專利名稱：用于不同亞型非小細(xì)胞肺癌分型的核酸適體及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于不同亞型非小細(xì)胞肺癌分型的核酸適體及其篩選方法。
背景技術(shù)：
肺癌是最致命的癌癥之一，在組織學(xué)上分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中后 者占肺癌病例的80%。非小細(xì)胞肺癌又分為腺癌，鱗癌和大細(xì)胞癌三類亞型。腺癌作為一 種最主要的亞型，占非小細(xì)胞肺癌的40%。非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后嚴(yán)重依賴于確診時(shí)疾病 所處的分期，按照現(xiàn)有的治療水平，病人的5年生存率從I期的60%降到IV期的1%。盡 管在肺癌的檢測(cè)方法上取得了較大進(jìn)展，但目前仍有約70%的病人在確診時(shí)已處于肺癌晚 期。對(duì)非小細(xì)胞肺癌不同亞型的治療施加相似的治療方法而沒(méi)有考慮亞型之間的異質(zhì)性是 影響非小細(xì)胞肺癌治療效果的重要原因。盡管目前神經(jīng)元特異性烯醇化酶、細(xì)胞角蛋白片 段21-1、癌胚抗原、糖類抗原等腫瘤標(biāo)志物用于肺癌的檢測(cè)和術(shù)后評(píng)估，但是這些腫瘤標(biāo)志 物對(duì)肺癌，尤其是不同肺癌亞型的特異性和敏感性不夠。非小細(xì)胞肺癌的分型和診斷仍主 要依靠細(xì)胞物理形態(tài)進(jìn)行判斷，發(fā)展能從分子水平上反映非小細(xì)胞肺癌特征的新試劑，并 用以進(jìn)行亞型分類和早期診斷是降低非小細(xì)胞肺癌死亡率重要手段。核酸適體(Aptamer，又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生 物靶標(biāo)的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。已報(bào)道核酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小 分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識(shí)別功能與抗體類似，但與抗體相比 具有很多優(yōu)良的特性，如無(wú)免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿透組織、良好的代謝動(dòng)力 學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會(huì)存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物檢測(cè)、疾病診斷治療等 領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于不同亞型非小細(xì)胞肺癌分型的核酸適體及其篩選 方法。本發(fā)明提供的核酸適體，是含有序列表的序列1至序列9中任一所示的核苷酸的 DNA片段。所述核酸適體具體可為序列表的序列1至序列16中任一所示的DNA片段。核酸適體1 :5，-CGCG TGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAG CGCG-3，；見(jiàn)序列表的序列 10 ；其中加粗下劃線標(biāo)記的為目標(biāo)序列，見(jiàn)序列表的序列1 ；核酸適體2 :5，-CAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’ ；見(jiàn)序列表的序列 2 ；核酸適體3a :5，-ATGCCAC AGTGGGGGGGTGGGTGG GTGGCAT-3’ ；見(jiàn)序列表的序列 11 ； 其中加粗下劃線標(biāo)記的為目標(biāo)序列，見(jiàn)序列表的序列3 ；
3
核酸適體3b :5，-TCGGATGC TGGGTGGGGGGGAAGA GCATCCGA-3，；見(jiàn)序列表的序列 12 ； 其中加粗下劃線標(biāo)記的為目標(biāo)序列，見(jiàn)序列表的序列4 ；核酸適體3c :5，-CCACTAC GAGGGTGGGCGGGTGGA GTAGTGG-3，；見(jiàn)序列表的序列 13 ； 其中加粗下劃線標(biāo)記的為目標(biāo)序列，見(jiàn)序列表的序列5 ；核酸適體3d :5，-GATC GGTGGGTGGGGGGGTTGGA GATC-3，；見(jiàn)序列表的序列 14 ；其中 加粗下劃線標(biāo)記的為目標(biāo)序列，見(jiàn)序列表的序列6 ；核酸適體3e5'-CGAACA GGTGGGTGGGTTGGGTGGAT TGTTCG-3，；見(jiàn)序列表的序列 15 ； 其中加粗下劃線標(biāo)記的為目標(biāo)序列，見(jiàn)序列表的序列7 ；核酸適體3f :5，-GATTAA GTGGGTGGGGGGGTGGAAG TTAATC-3，；見(jiàn)序列表的序列 16 ； 其中加粗下劃線標(biāo)記的為目標(biāo)序列，見(jiàn)序列表的序列8 ；核酸適體4 :5，-GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3’ ；見(jiàn)序列 表的序列9。其中，每條DNA序列中目標(biāo)序列以外的核苷酸可用其它互補(bǔ)的核苷酸代替。其中，核酸適體3a、核酸適體3b、核酸適體3c、核酸適體3d、核酸適體3e和核酸適 體3f，包含一保守序列G1T1GggtggGG2GGGt2G3GA。其中G1可以刪除，T1可被核苷酸A取代， G2可以被核苷酸C或TT取代，T2可以被核苷酸A取代，G3可以被核苷酸A取代或刪除。還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物，所述核酸適 體的衍生物可為a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具 有相同功能的核酸適體的衍生物。b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同 功能的核酸適體的衍生物。c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物。d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的 衍生物。e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體 具有相同功能的核酸適體的衍生物。本發(fā)明還保護(hù)所述核酸適體在不同亞型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分型中的應(yīng)用。所述核酸適體與不同亞型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的親和性不同。將兩者孵育后可得 到不同的結(jié)合信號(hào)，從而可以通過(guò)單個(gè)核酸適體信號(hào)或多個(gè)核酸適體分子圖譜的形式區(qū)分 非小細(xì)胞肺癌不同亞型。還可將所述核酸適體進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后對(duì)肺癌病人的組織切片 進(jìn)行染色，從而實(shí)現(xiàn)臨床樣本非小細(xì)胞肺癌不同亞型的區(qū)分。當(dāng)然，在核酸適體與不同亞型 的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的親和性不同的基礎(chǔ)上，可以再現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)上選擇任意方法，對(duì) 不同亞型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞進(jìn)行分型。所述不同亞型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可為腺癌亞型細(xì)胞、大細(xì)胞癌亞型細(xì)胞或鱗癌 亞型細(xì)胞。所述腺癌亞型細(xì)胞具體可為A549細(xì)胞；所述大細(xì)胞癌亞型細(xì)胞具體可為HLAMP細(xì) 胞或NCI-H460細(xì)胞；所述鱗癌亞型細(xì)胞具體可為NCI-H520細(xì)胞或NCI-H157細(xì)胞。
本發(fā)明還保護(hù)篩選述核酸適體的方法，包括如下步驟用靶細(xì)胞對(duì)核酸文庫(kù)進(jìn)行 篩選，得到與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸適體；所述核酸文庫(kù)為單鏈的隨機(jī)核苷酸序列的文庫(kù)； 所述靶細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的亞型細(xì)胞。所述篩選的方法具體包括如下步驟(1)以所述核酸文庫(kù)為起始核酸文庫(kù)；(2)將所述起始核酸文庫(kù)的溶液與靶細(xì)胞孵育，靶細(xì)胞與起始核酸文庫(kù)中部分核 酸序列結(jié)合，分離，得到與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸序列文庫(kù)；(3)將所述與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸序列文庫(kù)的溶液與非靶細(xì)胞孵育，分離去除與所 述非靶細(xì)胞結(jié)合的核酸序列，得到與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸序列；(4)得到核酸適體。所述步驟(2)中，還可包括如下步驟在得到與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸序列文庫(kù)后， PCR擴(kuò)增所述與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸序列文庫(kù)，并制備成單鏈。所述步驟(3)中，還可包括如下步驟在得到與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸序列后， PCR擴(kuò)增與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸序列，并制備成單鏈。所述篩選的方法中，在所述步驟(3)之后、步驟⑷之前，包括至少1次以下操作 以所述與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸序列為起始核酸文庫(kù)，重復(fù)步驟(2)和(3)，每次操作均以 前一次操作中得到的與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸序列為起始核酸文庫(kù)。所述篩選方法中，可每一輪篩選逐步增加篩選壓力，以增進(jìn)核酸適體的富集程度。 所述增加篩選壓力可為線性減少核酸序列文庫(kù)和靶細(xì)胞的孵育時(shí)間和相應(yīng)的線性增加核 酸序列文庫(kù)與非靶細(xì)胞的孵育時(shí)間。所述靶細(xì)胞具體可為腺癌亞型細(xì)胞；所述非靶細(xì)胞具體可為大細(xì)胞癌亞型細(xì)胞。肺癌的形成是一個(gè)多步的瘤形成過(guò)程。一些分子異常也伴隨腫瘤的形成而發(fā)生， 如一些分子在腫瘤中表達(dá)或過(guò)表達(dá)，或發(fā)生改變。利用本發(fā)明的核酸適體，可在目前非小細(xì) 胞肺癌腫瘤標(biāo)志物未知的情況下，從分子響應(yīng)信號(hào)而不是從細(xì)胞物理形貌上實(shí)現(xiàn)非小細(xì)胞 肺癌不同亞型的區(qū)分。利用本發(fā)明的核酸適體，對(duì)其結(jié)合靶標(biāo)的鑒定，將有利于非小細(xì)胞肺 癌不同亞型的腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有利于非小細(xì)胞肺癌更早的診斷和更準(zhǔn)確的分型，有利 于發(fā)現(xiàn)腫瘤治療新的藥物作用靶點(diǎn)。


圖1為實(shí)施例1中核酸適體的隨篩選輪次的富集過(guò)程；峰形代表A549細(xì)胞與異硫 氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記文庫(kù)，和第1輪、第6輪、第21輪產(chǎn)物結(jié)合的情況圖2為應(yīng)用四甲基羅丹明標(biāo)記的核酸適體識(shí)別非小細(xì)胞肺癌組織切片的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。腺癌A549細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基 礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，產(chǎn)品目錄號(hào)為CCC0002。鱗癌NCI-H520細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院
5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，產(chǎn)品目錄號(hào)為CCC0197。鱗癌 NCI-H157細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì) 胞中心，產(chǎn)品目錄號(hào)為CCC0113。大細(xì)胞癌HLAMP購(gòu)自中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大細(xì)胞 癌NCI-H460細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，產(chǎn)品目錄號(hào)為T(mén)CHu39。實(shí)施例1、用于不同亞型非小細(xì)胞肺癌分型的核酸適體的篩選—、隨機(jī)核酸文庫(kù)的設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)合成兩端包含20個(gè)核苷酸、中間包括45個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸序列文庫(kù)如下 5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG(N45)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3 ’。二、核酸適體的篩選將隨機(jī)核酸文庫(kù)溶于結(jié)合緩沖液中(PBS，150mM NaCl, 5mM MgCl2, lmg/ml酵母轉(zhuǎn) 移RNA)，與肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞在冰上孵育1小時(shí)；經(jīng)洗滌緩沖溶液(PBS，150mMNaCl, 5mM MgCl2)洗滌后，將A549細(xì)胞刮離下來(lái)，然后通過(guò)加熱將與細(xì)胞表面結(jié)合的DNA解離；解 離的DNA與大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系HLAMP細(xì)胞冰上孵育1小時(shí)，收集上清液并以其中的DNA為 模板，利用引物(FITC-5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和 Biotin-5，-GTCACCAGCACGTCCATGA G-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增后通過(guò)親和素包被的葡聚糖珠分離生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，然后 利用0. 2M的氫氧化鈉使雙鏈DNA變性解鏈，收集FITC標(biāo)記的DNA單鏈，這些DNA單鏈脫鹽 后用于下一輪篩選。為了得到高親和性的區(qū)分不同非小細(xì)胞不同亞型的核酸適體，在篩選的過(guò)程中， 通過(guò)逐步減少DNA文庫(kù)與靶細(xì)胞孵育的時(shí)間，增加洗滌次數(shù)和洗滌時(shí)間以及與對(duì)照細(xì)胞孵 育的時(shí)間來(lái)增強(qiáng)篩選壓力。核酸適體隨篩選輪次的富集過(guò)程見(jiàn)圖1。 25輪篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板通過(guò)引物(5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和 5，-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到以下核酸適體序 列核酸適體1 :5，-CGCG TGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAG CGCG-3，；核酸適體2:5，-CAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’ ；核酸適體3a :5，-ATGCCAC AGTGGGGGGGTGGGTGG GTGGCAT-3，；核酸適體3b :5，-TCGGATGC TGGGTGGGGGGGAAGA GCATCCGA-3，；核酸適體3c :5，-CCACTAC GAGGGTGGGCGGGTGGA GTAGTGG -3，；核酸適體3d :5，-GATC GGTGGGTGGGGGGGTTGGA GATC-3'；核酸適體3e :5，-CGAACA GGTGGGTGGGTTGGGTGGAT TGTTCG-3，；核酸適體3f :5，-GATTAA GTGGGTGGGGGGGTGGAAG TTAATC-3，；核酸適體4:5，-GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3，。將獲得的核酸適體分別在5’端標(biāo)記熒光分子制成分子探針，分別取0、5、10、20、 40、80、100、120、200nM的分子探針溶液，與5 X IO5個(gè)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞于冰上孵育50 分鐘后，用結(jié)合緩沖液洗滌兩遍，然后用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度，如細(xì)胞能結(jié) 合熒光標(biāo)記的核酸適體，則以熒光強(qiáng)度對(duì)探針濃度作圖，用公式Y(jié) = BmaxX/(Kd+X)計(jì)算核 酸適體的平衡解離常數(shù)Kd。結(jié)果表明，核酸適體的平衡解離常數(shù)均在納摩范圍內(nèi)。實(shí)施例2、應(yīng)用核酸適體對(duì)進(jìn)行不同亞型的小細(xì)胞肺癌進(jìn)行分型用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記實(shí)施例1得到的4條核酸適體。用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記實(shí)施例1的隨機(jī)核酸文庫(kù)。將培養(yǎng)的不同腫瘤細(xì)胞用PBS洗滌兩次、然后0. 02% EDTA處理3分鐘、再用PBS 洗滌兩次。每種腫瘤細(xì)胞分別進(jìn)行以下四組處理，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值處理一通過(guò)細(xì)胞記數(shù)分別取300，000左右的細(xì)胞分散于結(jié)合緩沖溶液中，然后 加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記核酸適體1 (最終濃度為IOOnM)。處理二 通過(guò)細(xì)胞記數(shù)分別取300，000左右的細(xì)胞分散于結(jié)合緩沖溶液中，然后 加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記核酸適體2 (最終濃度為IOOnM)。處理三通過(guò)細(xì)胞記數(shù)分別取300，000左右的細(xì)胞分散于結(jié)合緩沖溶液中，然后 加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記核酸適體3e (最終濃度為IOOnM)。處理四通過(guò)細(xì)胞記數(shù)分別取300，000左右的細(xì)胞分散于結(jié)合緩沖溶液中，然后 加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記核酸適體4 (最終濃度為IOOnM)。四個(gè)處理的混合液在冰上孵育50分鐘，離心洗滌兩次后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)核 酸適體和不同腫瘤細(xì)胞結(jié)合情況。將細(xì)胞與FITC標(biāo)記的隨機(jī)文庫(kù)孵育后做流式細(xì)胞儀檢 測(cè)，設(shè)定一熒光強(qiáng)度值大于95%的細(xì)胞熒光強(qiáng)度做為流式細(xì)胞儀背景熒光值。以細(xì)胞與核 酸適體結(jié)合后熒光強(qiáng)度超過(guò)這一閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)作為衡量核酸適體與細(xì)胞的結(jié)合能力 強(qiáng)弱(0 :< 15% ;+ 15-30% ；++ 30-65% ；+++ 65-85% ；++++ > 85% )。結(jié)果見(jiàn)表1。表1核酸適體對(duì)非小細(xì)胞肺癌不同亞型進(jìn)行分型的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果
腫瘤名稱細(xì)胞系核酸適體1核酸適體2核酸適體3e核酸適體4腺癌 (非小細(xì)胞肺癌)A549+++++++++++++++大細(xì)胞癌 (非小細(xì)胞肺癌)HLAMP++++++++大細(xì)胞癌 (非小細(xì)胞肺癌)NCI-H460++++++++鱗癌 (非小細(xì)胞肺癌)NCI-H52000+0鱗癌 (非小細(xì)胞肺癌)NCI-H15700++0 對(duì)于異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的核酸適體1，腺癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合后的熒 光強(qiáng)度高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有65-85%，大細(xì)胞癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合后的熒光強(qiáng)度高 于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有15-30%，鱗癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合后的熒光強(qiáng)度在閾值的細(xì)胞百 分?jǐn)?shù)小于15% ；對(duì)于異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的核酸適體2，腺癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合
7后的熒光強(qiáng)度高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有85%以上，大細(xì)胞癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合后的熒光 強(qiáng)度高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有30-65%，鱗癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合后的熒光強(qiáng)度高于閾值 的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)小于15%;對(duì)于異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的核酸適體3e，腺癌亞型的細(xì)胞 與其結(jié)合后的熒光強(qiáng)度高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有85%以上，大細(xì)胞癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合 后的熒光強(qiáng)度高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有65-85%，鱗癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合后的熒光強(qiáng)度 高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有15-65%;對(duì)于異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的核酸適體4，腺癌亞 型的細(xì)胞與其結(jié)合后的熒光強(qiáng)度高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有85%以上，大細(xì)胞癌亞型的細(xì)胞 與其結(jié)合后的熒光強(qiáng)度高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有65-85%，鱗癌亞型的細(xì)胞與其結(jié)合后的 熒光強(qiáng)度高于閾值的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)小于15%。結(jié)果表明利用以上核酸適體與不同亞型非小細(xì)胞肺癌的結(jié)合強(qiáng)弱圖譜均可實(shí)現(xiàn) 不同亞型非小細(xì)胞肺癌的區(qū)分。實(shí)施例3、檢測(cè)表1所列的核酸適體與肺癌組織切片的結(jié)合來(lái)自不同肺癌患者志愿者的甲醛固定石蠟包埋的組織切片浸于二甲苯中室溫脫 蠟2次，每次20分鐘，隨后浸于系列乙醇中水化(100%，兩次，每次1分鐘；95%乙醇，1次， 1分鐘；70%乙醇，1次，1分鐘)。隨后將水化的組織切片浸于緩沖溶液中95°C加熱15分 鐘。待組織切片恢復(fù)室溫后，與含20%胎牛血清和小牛胸腺DNA的結(jié)合緩沖液室溫孵育1 小時(shí)，組織切片經(jīng)洗滌后分別與四甲基羅丹名標(biāo)記的核酸適體(200nM)在結(jié)合緩沖液中室 溫孵育1小時(shí)。染色后用洗滌緩沖液洗滌組織切片3次，待干后封片檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)三種非小細(xì)胞肺癌不同分型患者的組織切片分別與四甲基羅丹名標(biāo)記的核酸 適體1孵育后，腺癌亞型的組織切片的熒光強(qiáng)度值為357. 59，而大細(xì)胞癌和鱗癌分別為 214. 99和181.06。當(dāng)非小細(xì)胞肺癌不同分型患者的組織切片分別與四甲基羅丹名標(biāo)記的 核酸適體2孵育后，腺癌亞型的組織切片的熒光強(qiáng)度值為289. 79，而大細(xì)胞癌和鱗癌分別 為220. 05和182.20。當(dāng)非小細(xì)胞肺癌不同分型患者的組織切片分別與四甲基羅丹名標(biāo)記 的核酸適體3e孵育后，腺癌亞型的組織切片的熒光強(qiáng)度值為492. 38，而大細(xì)胞癌和鱗癌分 別為203. 48和212. 54。當(dāng)非小細(xì)胞肺癌不同分型患者的組織切片分別與四甲基羅丹名標(biāo) 記的核酸適體4孵育后，腺癌亞型的組織切片的熒光強(qiáng)度值為482. 83，而大細(xì)胞癌和鱗癌 分別為 219. 33 和 218. 31。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所得到的核酸適體能與肺腺癌高親和性結(jié)合，從而在臨床上可用于 肺腺癌的檢測(cè)和診斷。
權(quán)利要求
核酸適體，為序列表的序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15和序列16任一所示的DNA片段。
2.權(quán)利要求1所述核酸適體在不同亞型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分型中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述不同亞型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為腺癌 亞型細(xì)胞、大細(xì)胞癌亞型細(xì)胞或鱗癌亞型細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述腺癌亞型細(xì)胞為A549細(xì)胞；所述大 細(xì)胞癌亞型細(xì)胞為HLAMP細(xì)胞或NCI-H460細(xì)胞；所述鱗癌亞型細(xì)胞為NCI-H520細(xì)胞或 NCI-H157 細(xì)胞。
5.篩選權(quán)利要求1所述核酸適體的方法，包括如下步驟用靶細(xì)胞對(duì)核酸文庫(kù)進(jìn)行篩 選，得到與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸適體；所述核酸文庫(kù)為單鏈的隨機(jī)核苷酸序列的文庫(kù)； 所述靶細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的亞型細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述篩選的方法包括如下步驟(1)以所述核酸文庫(kù)為起始核酸文庫(kù)；(2)將所述起始核酸文庫(kù)的溶液與靶細(xì)胞孵育，靶細(xì)胞與起始核酸文庫(kù)中部分核酸分 子結(jié)合，分離，得到與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)；(3)將所述與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)的溶液與非靶細(xì)胞孵育，分離去除與所述非靶細(xì) 胞結(jié)合的核酸分子，得到與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸分子；(4)得到核酸適體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，還包括如下步驟在得 到與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)后，PCR擴(kuò)增所述與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸文庫(kù)，并制備成單鏈；所 述步驟(3)中，還包括如下步驟在得到與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸分子后，PCR擴(kuò)增與靶細(xì) 胞特異結(jié)合的核酸分子，并制備成單鏈。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述篩選的方法中，在所述步驟(3) 之后、步驟(4)之前，包括至少1次以下操作以所述與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核酸分子為起始 核酸文庫(kù)，重復(fù)步驟(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的與靶細(xì)胞特異結(jié)合的核 酸分子為起始核酸文庫(kù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述靶細(xì)胞為腺癌亞型細(xì)胞；所述非靶細(xì) 胞為大細(xì)胞癌亞型細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于不同亞型非小細(xì)胞肺癌分型的核酸適體及其篩選方法。本發(fā)明提供的核酸適體，是含有序列表的序列1至序列9中任一所示的核苷酸的DNA片段。所述核酸適體可應(yīng)用于不同亞型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分型。利用本發(fā)明的核酸適體，可在非小細(xì)胞肺癌腫瘤標(biāo)志物未知的情況下，從分子響應(yīng)信號(hào)上實(shí)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌不同亞型的區(qū)分。利用本發(fā)明的核酸適體，對(duì)其結(jié)合靶標(biāo)的鑒定，將有利于非小細(xì)胞肺癌不同亞型的腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有利于非小細(xì)胞肺癌更早的診斷和更準(zhǔn)確的分型，有利于發(fā)現(xiàn)腫瘤治療新的藥物作用靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101955939SQ20101025609
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者上官棣華, 徐麗, 方曉紅, 譚蔚泓, 趙子龍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所