏色變化的色料的量成比例。合適的染料的實(shí)例包括份菁染料、4-[2_N-取代-1，4-氫化吡啶-4-亞基)亞乙 基]環(huán)己_2，5- 二烯-1-酮、紅吡唑啉酮染料、偶氮甲堿染料、靛苯胺染料、二氮雜份菁染 料、以Reichardt染料為例的兩性離子染料和其它染料以及它們的混合物。特別適合的染 料是兩性離子染料，其中兩性離子包含在構(gòu)成染料色原的毗鄰η電子體系當(dāng)中。另一類似 乎特別適用作微生物指示劑的染料是份菁染料。還可將染料以溶劑基或水基溶液的形式施加到表面并讓其干燥，留下所施加染料 溶液的干燥殘余物。干燥殘余物當(dāng)接觸到微生物時(shí)會(huì)變色，因此可用在包裝如擦面紙盒子 上、在隨身醫(yī)療用具如手套上和在其它表面上，這些表面在使用前先與染料一起制作，以便 以后可指示微生物污染情況。令人驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)將這些染料施加到表面上并 讓其干燥時(shí)，用以制作涂層(coating)的溶劑與所用的添加劑如羥丙基環(huán)糊精和表面 活性劑都對(duì)涂層的微生物檢測能力具有顯著的影響。已發(fā)現(xiàn)羥丙基-環(huán)糊精能有效提高色料在其涂敷在紙巾或類似的擦拭材料 上后的光亮度。雖然不想受理論的約束，但我們還是認(rèn)為染料的顏色因所添加的環(huán)糊精衍 生物抑制染料的結(jié)晶而得以改進(jìn)?？蓪⑵渌瘜W(xué)藥品加入到擦拭物(wipe)中，以幫助防止 因漂白劑(已發(fā)現(xiàn)它會(huì)干擾染料)的存在所導(dǎo)致的假陽性讀出結(jié)果。結(jié)合了微生物指示色料的側(cè)向流動(dòng)裝置也包括在本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容之內(nèi)。這些裝 置具有帶檢測區(qū)和對(duì)照區(qū)的膜，其中檢測區(qū)對(duì)細(xì)菌的存在作出響應(yīng)而變色，對(duì)照區(qū)仍保持 原來的染料顏色以表明測試是正確運(yùn)行的。本文還描述檢測物體表面上的微生物的方法，這種方法將含有微生物靈敏色料的 溶液施加到表面，并觀察是否出現(xiàn)表明微生物存在的明顯可檢測變化。本發(fā)明的其它特征和方面在下文中有更為詳細(xì)的討論。附圖簡述在本說明書的剩余部分，更加具體地面向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員闡述本發(fā)明的詳盡 且可實(shí)施的公開內(nèi)容，包括最佳實(shí)施方式，闡述中涉及到以下附圖

圖1是五種基本的細(xì)菌細(xì)胞形狀的示意圖。圖2是細(xì)菌細(xì)胞排列的示意圖。
圖3是一種份菁染料的結(jié)構(gòu)。圖4-5說明一種合成份菁染料的方法。圖6A-D是用陳放雞肉所作的表明微生物污染情況的示意圖。圖7A-G是并列對(duì)比表明微生物污染情況和清潔情況的示意圖。圖8A-D是用不同濃度細(xì)菌所作的表明微生物污染情況的示意圖。圖9A-E是用細(xì)菌和指示染料滴定所作的表明和定量微生物污染情況的示意圖。圖10A-C是表明計(jì)算機(jī)鍵盤上的微生物污染情況的示意圖。圖IlA-D是用有和沒有表面活性劑的溶液表明微生物污染情況的示意圖。圖12A-F是表明取決于溶劑的微生物污染指示速度的示意圖。圖13A-C是在色料干燥到基材(substrate)上的情形中表明微生物污染情況的示 意圖。圖14是實(shí)施例30所得結(jié)果的圖示說明，其中ΔΕ對(duì)已知濃度的金黃色葡萄糖球 菌作圖。圖15是實(shí)施例30所得結(jié)果的圖示說明，其中ΔΕ對(duì)已知濃度的綠膿桿菌 (P. aeuruginosa) {乍圖。圖16是實(shí)施例30所得結(jié)果的圖示說明，其中ΔΕ對(duì)已知濃度的大腸桿菌作圖。圖17是可用于本發(fā)明的側(cè)向流動(dòng)測定裝置的一個(gè)實(shí)施方案的頂視圖。圖18是反映分子對(duì)可見光的吸收涉及分子當(dāng)中電子躍遷的示意圖。
在本說明書和附圖中多次使用的參引字符意指代表本發(fā)明的相同或類似特征或要素。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及細(xì)菌和其它微生物的檢測，本文所用術(shù)語“微生物”應(yīng)理解為包括細(xì) 菌、真菌(如酵母和霉菌)以及病毒。有千千萬萬種不同種類的細(xì)菌存在。有些種類差別很小，需要訓(xùn)練有素的人員才 能鑒定它們。還有些種類在生長習(xí)性和外觀上差別很大，很容易就鑒別出來。如不考慮細(xì) 小的差別，則大多數(shù)細(xì)菌可按圖1所示的五種基本細(xì)胞形狀進(jìn)行分類。圖1從左到右，形狀 分別為圓形或球菌、桿狀或桿菌、螺旋狀或螺旋狀菌、逗號(hào)狀或弧菌以及絲狀。除形狀不同外，它們的細(xì)胞排列也不同，圖2從左到右分別為雙球菌、鏈球菌和葡 萄球菌。例如，一些球菌往往成雙聚集(雙球菌)。其它則排列成鏈(鏈球菌)。還有其它 排列成串(葡萄球菌)。雙球菌已知會(huì)引起肺炎。鏈球菌則經(jīng)常與“膿毒性咽炎(strep throat) ”有關(guān)。葡萄球菌因其在“葡萄球菌感染”和某些類型的食品中毒中的作用而為眾 人所熟悉。細(xì)菌在大小方面也有一定的不同，但單個(gè)細(xì)菌平均大小約為1/25，000英寸(1英 寸=2.Mcm)。換句話說，25，000個(gè)細(xì)菌并排在一起也就只占1英寸直線。一立方英寸足 以容納9萬億個(gè)平均大小的細(xì)菌，即地球上每個(gè)人可分?jǐn)偞蠹s3，000個(gè)細(xì)菌。雖然基于現(xiàn)代分子生物學(xué)概念對(duì)細(xì)菌的細(xì)致分類的理論基礎(chǔ)有很多論述，但對(duì)于 微生物工程師來說，快速細(xì)分方法是以革蘭氏反應(yīng)(對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的染色方法)和形態(tài) 學(xué)為基礎(chǔ)的。革蘭氏陽性細(xì)菌在酒精或丙酮存在下能保持結(jié)晶紫染色。它們包括以下重要的 屬放線菌屬(Actinomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)Jf維單胞菌屬(Cellulomonas)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、微 球菌屬(Micrococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、葡萄球菌 屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口鏈霉菌屬(Streptomyces)。一些革蘭 氏陽性細(xì)菌，特別是棒狀桿菌屬、分枝桿菌屬和諾卡氏菌屬的細(xì)菌，甚至在酸的存在下也能 將染料保持。它們被稱為抗酸細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌在酒精或丙酮存在下不能保持結(jié)晶紫染色。它們包括以下重要 的屬醋桿菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、 包特氏菌屬(Bordetella)、布氏桿菌屬(Brucella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、 禾丙 (Caulobacter) > J ff ^ M (Enterobacter) > i K ^ M (Erwinia) > ft 菌屬(Escherichia)、螺桿菌屬(Helicobacterium)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、奈瑟氏 菌屬(Nesseria)、硝化桿菌屬(NitrcAact)、巴斯德氏菌屬(Pasteurelia)、假單胞桿 菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、立克次體屬(Rickettsia)、沙門氏菌 屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、硫桿菌屬(ThicAacilus)、韋榮氏球菌 屬(Veiellonealla)、弧菌屬(Vibrio)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)和耶耳辛氏菌屬 (Yersinia)。細(xì)菌細(xì)胞膜通常由脂多糖的脂質(zhì)雙層構(gòu)成。革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌的 細(xì)胞膜之間有差別(即細(xì)胞壁)。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較薄，具有明顯的幾層。外 層與典型的三片層結(jié)構(gòu)組合更像細(xì)胞質(zhì)膜。革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是脂多糖。另外還存在磷脂、蛋白質(zhì)、脂蛋白和 少量的肽聚糖。脂多糖由核心區(qū)和連接于其上的多糖部分(moiety)重復(fù)單位組成。大多數(shù) 革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中有某種成分與內(nèi)毒性活性有關(guān)，而這種內(nèi)毒性活性則關(guān)系到革 蘭氏陰性細(xì)菌感染的熱原反應(yīng)。側(cè)鏈上攜帶著這些細(xì)菌的菌體抗原特異性的基礎(chǔ)物質(zhì)。這 些側(cè)鏈的化學(xué)組成(關(guān)系到各成分以及不同糖類排列)決定了菌體抗原或者說O抗原決定 簇的性質(zhì)，這是在血清學(xué)上對(duì)許多革蘭氏陰性細(xì)菌種屬進(jìn)行分類的非常重要的手段。在許 多情況下，已證實(shí)某些細(xì)菌歸屬甚為不同的種卻會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的血清學(xué)交叉反應(yīng)性的原因， 就在于它們將化學(xué)上類似的碳水化合物部分作為它們的脂多糖側(cè)鏈的一部分，通常具有約 30個(gè)重復(fù)單位。革蘭氏陽性細(xì)菌的特征是它們將肽聚糖以及多糖和/或磷壁酸作為它們的細(xì)胞 壁結(jié)構(gòu)的一部分。肽聚糖有時(shí)也稱胞壁質(zhì)，是多條聚糖鏈通過短肽交聯(lián)而成的雜聚物。胞壁質(zhì)的基礎(chǔ)是交替的N-乙酰葡糖胺殘基和N-乙酰胞壁酸殘基通過β _1，4鍵 連接而成的多條鏈。胞壁酸是細(xì)菌細(xì)胞壁的獨(dú)特物質(zhì)。這些鏈通過L-和D-氨基酸組成的 短多肽鏈交聯(lián)在一起。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，肽聚糖結(jié)構(gòu)簡單，在大多數(shù)屬中都比較一致， 而在革蘭氏陽性細(xì)菌中，其結(jié)構(gòu)和組成差別很大。一般來說，肽聚糖是多層的。還有記載 說，一些微生物類群在組成上有些小的差別。因此，在分支桿菌屬和諾卡氏菌屬中，胞壁酸 的N-乙酰部分被氧化形式N-乙醇酰部分取代。不同類群在交聯(lián)多肽和主干多肽的氨基酸 組成上都可能差別甚大。這些差別構(gòu)成了這些細(xì)菌的分類法的基礎(chǔ)。霉菌和酵母屬于真菌屆。雖然很多霉菌和真菌對(duì)人類有益，但有些具有病原性，能 釋放出有害真菌毒素而導(dǎo)致中毒或死亡。酵母也會(huì)導(dǎo)致發(fā)生感染，最廣為人知的大概是酵 母陰道炎。
11
接合菌門(Zygomycota)是一類真菌，包括黑面包霉和其它霉菌，與植物和動(dòng)物存 在著共生關(guān)系。這些霉菌能夠發(fā)生融合而形成堅(jiān)實(shí)的“接合孢子”。子囊菌門(Ascomycota) 是另一類真菌，包括酵母、白粉菌、黑霉和藍(lán)綠霉以及一些會(huì)引起疾病例如荷蘭榆病、蘋果 黑星病和麥角癥的種。這些真菌的生活史組合了有性繁殖和無性繁殖，菌絲細(xì)分成允許細(xì) 胞核和細(xì)胞質(zhì)通過的多孔壁。半知菌門(Deuteromycota)是又一類真菌，不能肯定適合上 述類別的各種真菌或擔(dān)子菌綱(Basidiomycota，包括大多數(shù)蘑菇、多孔菌和馬勃菌)全部 包括在此類當(dāng)中。這些半知菌綱(deuteromycetes)既包括制造干酪和青霉素的種屬，也包 括致病的種屬，如導(dǎo)致香港腳和癬菌病的種屬。近年來，染料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的使用在研究興趣和技術(shù)重要性方面都有非凡的增 長。染料在例如分析生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的許多領(lǐng)域，甚至在疾病的治療和預(yù)防上，都得 到使用。染料的顏色對(duì)于某些應(yīng)用來說是必需的，所述應(yīng)用從用于分光檢測(美國專利第 5，036，000號(hào))和體液分析物測量(歐洲專利第O 250 700號(hào))的簡單有機(jī)反應(yīng)到用于腫 瘤檢測的高清晰度成像技術(shù)(Motohashi，Med. Res. Rev.，11，239，1991)。染料還可在臨床 上用于治療疾病(美國專利第5，468，469號(hào))。光動(dòng)力療法(Sedlacek，“The change in research for the therapy oftumors”，Chimia，45，52，1991)被成功用于治療某些種類的 癌癥，如皮膚、頭部、頸部、肺和食道的惡性腫瘤。其它治療性應(yīng)用涉及到染料的抗病毒和殺 細(xì)菌性能。染料在組織學(xué)、熒光生物標(biāo)記和熒光生物探針這些重要領(lǐng)域中也是關(guān)鍵的物質(zhì)。 相關(guān)的技術(shù)非常復(fù)雜，需要進(jìn)行染色、洗滌和交叉染色(Blum，Wiotodynamic action and disease caused by light，，Reinhold, New York, 3,1941)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用特定的色料可制備出微生物指示噴劑及開發(fā)出快速微生物定量 方法。該技術(shù)的潛在應(yīng)用包括但不限于檢測以下固體表面上的微生物柜臺(tái)頂面、手、醫(yī)療 區(qū)域、浴室、床欄桿、醫(yī)療設(shè)備、手術(shù)臺(tái)、器皿、廚房、食品、食品制作表面、食品加工設(shè)備、門 把手、電話和計(jì)算機(jī)鍵盤。該有色染料涂層、噴劑或溶液對(duì)有害水平的細(xì)菌和其它微生物靈 敏，其顏色變化充當(dāng)著視覺指示工具，用以證實(shí)表面的清潔和/或凈化是否有效。對(duì)指示技術(shù)的要求是相當(dāng)嚴(yán)格的，因?yàn)樗玫娜玖媳仨殞?duì)革蘭氏陽性細(xì)菌株和革 蘭氏陰性細(xì)菌株都靈敏。染料應(yīng)能快速地與微生物或微生物代謝物發(fā)生相互作用。對(duì)于最 大的多功能性，染料還應(yīng)對(duì)其它微生物如酵母和霉菌靈敏。如前所述，染料長時(shí)間以來已被用作細(xì)胞和細(xì)菌鑒定的染色劑。染色溶液與細(xì)胞 或細(xì)菌發(fā)生反應(yīng)或者優(yōu)選被細(xì)胞或細(xì)菌保持，從而通過提高它和所存在的背景或其它成分 之間的反差來幫助進(jìn)行鑒定(Johnson，1995)。通常，須將染色劑施加到表面，然后通過振動(dòng) 或漂洗除去過量染色劑，以突出顯示微生物的存在。本發(fā)明人沒有聽說以前有任何關(guān)于在 暴露于微生物或與微生物發(fā)生相互作用時(shí)會(huì)變色的色料的報(bào)道。溶劑化變色(solvatochromism)現(xiàn)象可能是造成所看見的顏色變化的原因，不過 本發(fā)明人不想受到一個(gè)具體理論的限制。溶劑化變色染料在分子環(huán)境如溶劑極性和/或氫 鍵合傾向出現(xiàn)變化時(shí)就會(huì)發(fā)生顏色變化。舉例說，染料在極性環(huán)境如水中顏色可能為藍(lán)色， 但在非極性環(huán)境如富含脂質(zhì)的溶液中可能是黃色或紅色。這種“合適染料”所產(chǎn)生的顏色 取決于染料的基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的分子極性差異，這在下文有更為全面的討論。Reichardt 染料被選為研究用模型染料。本發(fā)明人想知道，通過對(duì)某些細(xì)胞成分(如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)和細(xì)胞外部之間的極性差別作出響應(yīng)，一些溶劑化變色染料是否可用于檢測微生物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微生 物與某些涂敷在基材(如紙巾)上的這些染料接觸時(shí)，的確觀察到顏色變化——不單單是 顏色變化，而且在大多數(shù)情況下染料是在被細(xì)菌接觸到的區(qū)域發(fā)生脫色。令本發(fā)明人驚奇 的是，進(jìn)一步的研究還提示，這當(dāng)中的機(jī)制并不完全歸于溶劑化變色現(xiàn)象。事實(shí)上，本發(fā)明 的發(fā)明人在此報(bào)告，出乎他們意料的是，他們發(fā)現(xiàn)以下事實(shí)i)可將被細(xì)菌或其它微生物脫色的染料的量與暴露于染料的微生物的濃度進(jìn)行 關(guān)聯(lián)，提示該方法是定量方法和定性方法，ii)能被檢測的微生物的范圍包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母和霉菌，iii)所試驗(yàn)的染料可作為干膜涂層的形式、或作為添加到含細(xì)菌液體中的溶液的 形式、或作為噴霧型檢測系統(tǒng)的形式使用，iv)當(dāng)作為例如紙巾或搪瓷表面上的干涂層的形式使用時(shí)，據(jù)以施加這種染料的 溶劑的性質(zhì)對(duì)檢測用染料的性能(脫色時(shí)間、脫色區(qū)域和非脫色區(qū)域之間的反差以及靈敏 度)產(chǎn)生顯著影響，ν)當(dāng)以例如紙巾上的干涂層的形式使用時(shí)，與染料一起包括在涂層中的添加劑可 影響檢測用染料的性能(脫色施加、脫色區(qū)域和非脫色區(qū)域之間的反差以及靈敏度)。例 如，羥丙基- β -環(huán)糊精可增強(qiáng)檢測用染料的性能，vi)細(xì)菌引起的這些染料的脫色可用強(qiáng)堿來逆轉(zhuǎn)。雖然溶劑化變色現(xiàn)象會(huì)促成所觀察到的顏色變化，但這些觀察結(jié)果可能還符合于 其它看似有理的機(jī)制。例如，這些觀察結(jié)果可能還符合某種類型酸-堿相互作用或某種類 型給質(zhì)子反應(yīng)，該反應(yīng)可促成細(xì)菌存在導(dǎo)致的染料顏色變化。本發(fā)明人也還沒有完全排除 這種可能性，即當(dāng)某些染料暴露于多種微生物時(shí)，氧化還原類型的反應(yīng)也可能促成所察覺 到的顏色變化。其它因素可能也會(huì)促成所觀察到的某些染料在微生物存在下的顏色變化， 例如，可能細(xì)胞膜的一部分與某些染料存在相互作用而導(dǎo)致顏色變化。還有一種可能性是 細(xì)菌細(xì)胞壁上的高度組織化酸部分(moiety)可能能夠使某些指示染料質(zhì)子化，導(dǎo)致失去 顏色。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種不尋常且目前還未能解釋的現(xiàn)象，并利用這種現(xiàn)象開發(fā)出可 用于檢測和定量多種微生物的方法。一般來說，就顏色變化的目視檢測而言，“顏色”是一種感覺類型，是當(dāng)人眼機(jī)構(gòu)察 覺到視野中的物體所反射或發(fā)射的各種波長光線的存在或不存在而產(chǎn)生的。由三種類型的 對(duì)可見光譜特定區(qū)域敏感的視錐細(xì)胞對(duì)進(jìn)入眼睛的光線進(jìn)行光譜分析。來自這些細(xì)胞的刺 激然后又被視網(wǎng)膜神經(jīng)元、視神經(jīng)神經(jīng)元和視皮質(zhì)所加工，結(jié)果體驗(yàn)到顏色的感覺。雖然存 在著數(shù)種顏色賦予機(jī)制(例如吸收、發(fā)射、熒光、磷光、折射、衍射等)，但合適的研究焦點(diǎn)限 于吸收性顏色(absorptive color)。換句話說，本發(fā)明涉及因吸收某些波長的光線而產(chǎn)生 顏色的染料。由于人眼運(yùn)作方式的原因，所感知到的顏色通常是物體所吸收光線的波長對(duì)應(yīng)的 顏色的互補(bǔ)色。例如在白光下觀看時(shí)看起來是紅色的物體，實(shí)際上在選擇性吸收490-500nm 波長范圍的淺藍(lán)色光線。類似地，在白光下看起來黃色的物體實(shí)際上在吸收435-480nm范 圍的藍(lán)光。分子對(duì)可見光的吸收涉及到分子當(dāng)中的電子躍遷，并導(dǎo)致激發(fā)態(tài)的產(chǎn)生。根據(jù)以
13下普朗克關(guān)系，分子的基態(tài)和相應(yīng)激發(fā)態(tài)之間能量差異決定著所吸收光線的波長E = hv式中E =能量，h =普朗克常數(shù)，ν是所吸收光線的光子的頻率，與波長λ和光速 c的關(guān)系如下ν = c/ λ圖18繪示了電子躍遷。顯然，所吸收的光子的能量與光子的波長成反比。因此，藍(lán)光G35-480nm)的光子 具有比黃光(580-595nm)更高的能量。所以，當(dāng)在白光下觀看時(shí)，溶液中或物體上的染料的 顏色由染料分子的基態(tài)和第一容許激發(fā)態(tài)間的躍遷能所決定。染料的吸光部分慣常稱為染料的色原。色原包括發(fā)色團(tuán)和其所連接的共軛體系。 發(fā)色團(tuán)是產(chǎn)生染料的顏色的主要基團(tuán)，例如偶氮染料中的偶氮基團(tuán)、胡蘿卜素中的多烯基 團(tuán)、蒽醌染料中的羰基基團(tuán)。還有許多其它發(fā)色團(tuán)。助色團(tuán)通過作用于共軛色原來影響染料 的顏色和強(qiáng)度。助色團(tuán)可與或可不與色原共軛。例如，通過例如苯環(huán)與偶氮基團(tuán)(發(fā)色團(tuán)) 共軛的氨基會(huì)形成氨基偶氮色原。共軛氨基助色團(tuán)可將偶氮基團(tuán)的吸收譜帶偏移向更長的 波長，增加吸收譜帶的強(qiáng)度。但是，有意將磺酸基團(tuán)加入氨基偶氮色原中并不發(fā)生共軛，不 過吸電子效應(yīng)使吸收偏移向更長的波長?；鶓B(tài)極性比激發(fā)態(tài)極性更大的染料的實(shí)例是如下所示的份菁染料1。左手邊的電 荷分離的正則結(jié)構(gòu)1是基態(tài)的主要促成結(jié)構(gòu)，而右手邊的正則結(jié)構(gòu)1'是第一激發(fā)態(tài)的主 要促成結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種半定量或定量檢測樣品中微生物存在的方法，所述方法包括使試驗(yàn)染料與樣 品接觸，使得試驗(yàn)染料發(fā)生可檢測的顏色變化，其特征在于所述試驗(yàn)染料包括兩性離子的 N-酚酸甜菜堿染料，所述N-酚酸甜菜堿染料不是2，6- 二苯基-4- (2，4，6-三苯基吡啶)-苯 酚鹽。
2.權(quán)利要求1的方法，其還包括將所述試驗(yàn)染料與對(duì)照染料的顏色進(jìn)行比較，其中所 述對(duì)照染料的顏色對(duì)應(yīng)于已知微生物濃度。
3.權(quán)利要求2的方法，其中將所述試驗(yàn)染料與多種對(duì)照染料的顏色進(jìn)行比較，其中所 述對(duì)照染料各自具有對(duì)應(yīng)于不同的已知微生物濃度的顏色。
4.權(quán)利要求2的方法，進(jìn)一步包括測量試驗(yàn)染料、一種或多種對(duì)照染料或它們的組合 的顏色強(qiáng)度。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述試驗(yàn)染料的顏色強(qiáng)度與試驗(yàn)樣品中微生物的濃度成正比。
6.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括通過將一種或多種對(duì)照染料的顏色強(qiáng)度對(duì)多個(gè)已知 的微生物濃度作圖，產(chǎn)生檢測曲線。
7.權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括將所述試驗(yàn)染料的顏色強(qiáng)度與所檢測曲線上的微生 物濃度進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
8.權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的方法，其中基材限定含有試驗(yàn)材料的檢測區(qū)。
9.權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的方法，其中所述顏色變化在少于約5分鐘內(nèi)發(fā)生，優(yōu)選在少 于1分鐘內(nèi)發(fā)生。
10.權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的方法，其中所述試驗(yàn)染料選自一下化合物
11.一種供半定量或定量檢測樣品中微生物存在的基材，所述基材限定檢測區(qū)，其中試 驗(yàn)染料包含在檢測區(qū)中，所述試驗(yàn)染料在微生物存在下能夠發(fā)生可檢測的顏色變化，其特 征在于所述試驗(yàn)染料，對(duì)照染料或其組合包括兩性離子的N-酚酸甜菜堿染料，所述N-酚酸 甜菜堿染料不是2，6- 二苯基-4- (2,4,6-三苯基吡啶)-苯酚鹽。
12.權(quán)利要求11的基材，其中所述試驗(yàn)染料選自下面的化合物
13.權(quán)利要求11的基材，其中多種對(duì)照染料包含在對(duì)照區(qū)中，每種對(duì)照染料的顏色對(duì) 應(yīng)于不同的已知微生物濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供一種半定量或定量檢測樣品中微生物的存在的方法。該方法采用了在一種或多種微生物的存在下能夠發(fā)生可檢測的顏色變化的試驗(yàn)染料。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)染料是能對(duì)微生物各成分(例如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)與細(xì)胞外部環(huán)境之間的極性差異作出響應(yīng)的溶劑化變色染料(例如Reichardt染料)?；蛘?，還可能有其它機(jī)制全部或部分上是染料與微生物之間的相互作用的原因，如酸-堿反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等等。不管怎樣，可將試驗(yàn)染料的顏色與對(duì)照染料的顏色進(jìn)行比較，其中對(duì)照染料的顏色對(duì)應(yīng)于已知的微生物濃度。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102121056SQ20101052885
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日
發(fā)明者J·G·麥唐納, J·利, S·M·馬丁 申請(qǐng)人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司