專利名稱：分子分析的裝置和方法
分子分析的裝置和方法本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00580031483. 0(名稱為《分子分析的裝置和方法》、國(guó)際申請(qǐng) 日為2005年9月16日)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉參照本申請(qǐng)是于2004年9月17日提交的未決的美國(guó)實(shí)用專利申請(qǐng)10/944，106的部 分繼續(xù)申請(qǐng)，此處完整引用作為參考。本申請(qǐng)也對(duì)分別于2005年1月31日和2005年2月 9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/649，009和60/651，846要求優(yōu)先權(quán)，這兩份申請(qǐng)?jiān)诖颂幰?作為參考。
背景技術(shù)：
自從熒光相關(guān)光譜學(xué)(FCS)的應(yīng)用以來(lái)，照射和信號(hào)檢測(cè)的約束一直公認(rèn)為分子 診斷學(xué)的一個(gè)重要工具。FCS包括對(duì)含有熒光標(biāo)記分子的樣品體積照射，以及檢測(cè)由于分子 擴(kuò)散進(jìn)出有效觀測(cè)體積而產(chǎn)生的熒光信號(hào)波動(dòng)。如果觀測(cè)體積內(nèi)僅包含少量的熒光分子， 并且背景信號(hào)較低，將最好地分析分子熒光強(qiáng)度的波動(dòng)。這可以通過(guò)結(jié)合使用嚴(yán)格限制的 檢測(cè)體積和低樣品濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)FCS的檢測(cè)體積大約為0.5飛升(或0.5X10—15升)， 并通過(guò)使用高數(shù)值光圈的顯微鏡物鏡來(lái)緊密聚焦一個(gè)激光束而實(shí)現(xiàn)。在這個(gè)檢測(cè)體積中， 在濃度最高約為1納摩爾的溶液中可以觀察到單分子(single molecules)。對(duì)于大部分的 生化反應(yīng)來(lái)說(shuō)，這個(gè)濃度范圍低得不可接受，典型的反應(yīng)常數(shù)應(yīng)該是在微摩爾或高于微摩 爾范圍。在較低濃度時(shí)，這些反應(yīng)進(jìn)行得不夠快，并且其表現(xiàn)方式與在大多數(shù)分析中可用的 方式在性質(zhì)上不同。為了在更高更相關(guān)的濃度下觀測(cè)單分子，一般需要將觀測(cè)體積降至更 小。最近幾年來(lái)，由于納米制造技術(shù)的進(jìn)展，使得可以生產(chǎn)整合了電子、光學(xué)、化學(xué)和/ 或機(jī)械元件的納米尺寸的裝置。然而，為了提供在生物學(xué)或診斷上更相關(guān)的條件下觀測(cè)單分子反應(yīng)的能力，仍然 非常需要更快速、更便宜、更精確的生物化學(xué)分析。同時(shí)還需要批量生產(chǎn)的小的一次性裝 置，其通過(guò)提供適合在高濃度條件下進(jìn)行單分子分析的光約束能夠達(dá)到這些目的。本發(fā)明 能滿足這些需求并還有相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)主要方面是用于表征分子和/或監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)的光學(xué)裝置和方法 的設(shè)計(jì)。本發(fā)明的裝置和方法特別適用于單分子(single-molecule)分析。因此，本發(fā)明提供了一種表面密度超過(guò)4X IO4個(gè)約束每平方毫米，甚至超過(guò)IO5個(gè) 約束每平方毫米的光約束(optical confinement)陣列。在一個(gè)方面，陣列中單個(gè)約束提 供了小于1納升(X 10_9升)、小于1皮升、或小于1飛升甚至仄升數(shù)量級(jí)的有效觀測(cè)體積。 在其它一些方面，每個(gè)單個(gè)約束提供小于1000仄升、100仄升、80仄升、或小于50仄升甚至 小于10仄升的有效觀測(cè)體積。在其它一些方面，每個(gè)單獨(dú)約束產(chǎn)生一個(gè)有效觀測(cè)體積，這個(gè)有效觀測(cè)體積允許 對(duì)濃度高于1納摩爾，或高于100納摩爾，甚至達(dá)到微摩爾數(shù)量級(jí)的單分子(individual molecules)進(jìn)行分辨。在特定優(yōu)選方案中，每個(gè)單約束產(chǎn)生的有效觀測(cè)體積允許分析以生理學(xué)相關(guān)的濃度，例如，高于約1微摩爾或者高于50微摩爾甚至高于100微摩爾的濃度存 在的單分子。這種陣列可以包含一個(gè)零模波導(dǎo)(zero-mode waveguide)或其它納米級(jí)光學(xué) 結(jié)構(gòu)。這種光約束陣列還可以包含另外一個(gè)約束陣列，這另外一個(gè)陣列不產(chǎn)生上述的有效 觀測(cè)體積或者不能分辨單分子。例如，這種光約束陣列可結(jié)合或整合到微量滴定板，在多孔 反應(yīng)板上的每個(gè)不同孔中可以設(shè)置了一個(gè)獨(dú)立的光約束陣列。這種光約束陣列可包含至少 約2 X IO5個(gè)光約束，或至少約IO6或至少約IO7個(gè)光約束。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有上述特征的多個(gè)光約束的方法。 該方法包括以下步驟(a)提供基板(substrate)；和(b)形成表面密度超過(guò)每平方毫米 4X IO4個(gè)約束的光約束陣列，其中在每個(gè)單獨(dú)的約束中包含一個(gè)零模波導(dǎo)，該零模波導(dǎo)包 含一個(gè)圍繞芯(core)的包層(cladding)，其中設(shè)置所述包層用于阻止波長(zhǎng)大于截止波長(zhǎng) 的電磁能縱向穿過(guò)零模波導(dǎo)的芯傳播，和(c)用頻率小于截止頻率的電磁輻射照射該陣 列，由此產(chǎn)生了多個(gè)光約束。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生可分辨單分子的光學(xué)觀測(cè)體積的 方法。該方法包括提供一個(gè)零模波導(dǎo)，這個(gè)零模波導(dǎo)包括圍繞芯的包層，其中設(shè)置所述包層 是為了阻止頻率低于截止頻率的電磁能縱向穿過(guò)零模波導(dǎo)的芯傳播，其中在用頻率低于截 止頻率的電磁輻射照射零模波導(dǎo)時(shí)，零模波導(dǎo)就產(chǎn)生了可分辨單分子的有效觀測(cè)體積。在 某些方面，這個(gè)有效觀測(cè)體積小于1納升(10_9升)，小于1皮升，或小于1飛升，優(yōu)選為仄 升的數(shù)量級(jí)。使用本發(fā)明的零模波導(dǎo)，一般可以獲得小于100仄升(100X10-21升)，或小于 50仄升，甚至小于10仄升的有效觀測(cè)體積。在其它方面，該方法產(chǎn)生的有效觀測(cè)體積允許 分辨濃度高于1納摩爾，通常高于100納摩爾，優(yōu)選為微摩爾數(shù)量級(jí)的單分子。在優(yōu)選實(shí)施 方案中，以高于約5微摩爾，高于7. 5微摩爾，甚至高于50微摩爾范圍的濃度存在的單分子 能使用本發(fā)明的方法分辨。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)多分子間相互作用的方法。該方法包括以下步驟(a) 將多分子緊密接近地置于零模波導(dǎo)陣列上，其中陣列中各個(gè)波導(dǎo)相距一個(gè)合適的距離，該 距離足以在用入射波長(zhǎng)照射該陣列時(shí)產(chǎn)生多種衍射級(jí)別的可檢測(cè)的衍射散射強(qiáng)度；(b)以 入射波長(zhǎng)照射零模波導(dǎo)陣列；和(c)檢測(cè)多種衍射級(jí)別的入射波長(zhǎng)衍射散射強(qiáng)度的變化， 從而檢測(cè)多分子間的相互作用。本發(fā)明還提供了一種在用入射波長(zhǎng)照射光約束陣列時(shí)減少衍射散射的方法，其中 此陣列至少包括一個(gè)第一光約束和一個(gè)第二光約束，所述方法包括形成光約束陣列，其中 光約束與第二光約束相距一段距離，使得在入射波長(zhǎng)照射下，在給定角度下由第一光約束 產(chǎn)生的衍射散射強(qiáng)度要小于在沒(méi)有該光約束的情況下用相同入射波長(zhǎng)照射第一光約束產(chǎn) 生的強(qiáng)度。在優(yōu)選方案中，上述光約束是零模波導(dǎo)。本發(fā)明還包括一種使用光約束陣列檢測(cè)生物分析物的方法，該光約束陣列在基板 上的密度超過(guò)每平方毫米4 X IO4個(gè)約束或本文提到的任何其它密度或其等同密度。該方法 一般包括用一入射光束照射陣列中至少一個(gè)懷疑包含分析物的光約束。本發(fā)明還提供了一 種使用光約束陣列來(lái)進(jìn)行多個(gè)化學(xué)反應(yīng)的方法，該光約束陣列在基板上的密度超過(guò)每平方 毫米4X IO4個(gè)約束或本文提到的任何其它密度或其等同密度。該方法包括以下幾個(gè)步驟， 將含有標(biāo)記的反應(yīng)物的多個(gè)反應(yīng)樣品放入陣列中的光約束內(nèi)，其中不同的反應(yīng)樣品放入陣 列中的一個(gè)不同的約束內(nèi)；將陣列置于適合化學(xué)反應(yīng)形成產(chǎn)物的條件下；并用上述光學(xué)系
此外，本發(fā)明還提供了一種對(duì)多種靶核酸分子進(jìn)行測(cè)序的方法。該方法一般包括 以下步驟(a)提供一種在基板上的密度超過(guò)每平方毫米4X IO4個(gè)約束或本文提到的任 何其它密度或其等同密度的光約束陣列，其中所述光約束提供能觀測(cè)單分子的有效觀測(cè)體 積；和與該光約束可操作連接的光學(xué)系統(tǒng)，其檢測(cè)來(lái)自所述約束的有效觀測(cè)體積的信號(hào)； (b)在光約束中混合多種靶核酸分子、互補(bǔ)于靶核酸分子的引物、聚合酶和一種以上類型的 將要摻入新生核苷酸鏈中的核苷酸或核苷酸類似物，每條鏈與各自的靶核酸分子互補(bǔ)；(C) 使步驟(b)中的混合物在適宜通過(guò)模板引導(dǎo)的核苷酸或核苷酸類似物聚合形成新生核苷 酸鏈的條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)；(d)用入射光束照射該光約束；和(e)鑒定摻入每個(gè)新生核苷 酸鏈中的核苷酸或核苷酸類似物。本發(fā)明還提供了一種裝置，其包括在填充分?jǐn)?shù)(fill fraction)大于約0. 0001的 固體載體(support)上的波導(dǎo)陣列，其中所述波導(dǎo)適合容納生物試劑，并且其中所述波導(dǎo) 提供可觀測(cè)所述生物試劑中存在的單分子的有效觀測(cè)體積；和一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，其檢測(cè)所述 波導(dǎo)中的所述單分子，如通過(guò)檢測(cè)來(lái)自有效觀測(cè)體積的信號(hào)。在一個(gè)方面，該陣列的填充分 數(shù)大于約0. 001。在另一方面，該陣列的填充分?jǐn)?shù)大于約0.01，在有些情況下大于0. 1，或處 于約0. 001到約0. 1的范圍內(nèi)。本發(fā)明也提供了多種使用這樣的高填充分?jǐn)?shù)陣列的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了一種檢測(cè)生物分析物的方法。該方法包括任選地捕獲光約束中的分析物，該光 約束是如下產(chǎn)生的(a)提供填充分?jǐn)?shù)高于約0. 0001的波導(dǎo)陣列；和(b)使用入射光束照 射陣列中的至少一個(gè)懷疑包含分析物的波導(dǎo)，從而檢測(cè)分析物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種使用所述高填充分?jǐn)?shù)陣列進(jìn)行涉及多種 反應(yīng)樣品的多個(gè)化學(xué)反應(yīng)的方法。該方法包括(a)提供一個(gè)所述的高填充分?jǐn)?shù)陣列；(b)將 含有標(biāo)記反應(yīng)物的多種反應(yīng)樣品置于陣列中的波導(dǎo)內(nèi)，其中一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)樣品置于陣列 中一個(gè)不同的波導(dǎo)內(nèi)；(c)將該陣列置于適合化學(xué)反應(yīng)形成產(chǎn)物的條件下；和(d)利用光學(xué) 系統(tǒng)檢測(cè)產(chǎn)物的形成。該檢測(cè)步驟包括用入射光束照射不同的波導(dǎo)和檢測(cè)從反應(yīng)樣品中發(fā) 出的光信號(hào)。適用的化學(xué)反應(yīng)包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、核酸_蛋白質(zhì)相互作用和核 酸-核酸相互作用。特別地，本發(fā)明提供了一種使用大于約0.0001的填充分?jǐn)?shù)對(duì)多個(gè)靶核 酸分子進(jìn)行測(cè)序的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用具有高填充分?jǐn)?shù)的陣列對(duì)核酸進(jìn)行測(cè)序的方法。該方 法一般包括(a)提供一個(gè)填充分?jǐn)?shù)大于約0. 0001或0. 001或0. 01或甚至0. 1的波導(dǎo)陣 列；(b)在波導(dǎo)中混合多個(gè)靶核酸分子、互補(bǔ)于靶核酸分子的引物、聚合酶和一種以上類型 的將要摻入到多個(gè)新生核苷酸鏈中的核苷酸或核苷酸類似物，每個(gè)鏈與各自的靶核酸分子 互補(bǔ)；(c)使步驟(b)中的混合物在適合通過(guò)模板引導(dǎo)的核苷酸或核苷酸類似物聚合形成 新生核苷酸鏈的條件下發(fā)生聚合反應(yīng)；(d)使用入射光束照射波導(dǎo)；和(e)鑒定摻入每個(gè)新 生核苷酸鏈中的核苷酸或核苷酸類似物。本發(fā)明也包括一種豐余測(cè)序方法。該方法包括(a)使靶核酸分子在多種類型的 核苷酸或核苷酸類似物和顯示出鏈置換活性的聚合酶的存在下發(fā)生模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng)， 產(chǎn)生與靶核酸分子互補(bǔ)的新生核酸鏈；以及(b)記錄核苷酸或核苷酸類似物摻入到新生核 苷酸鏈中的時(shí)序。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，靶核酸分子是一種環(huán)形核酸，或者是由環(huán)形核
6酸序列合成的線形或環(huán)形模板鏈，從而使合成的鏈包括原環(huán)形鏈的多個(gè)重復(fù)拷貝，然后進(jìn) 行本發(fā)明的測(cè)序操作。在該實(shí)施方案的另一方面，用聚合酶對(duì)靶核酸分子多次測(cè)序，例如一 次以上，或者兩次以上。在該實(shí)施方案的又另一方面，該聚合酶是DNA聚合酶，例如修飾的 或未修飾的Φ 29聚合酶。本發(fā)明還包括一種具有表面的固體載體，其中所述表面上附著有聚合酶陣列，其 中陣列中的成員包括具有鏈置換活性的能單獨(dú)光學(xué)分辨的聚合酶。本發(fā)明還包括一種零模波導(dǎo)，它包括固定在其中的第一分子復(fù)合物，所述分子復(fù) 合物包括與靶核酸復(fù)合的聚合酶，其中所述聚合酶通過(guò)模板依賴的靶核苷酸復(fù)制多次處理 靶核酸中的核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制作顯示最小的入射波長(zhǎng)衍射散射強(qiáng)度的光約束陣列 的方法。該方法包括提供一個(gè)基板；在該基板上形成光約束陣列，使該陣列中的每個(gè)單獨(dú)的 光約束彼此相距的距離小于波長(zhǎng)的一半。最后，本發(fā)明還包括一種制作光約束的方法，該光約束包括圍繞芯的包層，所述方 法包括(a)提供涂覆有光致抗蝕劑層的基板；(b)使所述光致抗蝕劑層形成圖案，以限定 所述芯的邊界；(c)去除圍繞所述限定的邊界的所述光致抗蝕劑層，使得還有足夠量的光 致抗蝕劑占據(jù)所述芯；(d)將一層包層材料沉積到所述保留的光致抗蝕劑和所述基板上； (e)去除至少一部分沉積在所述保留的光致抗蝕劑上的所述包層材料；和(f)去除(e)步 驟的所述光致抗蝕劑，從而形成所述光約束的由所述包層圍繞的所述芯。在一個(gè)方面，所述 光致抗蝕劑為負(fù)性圖案(negative)，并且所述圖案形成步驟使用正性圖案。在另一方面，所 述光致抗蝕劑為正性圖案(positive pattern)，并且所述圖案形成步驟使用負(fù)性圖案。所 述去除步驟可以采用選自蝕刻、機(jī)械拋光、離子研磨和溶劑溶解的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。包層材料層 可以使用熱蒸發(fā)法或蒸汽沉積法來(lái)沉積。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示的是一種示例性光約束陣列的頂視圖，其中零模波導(dǎo)排列成正方形格式。圖2顯示的是一種示例性光約束陣列的頂視圖，其中零模波導(dǎo)排列為非正方形格式。圖3顯示的是一種示例性二維陣列的頂視圖，有一個(gè)示例性的角和兩個(gè)不同的單 位向量長(zhǎng)度。 圖4顯示的是一種示例性ZMW規(guī)則排列的頂視圖。圖5顯示的是多個(gè)陣列組成的陣列，其中子陣列71是超級(jí)陣列72的一部分。圖6顯示的是負(fù)性制造的工藝。圖7顯示與光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)連接的ZMW陣列。圖8顯示通過(guò)正性抗蝕劑(左邊)或負(fù)性抗蝕劑(右邊)制作的ZMW結(jié)構(gòu)的掃描 電子顯微照片。這種多晶膜的顆粒結(jié)構(gòu)在圖像上可見(jiàn)為斑點(diǎn)，ZMW為暗的圓形結(jié)構(gòu)。圖9顯示使用人工預(yù)形成的復(fù)制叉，ZMW中的單分子DNA序列模式識(shí)別。圖10顯示的是與基板105結(jié)合的涂覆的ZMW 101。ZMW包括側(cè)壁102、上表面上的 包膜103和金屬膜104。圖11顯示的是一個(gè)校準(zhǔn)(alignment)策略和光學(xué)設(shè)置。圖12顯示一個(gè)在基板93上由多孔膜91構(gòu)成的備選光約束，92表示膜上的小孔。圖13A和13B顯示的是一個(gè)校準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)及相關(guān)的部件。
圖14顯示的是幾個(gè)示例性的光致切割阻斷劑和用于切割阻斷基團(tuán)的合適的波長(zhǎng)。圖15顯示的是一種示例性的可逆延伸終止子，其中光致切割阻斷劑與可檢測(cè)標(biāo) 記(如熒光標(biāo)記)結(jié)合。圖16顯示的是使用該光約束得到的熒光爆發(fā)譜，其對(duì)應(yīng)于在單分子測(cè)序反應(yīng)中 摻入兩種類型的標(biāo)記核苷酸或核苷酸類似物的時(shí)序。發(fā)明詳述除非另外說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將使用集成電路(IC)加工、生物化學(xué)、化學(xué)、分子 生物學(xué)、基因組學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域的技能。參見(jiàn)，如，Stanley Wolf 等，SILICON PROCESSING FOR THE VLSI ERA, Vols 1-4(Lattice Press) ；Michael Quirk 等，SEMICONDUCTOR MANUFACTURING TECHNOLOGY ；Sambrook, Fritsch 和 Maniatis， MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，第二版(1989) ；METHODS IN ENZYM0L0GY 系列 (Academic Press,Inc.) :PCR 2 :A PRACTICAL APPROACH(M. J. MacPherson，B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)，以上所有在此引用作為參考。定義在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一種”和“一個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式，除非上 下文中有明確的說(shuō)明?！鞍l(fā)光(Luminescence) ”指的是除自身溫度上升以外其它任何原因?qū)е挛镔|(zhì)發(fā)出 光。一般來(lái)說(shuō)，原子或分子當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)移到較低能態(tài)(一般是基態(tài))時(shí)發(fā)出電磁能 的光子(如光)；這個(gè)過(guò)程一般稱為“衰變”。存在多種激發(fā)原因，如果激發(fā)原因是光子，這 個(gè)發(fā)光過(guò)程就被稱為“光致發(fā)光”。如果這個(gè)激發(fā)原因是電子，這個(gè)發(fā)光過(guò)程就被稱為“電 致發(fā)光”。更具體而言，電致發(fā)光是由于直接注入和失去電子而形成電子空穴對(duì)，隨后電子 空穴對(duì)重組發(fā)出光子而引起的。由于化學(xué)反應(yīng)而引起的發(fā)光一般被稱為“化學(xué)發(fā)光”。由活 生物體產(chǎn)生的發(fā)光一般被稱為“生物發(fā)光”。如果光致發(fā)光是由于自旋容許躍遷造成的(如 單態(tài)(singlet)-單態(tài)躍遷，三重態(tài)(triplet)-三重態(tài)躍遷)，這種光致發(fā)光過(guò)程一般被稱 為“熒光”。典型地，熒光發(fā)射在激發(fā)原因消失后就不再持續(xù)了，這是由于通過(guò)這種自旋容許 躍遷可能快速衰減的短暫的激發(fā)態(tài)而造成的。如果光致發(fā)光是由于自旋禁戒躍遷(如三重 態(tài)_單態(tài)躍遷)，這種光致發(fā)光過(guò)程一般被稱為“磷光”。典型地，磷光發(fā)射在激發(fā)原因消失 后仍然持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，這是由于僅通過(guò)自旋禁戒躍遷才會(huì)衰減的長(zhǎng)久激發(fā)態(tài)而造成的。“發(fā) 光標(biāo)記物”或“發(fā)光信號(hào)”可能具有上述任一種特性。術(shù)語(yǔ)“電磁輻射”指的是帶有能量的電磁波，包括，例如，按照頻率升序排列(或按 照波長(zhǎng)降序排列)，紅外輻射、可見(jiàn)光、紫外(UV)光、χ-射線和Y射線。在文中使用的“有效觀測(cè)體積” 一般指的是通過(guò)用于特定用途的檢測(cè)手段可以觀 測(cè)的體積。例如，關(guān)于基于熒光的檢測(cè)，所述體積暴露于激發(fā)輻射，和/或其發(fā)射的輻射被 相鄰的光學(xué)系統(tǒng)/檢測(cè)器采集。例如，關(guān)于用于某些用途的零模波導(dǎo)，激發(fā)輻射傳播到波導(dǎo) 芯內(nèi)確定了有效觀測(cè)體積，特別是，所述體積暴露的光強(qiáng)至少為進(jìn)入波導(dǎo)芯的原激發(fā)輻射 強(qiáng)度的1%，優(yōu)選至少10%。這樣的強(qiáng)度和體積可根據(jù)所述應(yīng)用的特定條件容易地計(jì)算， 包括激發(fā)輻射的波長(zhǎng)和波導(dǎo)芯的尺寸(見(jiàn)，例如美國(guó)專利No. 6,917, 726，此處引用作為參 考)。
“引物”是一種短的多核苷酸，一般具有游離的3’ -OH基，它通過(guò)與靶核酸雜交結(jié) 合到靶樣品中可能存在的靶核酸(或模板)上，隨后促進(jìn)與靶標(biāo)互補(bǔ)的多核苷酸的聚合。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接于”或“可操作地偶聯(lián)于”這兩個(gè)詞在這里可以交互使用。它 們指的是一種并置關(guān)系，其中所述組件的關(guān)系使得它們能夠以預(yù)期的方式執(zhí)行功能。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”通常指的是包含堿基、糖和一個(gè)或更多的陰離子基團(tuán)，優(yōu)選磷酸基 的分子。該分子可以包括一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多的磷酸基團(tuán)和/或其它基團(tuán)如 硫酸基團(tuán)。該術(shù)語(yǔ)還包括核苷酸類似物，核苷酸類似物在結(jié)構(gòu)上和天然核苷酸類似，并且能 夠基本像核苷酸一樣起作用，例如顯示出與DNA或RNA中存在的一個(gè)或多個(gè)堿基的堿基互 補(bǔ)性，和/或能夠在聚合酶的作用下堿基互補(bǔ)地?fù)饺氲秸诤铣傻暮塑账徭溨?。“核苷酸類型”指的是擁有將要檢測(cè)的共同特性的一組核苷酸。例如，核苷酸類型 可以分為四類DNA為Α、Τ、C和G，或者RNA為Α、U、C和G，在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)中使用 的每一類核苷酸用一個(gè)獨(dú)特的標(biāo)記物標(biāo)記以和其它的區(qū)分開(kāi)來(lái)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指的是任意長(zhǎng)度的“核苷酸”的聚合形式。術(shù)語(yǔ)“光約束”指的是用于預(yù)期反應(yīng)的反應(yīng)物被限制在該約束內(nèi)并通過(guò)光學(xué)手段 分析的區(qū)域?！岸嗪塑账崽结槨敝傅氖怯糜谕ㄟ^(guò)雜交反應(yīng)檢測(cè)或鑒定其相應(yīng)的靶多核苷酸的多 核苷酸。術(shù)語(yǔ)“雜交”在用于多核苷酸時(shí)指的是多核苷酸在雜交反應(yīng)中形成復(fù)合物的 能力，該復(fù)合物通過(guò)核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵鍵合而穩(wěn)定化。氫鍵鍵合可以通過(guò) Watson-Crick堿基配對(duì)、Hoogstein結(jié)合作用或其它任何序列特異性的方式發(fā)生。這種復(fù) 合物可以包括形成雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條鏈，形成多鏈復(fù)合物的三條或更多條鏈，自雜交的單條 鏈，或這些結(jié)構(gòu)的任意組合。雜交反應(yīng)可以構(gòu)成更廣泛的過(guò)程中的一步，如PCR反應(yīng)的起 始，或使用核酶對(duì)多核苷酸的酶切。雜交反應(yīng)能在不同“嚴(yán)格性”的條件下進(jìn)行。相關(guān)條件包括溫度、離子強(qiáng)度、溫育 時(shí)間、反應(yīng)混合液中是否存在諸如甲酰胺這樣的其他溶質(zhì)和洗滌步驟。較高嚴(yán)格條件是 這樣的條件，例如較高的溫度和較低的鈉離子濃度，這種條件下需要雜交成分之間具有較 高的最低互補(bǔ)性才能形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。一般來(lái)說(shuō)，低嚴(yán)格雜交反應(yīng)在大約40°C在 IOXSSC中，或在相等離子強(qiáng)度的溶液/溫度下進(jìn)行。中等嚴(yán)格的雜交一般是在6 X SSC中 在約50°C下進(jìn)行的，嚴(yán)格雜交一般是在IxXSSC中在大約60°C下進(jìn)行的。當(dāng)在兩條單鏈多核苷酸之間以反向平行結(jié)構(gòu)發(fā)生雜交時(shí)，這種反應(yīng)被稱為“退 火”，那些多核苷酸被描述為“互補(bǔ)的”。如果雜交能發(fā)生在第一多核苷酸和第二多核苷酸鏈 中的一條之間，則該雙鏈多核苷酸與另一條多核苷酸可以是“互補(bǔ)的”或“同源的”?！盎パa(bǔ) 性”或“同源性”(一個(gè)多核苷酸與另一個(gè)多核苷酸互補(bǔ)的程度)可以根據(jù)公認(rèn)的堿基配對(duì) 原則，根據(jù)相對(duì)鏈中預(yù)期相互形成氫鍵的堿基比例來(lái)確定。本發(fā)明的光約束的結(jié)構(gòu)本發(fā)明的一方面是用于表征分子和/或監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)的光學(xué)裝置和方法的設(shè)計(jì)。 本發(fā)明的光學(xué)裝置允許在生理學(xué)相關(guān)條件下多路分析(multiplexing)大量單分子。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種高密度光約束陣列，其表面密度超過(guò)每平 方毫米4X IO4個(gè)約束，優(yōu)選超過(guò)IO5個(gè)，其中陣列中的單個(gè)約束提供仄升級(jí)別的有效觀測(cè)體
9積。陣列中可包括至少約2X105、至少約106、或至少約IO7個(gè)光約束。優(yōu)選地，陣列中單個(gè) 約束提供小于約1000仄升、更優(yōu)選小于約900仄升、更優(yōu)選小于約80仄升、甚至更優(yōu)選小 于約10仄升的有效觀測(cè)體積。需要時(shí)，能提供小于1仄升的有效觀測(cè)體積。在一個(gè)優(yōu)選方 面，單個(gè)約束產(chǎn)生可分辨以生理學(xué)濃度存在的單分子的有效觀測(cè)體積。對(duì)大多數(shù)生化反應(yīng) 而言，生理學(xué)相關(guān)的濃度是在微摩爾到毫摩爾之間，因?yàn)榻^大多數(shù)酶的米氏常數(shù)就處在這 個(gè)范圍。相應(yīng)的，優(yōu)選的光約束陣列具有能檢測(cè)濃度高于約1微摩爾(μΜ)，或更優(yōu)選高于 50 μ Μ、或者甚至高于100 μ M的單分子的有效觀測(cè)體積。為了達(dá)到在生理相關(guān)條件下進(jìn)行單分子分析所需要的觀測(cè)體積，陣列需包括零 模波導(dǎo)或可替代的納米級(jí)的光學(xué)結(jié)構(gòu)。這種可替代結(jié)構(gòu)包括但不限于具有反射率介質(zhì) (reflective index media)的多孔膜，和使用與反射率相匹配的固體的約束。如同這里所用的，“零模波導(dǎo)”指的是其中大部分入射輻射都衰減了的光波導(dǎo)，優(yōu) 選超過(guò)80 %，更優(yōu)選超過(guò)90 %，甚至更優(yōu)選超過(guò)99 %的入射輻射都衰減了。由于如此高水 平的衰減，波導(dǎo)內(nèi)不存在明顯的電磁輻射傳播模式。結(jié)果在進(jìn)入該波導(dǎo)時(shí)入射電磁輻射的 快速衰減產(chǎn)生了可有效地檢測(cè)單分子的極小的觀測(cè)體積，甚至當(dāng)它們以高達(dá)微摩爾級(jí)的濃 度存在時(shí)依然如此。本發(fā)明的零模波導(dǎo)一般包括一個(gè)圍繞芯的包層(即部分的或全部的)，其中設(shè)置 包層是為了阻止波長(zhǎng)高于截止波長(zhǎng)的電磁能縱向穿過(guò)零模波導(dǎo)的芯進(jìn)行傳播。這種包層一 般使用能防止電磁輻射產(chǎn)生的電磁場(chǎng)顯著穿透的材料制成。適合制造包層的材料包括但不 僅限于合金、金屬、半導(dǎo)體材料及其任意組合。合金包括具有金屬性質(zhì)，但是包含兩種或多 種成分，其中至少有一種成分是金屬的任意物質(zhì)。合金在各種成分-無(wú)論金屬還是非金屬 的_的含量或量上可能不同。優(yōu)選的合金與純成分的材料相比一般改善了某些所需的特 性?？梢酝ㄟ^(guò)使用材料的混合物來(lái)改善的特性包括，耐化學(xué)性、導(dǎo)熱性、導(dǎo)電性、反射性、粒 度、熱膨脹系數(shù)、脆性、耐溫性、傳導(dǎo)性和/或降低包層的粒徑。一般來(lái)說(shuō)，適用于本發(fā)明的合金可包括其中一種成分的比例低至0. 0001%的混合 物。在其它例子中，可能需要高比例的一種以上成分的合金。ZMW的一個(gè)實(shí)施方案是使用鋁 來(lái)作為ZMW結(jié)構(gòu)的包層。作為說(shuō)明合金是如何有益于ZMW結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子，這有益于考慮 不同的鋁合金是怎樣影響ZMW的。在冶金工藝中，很多材料和鋁做成合金。適合和鋁形成 合金的材料的非限制性例子有銻、砷、鈹、鉍、硼、鎘、鈣、碳、鈰、鉻、鈷、銅、鎵、氫、銦、鐵、鉛、 鋰、鎂、錳、汞、鉬、鎳、鈮、磷、硅、釩、鋅等。作為說(shuō)明引入其它成分是如何有利地影響ZMW性 能的一個(gè)例子，眾所周知，在鋁中加入硼能提高鋁的導(dǎo)電性。金屬膜導(dǎo)電性的增加能通過(guò)減 少穿透深度而降低觀測(cè)體積從而提高性能。優(yōu)選的實(shí)施方案包括含有超過(guò)0. 0001%摻雜劑 的鋁合金。更優(yōu)選的實(shí)施方案包括含有超過(guò)0.005%摻雜劑的鋁合金。再更優(yōu)選的實(shí)施方 案包括含有超過(guò)0. 摻雜劑的鋁合金。與之相反，有些材料預(yù)計(jì)降低ZMW結(jié)構(gòu)的性能，在這些情況中，需要采取措施去除 某些雜質(zhì)。例如，在某些應(yīng)用中出于裝置毒性的考慮可能需要降低鉛或砷的含量。該裝置 的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括含砷量小于的金屬膜。該裝置的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包 括含砷量小于0. 的金屬膜。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包括含砷量小于0.001%的金屬膜。 一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包括含砷量小于0.00001%的金屬膜。另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包 括含鉛量小于的金屬膜。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包括含鉛量小于0.1%的金屬膜。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包括含鉛量小于0. 01 %的金屬膜。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包括含鉛量 小于0.001%的金屬膜。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包括含鉛量小于0.00001%的膜。在光約 束的性能非常重要的其它應(yīng)用當(dāng)中，雜質(zhì)往往會(huì)降低其導(dǎo)電性，從而使約束變差，這是不希 望的。例如釩在冶金工藝中被認(rèn)為是降低鋁導(dǎo)電性的。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括含釩量小 于0.1%的金屬膜。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案包括含釩量小于0.01%的金屬膜。一個(gè)更優(yōu)選 的實(shí)施方案包括含釩量小于0. 001%的膜。適合制造包層的半導(dǎo)體材料通常是不透明的，包括硅、硅酸鹽、氮化硅、磷化鎵、砷 化鎵或其任意組合?？梢栽诹隳２▽?dǎo)包層上涂覆材料以提高其表面特性。例如，涂覆能加強(qiáng)包層材料 的耐用性。此外，如果芯內(nèi)包含的反應(yīng)物易與包層材料反應(yīng)或附著，特別需要涂覆。在該領(lǐng) 域內(nèi)有多種多樣的適用的涂覆材料。有一些材料能共價(jià)結(jié)合到表面，其它的則可通過(guò)非共 價(jià)相互作用結(jié)合到表面上。涂覆材料的非限制性例子包括氧化鋁膜，例如二甲基氯硅烷、二 甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷的硅烷化劑，聚馬來(lái)酰亞胺，以及諸如氧化 硅、Aquasil 和Surfasil 的滲硅劑。一個(gè)示例的涂覆的ZMW(IOl)如圖10所示。Z麗(101) 結(jié)合到基板(105)。ZMW包括側(cè)壁(102)、上表面上的涂覆材料(103)和金屬膜(104)。
在某些實(shí)施方案中，使用超過(guò)一種金屬的異質(zhì)金屬組合物制造約束可能會(huì)是有益 的。例如，對(duì)于某些應(yīng)用來(lái)說(shuō)，一種混合物包含一層以上，每層具有每種不同組成，或每層 中的組成不同可能是有益的。這可以有利地影響約束的幾個(gè)方面的性能，包括但不限于光 約束的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和裝置的性能、裝置的表面化學(xué)性質(zhì)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，約束包 含有兩層，其中一層是用于加強(qiáng)第二層和基板的粘著力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包層膜的組 成隨著相對(duì)于約束的軸向位置而不同，從而提供與一層均一組合物不同的光學(xué)性能。在這 個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)特別形式中，該膜包含一種緊靠基板表面的具有較高趨膚深度值(value of skin d印th)的組合物，并且包含另一種遠(yuǎn)離基板表面的具有較低趨膚深度值的組合 物，使得這種約束的特性是在接近表面處形狀更一致，隨著遠(yuǎn)離基板而很快逐漸減少。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，選擇包含約束包層的兩種不同層的厚度，從而在裝置的基板上獲得特定 的光學(xué)條件，例如，相長(zhǎng)干涉和相消干涉。只要能有效阻止電磁輻射的傳播模式，包層圍繞的內(nèi)腔(即芯)可以采用適宜的 大小、形狀或體積。通常芯具有小于截止波長(zhǎng)(λ。)的側(cè)向尺寸。對(duì)于直徑為d、擁有良好 導(dǎo)體包層的圓形波導(dǎo)，λ。大概為1.7Xd。芯的橫斷面可以是環(huán)形、橢圓形、卵形、圓錐形、矩 形、三角形、多面體或其它任何形狀。各種形狀可能特別適用于特定的應(yīng)用。例如，延長(zhǎng)的 橫斷面可用于更好地接近具有機(jī)械持續(xù)性或剛性的分子，例如DNA。從各種縱橫比的拉長(zhǎng)的 狹縫到卵形的范圍中的橫斷面顯著提高持續(xù)性分子對(duì)于結(jié)構(gòu)的檢測(cè)區(qū)的可達(dá)性，且輻射的 軸向衰減沒(méi)有過(guò)度的損失。盡管優(yōu)選均一的橫斷面積，但是需要時(shí)橫斷面積在波導(dǎo)的任意 特定深度可以不同。優(yōu)選的平均橫斷面積是IOOnm2到10，OOOnm2。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，芯是非圓柱形的。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，非圓柱形 芯在上表面上包括一個(gè)開(kāi)口，在完全被包層包裹的下表面上有一個(gè)基底，其中該開(kāi)口的側(cè) 向尺寸較基底窄。這種構(gòu)造顯著限制了反應(yīng)物的擴(kuò)散，由此增加了在觀測(cè)體積中的平均滯 留時(shí)間。該構(gòu)造特別可用于測(cè)量化學(xué)反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)(on-rate)。在另一方案中，芯包 括一個(gè)側(cè)向尺寸較基底寬的開(kāi)口。該構(gòu)造允許較容易地接近大分子，如果零模波導(dǎo)的開(kāi)口端與由于光學(xué)性能原因所需的基底一樣小，那么大分子在進(jìn)入該構(gòu)造時(shí)將產(chǎn)生空間或熵阻 礙。例子包括長(zhǎng)鏈多電解質(zhì)，如DNA分子的可達(dá)性，其承受與進(jìn)入小開(kāi)口相反的熵力。本發(fā)明包括的零模波導(dǎo)具有較高的填充分?jǐn)?shù)比，通常大于0. 0001,優(yōu)選大于 0.001，更優(yōu)選大于0.01，再更優(yōu)選大于0. 1。在此處所用的圖案的“填充分?jǐn)?shù)”是指該圖案 前景(foreground)所占面積與圖案所占總面積(前景和背景(background)之和)之比。 術(shù)語(yǔ)“填充分?jǐn)?shù)比”和“填充分?jǐn)?shù)”兩者可以互換使用。對(duì)于零模波導(dǎo)而言，認(rèn)為前景是零 模波導(dǎo)的芯所占據(jù)的區(qū)域，背景是零模波導(dǎo)之間的區(qū)域(例如，某些設(shè)計(jì)中形成包層的鋁 膜)。具有高填充分?jǐn)?shù)比的零模波導(dǎo)對(duì)于進(jìn)行同質(zhì)分析尤其有用?？梢酝ㄟ^(guò)將陣列中所有 零模波導(dǎo)的總面積加起來(lái)，并且除以總有效面積，包括零模波導(dǎo)以及它們之間的區(qū)域，從而 計(jì)算填充分?jǐn)?shù)。例如，如果一個(gè)零模波導(dǎo)的直徑為50nm，那么該零模波導(dǎo)的面積是7，850nm2 的四分之一，或者說(shuō)是1962. 5nm2。如果這些零模波導(dǎo)位于正方形的陣列中，相距IOOnmJP 么每個(gè)零模波導(dǎo)的總有效面積是10，000平方納米。因此，該陣列的填充分?jǐn)?shù)為78%的四分 之一或是19. 6%，與填充分?jǐn)?shù)為0. 01%級(jí)別的零模波導(dǎo)相比，這種零模波導(dǎo)在表面結(jié)合測(cè) 定中提供高近4個(gè)數(shù)量級(jí)的信號(hào)強(qiáng)度。在生物測(cè)定，例如ELISA和其它的分子結(jié)合生物測(cè)定中，一種限制是不能同質(zhì)地 進(jìn)行操作，或者其中可以將溶液加入混合物中但不去除任何物質(zhì)的模式。這使得高度多 路的測(cè)定變得復(fù)雜，因?yàn)閺拇罅靠字屑尤牒腿コ镔|(zhì)比僅僅添加物質(zhì)顯然更加復(fù)雜。至于 ELISA試驗(yàn)，去除物質(zhì)是必須的，因?yàn)樵谠囼?yàn)結(jié)束時(shí)仍游離在溶液中的熒光(或其它)標(biāo)記 物會(huì)干擾對(duì)反應(yīng)表面結(jié)合的標(biāo)記物的檢測(cè)能力。為了克服這一缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)了利用某些放射 性同位素的窄譜放射性發(fā)射的技術(shù)，但是這些技術(shù)在人員安全和廢物處理方面有其固有的 困難。已經(jīng)設(shè)計(jì)出了其它將測(cè)定的靈敏性限制在表面的技術(shù)，如全內(nèi)反射限制(TIR)和共 焦檢測(cè)。與這些技術(shù)中的任一種相比，零模波導(dǎo)光子結(jié)構(gòu)允許較簡(jiǎn)單的、較便宜的光學(xué)系統(tǒng) 配置，并且在靈敏性限制于表面的方面大大優(yōu)于這兩種技術(shù)。在生物測(cè)定中填充分?jǐn)?shù)很重要，因?yàn)橛行结樏娣e局限于檢測(cè)區(qū)域中零模波導(dǎo)底 部的表面積。這種測(cè)定中能檢測(cè)的信號(hào)量與有效區(qū)面積成正比，零模波導(dǎo)占據(jù)較大比例的 有效表面將增加該種測(cè)定的信號(hào)強(qiáng)度。高填充分?jǐn)?shù)結(jié)構(gòu)通?？梢杂糜谌魏伪砻骒`敏性用 途，并不局限于ELISA方法。截止波長(zhǎng)是這樣一種波長(zhǎng)，高于它的波長(zhǎng)在使用的照射幾何圖形下基本不能沿波 導(dǎo)傳播電磁能。如果給出芯的幾何圖形、包層材料的性質(zhì)以及入射電磁輻射的波長(zhǎng)，本領(lǐng) 域技術(shù)人員通過(guò)解麥克斯韋方程可以容易地推導(dǎo)出截止波長(zhǎng)(參見(jiàn)，如，John D. Jackson, CLASSICAL ELECTRODYNAMICS (經(jīng)典電動(dòng)力學(xué))，第二版，John Willey and Sons)。入射波 長(zhǎng)的選擇取決于使用陣列的特定用途。在有些方案中，入射波長(zhǎng)可以選自大約IOnm到大約 Imm的范圍。檢測(cè)熒光信號(hào)時(shí)，入射波長(zhǎng)一般選自大約380nm到大約SOOnm的范圍。為了 產(chǎn)生所需的觀測(cè)體積，通常采用極化(線性，或優(yōu)選圓極化)和非極化的入射輻射來(lái)照射陣 列。在一項(xiàng)單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種稱為外反射約束(ERC)的可替代的光 約束。與傳統(tǒng)的全內(nèi)反射約束(IRC)不同，低指數(shù)介質(zhì)是電磁輻射的載體，高指數(shù)(且不透 明的)介質(zhì)是反射器。因此其折射率的作用與IRC是相反的。通常ERC需要一定種類的在 不透明相中提供分析物(即待測(cè)分子)的方法。
IRC依賴于入射的電磁輻射在高指數(shù)折射與低指數(shù)折射之間界面上的反射。如果 光的入射角高于全內(nèi)反射的臨界角(本領(lǐng)域公知)，所有入射電磁輻射都被反射，不能傳播 到低指數(shù)相。迅衰輻射的窄區(qū)建立在接近低指數(shù)側(cè)的界面處。這種輻射場(chǎng)典型地是指數(shù)式 衰減場(chǎng)，衰減長(zhǎng)度的范圍為大約IOOnm到大約200nm，取決于入射角和兩相的折射率。如果 低指數(shù)相為含有分析物的溶液，則可以應(yīng)用迅衰輻射檢測(cè)溶液中的分析物，其具有高度的 表面敏感性。在ERC中，電磁輻射的傳播載體是透明的低指數(shù)膜，而承載分析物的介質(zhì)是不透 明的高指數(shù)金屬膜。在該情況下，大部分輻射被反射，而與入射角無(wú)關(guān)，沒(méi)有反射的光根據(jù) 金屬的趨膚深度快速衰減。通常會(huì)采取一些手段轉(zhuǎn)移金屬相中的分析物。這些手段可以利 用在金屬層內(nèi)形成的納米毛細(xì)管的形式。當(dāng)足夠小的時(shí)候，這種納米毛細(xì)管的存在對(duì)能量 在兩種介質(zhì)中的分配影響較小，但是可以大到足以用于傳送活性分子。為了足夠小，金屬膜 的任何缺陷都要小于照射波長(zhǎng)。這一點(diǎn)可以達(dá)到，因?yàn)榭梢?jiàn)光波長(zhǎng)與目的生物分子的典型 大小之間的比例較大。可見(jiàn)光的波長(zhǎng)通常在400nm到750nm之間，目的生物分子的直徑通 常在l-30nm左右?？梢岳媒缑嫣庉椛涞乃p將輻射限制在分析物的極小區(qū)域內(nèi)。在高 指數(shù)基板上指數(shù)匹配(與水)的膜上的小孔可以產(chǎn)生側(cè)向約束，這超過(guò)了在TIR中使用衍 射限制的光學(xué)所可能產(chǎn)生的。原則上，這樣可以產(chǎn)生100仄升的約束。在該方法中，使用全 內(nèi)反射約束形式，其中將與分析物溶液指數(shù)匹配的固體材料加到基板表面上，隨后穿刺出 納米級(jí)小孔。當(dāng)用于TIR模式時(shí)，該結(jié)構(gòu)將提供比單獨(dú)應(yīng)用TIR更多的約束。其它可替代的約束包括指數(shù)匹配的固體。作為一個(gè)說(shuō)明性的例子，這種光約束 的制作開(kāi)始于一個(gè)透明的高指數(shù)基板，如藍(lán)寶石，PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)抗性樹(shù)脂的 200nm旋涂膜。通過(guò)暴露于電子束光刻可以使分離的斑點(diǎn)依照所用圖案成為可溶的。顯影 以后，該裝置在PMMA層有納米級(jí)小孔，由于其與含有分析物的溶液的折射率相似，軸向約 束不受PMMA層的影響，但是倘若側(cè)向限制的程度是由小孔的直徑?jīng)Q定的，則溶液在物理上 被阻止接近除小孔所處區(qū)域之外的表面?？梢酝ㄟ^(guò)能夠在單分子水平上檢測(cè)和/或監(jiān)測(cè)反應(yīng)物之間相互作用的光學(xué)系統(tǒng) 提供光約束。該光學(xué)系統(tǒng)通過(guò)如下步驟完成這些功能首先產(chǎn)生入射波長(zhǎng)并將其傳送到 約束中所含的反應(yīng)物；隨后收集、分析反應(yīng)物發(fā)出的光信號(hào)。通常這種系統(tǒng)采用光具組 (optical train)，將來(lái)自約束陣列的信號(hào)引導(dǎo)到基于陣列的檢測(cè)器的不同位置上，同時(shí)檢 測(cè)來(lái)自多個(gè)不同約束的多個(gè)不同的光信號(hào)。特別地，光具組通常包括光柵和楔形棱鏡，將來(lái) 自陣列中的每個(gè)約束的光譜特征不同的信號(hào)同時(shí)引導(dǎo)和分離到基于陣列的檢測(cè)器上的不 同位置，如CCD。通過(guò)將來(lái)自各個(gè)約束的信號(hào)分別引導(dǎo)到檢測(cè)器上的不同位置，此外將來(lái)自 每個(gè)約束的分量信號(hào)分離到不同的位置，可以同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)約束，以及來(lái)自每個(gè)約束的多 種信號(hào)。適用于本發(fā)明的光學(xué)系統(tǒng)至少包括兩個(gè)組件，也就是一個(gè)激發(fā)源和一個(gè)光子探測(cè) 器。激發(fā)源產(chǎn)生并傳送對(duì)光約束中的反應(yīng)物進(jìn)行光學(xué)激發(fā)的入射光。根據(jù)應(yīng)用目的，入射 光的光源可以是激光、激光二極管、發(fā)光二極管(LED)、紫外線燈泡和/或白光源。如果需 要，可以同時(shí)使用一個(gè)以上的光源。在采用具有不同激發(fā)光譜的多種不同化合物的應(yīng)用中， 尤其需要采用多個(gè)光源，可以同時(shí)檢測(cè)一種以上熒光信號(hào)，追蹤一個(gè)以上或一種類型的分 子的相互作用。在該領(lǐng)域有大量不同的光子探測(cè)器。代表性的檢測(cè)器包括但不局限于光閱讀器、高效光子探測(cè)系統(tǒng)、光敏二極管(例如，雪崩光敏二極管(APD))、照相機(jī)、電荷耦合 器件(CCD)、電子倍增電荷耦合器件(EMCCD)、增強(qiáng)型電荷耦合器件(ICCD)和配備有前面任 一探測(cè)器的共焦顯微鏡。如果需要，光約束陣列可以包括各種校準(zhǔn)輔助裝置或標(biāo)記，以便于 光約束和激發(fā)源、光子探測(cè)器或下面所述的光傳輸組件的適當(dāng)空間放置。本發(fā)明光系統(tǒng)可能還包括具有多種功能的光傳輸組件。首先，它收集和/或引導(dǎo) 入射波長(zhǎng)進(jìn)入含有反應(yīng)物的光約束中。第二，它將光約束中反應(yīng)物發(fā)出的光信號(hào)傳送和/ 或引導(dǎo)到光子探測(cè)器中。第三，它可以選擇和/或改變?nèi)肷洳ㄩL(zhǎng)或反應(yīng)物發(fā)出的波長(zhǎng)的光 學(xué)特性。該種組件的說(shuō)明性例子包括衍射光柵、陣列波導(dǎo)光柵(AWG)、光學(xué)纖維、光開(kāi)關(guān)、 平面鏡、透鏡(包括微透鏡和納米透鏡)、準(zhǔn)直器(collimators)。其它的例子包括光學(xué)衰 減器、偏振濾光片(例如，二向色濾光片)、波長(zhǎng)濾波器(低通、通帶、高通)、波片、延遲線 (delay line)。在一些實(shí)施方案中，光傳輸組件可以是與光約束陣列光連接的平面波導(dǎo)。例 如，平面波導(dǎo)可以與零模波導(dǎo)陣列可操作地連接，將入射波長(zhǎng)直接引導(dǎo)到零模波導(dǎo)的各個(gè) 芯，以使波能的損失降到最低?？梢园ㄆ矫嫱ǖ雷鳛槲挥陉嚵谢宓撞康目刹饐卧?，或可 與基板結(jié)合作為陣列的一個(gè)組成部分。適合用于本發(fā)明的光傳輸組件包括將光以改變或未改變的狀態(tài)從一個(gè)位置引導(dǎo) 到另一個(gè)位置的多種光學(xué)裝置。該種光傳輸裝置的非限制性例子包括光導(dǎo)纖維、衍射光柵、 陣列波導(dǎo)光柵(AWG)、光開(kāi)關(guān)、平面鏡(包括二向色鏡)、透鏡(包括微透鏡和納米透鏡)、準(zhǔn) 直器、濾波器、棱鏡以及其它任何利用適當(dāng)?shù)恼凵渎屎蛶缀涡螤钜龑?dǎo)光線傳播的裝置。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的光約束與光子探測(cè)器可操作地連接。例如，光約 束陣列與相應(yīng)的、單獨(dú)的光子檢測(cè)器可操作地連接。光約束與相應(yīng)的探測(cè)器可以空間對(duì)齊 (例如1 1對(duì)應(yīng))，從而便于采集來(lái)自波導(dǎo)的光信號(hào)。一個(gè)特別優(yōu)選的設(shè)置包括零模波導(dǎo)陣 列，其中每個(gè)波導(dǎo)可以與相應(yīng)的微透鏡或納米透鏡可操作地連接，優(yōu)選對(duì)齊以優(yōu)化信號(hào)收 集效率?；蛘?，在光具組中可以使用物鏡、濾波器組、分辨不同波長(zhǎng)的信號(hào)的棱鏡、和成像透 鏡的組合，將不同光約束中發(fā)出的光信號(hào)引導(dǎo)到陣列檢測(cè)器，例如CCD，并且同時(shí)將每個(gè)不 同約束發(fā)出的信號(hào)分離為對(duì)應(yīng)于每個(gè)約束中發(fā)生的不同反應(yīng)的多種組成信號(hào)單元。圖7示出了一個(gè)示例性的光學(xué)設(shè)置，其中ZMW陣列與一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)可操作地連接。 該系統(tǒng)包括ZMW陣列膜(81)、蓋玻片(82)，光線可以通過(guò)蓋玻片(82)傳播，并且通過(guò)集成 透鏡組(83)聚焦，該透鏡是由具有與玻璃不同于的折射率的材料制成的。具體地，84代表 ZMW結(jié)構(gòu)，85代表經(jīng)集成透鏡如包埋式微透鏡聚焦到ZMW上的光線。圖11示出了一種校準(zhǔn)策略和光學(xué)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括一個(gè)光電探測(cè)器131，一個(gè)任 選的用于收集光線的透鏡132，具有與基板135連接的金屬膜134的ZMW 133，和一個(gè)與入 射光束137對(duì)準(zhǔn)的物鏡136。圖13顯示一種示例性的校準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)及其相關(guān)組件。示例性 的系統(tǒng)13A包括一個(gè)光約束，例如具有與基板114連接的金屬膜113的零模波導(dǎo)111。零模 波導(dǎo)111通常含有信號(hào)發(fā)生分子112，與相關(guān)組件光學(xué)連接，這些組件包括物鏡115、光束分 離器/ 二向色棱鏡117、任選的長(zhǎng)焦透鏡120 (用于無(wú)限遠(yuǎn)校正系統(tǒng))、光電探測(cè)器122 (例 如四象限光電探測(cè)器)。116代表通過(guò)系統(tǒng)傳播的光線。118代表入射照射線。119代表射 向探測(cè)器112的反射光線。圖13B示出了四象限光電二極管的前視圖。圖中央示出了在四 象限探測(cè)器中心上未正確對(duì)準(zhǔn)的光束?？梢酝ㄟ^(guò)處理四個(gè)象限產(chǎn)生的四種電壓，確定光束 和光約束，如ZMW，未正確對(duì)準(zhǔn)的程度和方向。
本發(fā)明陣列在基板表面可以有單行或是多行光約束，其中具有多條路徑，例如通 常至少兩條，更加常見(jiàn)10條以上，或是更加常見(jiàn)100條以上。光約束陣列可以沿基板的X 軸或Y軸水平或?qū)蔷€對(duì)齊。各個(gè)光約束可以在穿過(guò)基板表面或在基板表面上以任意形式 排列，例如成行或是成列排列，從而形成網(wǎng)格，或形成環(huán)形、橢圓形、卵形、圓錐形、矩形、三 角形或是多面體形。為使相鄰光約束之間的最近間距最小，優(yōu)選六邊形陣列?？梢詫⒐饧s束陣列結(jié)合到便于分析、具有高通量或其它優(yōu)點(diǎn)的一種結(jié)構(gòu)中，例如 微量滴定板等。這種設(shè)置在此也被稱為“陣列的陣列”。例如，可以將本發(fā)明陣列組合到另 一個(gè)陣列中，如微量滴定板或多孔板，其中該板的每個(gè)微孔中含有一個(gè)本發(fā)明光約束陣列。 通常，這種多孔板包括多個(gè)反應(yīng)槽或孔，例如，48孔、96孔、384孔或1536孔的形式。在這種 情況下，這些孔通常分別排列在18mm、9mm、4. 5mm或2. 25mm中心上。圖5示出了一種陣列的陣列的例子，其中子陣列71是超級(jí)陣列72的一部分。陣 列還可以以點(diǎn)陣排列。例如，圖4顯示的是一個(gè)說(shuō)明性的ZMW規(guī)則排列的頂視圖。在此構(gòu) 造中有一個(gè)由參數(shù)dl、d2和角53限定的點(diǎn)陣。除了每個(gè)陣點(diǎn)處有一個(gè)ZMW外，還有在一個(gè) 排列中包括多個(gè)ZMW的復(fù)合晶胞，這種排列由一系列角和間距限定，晶胞內(nèi)的每個(gè)組分具 有一個(gè)角和一個(gè)間距。具體來(lái)說(shuō)，52代表第一點(diǎn)陣間距，53代表點(diǎn)陣角，54代表第二點(diǎn)陣間 距，55代表晶胞的第一間距，56代表晶胞的第一角。該圖顯示了包括兩個(gè)組分的晶胞的陣 列，但是晶胞可以有任意多個(gè)組分。如上所述，本發(fā)明陣列包括多個(gè)光約束。在一些實(shí)施案例中，陣列至少有大約 20X 104個(gè)不同的光約束，優(yōu)選至少約20X 106個(gè)不同的約束，更優(yōu)選至少約20X 108個(gè)約 束。在某些實(shí)施方案中，固體表面上點(diǎn)的密度至少為約4X IO4個(gè)約束/mm2，通常至少約 8 X IO4,至少約1. 2 X IO5,或至少約4X IO6個(gè)約束/mm2，但不超過(guò)4X IO12個(gè)約束/mm2，通常 不超過(guò)約4X IOki個(gè)約束/mm2。陣列的總體尺寸通常是，厚度為幾納米到幾毫米，寬或長(zhǎng)為 幾毫米到50厘米。優(yōu)選的陣列具有厚度大概為幾百微米的總體尺寸，根據(jù)所需光約束的數(shù) 量可以具有任意的寬度或長(zhǎng)度。在圖1所示的一個(gè)例子中，光約束例如零模波導(dǎo)陣列為正方形排列。該陣列包括 代表性的零模波導(dǎo)21，它與毗鄰的波導(dǎo)相隔距離“d” (22代表兩個(gè)零模波導(dǎo)之間的距離)。 在圖2所示的另一個(gè)例子中，光約束例如零模波導(dǎo)陣列以非正方形的格式排列。該陣列包 括一個(gè)單獨(dú)性的零模波導(dǎo)31，它與毗鄰的波導(dǎo)的距離為“d”(32代表兩個(gè)零模波導(dǎo)之間的 距離)。圖3顯示另一個(gè)示例性的二維陣列的俯視圖。其中一個(gè)維度上相鄰光約束之間的 距離為“ dl ”，另一個(gè)維度上距離為“ d2 ”，單位向量角為43。可以根據(jù)使用本發(fā)明陣列的特定用途調(diào)整各個(gè)光約束之間的距離。例如，如果目 標(biāo)用途需要暗視野照射陣列，沒(méi)有或者具有低水平的來(lái)自光約束的入射光衍射散射，那么 通常相對(duì)于入射波長(zhǎng)，使各個(gè)約束彼此靠近。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種零模波導(dǎo)陣列，其包括至少一個(gè)第一和至少一個(gè) 第二零模波導(dǎo)，其中第一零模波導(dǎo)與第二零模波導(dǎo)之間有一段距離，便得在用入射波長(zhǎng)照 射時(shí)，以特定角度觀察到的第一零模波導(dǎo)的衍射強(qiáng)度低于在沒(méi)有第二零模波導(dǎo)時(shí)用相同入 射波長(zhǎng)照射第一零模波導(dǎo)時(shí)的衍射強(qiáng)度。如果陣列包括以規(guī)則間隔的點(diǎn)陣排列的零模波 導(dǎo)，其中零模波導(dǎo)與最近的零模波導(dǎo)之間的距離小于入射波長(zhǎng)的一半，則衍射散射可以減 小或明顯消除。在這種方案中，結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為零級(jí)光柵。這些光柵不能散射入射光，盡管其含
15有本身能非常有效地散射的大量組件。這種排列非常適用于某些照明方法，如暗視野照明， 其中表面散射將導(dǎo)致可被物鏡采集到的激發(fā)輻射，從而增加背景噪音。用于照射的波長(zhǎng)范 圍為250nm到8微米，也就是說(shuō)間距小于4000nm的零模波導(dǎo)陣列仍可以按此方式應(yīng)用。在 此方面，間距小于2000nm時(shí)更優(yōu)選，間距小于IOOOnm更優(yōu)選。如果不對(duì)稱地使用照射，或是 將收集錐度定在90度以下，一些間距大于波長(zhǎng)一半的構(gòu)造可能具有相同的優(yōu)點(diǎn)。除了減少 衍射散射的優(yōu)點(diǎn)以外，各個(gè)約束之間的較小間距還減小了照射面積，從而降低了功率需量。相對(duì)于入射波長(zhǎng)而言光約束之間距離較遠(yuǎn)的陣列也有合乎需要的特性。盡管角相 關(guān)的散射增強(qiáng)了背景信號(hào)，不利于某些應(yīng)用，但它提供了一種非常適合于表征描述光約束 的尺寸和形狀的方法。此外還適用于對(duì)分子相互作用進(jìn)行總體的、大量的測(cè)定，尤其是涉及 未標(biāo)記的分子。適于此用途的陣列通常包括多個(gè)光約束，各個(gè)光約束之間的距離大于一倍 入射波波長(zhǎng)，通常為入射波波長(zhǎng)的1. 5倍，但通常不超過(guò)入射波波長(zhǎng)的150倍。試劑盒本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的光約束陣列的試劑盒。本發(fā)明包括的試劑盒包括可以 表征分子和/或在單分子水平上監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)的那些。每個(gè)試劑盒通常包括使這種表征和 /或監(jiān)測(cè)程序成為可能的裝置和試劑。根據(jù)試劑盒的預(yù)期用途，試劑盒的內(nèi)容物和包裝各不 相同。如果用于DNA測(cè)序，試劑盒通常包括(a)光約束陣列，優(yōu)選本發(fā)明的零模波導(dǎo)，其可 以分辨單分子或單分子反應(yīng)，例如濃度大于約1微摩爾的那些分子；(b)測(cè)序試劑，通常包 括聚合酶、含水緩沖液、鹽、引物、核苷酸或核苷酸類似物。需要時(shí)，還可以包括一種已知序 列的“控制”核酸，用于監(jiān)測(cè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性或進(jìn)程。試劑可以以固體形式、固定化形式提供，和/或溶解/懸浮在適于貯存及以后在進(jìn) 行試驗(yàn)時(shí)置換或是添加到反應(yīng)介質(zhì)中的緩沖液中。通常提供適當(dāng)?shù)母鞣N包裝。試劑盒任選 地可以提供在該程序中有用的其他組分。這些任選的組分包括但不限于緩沖液、捕獲劑、 顯影劑、標(biāo)記物、反應(yīng)表面、對(duì)照樣品、說(shuō)明書(shū)和說(shuō)明信息。使用該發(fā)明試劑盒的診斷或預(yù)測(cè) 程序可由臨床實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)生或個(gè)人進(jìn)行。光約束的制備本發(fā)明陣列可以用本發(fā)明提供的納米加工技術(shù)制造，此外還可以采用在集成電路 (IC)和微電子機(jī)械系統(tǒng)(MEMS)領(lǐng)域已知的技術(shù)制作。制造過(guò)程通常包括，選擇陣列基板， 然后用合適的IC加工方法和/或MEMS顯微機(jī)械加工技術(shù)構(gòu)建和集成光約束和其它有關(guān)元 件。陣列基板在一些實(shí)施方案中，光約束陣列位于剛性基板上。在例如涉及具有折射率介質(zhì)的 多孔膜的另一些實(shí)施方案中，可以采用柔性材料。通常，剛性載體不易彎曲。本發(fā)明所用的 不是剛性載體的固體材料的例子包括膜、柔性金屬或塑料膜等等。這樣，在使用陣列的試驗(yàn) 條件下，特別是在高通量處理?xiàng)l件下，本發(fā)明陣列的剛性基板足以為位于其上或是其內(nèi)部 的光約束提供物理支持和結(jié)構(gòu)。其上排布有本發(fā)明陣列圖案的基板根據(jù)陣列的預(yù)期用途可以采用從簡(jiǎn)單到復(fù)雜 的多種構(gòu)造。因此，基板可以具有全部為片狀或是板狀的構(gòu)造，如矩形或圓盤(pán)形構(gòu)造，如在 標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板和顯微鏡載玻片中所見(jiàn)的總體為矩形的構(gòu)造是優(yōu)選的。通常，剛性基板的 厚度至少為約0. 01mm，也可以為Icm或是更厚，但通常不超過(guò)約5cm.。剛性基板的長(zhǎng)度和寬度根據(jù)將要在其上或內(nèi)部制作的光約束陣列的大小而不同。很多種材料可以用來(lái)制作本發(fā)明陣列的基板。制作基板的材料優(yōu)選地可以透過(guò)可 見(jiàn)光和紫外光。合適的材料包括玻璃、半導(dǎo)體(例如，硅酸鹽、硅、硅酸鹽類、氮化硅、二氧化 硅、石英、熔融石英和砷化鎵)、塑料和其它有機(jī)聚合材料。在優(yōu)選的方案中，使用基于硅基 基板如玻璃、石英和熔融石英作為下面的透明基板材料。本發(fā)明陣列的基板至少包括一個(gè)表面，上面安置光約束圖案，該表面可以是光滑 的，或是基本平面的，或是不規(guī)則的，例如具有凹陷或隆起?？梢杂靡粋€(gè)或多個(gè)不同的化合 物層對(duì)表面進(jìn)行修飾，用理想的方式調(diào)節(jié)表面性質(zhì)。目標(biāo)修飾層包括有機(jī)和無(wú)機(jī)層，例如 金屬、金屬氧化物、聚合物、有機(jī)小分子、功能部分如抗生物素蛋白/生物素等等。選擇涂覆 涂層材料的方法取決于所使用的涂覆材料的種類。通常通過(guò)直接將材料涂覆在零模波導(dǎo)表 面，隨后從表面上洗去基質(zhì)多余的未結(jié)合的涂覆涂料，進(jìn)行涂覆。此外，還可以用傳統(tǒng)的技 術(shù)沉積涂覆涂料，如化學(xué)蒸汽淀積(CVD)、濺射、旋涂、原位合成等等。某些涂覆材料可以通 過(guò)加熱、輻射和/或化學(xué)反應(yīng)交聯(lián)到表面上。在優(yōu)選的方案中，通過(guò)共價(jià)反應(yīng)或通過(guò)離子或 疏水/親水相互作用將合適的涂覆材料結(jié)合到基質(zhì)表面。對(duì)于硅基基板，例如，甲硅烷化學(xué) 方法特別適合將涂覆材料共價(jià)連接到表面上，例如偶聯(lián)基團(tuán)、特異性結(jié)合部分等等。這些化 學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，而且不需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)即可實(shí)施。制作程序本發(fā)明陣列基板的制作可以根據(jù)下述方法或IC-加工和/或MEMS顯微機(jī)械加工 的其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于電子束曝光技術(shù)、光刻技術(shù)、化 學(xué)蒸氣或物理蒸氣沉積、干法或濕法蝕刻、離子注入、等離子體蝕刻、壓焊和電鍍術(shù)。其它制 作方法在美國(guó)專利申請(qǐng)公布No. 2003/0174992中有詳細(xì)記述，其內(nèi)容在此引用作為參考。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種負(fù)性制作工藝(negative tone fabrication process)，相比可能產(chǎn)生不同尺寸的光約束的傳統(tǒng)正性制作工藝，該負(fù)性制 作工藝可以產(chǎn)生尺寸更均一并且更一致的光約束。下面的表1中列出了這兩種制作工藝的 比較。表1制作零模波導(dǎo)的正性和負(fù)性加工步驟 在負(fù)性工藝中，將負(fù)性抗蝕劑涂覆到基板上。如果通過(guò)施加某些因素會(huì)使一種抗 蝕劑可溶，則該抗蝕劑是負(fù)性的，對(duì)于光致抗蝕劑或e_束抗蝕劑來(lái)說(shuō)，相應(yīng)的因素分別是 光能或是電子束能。此外，正性抗蝕劑可以與負(fù)性圖案一起使用。負(fù)性圖案的特征是，在 除了光約束例如零模波導(dǎo)的位置以外的所有區(qū)域施加因素，而不同于僅向光約束區(qū)域施 加因素的正性圖像。在每一種情況中，在抗蝕劑顯影之后，抗蝕劑僅存在于光約束預(yù)期所 處的位置。在許多情況中，使用工具獲得這些殘留抗蝕劑特征的下切側(cè)壁剖面(undercutsidewall profile)是有用的。本領(lǐng)域有很多技術(shù)可以獲得下切側(cè)壁，例如，電子束光刻。 例如，當(dāng)應(yīng)用負(fù)性抗蝕劑時(shí)，一種方法是將電子束抗蝕劑層連續(xù)涂覆在表面上，上層膜對(duì)電 子束傳遞給它的能量具有較高的敏感性。因?yàn)殡娮邮袛U(kuò)散的趨勢(shì)，因此上層膜與下層膜 相比有較大的面積不溶，如期望的在上層下方形成一個(gè)懸垂部分。通過(guò)本領(lǐng)域中公知的顯影和適當(dāng)?shù)那逑催^(guò)程，例如等離子體清洗過(guò)程之后，包含 光約束的金屬膜可以通過(guò)幾種方法之一進(jìn)行涂覆，包括金屬蒸發(fā)、分子束外延技術(shù)等等。如 果抗蝕劑剖面如上所述下切，那么沉積在抗蝕劑仍然占據(jù)的區(qū)域中的金屬將留在抗蝕劑頂 部而不是留在裝置表面。隨后通過(guò)任一種技術(shù)將抗蝕劑層去除，包括采用或不采用超聲處 理或其它機(jī)械攪拌的溶劑溶解技術(shù)，活性等離子體蝕刻技術(shù)、蒸發(fā)等。當(dāng)抗蝕劑被去除時(shí)殘 留在抗蝕劑上的金屬被去除(“浮脫”)，同時(shí)直接存留在基板上的抗蝕劑仍然形成光約束 的壁。該工藝的優(yōu)點(diǎn)是光約束的尺寸由抗蝕劑特征決定，并不是取決于活性離子蝕刻圖 案?jìng)鬟f機(jī)制的精確度，該機(jī)制對(duì)于金屬膜，特別是鋁，是高度可變的，鋁是用于這些裝置的 一種理想的金屬。正性工藝具有抗蝕劑特征尺寸的固有的變化以及圖案轉(zhuǎn)移引起的變化， 而負(fù)性工藝僅具有第一種可變性而沒(méi)有第二種。金屬薄膜技術(shù)有更少的側(cè)向變化，因此總 體精確度較好。該方法也不依賴于適當(dāng)蝕刻對(duì)所述金屬的有效性，因此該工藝可應(yīng)用的金 屬比正性工藝有更廣的選擇。圖6是制作零模波導(dǎo)的一種示例性負(fù)性工藝的示意圖。在此工藝中，首先在基板 11上涂覆一層負(fù)性抗蝕劑12。任選地，可以在基板上涂覆第二抗蝕劑層13。將抗蝕劑暴露 于與正性工藝中使用的相同圖案的電子束光刻工具，產(chǎn)生與原來(lái)觀察到的相反的圖案，即 殘留抗蝕劑小柱以及小柱之間的空隙15的循環(huán)陣列之一。通過(guò)在該圖案上涂覆金屬薄層， 如鋁層17，隨后溶解負(fù)性抗蝕劑柱18，產(chǎn)生最終的零模波導(dǎo)結(jié)構(gòu)。因?yàn)樵摴に嚥灰蕾囉阡X 層的厚度或金屬膜的晶體結(jié)構(gòu)或形態(tài)，因此產(chǎn)生非常一致的構(gòu)造，并且在臨界特征尺寸上 提供更精細(xì)的控制。圖8示出了用正性抗蝕劑(左圖)或負(fù)性抗蝕劑(右圖)制作的ZMW 結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微照片。多晶膜的顆粒結(jié)構(gòu)在圖像上可見(jiàn)為斑點(diǎn)，ZMW為暗的圓形結(jié)構(gòu)。一種負(fù)性工藝變型被稱為納米澆鑄。除了不用雙層抗蝕劑以外，納米澆鑄的制作 步驟相似。該工藝首先是在基板表面沉積抗蝕劑(該例子中用的是單層抗蝕劑)。隨后是 電子束曝光和顯影，曝光圖案上的每一個(gè)點(diǎn)形成一個(gè)圓柱體。該工藝中，理想的是使金屬沉 積技術(shù)既可以將材料涂覆在抗蝕劑結(jié)構(gòu)的頂面，又可以涂覆在抗蝕劑結(jié)構(gòu)的側(cè)壁。該工藝 是三維的，因?yàn)槿S抗蝕劑結(jié)構(gòu)外表面的復(fù)制陰模(negative replica)在構(gòu)成光約束壁的 金屬膜的內(nèi)表面再現(xiàn)。在這種情況下，下切(undercut)抗蝕劑剖面和其各種產(chǎn)生方法都不 是必要的，因?yàn)樵谪?fù)性工藝中，它們特別用來(lái)防止沉積的膜與抗蝕劑結(jié)構(gòu)的側(cè)面接觸。在納 米澆鑄方法中，沉積的膜準(zhǔn)確地再現(xiàn)抗蝕劑的外表面，所以只在需要非圓柱狀約束時(shí)使用 下切圖形。在納米澆鑄的操作中，一般要小心地把金屬?gòu)募{米澆鑄“母版”(抗蝕劑結(jié)構(gòu))上 除去，這種抗蝕劑結(jié)構(gòu)在一些實(shí)例中可能完全埋藏而無(wú)法除去。然而，這可以用許多方法補(bǔ) 救。當(dāng)沉積技術(shù)在沉積中具有高度的各向異性時(shí)(例如金屬蒸發(fā))，側(cè)壁在靠近抗蝕 劑結(jié)構(gòu)的頂端將會(huì)非常薄，在一些實(shí)例中可能是圓柱形柱。這個(gè)弱點(diǎn)能夠?qū)е陆饘僦苯悠屏?，從而使金屬?gòu)目刮g劑結(jié)構(gòu)上因而從ZMW位置上去除?？梢岳靡环N溶液相或等離子體 的各向同性蝕刻使膜進(jìn)一步變薄直到這個(gè)弱點(diǎn)被分離，達(dá)到相同的效果。如果金屬沉積步 驟有著程度較低的各向異性(例如濺射或者電鍍)，則可以通過(guò)化學(xué)機(jī)械拋光或者離子碾 磨使抗蝕劑材料暴露。在除去抗蝕劑結(jié)構(gòu)上的金屬帽的同時(shí)或是之后，通過(guò)溶劑溶解或活性離子蝕刻除 去抗蝕劑材料。如果應(yīng)用適當(dāng)?shù)膱D案并正確選擇其他參數(shù)，就能完成制造步驟。本發(fā)明光約束和其他裝置的使用本發(fā)明裝置，包括光約束和聯(lián)合的光學(xué)系統(tǒng)，為分析分子和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)提 供了一種有效的方法。本發(fā)明裝置和檢測(cè)/監(jiān)測(cè)方法可以應(yīng)用于多個(gè)方面，包括用于診斷 和研究應(yīng)用的生物化學(xué)反應(yīng)和生物反應(yīng)分析。在特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明適用于說(shuō)明關(guān)于 研究應(yīng)用的核酸序列，尤其是作為預(yù)防醫(yī)學(xué)一部分的人類個(gè)體基因組測(cè)序，基因型-表型 相關(guān)性的快速假設(shè)檢驗(yàn)，多細(xì)胞生物發(fā)育各個(gè)階段的體外和原位基因表達(dá)模式分析，確定 個(gè)體克隆的廣泛突變組和多種疾病或疾病狀態(tài)。其他應(yīng)用包括測(cè)定酶動(dòng)力學(xué)，鑒別靶分子 與靶分子的候補(bǔ)調(diào)切劑之間的特異性相互作用。更進(jìn)一步的應(yīng)用包括描述細(xì)胞受體多樣 性，鑒別已知的和新的病原體，為農(nóng)業(yè)、環(huán)境和治療目的研究多樣性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明裝置和方法允許進(jìn)行高通量單分子分析。單分子分析 為研究生物學(xué)事件提供了幾個(gè)令人注目的優(yōu)于傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)。首先，這種分析提供單分 子的信息，而該分子的特性隱藏在那些通過(guò)普通總體測(cè)量技術(shù)記錄的統(tǒng)計(jì)學(xué)平均信息中。 另外，由于這種分析可以多路進(jìn)行，它有助于高通量的完成，只需要少量試劑，利用高帶寬 的光學(xué)系統(tǒng)如現(xiàn)代雪崩光敏二極管進(jìn)行快速數(shù)據(jù)收集。此外，由于單分子計(jì)數(shù)自動(dòng)產(chǎn)生一 定程度的抗照射性和光收集波動(dòng)，因此單分子分析在測(cè)量物質(zhì)量上比本體熒光或者光散射 技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確度。這樣，單分子分析大大地提高了基因分型、基因表達(dá)模式分析、DNA 測(cè)序、核苷酸多態(tài)性檢測(cè)、病原體檢測(cè)、蛋白質(zhì)表達(dá)模式分析和藥物篩選的效率和準(zhǔn)確度。單分子測(cè)序本發(fā)明裝置，包括不同形式的光約束和聯(lián)合的光學(xué)系統(tǒng)，尤其適合多路單分子測(cè) 序。因此，本發(fā)明提供了一種對(duì)多種靶核酸同時(shí)測(cè)序的方法。該方法一般包括(a)提供本 發(fā)明光約束的陣列；(b)在約束中混合多種靶核酸分子、與靶核酸分子互補(bǔ)的引物、聚合酶 和超過(guò)一種類型的將要摻入到多條與相應(yīng)靶核酸分子互補(bǔ)的新生核苷酸鏈內(nèi)的核苷酸或 核苷酸類似物；(c)使混合物在適合通過(guò)模板引導(dǎo)的聚合作用形成新生核苷酸鏈的條件下 發(fā)生聚合反應(yīng)；(d)用入射光束照射波導(dǎo)；和(e)鑒別摻入到每條新生核苷酸鏈內(nèi)的核苷酸 或者核苷酸類似物。本發(fā)明測(cè)序方法可用于測(cè)定任何核酸分子的核酸，包括雙鏈或單鏈的、線性的或 環(huán)狀的核酸(如環(huán)狀DNA)、單鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)、DNA/RNA雜合體、具有聚合酶識(shí)別位點(diǎn)的 RNA或RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的方法適用于復(fù)雜核酸結(jié)構(gòu)的測(cè)序，如5’或3’非翻譯序列、 串聯(lián)重復(fù)片段、外顯子或內(nèi)含子、染色體片段、整個(gè)染色體或者基因組。一方面，對(duì)核酸單分子確定在聚合反應(yīng)期間加入堿基的時(shí)間順序。這個(gè)確定步驟 發(fā)生時(shí)在光約束中發(fā)生模板引導(dǎo)的引物延長(zhǎng)或者聚合反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單 分子測(cè)序在均相測(cè)定中進(jìn)行，不需要在每個(gè)堿基添加事件后轉(zhuǎn)移、分離或洗去任何反應(yīng)物 或副產(chǎn)物(如從核苷酸上切下的熒光團(tuán))。在均相測(cè)定法的某些方面，單分子測(cè)序的進(jìn)行無(wú)需在讀取下一個(gè)堿基序列之前向混合物中加入反應(yīng)物。在這個(gè)測(cè)定中，逐步加入核苷酸 或者在每個(gè)堿基添加事件后除去副產(chǎn)物都不是必需的，因?yàn)楣饧s束上大量試劑的反應(yīng)物的 擴(kuò)散不會(huì)干擾摻入的檢測(cè)。序列信息隨著聚合酶不斷將合適的核苷酸或者核苷酸類似物加 入到新生DNA鏈中而不斷地產(chǎn)生。關(guān)于這種單分子測(cè)序的詳細(xì)論述參見(jiàn)如公開(kāi)的美國(guó)專 利申請(qǐng)第2003/0044781號(hào)，此處引用全部作為參考，M. J. Levene, J. Korlach, Sff. Turner, Μ.Foquet, H. G. Craighead, W.W.Webb, SCIENCE 299 682-686,2003. 1，Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations (用于高濃度單分 子分析的零模波導(dǎo))。沒(méi)有同步化損耗，因?yàn)閭€(gè)單分子被分別觀測(cè)。該方法也能使直接來(lái)自 生物樣品的靶核酸分子得到利用，使能夠進(jìn)行測(cè)序之前對(duì)靶核酸的克隆、亞克隆或擴(kuò)增的 需要最小化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將聚合酶錨定在光約束內(nèi)的有效觀測(cè)體積內(nèi)。在觀測(cè) 該體積的同時(shí)，利用例如用于脫保護(hù)等的，能夠無(wú)中斷地連續(xù)摻入生長(zhǎng)鏈內(nèi)的標(biāo)記核苷酸 類似物，進(jìn)行依賴模板的互補(bǔ)鏈合成。在優(yōu)選的方面，在該方法中使用如下的核苷酸類似 物，其在非摻入的磷酸基或衍生物如核苷酸多聚磷酸的β、Y、δ等上帶有標(biāo)記，該標(biāo)記在 摻入過(guò)程中從該類似物上切下。這種核苷酸類似物的優(yōu)點(diǎn)在于能夠連續(xù)摻入到生成生長(zhǎng)核 酸鏈中，并且在摻入過(guò)程中除去它們的標(biāo)記基團(tuán)，從而不增大合成過(guò)程中的信號(hào)噪音，而如 果這些標(biāo)記物仍然與合成鏈結(jié)合，則將會(huì)導(dǎo)致這種增大的信號(hào)噪音。另外，由于摻入事件導(dǎo) 致觀測(cè)體積內(nèi)標(biāo)記類似物的存在延長(zhǎng)(與觀測(cè)體積內(nèi)非摻入的類似物的隨機(jī)擴(kuò)散相比)， 與摻入有關(guān)的信號(hào)是很容易識(shí)別的。在特別優(yōu)選的方面，單分子核酸測(cè)序應(yīng)用使用一種模 板核酸，從而對(duì)特定目標(biāo)序列段的串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行多次或反復(fù)的讀取/合成。特別地，本 發(fā)明系統(tǒng)一般用多種方法提供豐余性，以校正用聚合酶在模板依賴的合成中可能產(chǎn)生的任 何錯(cuò)誤。例如，由于本發(fā)明方法集中在單分子上，采用豐余過(guò)程確保由聚合酶引起的錯(cuò)摻事 件在數(shù)據(jù)分析時(shí)被校正。第一方面，這種豐余性通過(guò)利用多種不同的應(yīng)用于特定目標(biāo)序列的約束陣列來(lái)提 供，如在多孔板的一個(gè)孔中。除了這種豐余性之外，本發(fā)明也提供在一個(gè)約束中對(duì)特定序列 段(或者它的拷貝)多次反復(fù)測(cè)序。在第一優(yōu)選方面，這樣的反復(fù)測(cè)序可能通過(guò)以環(huán)狀模 板形式提供目標(biāo)序列段來(lái)完成，因此聚合酶在環(huán)形模板周圍多次處理(允許說(shuō)明這種模板 的序列)。核苷酸片段環(huán)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，依據(jù)本發(fā)明能夠容易地應(yīng)用于模 板序列。另一方面，通過(guò)利用具有目標(biāo)序列段的模板依賴的環(huán)狀模板獲得類似的結(jié)果。尤 其是這種合成產(chǎn)物一般包括一條線性鏈、環(huán)狀模板的多個(gè)拷貝，并且，提供目標(biāo)序列段的反 復(fù)測(cè)序。更進(jìn)一步地說(shuō)，豐余性是通過(guò)環(huán)化這種線性、多拷貝模板并對(duì)多拷貝多次反復(fù)測(cè)序 而完成的。另一方面，通過(guò)連環(huán)化以單分子擴(kuò)增策略產(chǎn)生的擴(kuò)增子獲得類似的結(jié)果，基中一 些策略是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些策略可以利用稀釋達(dá)到單分子水平，或者在擴(kuò)增過(guò) 程中在雙相乳液中從小微囊中分離出分子。連環(huán)化的鏈隨后作為單個(gè)模板被測(cè)序，以這種 方式從單分子產(chǎn)生豐余信息。 在另一方面，通過(guò)利用一個(gè)長(zhǎng)的在沿著它的多個(gè)位置處有切口和/或缺口的雙鏈 模板獲得類似的結(jié)果。這個(gè)分子然后能在沿著鏈的幾個(gè)位點(diǎn)處開(kāi)始單分子測(cè)序，每個(gè)位點(diǎn)
21包含一個(gè)能獨(dú)立對(duì)鏈測(cè)序的約束。因?yàn)橛袔讉€(gè)約束作用于相同的鏈，結(jié)果就是相同的模板 被測(cè)序若干次從而得到來(lái)自一個(gè)單分子的豐余信息。示例性的實(shí)驗(yàn)裝置在實(shí)施本發(fā)明的測(cè)序方法中，將包含靶核酸、與靶核酸互補(bǔ)的引物、聚合酶和一種 以上類型的核苷酸或者核苷酸類似物的反應(yīng)混合物加到光約束陣列上。優(yōu)選地每個(gè)光約束 只接收一個(gè)待測(cè)序的靶核酸分子。它可以通過(guò)在大量包含測(cè)序過(guò)程需要的其他反應(yīng)物的溶 液中稀釋微量靶核酸來(lái)完成?？商娲模溟_(kāi)口的側(cè)向尺寸比底部窄的非圓柱形波導(dǎo)可以 用于限制多種靶核酸的進(jìn)入。靶核酸或聚合酶在光約束上的固定可以通過(guò)許多方法把靶核酸固定在光約束的內(nèi)面。例如，通過(guò)附著⑴弓丨物或(2) 單鏈靶核酸或(3)雙鏈或者部分雙鏈靶核酸分子，可以將靶核酸固定在光約束上。此后，或 是(1)靶核酸分子與附著的寡核苷酸引物雜交，(2)寡核苷酸引物與固定化的靶核酸分子 雜交形成引物靶核酸分子復(fù)合物，或者(3)在雙鏈或部分雙鏈靶核酸上產(chǎn)生聚合酶識(shí)別位 點(diǎn)(例如，通過(guò)諸如引發(fā)酶的輔助蛋白的相互作用)。引物靶核酸分子復(fù)合物上的核酸聚合 酶在適合沿著靶核酸分子移動(dòng)并且在聚合位點(diǎn)處使寡核苷酸引物延長(zhǎng)的位置上提供。在優(yōu)選的方面，如先前所描述的那樣，聚合酶首先附著到本光約束的表面上該約 束的有效觀測(cè)體積內(nèi)，在適合靶核酸分子復(fù)合物相對(duì)于聚合酶移動(dòng)的位置處。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道有許多方法可以使核酸和酶固定在光約束上，不論是共價(jià)的 還是非共價(jià)的，通過(guò)連接部分或者將它們限定到一個(gè)固定的部分。這些方法是固相合成和 微陣列領(lǐng)域眾所周知的(Beier等，Nucleic Acids Res. 27 1970-1-977 (1999))。用于將核 酸或聚合酶連接到固體載體上的結(jié)合部分的非限制性例子包括鏈霉抗生物素蛋白或抗生 物素蛋白/生物素連接、氨基甲酸酯鍵、酯鍵、酰胺、硫脂、(N)-官能化的硫脲、官能化的順 丁烯二酰亞胺、氨基、二硫化物、酰胺、腙鍵等等。特異性結(jié)合靶核酸或聚合酶的抗體也可以 作為結(jié)合部分。另外，利用本領(lǐng)域公知的方法甲硅烷基部分可以使核酸直接連接到諸如玻 璃的基板上。我們所期望的是，聚合酶可以經(jīng)過(guò)修飾包含一個(gè)或多個(gè)表位如Myc、HA(來(lái)自流感 病毒血凝素)、多組氨酸和/或FLAG，它們的特異性抗體可以在商業(yè)上獲得。另外，聚合酶 經(jīng)修飾可包含異源結(jié)構(gòu)域如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、特異性結(jié)合 肽區(qū)(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利5，723，584，5，874，239和5，932，433)或者免疫球蛋白的Fc部 分。上述區(qū)域各自的結(jié)合劑即谷胱甘肽、麥芽糖和抗免疫球蛋白Fc部分的抗體是可以獲得 的，并且可以用于涂覆本發(fā)明的光約束的表面。采用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)化學(xué)技術(shù)可以將它們固定的聚合酶或核酸的結(jié)合部 分或試劑加至載體上。一般來(lái)說(shuō)，這些操作包括載體的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)表面修飾，載體在不同溫度 水平及在包含結(jié)合部分或試劑的不同介質(zhì)中的溫育，以及隨后可能的洗滌和清潔步驟。反應(yīng)混合物標(biāo)記的核苷酸、聚合酶和引物根據(jù)單分子測(cè)序法利用的各種類型的核苷酸與可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)，以便于光子探 測(cè)器能夠檢測(cè)和辨別它們?cè)诒景l(fā)明光約束中的存在。優(yōu)選的標(biāo)記物是發(fā)光標(biāo)記物，尤其是 熒光標(biāo)記物或生色標(biāo)記物。在本領(lǐng)域中已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多種在核苷酸中作為可檢測(cè)標(biāo)記物使用的官能團(tuán)。表
220144]
0145]
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
1列舉了很多這種官能團(tuán)的例子。其余的例子參見(jiàn)美國(guó)專利第6，399，335號(hào)、公布的美國(guó) 專利申請(qǐng)第2003/0124576號(hào)，以及名為“熒光探針和標(biāo)記技術(shù)(A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)，第十片反，，(2005)白勺手冊(cè)(可從 Invitrogen，Inc.，/ Molecular Probes獲得)，均在此處引用作為參考。 0143] 表 1
可檢測(cè)標(biāo)記官能團(tuán)示例 4-氨基苯酚 6-氨基萘酚 6-硝基萘酚 6_氯萘酚 6-溴萘酚
6-碘萘酚. 4，4’ - 二羥基聯(lián)苯基
8-羥基喹啉 3-羥基吡啶
7-羥基香豆素
9-羥基異吩噻唑
8-羥基芘
9-羥基蒽 6-硝基-9-羥基蒽 3-羥基黃酮
6-甲基萘酚螢光素 6_甲氧基萘酚3-羥基苯并黃酮 0161] 利用這些或者其他本領(lǐng)域公知的合適的官能團(tuán)，可以產(chǎn)生適合本測(cè)序方法的多種 熒光團(tuán)。它們包括但不限于4-乙酰胺基-4’-異硫氰酸芪-2，2’_ 二磺酸、吖啶及其衍生物 如吖啶和吖啶異硫氰酸酯、5-(2’_氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4_氨基-氮-[3-乙 烯砜基/苯基]萘酰亞胺-3，5-二磺酸脂(熒光黃VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)順丁烯 二酰亞胺、鄰氨基苯甲酸、亮黃、香豆素及其衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC， 香豆素120)、7_氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆?jié)M151)；焰紅染料(cyanosine) ；4，，6-二 脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ；5，，5”_ 二溴鄰苯三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7-二乙氨 基-3-(4，-異硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二亞乙基三胺五乙酸；4，4，- 二異硫氰酸二 氫-芪-2，2’ - 二磺酸；4，4’ - 二異硫氰酸芪_2，2' - 二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰 氯(DNS，丹酰氯)；4-(4’ - 二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL) ；4-二甲氨基苯偶氮基苯 基-4’ -異硫氰酸酯(DABITC)；曙紅及其衍生物如曙紅異硫氰酸酯；赤蘚紅及其衍生物如 赤蘚紅B及赤蘚紅異硫氰酸酯；乙啡啶；熒光素及其衍生物如5-羧基熒光素(FAM)、5-(4， 6_ 二氯三嗪-2-基)氨基熒光素(DTAF)、2，，7，- 二甲氧基_4，，5，- 二氯_6_羧基熒光素 (J0E)、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)和QFITC(XRITC)；熒光胺；IR144 ；IR1446 ；異硫氰 酸孔雀綠；4-甲基傘形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚紅；B-藻紅蛋白；鄰苯二 醛；芘及其衍生物如芘、芘丁酸酯及琥珀酰亞氨基-1-芘丁酸酯；活性紅4(CibaCr0n. RTM. 亮紅3B-A)；羅丹明及其衍生物如6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6_羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺
4_硝基苯酚 4-甲基酚 4-甲氧基酚 4_氯苯酚 4-溴苯酚 4-碘苯酚 4_硝基萘酚 4-氨基萘酚 4-甲基萘酚 4-甲氧基萘酚 4_氯萘酚 4-溴萘酚
0158]4-碘萘酚
0159]
0160]
23羅丹明B、磺酰氯羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸酯、磺酰羅丹明 B、磺酰羅丹明101和磺酰羅丹明101的磺酰氯衍生物(德克薩斯紅)；N，N，N’，N’ -四甲 基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；四甲基羅丹明；四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)；核黃素；玫 紅酸和鋱螯合衍生物。其他能應(yīng)用于本發(fā)明測(cè)序方法的熒光團(tuán)在美國(guó)專利第5，866，366號(hào) 和WO 01/16375中公開(kāi)，這兩項(xiàng)在此處引用作為參考。標(biāo)記物可以連接到磷酸主鏈的堿基、核糖單位或其組合上。優(yōu)選的標(biāo)記物是基本 上不會(huì)妨礙在測(cè)序反應(yīng)中連續(xù)添加核苷酸的那些。這樣的標(biāo)記物包括與α磷酸、β磷酸、 末端磷酸、或者在四、五或六磷酸核苷酸中的δ或更遠(yuǎn)端磷酸、或者核苷酸的堿基單位連 接的那些。包含標(biāo)記末端磷酸(如dNTP中的Y磷酸)的核苷酸是特別優(yōu)選的，因?yàn)樵跍y(cè)序 過(guò)程中不需要其他的方法來(lái)除去標(biāo)記物。在核酸聚合過(guò)程中，核苷酸的α和β磷酸之間 發(fā)生鍵斷裂，導(dǎo)致β和末端磷酸(如dNTP的γ磷酸)從聚合位點(diǎn)釋放出來(lái)。這樣，核苷 酸一旦摻入，連接到末端磷酸上的標(biāo)記物就從新生鏈上分離出來(lái)。一般而言，末端磷酸連接 的核苷酸可能包含三個(gè)或者更多磷酸，一般是大約3到6個(gè)磷酸，優(yōu)選大約3到大約5個(gè)磷 酸。表1列舉了許多帶有標(biāo)記末端磷酸的核苷酸的例子。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了其他許多末端磷酸連 接的核苷酸，并且在美國(guó)專利申請(qǐng)第2003/0124576號(hào)中有詳述，此處引用作為參考。
0164]表20165]腺苷-5，-(Y-乙〖-硝基苯基)三磷酸0166]鳥(niǎo)苷-5，-(Y-乙〖-硝基苯基)三磷酸0167]胞苷-5，-(Y-乙〖-硝基苯基)三磷酸0168]胸苷-5，-(Y-乙〖-硝基苯基)三磷酸0169]尿嘧啶_-5，-(Y-4-硝基苯基)三磷酸0170]3，- ft氮基_3’-脫氧胸苷-5’ "(Y-4-0171]3，- ft氮基_2’，3’ - 二脫氧胸苷-5’ -0172]2，，3’二脫氫-2’，3’ - 二脫氧胸苷-50173]腺苷-5，-(Y-乙〖-氨基苯基)三磷酸0174]腺苷-5，-(Y-乙〖-甲基苯基)三磷酸0175]腺苷-5，-(Y-乙〖-甲氧基苯基)三磷酸0176]腺苷-5，-(Y-乙〖-氯苯基)三磷酸0177]腺苷-5，-(Y-乙〖-溴苯基)三磷酸0178]腺苷-5，-(Y-乙〖-碘苯基)三磷酸0179]腺苷-5，-(Y-乙〖-硝基萘基)三磷酸0180]腺苷-5，-(Y-乙〖-氨基萘基)三磷酸0181]腺苷-5，-(Y-乙〖-甲基萘基)三磷酸0182]腺苷-5，-(Y-乙〖-甲氧基萘基)三磷酸0183]腺苷-5，-(Y-乙〖-氯萘基)三磷酸0184]腺苷-5，-(Y-乙〖-溴萘基)三磷酸0185]腺苷-5，-(Y-^〖-碘萘基)三磷酸0186]腺苷-5，-(Y-6-甲基萘基)三磷酸
3粦酸
3粦酸
腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷腺苷也可以使用包含修飾的磷酸主鏈的核苷酸。例如，修飾成分可以磷酰二胺、甲基膦 酸酯、烷基磷酸三酯、甲?？s醛(formacetal)、二硫代磷酸酯、一硫代磷酸酯、硫代磷酰胺、 氨基磷酸酯或它們的類似物。在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的核苷酸或核苷酸類似物是包含可逆阻斷基的可 逆延伸終止子。在一些實(shí)施方案中，可逆延伸終止子上的可逆阻斷基與可檢測(cè)標(biāo)記物相連 接。在其他實(shí)施方案中，阻斷基和可檢測(cè)標(biāo)記物位于核苷酸上的不同位點(diǎn)。還有一些實(shí)施 方案中，阻斷基本身也是標(biāo)記物。一個(gè)用作說(shuō)明的可逆延伸終止子包含3’端的標(biāo)記核糖單位。在核糖單位上的每一 個(gè)標(biāo)記物一般充當(dāng)可逆阻斷基，在聚合反應(yīng)時(shí)下一個(gè)核苷酸加入事件發(fā)生前必須被除去。 優(yōu)選的3’ -核糖標(biāo)記物包含暴露在適當(dāng)波長(zhǎng)的光束下能夠被脫保護(hù)的光致除去的官能團(tuán)。在另外一個(gè)實(shí)例中，可逆阻斷基位于核苷酸核糖單位的2’或4’位置處。然而在 另外一些實(shí)施方案中，可逆阻斷基是與核苷酸的堿基(腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤 或尿嘧啶)相連接或結(jié)合的?？赡孀钄嗷绕涫枪庵虑懈钭钄嗷姆窍拗菩岳影ǖ?不限于那些圖14和圖15所示的及序列號(hào)為60/649，009的未決的申請(qǐng)中描述的分子，該申 請(qǐng)?jiān)诖颂幰米鳛閰⒖?。用于切割光致切割阻斷基的波長(zhǎng)依賴于阻斷基的選擇。波長(zhǎng)可能在大約320nm到 大約SOOnm之間。在一些實(shí)施方案中，用于切割阻斷基的波長(zhǎng)與用來(lái)檢測(cè)標(biāo)記物的波長(zhǎng)差 不多相同。在另一些實(shí)施方案中，用于切割阻斷基的波長(zhǎng)與用來(lái)檢測(cè)標(biāo)記物的波長(zhǎng)是不同 的。在一些實(shí)施方案中，使用基本上不含未標(biāo)記核苷酸的標(biāo)記核苷酸混合物是有利
-5，-(γ-6-甲氧基萘基)三磷酸
-5，- (Y-6-氨基萘基)三磷酸
-5，- (Y-6-硝基萘基)三磷酸
-5，-(Y-6-氯萘基)三磷酸
-5，- (Y-6-溴萘基)三磷酸
-5，- (Y-6-碘萘基)三磷酸
-5，-(Y _4，-羥基聯(lián)苯基)三磷酸
-5，- (γ-8-喹啉基)三磷酸
-5' - (Y-3-吡啶基)三磷酸
-5，-(Y-傘形酮)三磷酸
-5，-(Y-試鹵靈)三磷酸
-5，-(Y-芘)三磷酸
-5，-(γ-蒽)三磷酸
-5，- (Y-6-硝基蒽)三磷酸
-5，-(Y-黃酮基)三磷酸
-5，-(Y-熒光素)三磷酸
-5，-(Y-苯并黃酮)三磷酸
-5，- ( γ - (4-硝基苯基)-y-(4-氨基苯基)三磷酸
-5，- ( γ - (4-硝基苯基)-y-(4-硝基萘基)三磷酸
25的。這種混合物及其在測(cè)序中的應(yīng)用在序列號(hào)為60/651，846的未決的申請(qǐng)中有詳述，該申 請(qǐng)?jiān)诖颂幰米鳛閰⒖?。?jiǎn)要地說(shuō)，這種混合物的制備是通過(guò)用特異性修飾未標(biāo)記或錯(cuò)誤 標(biāo)記的核苷酸或核苷酸類似物的試劑處理包含標(biāo)記和未標(biāo)記的核苷酸或核苷酸類似物的 混合物，來(lái)降低它們用于雜交和測(cè)序分析中的能力。優(yōu)選地，使用的試劑特異性地修飾未標(biāo) 記或錯(cuò)誤標(biāo)記的核苷酸類似物，使這些核苷酸類似物不能用于雜交或測(cè)序分析。例如，核苷 酸可以被修飾，使其不再含有在雜交或模板引導(dǎo)的測(cè)序試驗(yàn)中Watson Crick堿基配對(duì)通常 所需要的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，核苷酸或核苷酸類似物的磷酸基尤其是末端磷酸基被 修飾，生成在模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng)過(guò)程中較低程度地?fù)饺胄律怂徭渻?nèi)的分子。在更優(yōu)選 的實(shí)施方案中，核苷酸或核苷酸類似物的末端磷酸基被修飾，生成在模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng) 過(guò)程中不能或是基本上不能摻入新生核酸鏈內(nèi)的分子。試劑可以包括一種或多種酶。本領(lǐng)域公知的許多種酶適合用于修飾核苷酸或核苷 酸類似物，如通過(guò)切割或改變糖、堿基或磷酸基的構(gòu)型來(lái)破壞特定的Watson Crick堿基配 對(duì)。可作為示例的試劑包括但是不限于鳥(niǎo)嘌呤或腺嘌呤P-核糖基轉(zhuǎn)移酶、嘌呤核苷磷酸化 酶、AMP核苷酶、嘌呤的核苷脫氧核糖基轉(zhuǎn)移酶、乳清酸P-核糖基轉(zhuǎn)移酶、胸苷磷酸化酶、胸 苷或尿苷核苷酶、尿苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶、核苷脫氧核糖基轉(zhuǎn)移酶。適用于修飾核苷酸或核苷酸類似物的末端磷酸基的酶包括多種磷酸酶。這種酶的 一個(gè)例子是能夠除去脫氧核苷三磷酸(dNTP)的Y和β磷酸的蝦堿性磷酸酶(SAP)。這 種酶可以將特異性未標(biāo)記的dNTP轉(zhuǎn)化成一般在模板引導(dǎo)的測(cè)序反應(yīng)中不能被聚合酶利用 的一磷酸核苷dNMP。據(jù)顯示這種磷酸酶能夠選擇性地修飾未被標(biāo)記的核苷酸，如在末端磷 酸處。因此，在末端磷酸標(biāo)記和未標(biāo)記的核苷酸混合物中，SAP將優(yōu)先作用于未標(biāo)記的核苷 酸，留下大部分的標(biāo)記核苷酸用于在測(cè)序反應(yīng)中摻入。其他可用的適合的磷酸酶包括但是不限于小牛小腸堿性磷酸酶和/或其他 哺乳動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物和其他動(dòng)物的磷酸酶。對(duì)實(shí)施本發(fā)明有用的磷酸酶的例子在US 20040203097、US 20040157306、US20040132155 和 US 20040110180 中可以找到。任何其他的天然發(fā)生或合成的磷酸酶或是通過(guò)重組DNA技術(shù)制備的磷酸酶，只要 它們特異性地或優(yōu)先地使未標(biāo)記的核苷酸或類似物(與標(biāo)記的核苷酸相比而言)轉(zhuǎn)化成基 本上不能被聚合酶利用的分子，也都是可以使用的。定向分子進(jìn)化也可用于提高和擴(kuò)大相 關(guān)酶的活性，以產(chǎn)生上述期望的性質(zhì)。許多種芯片(in silicon)和原位誘變技術(shù)都可用于 本領(lǐng)域。產(chǎn)生這種酶的誘變和篩選實(shí)驗(yàn)的一個(gè)例子包括用未標(biāo)記的核苷酸廢除系統(tǒng)內(nèi)聚合 反應(yīng)的第一項(xiàng)試驗(yàn)，和檢查在標(biāo)記核苷酸存在下聚合活性的保留的第二項(xiàng)篩選。這兩種篩 選可以在高度多路傳送平行測(cè)定中進(jìn)行。顯示出某些有益特異性的酶可以保留，用一些方 法突變，然后再次篩選。諸如這些的方法已經(jīng)在特異性和表現(xiàn)上產(chǎn)生了相當(dāng)大的改善。也可以使用能夠選擇性或優(yōu)先修飾一部分未標(biāo)記的核苷酸的酶。例如，肌酸激酶 能夠特異性切除三磷酸腺苷上的磷酸，但是不作用于其他堿基。其他的選擇性或優(yōu)先作用 于一種或多種類型的未標(biāo)記核苷酸的酶同樣可以使用。上述核苷酸修飾酶可用于預(yù)處理核苷酸或核苷酸類似物，或用在雜交和/或測(cè)序 反應(yīng)混合物中，例如，同其他雜交或測(cè)序試劑一起。核苷酸修飾發(fā)生的反應(yīng)條件隨著修飾酶的選擇而不同。一方面，條件可按照下列 參數(shù)設(shè)定:pH值介于4. 0和12. 0之間，更優(yōu)選pH6. 0 10. 0、更優(yōu)選7. 0 9. 0、更優(yōu)選小于8、更優(yōu)選7 8，最優(yōu)選pH7. 5 8. 5，優(yōu)選用緩沖液控制。緩沖液可以是基于Tris的，優(yōu)選 pH7. 5至pH8. 5。其他可用的緩沖液如下但不僅限于有機(jī)緩沖液如MOPS、HEPES, TRICINE 等，或者無(wú)機(jī)緩沖劑如磷酸鹽或醋酸鹽?？梢蕴砑泳彌_液或其他試劑控制溶液的PH值從而 提高酶的穩(wěn)定性。期望時(shí)，可以加入還原劑例如但是不限于二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙 醇來(lái)限制可能不利地影響酶穩(wěn)定性的酶的氧化。特定反應(yīng)條件包括各種緩沖液和PH條件 的選擇屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能，因此在此處不再詳細(xì)說(shuō)明。在預(yù)處理完成后，可以通過(guò)使反應(yīng)溫度升高到至少約65°C，優(yōu)選約65°C -約80°C 來(lái)對(duì)酶進(jìn)行熱滅活?？晒┻x擇地，可以通過(guò)采用如透過(guò)具有小于酶大小的分子量截止值的 濾器(如Millipore)離心，而從反應(yīng)混合物中除去酶。處理之后，混合物一般含有低于約30%，優(yōu)選低于約20%，更優(yōu)選低于約10%、更 優(yōu)選低于約5%、更優(yōu)選低于約1%、更優(yōu)選低于約0. 5%或者更優(yōu)選低于約0. 1%，甚至更 優(yōu)選低于約0. 01 %的未標(biāo)記的核苷酸或未標(biāo)記的核苷酸類似物。這種富集的標(biāo)記核苷酸或 核苷酸類似物的混合物對(duì)在單分子測(cè)序反應(yīng)中標(biāo)記核苷酸的高分辨率檢測(cè)特別有用。重要的是，前述處理的結(jié)果是一種用于核酸合成的方法，優(yōu)選為了基本只利用核 苷酸來(lái)說(shuō)明模板序列，例如用核苷酸類似物特別是標(biāo)記的類似物基本上完全取代天然核苷 酸。這種在測(cè)序操作中基本只存在核苷酸類似物尤其是標(biāo)記的類似物，也被稱為基本完全 取代的模板依賴性合成，與以前描述的測(cè)序方法有很大不同，以前的方法是將一個(gè)核苷酸 置換為其余三個(gè)天然核苷酸中的一個(gè)標(biāo)記的鏈終止核苷酸，或者每次只用一個(gè)類似物探詢 聚合酶模板合成物，以確定這種類似物是否摻入。用于本發(fā)明測(cè)序方法的另一種類型的適宜核苷酸允許通過(guò)熒光共振能量傳遞 (FRET)檢測(cè)。在FRET中，受激發(fā)的熒光團(tuán)(供體)以依賴于距離的方式把它激發(fā)態(tài)的能 量傳遞給光吸收分子(受體)。限制能量可以傳遞的距離能夠使人看出標(biāo)記分子和緊密靠 近的物質(zhì)的相互作用。這種類型的核苷酸可能包含連接在堿基、核糖或優(yōu)選磷酸主鏈(例 如，連接在末端磷酸上)上的供體熒光團(tuán)，和連接在堿基、核糖或磷酸主鏈上所述供體不會(huì) 連接之處的受體熒光團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，供體熒光團(tuán)連接在末端磷酸上，受體熒 光團(tuán)連接到核苷酸的堿基或核糖單位上。一旦這種類型的核苷酸摻入新生鏈中，即可以檢 測(cè)到熒光信號(hào)，這可能由不再被猝滅的多聚磷酸的釋放而引起。通過(guò)測(cè)定在聚合反應(yīng)過(guò)程 中摻入互補(bǔ)核苷酸后釋放的熒光多聚磷酸的順序，人們可以推斷出靶核酸的堿基序列。這 種類型的核苷酸的其他例子在美國(guó)申請(qǐng)20030194740中公開(kāi)，此處引用作為參考。在另一種實(shí)施方案中，供體熒光團(tuán)可以存在于核苷酸中，而受體存在于聚合酶中， 或反之亦然。需要時(shí)，熒光團(tuán)可由綠色熒光蛋白(GFP)或其突變體提供，該突變體具有與野 生型綠色熒光蛋白不同的發(fā)射和/或吸收光譜。例如在399nm處激發(fā)并在511nm處發(fā)射 的GFP突變體H9-40 (Tsien等人，Ann. Rev. Biochem. 67 509(1998))可作為熒光團(tuán)供體與 B0DIPY、熒光素、羅丹明綠和俄勒R綠合用。此外，四甲基羅丹明、麗絲胺 、德克薩斯紅和 萘熒光素可作為該GFP突變體的受體熒光團(tuán)。其它能夠進(jìn)行熒光團(tuán)能量轉(zhuǎn)移的代表性供體和受體包括但不限于4_乙酰胺 基-4’ -異硫氰酸芪-2，2’ - 二磺酸；吖啶及其衍生物吖啶、吖啶異硫氰酸酯；5-(2'-氨 乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS) ；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰)苯基]萘亞胺_3，5-二磺 酸；N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來(lái)酰亞胺；鄰氨基苯甲酰胺；BODIPY ；亮黃；香豆素及其衍生物香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7_氨基-4-三氟甲基香豆素(香 豆?jié)M151)；花青染料；焰紅染料；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ；5'，5〃 -二溴鄰苯 三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7-二乙基氨基-3-(4'-異硫氰酸苯基)4-甲基香豆素；二 亞乙基三胺五乙酸；4，4' - 二異硫氰酸二氫-芪_2，-2' -二磺酸；4，4' -二異硫氰酸 芪-2-2' -二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶 氮苯基-4'-異硫氰酸酯(DABITC)；曙紅及其衍生物曙紅、曙紅異硫氰酸酯；赤蘚紅及其 衍生物赤蘚紅B、赤蘚紅異硫氰酸酯；乙啡啶；熒光素及其衍生物5_羧基熒光素(FAM)、 5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基-熒光素(DTAF)、2'，7，- 二甲氧基-4，5，- 二氯-6-羧 基熒光素(JOE)、熒光素、異硫氰酸熒光素、OFITC、(XRITC)；熒光胺；IR144 ；IR1446 ；孔雀 綠異硫氰酸酯；4-甲基傘形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚紅；B-藻紅蛋白；鄰 苯二醛；芘及其衍生物芘、芘丁酸酯、琥珀酰亞氨基-ι-芘丁酸酯；丁酸酯量子點(diǎn)；活性紅 4 (Cibacron. TM.亮紅3B-A)；羅丹明及其衍生物6_羧基-X-羅丹明(ROX)、6_羧基羅丹明 (R6G)、麗絲胺羅丹明B、磺酰氯羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸酯、 磺酰羅丹明B、磺酰羅丹明101、磺酰羅丹明101的磺酰氯衍生物(德克薩斯紅)；N，N, N’， N’ 一四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；四甲基羅丹明；四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)； 核黃素；玫紅酸；鋱螯合衍化物；Cy 3 ；Cy 5 ；Cy 5. 5 ；Cy 7 ；IRD 700 ；IRD 800 ；拉霍亞藍(lán) (La Jolla Blue)；酞菁；萘酞菁。在替代構(gòu)型中，每一核苷酸類似物上都存在供體和受體熒光團(tuán)，其中供體發(fā)出基 本均一的激發(fā)光譜，但是給予受體能量，受體發(fā)出對(duì)于每一類型的類似物如A、T、G或C而言 不同的發(fā)射光譜。這種構(gòu)型能將單一激發(fā)源用于多種不同的發(fā)射譜，降低所用系統(tǒng)的能量 輸入需求。此外，咕噸染料，包括熒光素和羅丹明染料，可作為供體和受體對(duì)。這些染料中有 許多在苯基部分上含有修飾的取代基，可用作同核苷酸的末端磷酸或堿基鍵合的位點(diǎn)。需 要時(shí)，可以使用充當(dāng)猝滅劑能夠猝滅多種波長(zhǎng)的熒光的受體。這些猝滅劑的代表性的例子 包括4-(4' -二甲基氨基苯基偶氮基)-苯甲酸(DABCYL)、二硝基苯(DNP)和三硝基苯 (TNP)。適用于本發(fā)明的聚合酶可以是任何能夠以合理的合成保真度催化模板引導(dǎo)的聚 合的核酸聚合酶。聚合酶可以是DNA聚合酶或RNA聚合酶，野生型或修飾型熱穩(wěn)定聚合 酶或熱降解聚合酶。適用的熱穩(wěn)定聚合酶包括來(lái)自水生棲熱菌(Thermus aquaticus), Thermus caldophilus、絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)、熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophus)、嗜熱芽孢桿菌(Thermus thermophilus)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、 Thermococcus Iitoralis和海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)的聚合酶。適用的熱降解 聚合酶包括大腸桿菌DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，T4DNA聚合酶，T7DNA 聚合酶。能用于測(cè)定核苷酸序列分子序列的其它聚合酶的例子包括大腸桿菌T7，T3， SP6RNA聚合酶和AMV，M-MLV和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。聚合酶能夠結(jié)合引物單鏈核酸處的引物靶 核酸序列，復(fù)制起點(diǎn)，雙鏈核酸中的切口或缺口，單鏈核酸中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，輔助蛋白生成的 結(jié)合位點(diǎn)，或引物單鏈核酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在添加非常規(guī)或修飾后的核苷酸例如同熒光團(tuán)連接的 核苷酸方面，聚合酶顯示出比野生型酶更高的效率。重組DNA技術(shù)可用于修飾野生型酶。此 類技術(shù)一般包括表達(dá)載體或表達(dá)載體庫(kù)的構(gòu)建，在發(fā)生表達(dá)的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞。通過(guò)使用任一常規(guī)測(cè)序方法以及此處公開(kāi)的測(cè)序方法能夠選擇能夠添加非常規(guī)或修飾 后的核苷酸的聚合酶。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，用表現(xiàn)出高度持續(xù)合成能力的聚合酶進(jìn)行測(cè)序，該能 力即通過(guò)保持穩(wěn)定的核酸/酶復(fù)合物合成長(zhǎng)核酸段的能力。加工聚合酶一般可以合成一條 大約10000堿基對(duì)的新鏈。在輔助酶(例如解旋酶/引發(fā)酶)的幫助下，一些加工聚合酶甚 至可以合成超過(guò)50，000的堿基對(duì)。例如，與解旋酶/引發(fā)酶復(fù)合的T7DNA聚合酶可以合成 幾百個(gè)kb的核苷酸，同時(shí)還保持了與靶核酸的穩(wěn)定的復(fù)合物(Kelman等人，“Processivity of DNA Polymerases :Two Mechanisms, One Goal (DNA 聚合酶的持續(xù)合成能力兩種機(jī)制， 同一目標(biāo))"Structure 6 121-125 (1998))。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)序用能夠滾環(huán)復(fù)制的聚合酶進(jìn)行，S卩能夠復(fù)制環(huán)狀 DNA模板，包括但不僅限于質(zhì)粒和噬菌體DNA。優(yōu)選的滾環(huán)聚合酶表現(xiàn)出鍵置換活性，而且 優(yōu)選具有降低的或基本上沒(méi)有5’至3’外切核酸酶活性。鍵置換引起環(huán)狀DNA模板的串 聯(lián)拷貝的合成，從而可以對(duì)同一 DNA模板進(jìn)行再測(cè)序一次以上。對(duì)同一 DNA模板的再測(cè)序 大大增加了聚合酶所產(chǎn)生的任何錯(cuò)誤的檢出機(jī)會(huì)，因?yàn)榫酆厦覆惶赡苤貜?fù)發(fā)生同一個(gè)錯(cuò) 誤，而且在聚合酶鏈反應(yīng)中，同一個(gè)錯(cuò)誤肯定不會(huì)指數(shù)擴(kuò)增。適用于本發(fā)明的滾環(huán)聚合酶的非限制性實(shí)例包括但不僅限于，T5DNA聚合酶 (Chatterjee 等人，Gene 97 13-19 (1991))，T4DNA聚合酶全酶(Kaboord和 Benkovic，Curr. Biol. 5 149-157 (1995))，噬菌體 M2DNA 聚合酶(Matsumoto 等人，Gene 84:247(1989))， 噬菌體 PRDI DNA 聚合酶(Jung 等人，Proc. Natl. Aced. Sci. USA 84 8287 (1987)，和 Zhu 和 Ito, Biochim. Biophys. Acta. 1219 267-276 (1994))，DNA 聚合酶 I Klenow 片段(Jacobsen 等人，Eur. J. Biochem. 45 :623_627 (1974))。優(yōu)選的一類滾環(huán)聚合酶利用蛋白質(zhì)引發(fā)作為開(kāi)始復(fù)制的途徑。該類別中示例性的 聚合酶是經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾的DNA聚合酶，選自或來(lái)源于噬菌體Φ29、PRDU Cp-U Cp_5、 Cp-7、Φ15、ΦΙ、Φ21、025、BS 32 L17、PZE、PZA、Nf、M2Y(或 M2)、PR4、PR5、PR722、B 103、 SF5、GA-1，及短尾病毒科中的有關(guān)成員。特別的是，野生型噬菌體Φ29基因組由19，285個(gè) 堿基對(duì)的線形雙鏈DNA(ds-DNA)組成，其末端蛋白(TP)同每一 5，端共價(jià)連接。為了開(kāi)始 復(fù)制，組蛋白樣病毒蛋白質(zhì)同復(fù)制起點(diǎn)形成核蛋白復(fù)合物，這樣可能促成DNA兩末端的雙 螺旋解螺旋(Serrano 等人，EMBO Journal 16(9) =2519-2527 (1997)) DNA 聚合酶催化第 一 dAMP向TP提供的羥基上的添加。此蛋白質(zhì)引發(fā)的事件的發(fā)生同模板中的第二 3’核苷 酸相反，并且起始產(chǎn)物(TP-dAMP)滑回DNA中的某一位置以恢復(fù)末端核苷酸。起始后，同一 DNA聚合酶復(fù)制DNA鏈中的一條，而同時(shí)置換另一條。Φ 29DNA聚合酶的高持續(xù)合成能力和 鏈置換能力使其有可能在沒(méi)有解旋酶或輔助持續(xù)性因子的情況下完成含有Φ29ΤΡ的基因 組(TP-DNA)的復(fù)制(綜述見(jiàn) Serrano 等人，EMBO Journal 16(9) :2519_2527 (1997))。5’至3’外切核酸酶活性降低的修飾的Φ29 ΝΑ聚合酶也已經(jīng)描述(美國(guó)專利 5，198，543和5，001，050，此處引入)。這些聚合酶作為5'至3'外切核酸酶用于測(cè)序是特 別理想的，如果過(guò)量存在，可以降解正在合成的新生鏈。
29
利用多種輔助蛋白質(zhì)可以加強(qiáng)鏈置換。輔助蛋白質(zhì)包括但不僅限于解旋 酶(Siegel 等人，J. Biol. Chem. 267 13629-13635 (1992))、單純皰疹病毒蛋白質(zhì) ICP8 (Skaliter 和 Lehman, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 91(22) :10665_10669 (1994))、單鏈 DNA 結(jié)合蛋白(Rigler 和 Romano，J. Biol. Chem. 270 :8910_8919 (1995))、腺病毒 DNA 結(jié)合蛋 白(Zijderveld 和 van der Vliet, J. Virology 68(2) : 1158-1164 (1994))和 BMRFl 聚合酶 輔助亞基(Tsurumi 等人，J. Virology 67(12) :7648_7653 (1993))。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)序反應(yīng)涉及鏈置換聚合酶和環(huán)狀靶DNA的單一復(fù)合 物，其固定于光約束上?；旌蠘?biāo)記的核苷酸或核苷酸類似物和引物之后，鏈置換聚合酶引導(dǎo) 新鏈的合成，并記錄各種類型的標(biāo)記核苷酸或核苷酸類似物摻入新鏈的時(shí)序。需要時(shí)，鏈置 換聚合酶可以合成靶DNA的多個(gè)串聯(lián)重復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)同一環(huán)狀DNA靶標(biāo)的多次重測(cè)序。優(yōu) 選地記錄核苷酸或核苷酸類似物摻入靶DNA分子的至少兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)，更優(yōu)選至少大約3 個(gè)至大約10個(gè)或至少大約3個(gè)至大約100個(gè)串聯(lián)重復(fù)，優(yōu)選不超過(guò)大約100萬(wàn)個(gè)串聯(lián)重復(fù) 的時(shí)序。這種多輪的或豐余的測(cè)序可在等溫條件和/或室溫下進(jìn)行。使用本發(fā)明的方法，可以以每秒至少一個(gè)堿基的速度進(jìn)行測(cè)序，優(yōu)選至少每秒 10個(gè)堿基，更優(yōu)選至少每秒100個(gè)堿基。據(jù)報(bào)道，聚合酶在體內(nèi)每秒能夠聚合1，000個(gè) 堿基，在體外每秒能夠聚合750個(gè)堿基(見(jiàn)，例如=Kelman等人，"Processivity of DNA Polymerases :Two Mechanisms, One Goal (DNA聚合酶持續(xù)合成能力兩種機(jī)制，同一目 標(biāo))，，Structure 6 121-125 (1998) ；Carter 等人，"The Role of Exonuclease and Beta Protein of Phage Lambda in Genetic Recombination. II. Substrate Specificity and the Mode of Action of Lambda Exonuclease (遺傳重組中外切核酸酶和噬菌體 λ的β蛋白的作用.II. λ核酸外切酶的底物特異性和作用方式)” J. Biol. Chem. 246 2502-2512 (1971) ；Tabor 等人，"Escherichia coli Thioredoxin Confers Processivity on the DNA Polymerase Activity of the Gene 5 Protein of Bacteriophage T7(大 腸桿菌硫氧還蛋白使噬菌體T7基因5蛋白的DNA聚合酶活性具有持續(xù)合成能力)” J. Biol. Chem. 262 16212-16223 (1987)；和 Kovall 等 A, "Toroidal Structure of Lambda-Exonuclease ( λ 核酸外切酶的環(huán)型結(jié)構(gòu))” Science 277 1824-1827 (1997)，在此 引入作為參考)。反應(yīng)條件本發(fā)明的測(cè)序過(guò)程可在利用聚合酶能夠進(jìn)行模板引導(dǎo)的聚合的任何條件下進(jìn)行。 一方面，將聚合酶的底物，即測(cè)序反應(yīng)中存在的不同類型的核苷酸，調(diào)整至生理學(xué)相關(guān)濃 度。例如，測(cè)序反應(yīng)中使用的核苷酸以大約為聚合酶米氏常數(shù)的濃度存在。這一濃度一般 從大約1微摩爾到大約50微摩爾或大約100微摩爾。測(cè)序過(guò)程同樣可以通過(guò)使用少于4個(gè)的標(biāo)記物來(lái)實(shí)現(xiàn)。使用3個(gè)標(biāo)記物，序列可 通過(guò)核酸鏈測(cè)序推斷，⑴如果可以檢測(cè)第4種堿基，則作為其他標(biāo)記物信號(hào)之間的恒定暗 時(shí)間延遲(dark time delay)，或者(2)明確地通過(guò)對(duì)兩條核酸鏈測(cè)序，因?yàn)榇朔N情況下，可 以從每一堿基對(duì)獲取正熒光信號(hào)。使用兩種標(biāo)記物的另外一種可能的方案是將一種堿基用 一種熒光團(tuán)標(biāo)記，將另外三種堿基有另外一種熒光團(tuán)標(biāo)記。此種情況下，其它的三種堿基無(wú) 法給出序列，而僅僅給出在用該另外一種熒光團(tuán)標(biāo)識(shí)的特定堿基之間產(chǎn)生的大量堿基。通 過(guò)在不同的測(cè)序反應(yīng)中通過(guò)不同堿基循環(huán)這種標(biāo)識(shí)熒光團(tuán)，可由連續(xù)的測(cè)序過(guò)程推斷出整
30個(gè)序列。充分利用這個(gè)僅使用2種標(biāo)記物的方案，通過(guò)每一測(cè)序過(guò)程僅使用兩種標(biāo)記的堿 基，甚至有可能獲得完整的序列。測(cè)序過(guò)程可在等溫條件下、在室溫或循環(huán)變溫加熱條件下進(jìn)行。緩沖液、pH等等 的選擇屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能，因此此處不加以詳述。檢測(cè)本發(fā)明的測(cè)序法需要限制在光約束中的單(獨(dú))分子的成像。使用當(dāng)某一特定類 型的核苷酸摻入新鏈中時(shí)發(fā)出可辨別的光信號(hào)的熒光團(tuán)標(biāo)記聚合酶和/或核苷酸。隨著核 苷酸持續(xù)加到光約束內(nèi)的新鏈中，檢測(cè)可辨別信號(hào)的順序。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在每一 個(gè)核苷酸加入事件后無(wú)需轉(zhuǎn)運(yùn)、分離或洗脫任何反應(yīng)物或副產(chǎn)物(例如從核苷酸上切下 的熒光團(tuán))，即可進(jìn)行這種檢測(cè)。在該優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面，在讀取下一個(gè)即將摻入的 堿基序列核苷酸之前無(wú)需向混合物中添加反應(yīng)物即可實(shí)現(xiàn)序列的測(cè)定。通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)的協(xié)助進(jìn)行限制在本發(fā)明的光約束內(nèi)的單分子的成像。此系統(tǒng)一般 包括至少兩個(gè)單元，即激發(fā)源和光子探測(cè)器。眾多有關(guān)這些單元的例子在上面已有表述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，激發(fā)源是激光，優(yōu)選偏振激光。激光的選擇取決于連 接到不同類型核苷酸和/或聚合酶上的熒光團(tuán)。對(duì)于大多數(shù)熒光化合物而言，其所需的 激發(fā)光范圍為大約300nm至大約700nm之間。對(duì)于蛋白質(zhì)性質(zhì)的熒光團(tuán)而言，如綠色熒光 蛋白及其突變體，激發(fā)波長(zhǎng)的范圍可以是大約488nm至大約404nm之間。本領(lǐng)域技術(shù)人 員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)知道或者能夠確定激發(fā)特定熒光團(tuán)的適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)(參見(jiàn)，例如 The Handbook-' A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,第十版 (2005)(可從 Invitrogen，Inc. /Molecular Probes 獲得)，此處引用作為參考)。選擇激發(fā)源的另一個(gè)考慮是選擇熒光的單光子激發(fā)還是多光子激發(fā)。多光子激 發(fā)同檢測(cè)配合使用，也被稱為多光子顯微術(shù)(“MPM”)，能夠提供較高的靈敏度和空間分辨 率。MPM是激光掃描顯微鏡的一種形式，它利用局部非線性激發(fā)來(lái)激發(fā)薄光柵掃描平面內(nèi) 的熒光。同傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微術(shù)一樣，在MPM中，激光被聚焦，并且穿過(guò)樣品光柵 掃描。影像由熒光強(qiáng)度測(cè)量矩陣組成，這種測(cè)量是在激光來(lái)回掃描樣品時(shí)通過(guò)將檢測(cè)器信 號(hào)數(shù)字化而進(jìn)行的。雙光子激發(fā)的概率是非常小的，而且聚焦增加了在焦點(diǎn)處的局部強(qiáng)度。 雖然雙光子激發(fā)的熒光通常是MPM中的主要信號(hào)源，但三光子或更多光子激發(fā)的熒光和二 次或三次諧波振蕩也可用于成像。參見(jiàn)，例如多光子顯微術(shù)的綜述，Webb等人.Nature Biotechnology (2003) 21 (11) 1251-1409。一種優(yōu)選的MPM設(shè)置包括MPM激光掃描顯微鏡 和二次諧波成像，配備工作波長(zhǎng)為約700nm-1000nm的飛秒鎖模(mode-lock)鈦藍(lán)寶石激 光。此設(shè)置在常規(guī)成像多光子顯微鏡中能捕捉超過(guò)約100個(gè)光子/像素?？杀鎰e信號(hào)的順序也可以通過(guò)其它的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，這些系統(tǒng)包括諸如光 閱讀器、高效光子探測(cè)系統(tǒng)、光倍增管、閘敏(gate-sensitive)FET、納米管FET、光敏二極 管(例如雪崩光敏二極管(APD))、照相機(jī)、電荷耦合器件(CCD)、電子倍增電荷耦合器件 (EMCXD)、增強(qiáng)型電荷耦合器件(ICXD)和共焦顯微鏡等部件。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括寬場(chǎng)CXD或ICXD及具有數(shù)字圖像處理能力的增強(qiáng)型電 視成像顯微鏡，以及熒光光脫色恢復(fù)技術(shù)(FPR)和熒光相關(guān)光譜學(xué)(FCS)，同時(shí)具備共焦多 光子能力和連續(xù)數(shù)據(jù)采集和控制。此設(shè)置還可包括用于準(zhǔn)彈性光散射、激光DIC干涉測(cè)量、 相關(guān)光譜學(xué)儀器操作、光學(xué)力顯微鏡檢查和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)的模塊裝置。
這些光學(xué)系統(tǒng)也可包括光傳輸組件，如衍射柵、陣列波導(dǎo)光柵(AWG)、光學(xué)纖維、光 開(kāi)關(guān)、平面鏡、透鏡(包括微透鏡和納米透鏡)、準(zhǔn)直器。其它的一些實(shí)例包括光學(xué)衰減器、 偏振濾光片(例如二向色濾光片)、波長(zhǎng)濾波器(低通、帶通或高通)、波片及延遲線。在 一些實(shí)施方案中，光傳輸組件可以是與光約束陣列光學(xué)連通的平面波導(dǎo)。本領(lǐng)域中已知的上述及其它的光學(xué)組件可以以多種方式組合和裝配，從而實(shí)現(xiàn)由 測(cè)序反應(yīng)所發(fā)出的可辨別信號(hào)的檢測(cè)。優(yōu)選的裝置允許利用具有大量光約束的陣列進(jìn)行平 行數(shù)據(jù)收集，其中發(fā)生同時(shí)的和獨(dú)立的核苷酸測(cè)序。一方面，優(yōu)選的系統(tǒng)能夠收集和處理來(lái) 自超過(guò)104、超過(guò)2X 104、或超過(guò)105、或超過(guò)2X 105、或優(yōu)選超過(guò)106、或優(yōu)選超過(guò)2X 106、更 優(yōu)選超過(guò)IO7或2X IO7個(gè)光約束的信號(hào)。另一方面，優(yōu)選的設(shè)置可以每秒約1個(gè)堿基的速 度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)同時(shí)且獨(dú)立的核酸測(cè)序，優(yōu)選以每秒約10個(gè)堿基的速度，更優(yōu)選以每秒約100 個(gè)堿基的速度，更優(yōu)選以每秒1000個(gè)堿基的速度。這樣，與快速測(cè)序反應(yīng)結(jié)合的群并行性 可以提供超過(guò)100，000堿基/秒的總測(cè)序輸出。總測(cè)序輸出可擴(kuò)大至至少1兆堿基/秒， 優(yōu)選10兆堿基/秒或更高。進(jìn)一步通過(guò)從多種不同序列片段中獲取數(shù)據(jù)，例如從2個(gè)或 2個(gè)以上不同反應(yīng)體積中獲取數(shù)據(jù)，人們可以獲得獨(dú)立的序列，例如從基因組DNA的連續(xù)片 段獲得，使其具有可直接應(yīng)用于基因組測(cè)序的高通量。其它的單分子應(yīng)用本發(fā)明的光約束和光約束陣列可應(yīng)用于期望進(jìn)行單分子分析的其他許多化學(xué)和 生物應(yīng)用中。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的光約束適用于與任何試劑有關(guān)的任何單分子分析，該試劑 可以附著在表面上，并且其底物可以被標(biāo)記，包括酶、核酸、抗體、抗原等等。這些應(yīng)用包括 鑒別與諸如蛋白質(zhì)、糖蛋白、核酸、類脂以及無(wú)機(jī)化學(xué)物質(zhì)或其任意組合的生物分子有關(guān)的 相互作用。這些相互作用可能發(fā)生在核酸分子之間，核酸和蛋白質(zhì)之間，蛋白質(zhì)和小分子之 間。長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)人們已經(jīng)認(rèn)可與生物分子有關(guān)的相互作用的異?？山忉尨罅康募膊?， 包括多種形式的癌癥、血管疾病、神經(jīng)元疾病和內(nèi)分泌疾病。現(xiàn)已知異常的相互作用，例如 信號(hào)復(fù)合物的組成型激活和過(guò)早失活的形式，導(dǎo)致疾病細(xì)胞的異常行為。對(duì)于癌癥，兩種信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如生長(zhǎng)因子受體及其相應(yīng)的配體之間異常的相互作用可能導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)程的功 能障礙，將最終導(dǎo)致生長(zhǎng)失調(diào)、缺乏錨定抑制作用、基因組不穩(wěn)定性和/或細(xì)胞轉(zhuǎn)移傾向。生物學(xué)分子或化學(xué)分子之間特定的相互作用一般涉及一個(gè)正在研究的靶分子和 能夠與該靶分子特異性相互作用的探針。在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，將靶分子和探針置于光 約束中。靶分子-探針復(fù)合物可以是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物、糖蛋白-蛋白質(zhì)復(fù)合物(例如 受體和配體復(fù)合物)、蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物(例如轉(zhuǎn)錄因子和核酸復(fù)合物)、蛋白質(zhì)-脂質(zhì) 復(fù)合物以及有機(jī)或無(wú)機(jī)小分子的復(fù)合物。優(yōu)選地，每個(gè)光約束僅含有一個(gè)研究中的靶分子。這可以如下實(shí)現(xiàn)通過(guò)在大量溶 液中稀釋少量的靶分子，使得在約束陣列上的沉積導(dǎo)致初級(jí)分布，或者大多數(shù)約束將排列 有單個(gè)靶分子?；蛘?，可以使用非圓柱形波導(dǎo)，其中波導(dǎo)芯的開(kāi)口其橫向尺寸要比底部窄， 來(lái)限制多個(gè)標(biāo)記蛋白的進(jìn)入，同時(shí)允許大量較小的探針進(jìn)入。利用任何適用于使上述聚合酶固定和沉積的方法可以將靶標(biāo)或探針固定在光約 束的內(nèi)面上。這些方法包括使用通過(guò)多種結(jié)合部分實(shí)現(xiàn)的共價(jià)和非共價(jià)連接。結(jié)合部分的 選擇取決于靶標(biāo)和/或探針的性質(zhì)。例如結(jié)合部分可通過(guò)合成與蛋白質(zhì)靶標(biāo)或探針相連接，或者通過(guò)重組方法制備為融合基序或標(biāo)簽。固定靶蛋白或蛋白質(zhì)探針的一種優(yōu)選方法 包括使用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素結(jié)合對(duì)，以及上面提到的其它任何結(jié) 合部分或結(jié)合因子。反應(yīng)條件取決于研究中的特定相互作用?？梢愿淖兎磻?yīng)溫度、反應(yīng)持續(xù)時(shí)間、緩沖 液強(qiáng)度和靶標(biāo)濃度或探針濃度。例如，為了測(cè)定探針同靶蛋白的結(jié)合親和力，可以改變探針 濃度。為了確定靶標(biāo)-探針復(fù)合物的熱穩(wěn)定性，可以改變反應(yīng)溫度。還可以通過(guò)改變PH或 緩沖鹽濃度決定靶標(biāo)_探針復(fù)合物的穩(wěn)定性。希望時(shí)，可以在生理學(xué)相關(guān)溫度和緩沖液條 件下研究相互作用。生理學(xué)相關(guān)溫度的范圍從大約室溫到大約37°C。一種生理學(xué)緩沖液含 有生理濃度的鹽，為中性pH，范圍為約6. 5至約7. 8，優(yōu)選約7. 0至約7. 5。為了鑒別特定靶 標(biāo)和探針之間的特定體外相互作用而調(diào)整反應(yīng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能，在此不再詳 述。靶標(biāo)和/或探針一般用可檢測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，使光子探測(cè)器可以探測(cè)到指示 相互作用的信號(hào)。合適的標(biāo)記物包括在“單分子測(cè)序”部分提到的所有那些標(biāo)記物。優(yōu)選 的標(biāo)記物是發(fā)光標(biāo)記物，特別是熒光或發(fā)色標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用熒光團(tuán)標(biāo)記靶標(biāo)，在熒光團(tuán)同相應(yīng)的結(jié)合有適當(dāng)猝滅劑的 探針發(fā)生相互作用時(shí)，熒光團(tuán)的信號(hào)會(huì)猝滅。上述部分描述了多種合適的熒光團(tuán)_猝滅劑 對(duì)，因此不再詳述。這一實(shí)施方案的一種變化是用供體和受體熒光團(tuán)標(biāo)記靶標(biāo)和探針(或 反之亦然)，當(dāng)兩個(gè)分子彼此結(jié)合時(shí)發(fā)出可辨別的信號(hào)。范圍較寬的適用的供體和受體熒光 團(tuán)在上面已有描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道多種多樣的可檢測(cè)標(biāo)記物以及他們的組合， 用來(lái)產(chǎn)生指示生物學(xué)分子和/或化合物之間的特定相互作用的可辨別信號(hào)。在本文所述光學(xué)系統(tǒng)的幫助下完成對(duì)指示特定相互作用的可辨別信號(hào)的檢測(cè)。任 何適用于單分子測(cè)序的系統(tǒng)同樣適用于檢測(cè)其它生物學(xué)分子和/或化合物之間的相互作 用。一個(gè)優(yōu)選的系統(tǒng)允許利用具有大量光約束的陣列實(shí)現(xiàn)平行數(shù)據(jù)收集，在此系統(tǒng)中，可以 發(fā)生同時(shí)且獨(dú)立的靶標(biāo)-探針相互作用。一方面，優(yōu)選的系統(tǒng)可以從超過(guò)IO4個(gè)光約束、超 過(guò)2 X IO4個(gè)光約束、超過(guò)IO5個(gè)光約束、超過(guò)2 X IO5個(gè)光約束、優(yōu)選超過(guò)106、或者優(yōu)選超過(guò) 2X IO6個(gè)光約束、甚至更優(yōu)選超過(guò)IO7或2X IO7個(gè)光約束中收集和處理信號(hào)。上面提到的方法在檢測(cè)特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用是特別有意義的。 這一應(yīng)用一般利用置于光約束中的蛋白質(zhì)探針和靶蛋白。在該實(shí)施方案的一方面，特定蛋 白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在細(xì)胞表面受體和它相應(yīng)的配體之間。細(xì)胞表面受體是錨定在 或插入到細(xì)胞質(zhì)膜中的分子。他們組成了蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖和脂質(zhì)的一個(gè)大家族，他們 不但是作為質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)組成成分，還是控制多種生物學(xué)功能的調(diào)控元件。另一方面，特定蛋 白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用涉及細(xì)胞表面受體和免疫脂質(zhì)體或免疫毒素。又另一方面，特定蛋 白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用能夠涉及胞質(zhì)蛋白質(zhì)、核蛋白質(zhì)，侶伴蛋白質(zhì)或錨定在其它細(xì)胞內(nèi) 膜結(jié)構(gòu)上的蛋白質(zhì)。又另一方面，特定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在靶蛋白質(zhì)(例如抗 原)和該抗原的特異性抗體之間?？乖涂贵w之間的特異性相互作用已在免疫測(cè)定法中利用。本領(lǐng)域中有多種免疫 測(cè)定法，但沒(méi)有一種可以進(jìn)行單分子檢測(cè)。例如，常規(guī)放射免疫測(cè)定法檢測(cè)免疫印跡上一組 抗原和一組放射性標(biāo)記的抗體之間的相互作用。另一種常規(guī)免疫測(cè)定法被稱為ELISA(酶 聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)，它利用抗原-特異性抗體以及與該特異性抗體結(jié)合的酶聯(lián)屬抗體。在加入連接的酶的底物后，顯示抗原和抗體之間的特異性相互作用。對(duì)免疫印跡再進(jìn)行這種 測(cè)定，為所有接受檢測(cè)的相互作用提供一個(gè)總體的測(cè)量。本發(fā)明的光約束為進(jìn)行單分子免疫測(cè)定法提供了有效的工具。與常規(guī)免疫測(cè)定法 不同，可以在單分子水平上分析抗原和抗體之間的特異性相互作用。盡管本發(fā)明中包括的 所有光約束都適用于進(jìn)行單分子免疫測(cè)定，但是一個(gè)特別理想的系統(tǒng)包括具有較高填充分 數(shù)比的光約束陣列。例如，一個(gè)優(yōu)選系統(tǒng)包括填充分?jǐn)?shù)大于0. 0001，更優(yōu)選大于約0. 001， 更優(yōu)選大于約0.01，再更優(yōu)選大于0. 1的波導(dǎo)陣列。在實(shí)施本發(fā)明的免疫測(cè)定的過(guò)程中，可用合適的標(biāo)記物標(biāo)記抗體，該標(biāo)記物選自 放射性標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、酶標(biāo)簽，如洋地黃毒苷、牛乳糖苷酶、脲 酶、堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶、親和素/生物素復(fù)合物以及在此公開(kāi)的任何可檢測(cè)標(biāo)記物。本發(fā)明的免疫測(cè)定法可用于表征生物實(shí)體、篩選抗體治療劑和確定靶抗原的結(jié)構(gòu) 構(gòu)象。例如，已經(jīng)常規(guī)使用涉及生物實(shí)體特異性抗體或該生物實(shí)體所產(chǎn)生的副產(chǎn)物的特異 性抗體的免疫測(cè)定法通過(guò)形成抗體_實(shí)體復(fù)合物鑒定該實(shí)體。免疫測(cè)定法還可用于篩選具 有治療潛能的能夠激活或下調(diào)靶抗原生物活性的抗體。通過(guò)利用能夠區(qū)分折疊為不同構(gòu)象 的靶蛋白的抗獨(dú)特型抗體，免疫測(cè)定法也可用于確定結(jié)構(gòu)構(gòu)象。前面提到的單分子分析的另外一個(gè)重要的應(yīng)用是研究酶動(dòng)力學(xué)，包括確定酶的轉(zhuǎn) 化循環(huán)，動(dòng)態(tài)行為，折疊和展開(kāi)的中間體以及結(jié)合親和力。所研究的酶可以固定在光約束內(nèi) 或者存在于在本發(fā)明的光約束內(nèi)限制的溶液中。本發(fā)明中包括的所有光約束可用于研究酶動(dòng)力學(xué)。對(duì)特定光約束的選擇取決于所 研究的具體特性。例如，測(cè)量酶促反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)(on-rate)優(yōu)選一種光約束，其包含 非圓柱形芯，該芯在其上表面有一個(gè)開(kāi)口，該開(kāi)口要比在光約束的底部窄。這種結(jié)構(gòu)顯著地 限制了反應(yīng)物或底物的擴(kuò)散，因此增加了在觀測(cè)體積內(nèi)的平均滯留時(shí)間。另一方面，包含一 個(gè)有開(kāi)口的芯，而該開(kāi)口的橫向尺寸比底部寬的光約束施加了進(jìn)入結(jié)構(gòu)的立體或熵阻礙， 因此對(duì)測(cè)定大酶或酶復(fù)合物的可達(dá)性是很有用的。本發(fā)明光約束在總體測(cè)量中的應(yīng)用本發(fā)明的光約束尤其可以用于進(jìn)行單分子分析，該本發(fā)明光約束也適用于高通量 的總體大量測(cè)量。因此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)多種分子之間相互作用的方法，包括將所 述的緊密靠近的多種分子加入到零模波導(dǎo)陣列上，其中所述陣列中的每個(gè)波導(dǎo)都相隔一定 的間距，該間距足以在應(yīng)用入射波長(zhǎng)的光束照射所述陣列時(shí)產(chǎn)生可探測(cè)到的強(qiáng)度的多衍射 級(jí)的衍射散射；應(yīng)用所述的入射波長(zhǎng)照射所述的零模波導(dǎo)陣列；檢測(cè)所述多衍射級(jí)的所述 入射波長(zhǎng)的衍射散射的強(qiáng)度變化，由此檢測(cè)所述的多種分子之間的相互作用。用于該方法的陣列一般包括相對(duì)于入射波長(zhǎng)而言遠(yuǎn)距離間隔的光約束。這種相對(duì) 于照射輻射(例如，半個(gè)波長(zhǎng)的照射輻射)而言遠(yuǎn)距離的光約束間隔對(duì)遠(yuǎn)離鏡反射角的特 定角度的入射光的衍射散射產(chǎn)生較大影響。在該實(shí)施方案的一方面，該陣列包括相隔一個(gè) 以上入射輻射波長(zhǎng)的各個(gè)約束，通常是入射波長(zhǎng)的1.5倍以上，但通常不超過(guò)入射波長(zhǎng)的 150 倍。具有相對(duì)于入射波長(zhǎng)而言遠(yuǎn)距離間隔的光約束的陣列也有預(yù)期的性質(zhì)。盡管依 賴于角度的散射可能提高不利于某些特定用途的本底信號(hào)，但是它提供了一種尤其適用于 表征光約束的大小和形狀的方法。它也能夠方便地進(jìn)行分子相互作用的總體大量測(cè)量，尤其涉及未標(biāo)記的分子。適用于該用途的陣列一般包括相隔一個(gè)以上入射輻射波長(zhǎng)的各個(gè)約 束，通常是入射波長(zhǎng)的1.5倍以上，但通常不超過(guò)入射波長(zhǎng)的150倍?！憬柚诒疚乃龅墓鈱W(xué)系統(tǒng)進(jìn)行總體大量測(cè)量。適用于單分子測(cè)序的任何方 案同樣也適用于該分析。下面的實(shí)施例部分提供了關(guān)于制作本發(fā)明的光約束的進(jìn)一步說(shuō)明以及其在測(cè)序 中的應(yīng)用。這些實(shí)施例為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了指南，并不意味著限制。
實(shí)施例實(shí)施例1下面提供了一種示例性的制作零模波導(dǎo)的方法。在此描述的參數(shù)旨在舉例說(shuō)明， 而不是進(jìn)行限制。1.基板基板進(jìn)行兩次拋光，60/40劃痕/刺孔(scratch/dig)的表面質(zhì)量，熔融 氧化硅晶片，切至直徑為100毫米(+/-0. 2毫米)，并且厚度為175微米(+/-25微米)，總 厚度的偏差小于25微米。2.清洗5份去離子水、1份30% ν/ν的過(guò)氧化氫水溶液、1份30% ν/ν的氫氧化 銨水溶液的混合溶液在一個(gè)熱板上加熱至75°C。利用特氟綸容器或其他抗化學(xué)腐蝕的容 器，將上述晶片浸入該混合溶液中15分鐘。3.沖洗將載有晶片的容器從RCA清洗浴中取出，浸入去離子水浴中。晶片放置 在該第二浴中2分鐘。將仍然載有該晶片的容器從去該浴中取出，并用去離子水噴灑直至 沖洗階段完成。4.干燥在最后沖洗步驟的1分鐘內(nèi)，仍然在該容器內(nèi)，使用干燥清潔的氮?dú)饬鬟M(jìn) 行干燥。5.氧等離子體處理將晶片裝入Glerm IOOOp等離子灰化機(jī)中，使用等離子體蝕 刻模式(晶片放在一個(gè)動(dòng)力板(powered shelf)上，另一個(gè)動(dòng)力板下)、140m托的壓強(qiáng)、400 瓦特的正向功率，40千赫的頻率。等離子體保持10分鐘。使用ISsccm的分子氧流。6.蒸氣涂覆在氧等離子體處理后的3分鐘內(nèi)，將晶片放到Y(jié)ield Engineering Systems蒸氣涂覆爐中，涂覆一層六甲基二硅氮烷(HMDS)粘合增進(jìn)劑。7.電子束抗蝕劑涂覆在蒸氣涂覆后的15分鐘內(nèi)，應(yīng)用NEB-31電子束抗蝕劑 (Sumitomo Chemical America)在手動(dòng)旋轉(zhuǎn)單元中涂覆晶片。大約有3毫升涂覆在晶片上， 然后以4500轉(zhuǎn)/分的速率旋轉(zhuǎn)60秒。初始加速和減速均設(shè)定為3秒。8.抗蝕劑烘烤將晶片放在115°C的CEE熱板上烘烤2分鐘。該熱板配有真空機(jī) 構(gòu)，可以使晶片和熱板表面有良好的熱接觸。9.金蒸發(fā)然后將一層IOnm的金熱蒸發(fā)到晶片上抗蝕劑涂覆的那一面。蒸發(fā)前， 壓強(qiáng)必須達(dá)到低于2X10_6托。蒸發(fā)以大約2.5埃/秒的速率進(jìn)行，并使用Inficon控制儀 進(jìn)行監(jiān)控。10.電子束曝光使用諸如Leica VB6-HR的高分辨率電子束光刻工具將由零模 波導(dǎo)組成的圖案在晶片上曝光。零模波導(dǎo)形成單個(gè)exel特征的圖案。在標(biāo)稱1納安的電 流、可變分辨單位為1、以及5納米的exel設(shè)置，劑量范圍可以是10000微庫(kù)倫/平方厘 米-300000微庫(kù)倫/平方厘米。
11.曝光后烘烤將晶片放置在同樣配備有真空機(jī)構(gòu)的95°C的熱板上，進(jìn)行2分鐘 的曝光后烘烤。12.金蝕亥Ij 移開(kāi)電子束系統(tǒng)后，用金蝕刻劑TFA(GE 8148，Transene Corporation)在室溫下保持10秒鐘除去10納米的金層。將晶片放在與步驟2中使用的相 似的特氟綸容器中。13.沖洗從金蝕刻劑浴中取出裝有晶片的容器，將其浸入去離子水浴中。晶片在 該第二浴中放置2分鐘或更短的時(shí)間并輕輕手工攪拌。從去離子水浴中取出含有晶片的容 器，并用去離子水噴灑直至徹底地完成沖洗過(guò)程?；蛘咭部梢詫⒀b有晶片的容器放入一個(gè) 新的裝有新鮮去離子水的容器中。14.干燥在最后沖洗步驟的1分鐘內(nèi)，使用干燥清潔的氮?dú)饬髟谠撊萜鲀?nèi)進(jìn)行晶 片干燥。15.曝光后烘烤將晶片放置在同樣配備有真空機(jī)構(gòu)的95°C的熱板上，進(jìn)行2分鐘 的曝光后烘烤。16.顯影在室溫下，將仍然在抗化學(xué)腐蝕的容器中的晶片浸入顯影液 MF-321 (Shipley Chemicals，Rohm-Haas)中，放置 30 秒。17.沖洗從顯影蝕刻劑浴中取出裝有晶片的容器，并浸入去離子水浴中。晶片在 該第二浴中放置2分鐘并輕輕地?cái)嚢琛娜ルx子水浴取出含有晶片的容器，并用去離子水 噴灑直至徹底地完成沖洗過(guò)程。18.干燥在最后沖洗步驟的1分鐘內(nèi)，使用干燥清潔的氮?dú)饬髟谠撊萜鲀?nèi)進(jìn)行晶 片干燥。19.表面清除將晶片裝入以灰化模式運(yùn)行的Glerm IOOOp等離子體灰化機(jī)中 (晶片放在一個(gè)底板(grounded plate)上，動(dòng)力板下)，并以140毫托的壓強(qiáng)、400瓦特的正 向功率在40千赫下進(jìn)行30秒的氧等離子體表面清除。使用ISsccm的分子氧流。20.鋁蒸發(fā)在表面清除后的5分鐘內(nèi)將該晶片放入金屬蒸發(fā)器中。將一層IOOnm 的熱蒸發(fā)的鋁沉積在該晶片上。蒸發(fā)在不小于2X 10_6托的壓強(qiáng)下以25埃/秒的速率進(jìn) 行，并使用Inficon控制器進(jìn)行監(jiān)控。21.鋁厚度測(cè)量應(yīng)用P-10表面光度儀(Tencor)測(cè)量鋁的厚度。22.零模波導(dǎo)剝離(decasting)通過(guò)將特氟綸容器或其他抗化學(xué)腐蝕的容器中 的零模波導(dǎo)浸入1165剝離劑(Shipley Chemicals, Rohm-Haas)浴中或AZ-300T剝離劑 (Shipley Chemicals, Rohm-Haas)浴中，將其從包覆的鋁膜上剝離。通過(guò)將裝有剝離劑和 晶片的容器放入超聲波儀中，對(duì)其進(jìn)行超聲處理。晶片在剝離浴中放置30分鐘或更長(zhǎng)至大 約45分鐘，并輕輕地?cái)嚢琛?3.沖洗將剝離浴從超聲波儀中移開(kāi)。從剝離浴中取出晶片，并浸入去離子水浴 中。晶片在該第二浴中放置2分鐘并輕輕地手動(dòng)攪拌。從去該浴中取出晶片，并用去離子 水噴灑直至徹底地完成沖洗過(guò)程。24.干燥在最后沖洗的1分鐘內(nèi)，使用干燥清潔的氮?dú)饬髟谠撊萜鲀?nèi)進(jìn)行晶片干
O25.光致抗蝕劑涂覆以1500轉(zhuǎn)/分的速度用Shipley 1827光致抗蝕劑旋轉(zhuǎn)涂 覆晶片。涂覆約5毫升的抗蝕劑。加速和減速設(shè)定為5秒。
36
26.抗蝕劑烘烤將晶片放在115°C的CEE熱板上烘烤15分鐘。該熱板配有真空 機(jī)構(gòu)，可以使晶片和熱板表面有良好的熱接觸。27.切割使用K & S-7100切割機(jī)(Kulicke & Soffa)使用樹(shù)脂/金剛石刀片 (ADT 00777-1030-010-QIP 600)對(duì)晶片進(jìn)行切割。晶片在切割之前要放置到低粘性膠帶上。28.模具去除用手從膠帶上取下模具并儲(chǔ)存。29.抗蝕劑去除通過(guò)將模具首先浸入丙酮浴中1分鐘，然后浸入2-丙醇浴中2分 鐘并輕輕地手動(dòng)攪拌，除去1827光致抗蝕劑層。30.模具干燥從2-丙醇浴中取出模具后，用干燥的清潔空氣進(jìn)行干燥。31.等離子體清潔將晶片放入Drytek 100等離子體蝕刻機(jī)中，并在140毫托的 壓力、85sCCm氧的分子氧流和500瓦特正向功率的射頻功率下以13兆赫進(jìn)行1分鐘的氧等 離子體處理?；蛘?，也可以在2托的壓力、10. 5瓦特的功率下用Harrick等離子體清潔機(jī) PDC-32G進(jìn)行5分鐘的干燥清潔空氣等離子體處理。實(shí)施例2單個(gè)DNA聚合酶分子酶促合成DNA鏈的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)該實(shí)驗(yàn)可以利用如下詳述的光學(xué)系統(tǒng)和反應(yīng)混合物進(jìn)行。但是，提到任何具體的 光學(xué)系統(tǒng)和參數(shù)、緩沖液、試劑、濃度、PH、溫度等并不是限制性的。其作為實(shí)施本發(fā)明的方 法的一個(gè)示例性的實(shí)施例。使用熒光標(biāo)記的核苷酸實(shí)時(shí)跟蹤單個(gè)DNA聚合酶分子酶促合成DNA鏈。應(yīng)用稀 釋的酶溶液，通過(guò)非特異性結(jié)合，將單個(gè)的Phi29N62DDNA聚合酶(Amersham Biosciences, Piscataway,NJ)固定在零模波導(dǎo)(ZMWs)中。固定化后，清洗ZMW結(jié)構(gòu)除去未結(jié)合的酶，然 后暴露于含有反應(yīng)試劑的溶液。并于DNA模板，使用一種70bp的預(yù)引發(fā)的環(huán)狀DNA序列， 其以特征性的不對(duì)稱間距包含兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤堿基(圖9A)。鏈置換聚合酶如Phi29 DNA聚合 酶將繼續(xù)環(huán)繞該環(huán)狀模板并因此產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)的、高度重復(fù)的互補(bǔ)DNA鏈。RllO-dCTP(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)被用作熒光標(biāo)記的核苷酸類 似物，其中熒光團(tuán)通過(guò)一個(gè)與Y磷酸連接的連接體連接到核苷酸上。與更為常用的堿基 標(biāo)記的核苷酸類似物相反，隨著連接的核苷酸摻入到不斷增長(zhǎng)的DNA鏈內(nèi)，γ磷酸連接的 類似物可以通過(guò)DNA聚合酶的酶活性切割，然后該標(biāo)記自由地?cái)U(kuò)散到DNA聚合酶周圍的有 效觀察體積之外。熒光團(tuán)的有效去除確保持續(xù)較低的本底水平，并防止明顯干擾DNA聚合 酶的活性。Y磷酸連接的熒光團(tuán)的這些特征可優(yōu)選用于該用途，因?yàn)樗麄兡軌蛴脽晒鈭F(tuán)標(biāo) 記的類似物替換所有四種堿基。核苷酸的結(jié)合及其后續(xù)向核酸內(nèi)的摻入與錯(cuò)配事件不同， 因?yàn)檫@兩個(gè)過(guò)程的速率常數(shù)明顯不同，并且核苷酸摻入包括幾個(gè)阻止零延遲事件的后續(xù)步 馬聚ο所有其他的核苷酸都不進(jìn)行標(biāo)記。我們已經(jīng)建立了一個(gè)非常有效的方法去除核苷 酸類似物制劑中剩余的痕量的天然dNTP，通過(guò)在聚合試驗(yàn)前使用堿性磷酸酶進(jìn)行酶純化， 以確保不會(huì)由于摻入未標(biāo)記的dNTP而引入這些錯(cuò)誤。為了研究這些條件下Phi29N62D DNA聚合酶的速率和持續(xù)合成能力，在溶液中并且 使用固定在玻璃表面的酶，在反應(yīng)混合物中使用RllO-dCTP完全替代dCTP測(cè)量摻入特征。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶能夠有效地利用這種類似物，合成幾千個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的互補(bǔ)DNA，而在滾環(huán)合
37成方案中沒(méi)有中斷，使用兩個(gè)小的預(yù)形成的復(fù)制叉(圖9A)和較大的環(huán)狀DNA如M13 DNA0 只有兩個(gè)不對(duì)稱間隔的RllO-dCTP被整合入該模板內(nèi)。相似的實(shí)驗(yàn)表明DNA聚合酶可以被 固定在ZMW底部，而不丟失其催化活性。通過(guò)記錄單個(gè)ZMW中發(fā)出的熒光爆發(fā)，跟蹤滾環(huán)DNA合成期間熒光標(biāo)記的dCTP核 苷酸的摻入。觀察多個(gè)波導(dǎo)中的DNA聚合酶活性，其為持續(xù)幾分鐘的不同的熒光爆發(fā)。熒 光時(shí)間軌跡顯示特征性的雙爆發(fā)模式(圖9B)，每個(gè)爆發(fā)對(duì)應(yīng)于一個(gè)RllO-dCTP類似物向 DNA鏈內(nèi)的摻入事件和隨后熒光團(tuán)的切割。在由全時(shí)軌跡得到的爆發(fā)間隔直方圖中，可見(jiàn)兩 個(gè)峰，它們與沿短(14個(gè)堿基，約1秒)和長(zhǎng)(54個(gè)堿基，約4秒)DNA模板片段的DNA合成 相對(duì)應(yīng)，這與這些條件下在本體溶液中測(cè)量的總平均速度一致，即每秒約10個(gè)堿基對(duì)。值得注意的是，在10 μ m的熒光團(tuán)濃度時(shí)，單分子活性較易觀察到。在常規(guī)產(chǎn)生的 激發(fā)體積內(nèi)，熒光團(tuán)的數(shù)量很大以至于不能觀察到DNA聚合酶的各個(gè)酶轉(zhuǎn)化。這些實(shí)驗(yàn)通 過(guò)證實(shí)以下幾點(diǎn)證實(shí)了基于ZMW的單分子DNA測(cè)序方法的有效性(a) ZMW中DNA聚合酶的 固定化不影響其酶活性；(b)熒光Y磷酸連接的核苷酸類似物不抑制DNA聚合酶的活性； (c) ZMW提供了一個(gè)適當(dāng)?shù)募s束來(lái)檢測(cè)在試劑的生理學(xué)濃度下單分子DNA聚合酶的活性。一 般來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果證明了 ZMW允許進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)的單分子分析，尤其涉及任何能附著在表 面上并且其底物可以被熒光標(biāo)記的酶。實(shí)施例3應(yīng)用多種不同標(biāo)記的核苷酸的實(shí)時(shí)測(cè)序使用兩種不同的標(biāo)記核苷酸類似物進(jìn)行與以上實(shí)施例2所述相似的實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn) 可以利用如下詳述的光學(xué)裝置或系統(tǒng)以及反應(yīng)混合物進(jìn)行。但是，提到任何具體的光學(xué)裝 置和參數(shù)、緩沖液、試劑、濃度、PH、溫度等并非限制性的。其作為實(shí)施本發(fā)明的方法的一個(gè) 示例性的實(shí)施例。制備反應(yīng)樣品在一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中使用大約10 μ 1的反應(yīng)混合物。該反應(yīng)混合物 通常含有 0. 5-lmM 的 MnCl2、0. 1-1 μ M 的 DNA 模板、10 μ M 的 dATP、10 μ M 的 dAGP、10 μ M 的 SAP處理過(guò)的Alexa488-dC4P、10 μ M的SAP處理過(guò)的Alexa 568_dT4P以及DNA聚合酶。標(biāo) 記的dC4P和dT4P也可以用標(biāo)記的dA4P和dG4P代替。制備零模波導(dǎo)在聚合反應(yīng)之前，零模波導(dǎo)一般要在等離子體清洗機(jī)中再生。將覆 蓋ZMW的PDMS墊圈放置在波導(dǎo)上方，蓋住每個(gè)光約束。添加一份不含DNA聚合酶的上述反 應(yīng)混合物而不接觸波導(dǎo)表面。檢測(cè)擴(kuò)散背景。如果背景(即ZMW發(fā)出的熒光爆發(fā))較低并 且可以接受，就可將DNA聚合酶加至ZMW，并將其固定在上面。固定混合物一般含有0. 5至 ImM 的 MnCl2、0. 1-1 μ M 的模板、15ηΜ 的 DNA 聚合酶，在 25mM Tris-HCL，pH 7. 5 以及 IOmM β-巰基乙醇的緩沖液中。在約0°C溫育約15分鐘后，可以將聚合酶吸附于ZMW表面。然 后去除固定反應(yīng)混合物，替換成上述反應(yīng)混合物。使用一種配備有適宜激光例如Ar/Kr激光的顯微鏡系統(tǒng)，其包括用于同時(shí)收集和 檢測(cè)來(lái)自多個(gè)不同波導(dǎo)的信號(hào)以及用于分辨存在的A488和568熒光團(tuán)的光學(xué)裝置。該系 統(tǒng)包括一個(gè)物鏡和一系列用于從反射的激發(fā)光中分離發(fā)出的熒光的二向色/缺口關(guān)閉的 (notch-off)濾光器。發(fā)出的信號(hào)經(jīng)過(guò)一個(gè)楔形濾光片，將每一種熒光團(tuán)的信號(hào)組分在空間 上分開(kāi)，并將每個(gè)信號(hào)在EMCCD照相機(jī)上成像。聚合酶活性檢測(cè)將ZMW放置于顯微鏡下。開(kāi)啟透射照明光后，使用照像機(jī)在需要
38的時(shí)間內(nèi)，例如2分鐘或更長(zhǎng)的時(shí)間，監(jiān)測(cè)聚合反應(yīng)。數(shù)據(jù)被自動(dòng)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)上，該計(jì)算 機(jī)存儲(chǔ)并跟蹤ZMW中每個(gè)反應(yīng)的熒光爆發(fā)。一種環(huán)狀DNA根據(jù)上述的操作過(guò)程進(jìn)行測(cè)序，該DNA有一段重復(fù)的A堿基之后是 一段G堿基，或者具有一系列重復(fù)的A-G堿基。圖16顯示了一個(gè)代表性的熒光爆發(fā)譜，其 對(duì)應(yīng)于標(biāo)記核苷酸的每個(gè)摻入事件，表明用一種以上類型的標(biāo)記核苷酸已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)單 分子測(cè)序。來(lái)自多個(gè)不同重復(fù)和多個(gè)不同波導(dǎo)的脈沖數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析建立了對(duì)標(biāo)記堿基 摻入的依賴于序列的實(shí)時(shí)檢測(cè)。盡管為了舉例說(shuō)明而進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是應(yīng)當(dāng)指出，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或了 解的許多變化可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)實(shí)施。本文中提到的所有公開(kāi)的參考文獻(xiàn)和專利文件 都完整引入作為參考。
權(quán)利要求
一種核苷酸測(cè)序的方法，包括使靶核苷酸分子進(jìn)行模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng)，在多種類型的核苷酸或核苷酸類似物和顯示鏈置換活性的聚合酶的存在下，產(chǎn)生與靶核苷酸分子互補(bǔ)的新生核酸鏈；以及記錄核苷酸或核苷酸類似物摻入新生核苷酸鏈中的時(shí)序。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子是一種環(huán)狀核酸。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述靶核酸分子是一種環(huán)狀DNA。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng)多次處理靶核酸分子中相 同的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子包括在靶核酸分子內(nèi)多次存在的核 苷酸序列。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括環(huán)狀核酸的依賴于模板復(fù)制的產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中利用聚合酶對(duì)所述靶核酸分子測(cè)序一次以上。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中利用聚合酶對(duì)所述靶核酸分子測(cè)序兩次以上。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸類似物還包括一個(gè)標(biāo)記。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記在核苷酸或核苷酸類似物的堿基、糖部 分、α磷酸或β磷酸處連接到所述核苷酸或核苷酸類似物上。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記在末端磷酸處連接到核苷酸或核苷酸類 似物上。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記在核苷酸或核苷酸類似物的末端磷酸上， 包括選自一磷酸、二磷酸、三磷酸、四磷酸、五磷酸和六磷酸的磷酸部分。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中各類核苷酸或核苷酸類似物都有在所述記錄步驟 過(guò)程中區(qū)分彼此的標(biāo)記。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記是熒光共振能量轉(zhuǎn)移供體或受體。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子附著到載體上。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子與附著到載體上的引物雜交。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合酶附著到載體上。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述記錄是在模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng)發(fā)生時(shí)進(jìn)行的。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述記錄步驟包括鑒定在所述多種類型的核苷酸 或核苷酸類似物中提供的核苷酸或核苷酸類似物。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng)在一個(gè)光約束中發(fā)生。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng)在一個(gè)光約束陣列中發(fā)生。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中模板引導(dǎo)的聚合反應(yīng)在一個(gè)零模波導(dǎo)中發(fā)生。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中靶核酸分子和聚合酶形成了在一個(gè)光約束中固定 化的單個(gè)復(fù)合物。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中光約束陣列的填充分?jǐn)?shù)大于約0.0001。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其中光約束陣列在基板上的密度超過(guò)4ΧIO4約束/平方毫米。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其中光約束陣列在基板上的密度超過(guò)IO5約束/平方毫米。
27.一種具有表面的固體載體，其中該表面附有一個(gè)聚合酶陣列，其中該陣列的成員包 括具有鏈置換活性的、可以被單獨(dú)和光學(xué)分辨的聚合酶。
28.如權(quán)利要求27所述的固體載體，其中陣列內(nèi)至少一個(gè)單個(gè)聚合酶與一種靶核酸相 連，由該靶核酸通過(guò)聚合酶引起的模板引導(dǎo)的聚合作用可以生成新生鏈。
29.如權(quán)利要求27所述的固體載體，其中每個(gè)單獨(dú)的且光學(xué)可分辨的聚合酶被分別限 制在光約束中。
30.如權(quán)利要求29所述的固體載體，其中所述約束是一個(gè)零模波導(dǎo)。
31.一種零模波導(dǎo)，包括固定在其中的第一分子復(fù)合物，所述分子復(fù)合物包括與靶核酸 復(fù)合的聚合酶，其中該聚合酶通過(guò)依賴于模板的靶核酸復(fù)制多次處理所述靶核酸內(nèi)的核苷 酸序列。
32.如權(quán)利要求31所述的零模波導(dǎo)，其中所述靶核酸包括環(huán)狀核酸。
33.如權(quán)利要求31所述的零模波導(dǎo)，其中所述靶核酸包括多次存在于靶核酸內(nèi)的核苷 酸序列。
34.如權(quán)利要求32所述的零模波導(dǎo)，其中所述靶核酸包括環(huán)狀核酸。
35.如權(quán)利要求32所述的零模波導(dǎo)，其中所述靶核酸序列包括線性核酸。
36.一種構(gòu)建包含環(huán)繞芯的包層的光約束的方法，包括(a)提供涂覆有光致抗蝕劑層的基板；(b)使所述光致抗蝕劑層形成圖案，以限定所述芯的邊界；(c)除去圍繞所述限定的邊界的所述光致抗蝕劑層，使足量的光致抗蝕劑仍然占據(jù)所、去-H--還心；(d)將一層包層材料沉積在所述剩余的光致抗蝕劑和基板上；(e)除去沉積在所述剩余的光致抗蝕劑上的至少一部分所述包層材料；并且(f)除去步驟(e)中的所述光致抗蝕劑，形成被所述光約束的所述包層圍繞的所述芯。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述包層由半導(dǎo)體制成。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述包層由合金制成。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述合金是鋁合金。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述鋁合金含有多于0.0001%的雜質(zhì)。
41.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述包層涂覆有涂層材料。
42.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述芯是圓柱形的。
43.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述芯是非圓柱形的。
44.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述光約束阻止了大部分波長(zhǎng)大于截止波長(zhǎng)的入 射光穿過(guò)所述芯的傳播。
45.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述光約束阻止了90%以上的波長(zhǎng)大于截止波長(zhǎng) 的入射光穿過(guò)所述芯的傳播。
46.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述光約束阻止了99%以上的波長(zhǎng)大于截止波長(zhǎng) 的入射光穿過(guò)所述芯的傳播。
全文摘要
本發(fā)明涉及光約束，其制備方法，和使用光約束來(lái)分析分子和/或監(jiān)控化學(xué)反應(yīng)的方法。本發(fā)明包括的裝置和方法在高通量和低成本單分子分析中特別有用。
文檔編號(hào)C12M1/00GK101914620SQ20101024851
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2005年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者J·科爾拉赫, S·特納 申請(qǐng)人:加利福尼亞太平洋生命科學(xué)公司