專利名稱：與小麥黃花葉病抗性主效qtl緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬 于小麥育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥黃花葉病是由小麥黃花葉病病毒(wheal yellow Mosaic Virus, WYMV)引起 的以真菌為介體的土傳病毒病。日本的Sawada(1927)首次發(fā)現(xiàn)并描述小麥黃花葉病害。 Inouye (1969)證明該病害的病原是小麥黃花葉病毒(WYMV)。由于小麥黃花葉病與首次 在加拿大安大略省的冬小麥上發(fā)現(xiàn)的小麥梭條斑花葉病(wheat spindle streak mosaic virus, WSSMV)癥狀相似(Slykui，1960)，這兩個(gè)名字都曾被用于我國和歐洲分離物，后 來通過不同地區(qū)分離物的基因組研究證實(shí)北美和歐洲分離物為WSSMV，而亞洲分離物為 WYMV(Lei, 1998 ；Chen, 2000)，因此在我國，小麥梭條花葉病即應(yīng)是小麥黃花葉病。小麥黃花 葉病于1962年在四川省天全縣被發(fā)現(xiàn)(李振岐，1994)，目前主要分布于我國長江、黃河中 下游流域及淮河流域(候慶樹，1993)。自90年代以來，全國每年該病的發(fā)生面積都達(dá)66. 7 萬hm2以上。小麥?zhǔn)芎笠话銣p產(chǎn)10 50%，嚴(yán)重田塊達(dá)85%以上，甚至絕收。近年由于 廣泛種植的高產(chǎn)品種大多缺乏對小麥黃花葉病的抗性、小麥重茬種植以及病土中傳毒介體 的傳毒特性的變化等原因，使病害呈蔓延態(tài)勢。采用栽培管理措施、藥劑防治可減輕病害的 發(fā)生，但效果都不明顯，利用植物自身的抗性基因培育抗病品種對控制小麥黃花葉病最為 經(jīng)濟(jì)有效。研究小麥黃花葉病抗性遺傳對抗病育種具有重要的指導(dǎo)意義。因此，自 Dubey (1970)對小麥黃花葉病抗性進(jìn)行遺傳研究以來，秦家忠(1986)、姚金保(1999)、程兆 榜(2000)和岳緒國(2001)、Liu Weihua(2005)等利用 F1, F2、F3、BC1, BC2 群體研究了小麥 黃花葉病抗性遺傳，但所得結(jié)論并不一致，部分研究認(rèn)為由1對主基因控制，部份認(rèn)為受3 對或3對以上多基因控制。目前對此病害分子遺傳機(jī)制等遺傳基礎(chǔ)方面的研究還處于起步 階段，從分子水平對小麥黃花葉病進(jìn)行基因定位和分子標(biāo)記研究的報(bào)道也不是很多(Khan， 2000 ；張清平，2005 ；Liu, 2005 ；顏偉，2008 ；Zenta，2010)。根據(jù)目前的研究結(jié)果，大多數(shù)人 認(rèn)為抗性基因存在于2D染色體長臂上(Khan，2000 ；Liu, 2005a ；顏偉，2008 ；Zenta, 2010)， 也有人認(rèn)為抗性基因存在于2D染色體短臂或2A染色體上(張清平，2005;Liu ffeihua, 2005b)。因此為進(jìn)一步明確小麥黃花葉病抗性分子遺傳規(guī)律，同時(shí)拓寬小麥黃花葉病抗性 遺傳基礎(chǔ)，有必要對不同的小麥黃花葉病抗源在全基因組水平進(jìn)行分子遺傳基礎(chǔ)研究。小麥品種CI12633是來自美國的抗白粉病及紋枯病的材料(劉朝暉，2000 ；顏偉， 2004)。經(jīng)本項(xiàng)目組多年鑒定，CI12633具有較好的黃花葉病抗性。目前為止尚未有與CI12633抗小麥黃花葉病主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于，針對目前人們對小麥黃花葉病的認(rèn)知和研究的現(xiàn)狀，提 供小麥黃花葉病抗性主效QTL的分子標(biāo)記及其在抗小麥黃花葉病育種中的應(yīng)用。本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo) 記，其特征在于，采用PCR引物Wmc327和Gwml54對小麥品種CI12633的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，分別獲得與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊 密連鎖的分子標(biāo)記Xwmc327-180和Xgwml54_105，它們的大小分別為180bp和105bp。在本發(fā)明中所述的小麥品種CI12633的DNA是指對CI12633小麥植株的葉片 分離提取獲得的DNA ；所述的12%聚丙烯酰胺凝膠是指100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有 11. 6克丙烯酰胺和0. 4克甲叉雙丙烯酰胺。上述與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于將 分子標(biāo)記Xwmc327-180和Xgwml54-105用于小麥品種CI12633的衍生品種或品系的基因型 檢測，以判斷該衍生品種或品系是否具有小麥黃花葉病抗性。在本發(fā)明的應(yīng)用中所述的小麥品種CI12633的衍生品種或品系是指以小麥品 種CI12633為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或采用玉米與小麥 雜交誘導(dǎo)單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥衍生品 種或品系。在本發(fā)明的應(yīng)用中所述的小麥品種CI12633的衍生品種或品系還包括以小麥 品種CI12633的衍生品種或品系為父本或母本，再與其他小麥雜交并繁衍至F2代以上的衍 生品種或品系。在本發(fā)明的應(yīng)用中分別采用PCR引物Wmc327和Gwml54對小麥品種CI12633的 衍生品種或品系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，通過 判斷與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記Xwmc327-180和Xgwml54-105在小 麥品種CI12633的衍生品種或品系的DNA中的同時(shí)存在與否，來預(yù)測該衍生品種或品系是 否具有小麥黃花葉病抗性，同時(shí)存在所述兩個(gè)分子標(biāo)記的小麥品種CI12633的衍生品種或 品系，它們對小麥黃花葉病的抗性達(dá)到“中抗”以上水平，同時(shí)不存在所述兩個(gè)分子標(biāo)記的 小麥品種CI12633的衍生品種或品系，它們對小麥黃花葉病的抗性達(dá)到“感病”。在本發(fā)明的應(yīng)用中所述的“中抗”以上水平是指對小麥黃花葉病的抗性達(dá)到“抗 病”或“中抗”，其中，“抗病”是指該衍生品種或品系對小麥黃花葉病的實(shí)際病情指數(shù)小于 20%，“中抗”是指該衍生品種或品系對小麥黃花葉病的實(shí)際病情指數(shù)達(dá)到20. 1 35. 0%;所 述的“感病”是指該衍生品種或品系對小麥黃花葉病的實(shí)際病情指數(shù)在35%以上。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于充分發(fā)揮分子標(biāo)記Xwmc327-180、Xgwml54-105輔助選擇的特 長，利用分子標(biāo)記Xwmc327-180、Xgwml54-105輔助選擇不受環(huán)境條件的影響的特點(diǎn)，通過 檢測這些分子標(biāo)記可以預(yù)測小麥植株的黃花葉病抗性，在低世代就可以對小麥新品種或新 品系的小麥黃花葉病抗性進(jìn)行選擇。采用分子標(biāo)記XWmc327-180、XgWml54-105輔助選擇不 僅準(zhǔn)確性高，加快對抗黃花葉病小麥的選擇進(jìn)度，同時(shí)也將大大減少了育種的工作量，提高 了育種效率，克服了常規(guī)抗小麥黃花葉病品種或品系育種周期長、后期篩選工作量大、對品 種或品系進(jìn)行鑒定的效率低等缺陷和不足。


圖1是CI12633的5A染色體上小麥抗黃花葉病主效QTL分析的LOD值分布圖。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1小麥黃花葉病抗源CI12633的測定1、提取小麥品種CI12633的DNA將小麥品種CI12633的植株的葉片采用CTAB提取方法進(jìn)行分離提取獲得的DNA。2、對小麥品種CI12633的DNA進(jìn)行檢測，篩選出與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊 密連鎖的分子標(biāo)記PCR 引物 Wmc327:上游引物5，TGCGGTACAGGCAAGGCT3，；下游引物5，TAGAACGCCCTCGTCGGA3，。PCR 引物 Gwml54:上游引物5，TCACAGAGAGAGAGGGAGGG3，；下游引物4:5，ATGTGTACATGTTGCCTGCA 3，。PCR 擴(kuò)增利用PCR引物Wmc327對獲得的小麥品種CI12633植株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物 在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得大小為ISObp的分子標(biāo)記Xwmc327-180。利用PCR引物Gwml54對獲得的小麥品種CI12633植株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物 在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得大小為105bp的分子標(biāo)記Xgwml54-105。上述對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離使用的12%聚丙烯酰胺凝膠是100ml聚丙烯酰胺 膠溶液中含有11. 6克丙烯酰胺和0. 4克甲叉雙丙烯酰胺。通過MapQTL5. 0軟件進(jìn)行QTLs分析，獲得CI12633的5A染色體抗性QTL的LOD 值分布圖(見圖1)，其中左邊為5A染色體遺傳連鎖圖；右邊的曲線圖為QTL的LOD值分 布圖。由圖1可見，大小為180bp、105bp的分子標(biāo)記Xwmc327-180、Xgwml54_105位于該QTL 兩側(cè)，與該QTL緊密連鎖。實(shí)施例2利用大小分別為180bp和105bp的分子標(biāo)記Xwmc327-180、Xgwml54_105對小麥品 種CI12633的衍生品系進(jìn)行小麥黃花葉病抗性預(yù)測鑒定對象采用小麥品種CI12633與揚(yáng)麥158雜交，繁衍到F8代的后代，不同的株系號分別 定義為:E294, E304, E310, E313, E316, E322, E332, E351，E367，E386。將它們都作為對行小 麥黃花葉病抗性未知的鑒定對象。將對小麥黃花葉病抗性已知的小麥品種CI12633和揚(yáng)麥158作為參照鑒定對象。鑒定過程a)利用與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定先從各鑒定對象的葉片采用CTAB提取方法進(jìn)行分離提取獲得的DNA，然后用分子 標(biāo)記Xwmc327-180、Xgwml54-105的引物分別對這些DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[分離提取DNA以及PCR擴(kuò)增和電泳分離過程與實(shí)施例1相同]。每個(gè)鑒定對象均采用三個(gè)重復(fù)。 獲取的鑒定結(jié)果記錄在表1中當(dāng)PCR擴(kuò)增、電泳分離后存在相應(yīng)的分子標(biāo)記時(shí)，記錄為A， 否則記錄為B。b)將經(jīng)過分子標(biāo)記鑒定的株系，后續(xù)兩年在田間進(jìn)行抗性鑒定，鑒定方法是將以上鑒定材料分別于2006、2007年秋種植于江蘇省農(nóng)科院小麥黃化葉病病圃， 每株系12單株，設(shè)置2個(gè)重復(fù)，采用自然發(fā)病法鑒定抗病性。分別于2007、2008年3月小 麥返青期，發(fā)病最重時(shí)記錄病情，每個(gè)株系全部單株都調(diào)查病級。分級標(biāo)準(zhǔn)參照侯慶樹等 (1990)的方法。0級，無病癥；1級，植株矮縮不明顯，輕度花葉，一般不產(chǎn)生明顯的條紋壞 死斑，葉片不黃化或少數(shù)黃化；2級，病株輕度矮縮，花葉明顯，條紋斑占葉面積1/2左右，部 分葉片黃化，少數(shù)枯死，分蘗黃化矮縮；3級，植株明顯矮縮，嚴(yán)重花葉，條紋斑占葉面積3/4 左右，心葉扭曲或呈縮頂狀，葉片黃化，部分葉片和分蘗或整株枯死。病情指數(shù)的計(jì)算公式為
權(quán)利要求
一種與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，采用PCR引物Wmc327和Gwm154對小麥品種CI12633的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，分別獲得與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記Xwmc327 180和Xgwm154 105，它們的大小分別為180bp和105bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在 于所述的小麥品種CI12633的DNA是指對CI12633小麥植株的葉片分離提取獲得的DNA ； 所述的12%聚丙烯酰胺凝膠是指100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有11. 6克丙烯酰胺和0. 4 克甲叉雙丙烯酰胺。
3.一種如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于將分子標(biāo)記Xwmc327-180 和Xgwml54-105用于小麥品種CI12633的衍生品種或品系的基因型檢測，以判斷該衍生品 種或品系是否具有小麥黃花葉病抗性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述的小麥品種CI12633的 衍生品種或品系是指以小麥品種CI12633為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采 用花藥培養(yǎng)、或采用玉米與小麥雜交誘導(dǎo)單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用 遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥衍生品種或品系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述的小麥品種CI12633的 衍生品種或品系還包括以小麥品種CI12633的衍生品種或品系為父本或母本，再與其他 小麥雜交并繁衍至F2代以上的衍生品種或品系。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于分別采用PCR引物 Wmc327和Gwml54對小麥品種CI12633的衍生品種或品系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物 在12%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，通過判斷與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的 分子標(biāo)記Xwmc327-180和Xgwml54_105在小麥品種CI12633的衍生品種或品系的DNA中的 同時(shí)存在與否，來預(yù)測該衍生品種或品系是否具有小麥黃花葉病抗性，同時(shí)存在所述兩個(gè) 分子標(biāo)記的小麥品種CI12633的衍生品種或品系，它們對小麥黃花葉病的抗性達(dá)到“中抗” 以上水平，同時(shí)不存在所述兩個(gè)分子標(biāo)記的小麥品種CI12633的衍生品種或品系，它們對 小麥黃花葉病的抗性達(dá)到“感病”。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述的“中抗”以上水平是指 對小麥黃花葉病的抗性達(dá)到“抗病”或“中抗”，其中，“抗病”是指該衍生品種或品系對小麥 黃花葉病的實(shí)際病情指數(shù)小于20%，“中抗”是指該衍生品種或品系對小麥黃花葉病的實(shí)際 病情指數(shù)達(dá)到20. 1 35. 0% ；所述的“感病”是指該衍生品種或品系對小麥黃花葉病的實(shí) 際病情指數(shù)在35%以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，采用PCR引物Wmc327和Gwm154對小麥品種CI12633的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，分別獲得與小麥黃花葉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記Xwmc327-180和Xgwm154-105，它們的大小分別為180bp和105bp，并將所述分子標(biāo)記用于小麥品種CI12633的衍生品種或品系的基因型檢測，以判斷該衍生品種或品系是否具有黃花葉病抗性。
文檔編號C12Q1/68GK101935654SQ20101028687
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者任麗娟, 周淼平, 姚金保, 楊學(xué)明, 馬鴻翔 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院