專利名稱：抗-干擾素α的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及中和性抗-IFN-α單克隆抗體的產(chǎn)生和特性鑒定，這些抗體對(duì) 各種IFN-α亞型具有廣譜反應(yīng)性。本發(fā)明還涉及這些抗-IFN-α抗體在診斷與治療與 IFN-α的表達(dá)增加相關(guān)疾病，特別是自身免疫病如胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和全身性 紅斑狼瘡(SLE)中的應(yīng)用。
相關(guān)技術(shù)的描述干擾素_ α (IFN- α )雖然干擾素最初發(fā)現(xiàn)的是它們的抗病毒活性，但隨后的研究闡明了與這些強(qiáng)力細(xì) 胞因子有關(guān)的多種調(diào)節(jié)活性。I型干擾素形成了一個(gè)細(xì)胞因子的古老家族，包括IFN-a， IFN-β，IFN- δ，IFN-ω 以及 IFN- τ (Roberts 等人，J. Interferon Cytokine Res. 18 805-816 [1998])。他們由無內(nèi)含子的基因編碼并且廣泛分布于脊椎動(dòng)物中。其中IFN-β在 靈長(zhǎng)類和嚙齒類動(dòng)物中由單一基因編碼，在小鼠和人體中各發(fā)現(xiàn)了 10種和15種以上的不 同的IFN-α亞型。其他I型干擾素更有限，比如，豬的IFN- δ，牛和羊的IFN- τ，牛和人的 IFN-ω。因此，人I型干擾素包括IFN-α家族中的多個(gè)成員，以及IFN-β和IFN-ω家族 的單個(gè)成員。所有I型IFN看來都只結(jié)合一個(gè)受體，該受體含有至少兩個(gè)跨膜蛋白質(zhì)。另 一方面，II型干擾素由一個(gè)成員IFN-Y代表，并且結(jié)合一個(gè)獨(dú)特的受體。盡管所有的I型IFN，包括IFN-α，都顯示出抗病毒和抗增殖活性而因此有助 于控制病毒感染和腫瘤(Lefevre等人，Biochimie 80 :779_788 [1998] ；Horton等人， Cancer Res. 59 :4064_4068[1999] ;Alexenko 等 A, J.InterferonCytokine Res. 17 769-779[1997] ；Gresser, J. Leukoc. Biol. 61 :567_574[1997])，但也有幾種自身免疫疾 病與IFNa的表達(dá)增加有關(guān)，最顯著的是胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和全身性紅斑狼瘡 (SLE)。I型糖尿病，也就是自身免疫性糖尿病或胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，是一種自 身免疫疾病，該疾病的特征是自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞所引起的胰腺β細(xì)胞的選擇性破壞 (Bach, Endocr. Rev. 15 :516_542[1994] ；Castano 禾口 Eisenbarth, Annu. Rev. Immunol. 8 647-679 [1990] ；Shehadeh 和 Lafferty, DiabetesRev. 1 141-151 [1993])。IDDM 的病理 學(xué)非常復(fù)雜，涉及遺傳易感性宿主中的后生事件(可能是病毒感染)，胰腺β細(xì)胞和免 疫系統(tǒng)之間的相互反應(yīng)。許多細(xì)胞因子，包括IFN-α和IFN-Y，參與了人體與此病動(dòng)物 模型中的 IDDM 病理過程(Campbell 等人，J.Clin. Invest. 87 :739_742 [1991] ； Huang 等 人，Diabetes44 :658_664[1995] ；Rhodes 和 Taylor, Diabetologia 27 :601_603[1984])。 例如，已有報(bào)告說患IDDM病人的β細(xì)胞內(nèi)存在胰Ifn-amRNA表達(dá)和免疫反應(yīng)性 IFN-a (Foulis 等人，Lancet 2 1423-1427 [1987] ；Huang 等人，[1995]同上；Somoza 等人，J. Immunol. 153 :1360-1377 [1994])。IFN-α表達(dá)與人胰島內(nèi)主要組織相容性復(fù)合物(MHC) Ia類抗原的高表達(dá)有關(guān)(Foulis等人[1987]同上；Somoza等人[1994]同上)。在自身免疫 性糖尿病的兩種嚙齒動(dòng)物模型(易于患糖尿病的DPBB大鼠和鏈唑霉素處理的小鼠)中，胰 島內(nèi)Ifn-α mRNA的表達(dá)先于胰島炎和糖尿病(Huang等人，Immunity 1 :469_478[1994])。 此外攜帶雜合性人胰島素啟動(dòng)子-Ifn-α構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了伴有胰島炎的低胰 島素血癥型糖尿病(Stewart 等人，Science 260 1942-1946 [1993])?？磥硪葝u細(xì)胞在對(duì)潛在的致糖尿病性刺激如病毒的反應(yīng)中局部表達(dá)的IFN-α可激發(fā)胰島炎過程。與IFN-α作為始動(dòng)因素的作用相一致，已顯示它能誘導(dǎo)人胰島內(nèi)皮 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞間粘附分子-I(ICAM-I)和HLAIa類分子，這會(huì)導(dǎo)致胰島炎時(shí)白細(xì)胞的滲入 (Chakrabarti等，J. Immunol. 157 :522_528[1996])。此外，通過誘導(dǎo)胰島內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞 上的共刺激分子ICAM-I和B7. 2，IFN-α促進(jìn)了 T細(xì)胞的激活(Chakrabarti等人，Diabetes 45 :1336-1343[1996])。這些研究集合在一起表明β細(xì)胞早期表達(dá)IFN-α在自身免疫性 糖尿病的啟動(dòng)中可能是關(guān)鍵性的。雖然有許多報(bào)告提示IFN-γ涉及嚙齒動(dòng)物模型中IDDM 的發(fā)生，但是該細(xì)胞因子的表達(dá)與人IDDM之間相關(guān)性很差。只是在所選出的具有明顯淋巴 細(xì)胞滲入胰島的一組患者的胰島中，可能發(fā)現(xiàn)表達(dá)IFN-Y的細(xì)胞。而在不按此標(biāo)準(zhǔn)所選的 患者組中沒有發(fā)現(xiàn)IFN-Y表達(dá)與人IDDM之間的明顯關(guān)系。根據(jù)全身性紅斑狼瘡(SLE)病人IFN-α表達(dá)水平的增加，IFN-α也涉及SLE 的病理過程(Ytterberg 和 Schnitzer, Arthritis Rheum. 25 401-406[1982] ；Shi 等人， Br. J. Dermatol. 117 155-159 [1987]) 令人感興趣的是目前IFN-α正用于治療癌癥與 病毒感染，如乙肝或丙肝病毒感染引起的慢性肝炎。與IFN-α水平增高激發(fā)自身免疫性 的觀察相一致，已報(bào)道接受IFN-α治療的病人中自身免疫失調(diào)(如IDDM，SLE以及自身 免疫性甲狀腺炎)的出現(xiàn)明顯增加。例如，研究表明長(zhǎng)期使用IFN-α作為抗病毒療法 會(huì)引起 IDDM(ffaguri 等人，Diabetes Res. Clin. Pract. 23 :33_36[1994] ；Fabris 等人， J. Hepatol. 28 :514_517[1998])或 SLE(Garcia-Porrua 等人，Clin. Exp. Rheumatol. 16 107-108 [1998])。用IFN-α療法治療柯薩奇病毒B (CBV)感染，也與IDDM的引起相 關(guān)(Chehadeh 等人，J. Infect. Dis. 181 1929-1939 [2000])。類似地，在用 IFN-α 治 療的癌癥患者中有多個(gè)病例報(bào)告發(fā)現(xiàn)IDDM或SLE(Ronnblom等人，J. Intern. Med. 227 207-210[1990])ο抗體療法隨著一些單克隆抗體(mAb)被批準(zhǔn)于人體或者作后期臨床試驗(yàn)考核，使用單克隆 抗體作為治療劑已獲得了越來越多的接受。1986年美國食品和藥品署(FDA)第一個(gè)批準(zhǔn)的 mAb是用于治療同種異體移植物排斥的抗_CD3(0KT3)。此后，mAb領(lǐng)域的前進(jìn)步伐大為加 速，尤其是1994年起，導(dǎo)致另外7個(gè)mAb被批準(zhǔn)用于人體治療。這些包括1994年用于治療冠 狀血管成形術(shù)并發(fā)癥的keoPro ，1997年用于預(yù)防同種異體移植物排斥反應(yīng)的Zenapax (抗-⑶25)，1997年用于治療B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的Rituxan (抗-⑶20)，1998年 最初用于治療克羅恩氏病并且隨后在1999年用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的Infliximab (抗-TNF-α )，1998年用于預(yù)防同種異體移植物排斥反應(yīng)的Simulect (抗-⑶25)，1998 年用于治療呼吸道感染的Synagis (抗呼吸道合胞病毒的F蛋白)，以及1998年用于治療HER2過度表達(dá)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的Herceptin (抗-HER2/neu) (Glennie和Johnson， Immunol. Today 21 :403_410 [2000])。抗-IFN-α抗體 經(jīng)單克隆抗體治療干預(yù)能得以緩解的疾病狀態(tài)包括所有那些具有病理性靶抗 原水平的疾病。例如，能中和SLE患者血清中存在的和在IDDM中胰島表達(dá)的IFN-α的 抗體，是治療性干預(yù)這些疾病的潛在候選物。這也可用于IFN-a表達(dá)潛在性增加和起 病因作用的其它自身免疫性疾病的治療性干涉。在人IDDM(Foulis等人，Lancet 2 1423-1427 [1987] ；Huang 等人，Diabetes44 658-664 [1995] ；Somoza 等人，J. Immunol. 153 1360-1377[1994])和人 SLE(Hooks 等人，Arthritis & Rheumatism 25 396-400[1982]； Kim 等人，Clin. Exp. Immunol. 70 :562_569 [1987] ；Lacki 等人，J. Med. 28 :99_107 [1997]； Robak等人,Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 46 :375_380[1998]； Shiozawa φ A, Arthritis & Rheumatism 35 417-422[1992] ；vonffussow φ 人， Rheumatology International 8 :225_230 [1988]) 二者中，看起來疾病都與 IFN-α 有關(guān)， 但與IFN-β或IFN-γ無關(guān)。因而，抗干擾素mAb在IDDM或SLE中的干預(yù)要求對(duì)大多數(shù) (如果不是所有的)IFN-α亞型產(chǎn)生特異性中和而不引起IFN-β或IFN-γ的任何明顯性 中和。保留后兩種干擾素的活性完整也可能有利于保留明顯的抗病毒活性。雖然已有描述說一些mAb對(duì)一定范圍的重組人IFN-α亞型顯示了反應(yīng)活性，但 發(fā)現(xiàn)只能中和所分析的重組IFN-α亞型的有限亞組或者對(duì)激活的外周血白細(xì)胞產(chǎn)生的 IFN-α 亞型混合物無中和能力(Tsukui 等人，Microbiol. Immunol. 30 1129-1139[1986]； Berg, J.Interferon Res. 4 481-491[1984] ；Meager 禾口 Berg, J.Interferon Res. 6 729-736[1986] ；US PatentNo. 4，902，618 ；和 EP publication No. 0，139，676 Bi)。因此對(duì)不僅能結(jié)合大多數(shù)，優(yōu)選所有的IFN-α亞型而且能中和這些亞型同時(shí)不 干擾其它干擾素生物功能的抗-IFN-α抗體有很大需要。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明以一種單克隆抗體的開發(fā)為基礎(chǔ)，該單克隆抗體在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)能中和所有 7種受測(cè)試的不同的重組人IFN-α亞型和兩種天然人IFN-α亞型的獨(dú)立的合并物。一方面，本發(fā)明提供了一種抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體能結(jié)合至少人IFN-α 亞型IFN-α 1，IFN-α 2，IFN-α 4，IFN-α 5，IFN-α 8，IFN-α 10 以及 IFN-α 21 并中和其生 物活性。另一方面，本發(fā)明提供了一種能結(jié)合所有人IFN-α亞型并中和其生物活性的抗人 IFNa單克隆抗體。本發(fā)明的抗體能顯著降低或者消除所討論人IFN-a的生物活性。在 一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的抗體能中和目標(biāo)人IFN- α的生物活性的至少60 %或至少70 %，較佳 至少75 %，更佳至少80 %，再佳至少85 %，還要佳至少90 %，還要更佳至少95 %，最佳至少 99%。在另一實(shí)例中，這種中和人IFN-a生物活性的單克隆抗體不中和人IFN-β的相應(yīng) 生物活性。目標(biāo)人IFN-α的生物活性可以是IFNAR2結(jié)合活性。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提 供的抗人IFN-α單克隆抗體能夠結(jié)合所有的或基本上所有的人IFN-α亞型并阻斷IFNAR2 結(jié)合活性的至少60 %或至少70 %，較佳至少75 %，更佳至少80 %，再佳至少85 %，還要佳至 少90%，還要更佳至少95%，最佳至少99%。在另一實(shí)施例中本發(fā)明提供一種抗人IFN-a 單克隆抗體，它能結(jié)合每種人IFN- α亞型1、2、4、5、8、10和21并阻斷IFNAR2結(jié)合活性的至少60 %或至少70 %，較佳至少75 %，更佳至少80 %，再佳至少85 %，還要佳至少90 %，還要 更佳至少95%，最佳至少99%。在另一實(shí)施例中，該抗人IFN-α單克隆抗體不與人IFN-β 交叉反應(yīng)。目標(biāo)人IFN-α的生物活性可以是抗病毒活性。在一個(gè)實(shí)施例中，抗人IFN-α單 克隆抗體能與所有的或基本上所有的人IFN-α亞型結(jié)合并中和其抗病毒活性。在另一實(shí) 施例中，該抗人IFN-α單克隆抗體能結(jié)合每種人IFN-α亞型1、2、4、5、8、10和21并中和 其抗病毒活性。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供的抗人IFN-a單克隆抗體能夠結(jié)合所有 的或基本上所有的人IFN-α亞型并中和其抗病毒活性的至少60%或至少70%，較佳至少 75 %，更佳至少80 %，再佳至少85 %，還要佳至少90 %，還要更佳至少95 %，最佳至少99 %。 在還有另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供的抗人IFN-a單克隆抗體能結(jié)合每種人IFN-α亞型1、 2、4、5、8、10和21并中和其抗病毒活性的至少60%或至少70%，較佳至少75%，更佳至少 80 %，再佳至少85 %，還要佳至少90 %，還要更佳至少95 %，最佳至少99 %。在還有另一實(shí) 施例中，這種中和人IFN-α的抗病毒活性的單克隆抗體不中和人IFN-β的抗病毒活性。 此抗體可以是小鼠的、人源化的或人的抗體。此抗體可以是小鼠抗人IFN-a單克 隆抗體9F3或它的人源化版本如版本13(V13)或其嵌合形式。本發(fā)明的范圍還包括能與小 鼠抗人IFN-α單抗9F3或其人源化或嵌合形式結(jié)合基本上相同的IFN-α表位的抗體。例 如，用于這一目的的參考抗體是2001年1月18日存放在ATCC的登錄號(hào)No. PTA-2917的小 鼠雜交瘤細(xì)胞系9F3. 18. 5產(chǎn)生的抗-IFN-α抗體。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了小鼠 或鼠/人嵌合性抗人IFN-α單克隆抗體，該抗體含有如圖5A (SEQ ID N0:1)所示的小鼠 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列和/或圖5B(SEQ ID NO :2)所示的小鼠重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基 酸序列。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了人源化抗人IFN-a單克隆抗體，該抗體含有如圖 5A(SEQ ID NO 3)所示的人源化輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列和/或圖5B (SEQ ID NO 5)所 示的人源化重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。還提供了一種抗人IFN-a單克隆抗體，該抗體能與小鼠抗人IFN-α單克隆抗體 9F3或其人源化或嵌合形式結(jié)合基本上相同的人IFN-a亞型1，2，4，5，8，10和21上的表 位。本文還提供了抗人IFN-a單克隆抗體，該抗體能與小鼠抗人IFN-α單克隆抗體9F3 競(jìng)爭(zhēng)與每種人IFN-α亞型1，2，4，5，8，10和21相結(jié)合。也提供了編碼本文所述任一抗體的分離的核酸分子，含有該分離的核酸分子的載 體，被該核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生此抗體的方法，該方法包括在該核酸分子表達(dá)的 條件下培養(yǎng)此宿主細(xì)胞以產(chǎn)生此抗體并任選地從此宿主細(xì)胞回收此抗體。此抗體可以是 IgG類和亞型如IgGl，IgG2，IgG3或IgG4。本發(fā)明的范圍也包括抗體片段如Fv，scFv，F(xiàn)ab， F(ab，)2和 Fab，片段。另一方面，本發(fā)明提供了抗人IFN-α單克隆抗體輕鏈或其片段，它們包含以下 CDR(如 Kabat 等人所定義，Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,第五版， NIH Publication 91-3242，Bethesda MD[1991]，第 1-3 卷)(a)式 RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 Ll ； (b)式 YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；以及(C)式 QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的L3。本發(fā)明的范圍也包括抗人IFN-α單克隆抗體輕鏈片段的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā) 明的范圍還包括抗人IFN- α單克隆抗體輕鏈多肽，該多肽含有小鼠/人嵌合性輕鏈可變結(jié) 構(gòu)域氨基酸序列或整個(gè)嵌合性輕鏈多肽氨基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號(hào)為N0.PTA-2880的XAIFN-CHLpDRl載體所編碼。本發(fā)明的范圍還包括抗人IFN-a單 克隆抗體輕鏈多肽，該多肽含有人源化輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列或整個(gè)人源化輕鏈多肽 氨基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號(hào)為NO. PTA-2882的VLV30_IgG載體 所編碼。另一方面，本發(fā)明提供了抗人IFN-a單克隆抗體重鏈或其片段，它們含有下述 CDR (a)式 GYTFTEYIIH(SEQ ID NO: 10)的 HI ； (b)式 SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO: 11) 的H2;以及(c)式WISDFFDY(SEQID NO 12)的H3。本發(fā)明的范圍也包括抗人IFN-a單 克隆抗體重鏈片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的范圍還包括抗人IFN-a單克隆抗體重鏈 多肽，該多肽含有小鼠/人嵌合性重鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個(gè)嵌合性重鏈多肽氨基酸序 列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號(hào)為NO. PTA-2883的XAIFN_ChHpDR2載體所編 碼。本發(fā)明的范圍還包括抗人IFN-a單克隆抗體重鏈多肽，該多肽含有人源化重鏈可變區(qū) 氨基酸序列或整個(gè)人源化重鏈多肽氨基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號(hào) 為 NO. PTA-2881 的 VHV30-IgG2 載體所編碼。另一方面，本發(fā)明提供了抗人IFN-a單克隆抗體，該抗體包含(A)至少一條輕 鏈或其片段，它們含有如下CDR: (a)式RASQSVSTSSYSYMH(SEQID NO 7)的LI ； (b)式 YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；以及(C)式 QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3 ； (B)至少 一條重鏈或其片段，它們含有如下CDR: (a)式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO 10)的HI ； (b)式 SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2;以及(c)式 WISDFFDY (SEQID NO 12)的 H3。此 抗體可以是由兩對(duì)由二硫鍵鍵合的抗體重鏈-輕鏈構(gòu)成的同型四聚體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的范圍 具體包括線形抗體，小鼠抗體，嵌合抗體，人源化抗體，或人抗體。還提供了一種嵌合性抗 體，該抗體包含(1)小鼠/人嵌合性輕鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個(gè)嵌合性輕鏈多肽氨基酸 序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號(hào)為NO. PTA-2880的XAIFN-ChLpDRl載體所 編碼；和(2)小鼠/人嵌合性重鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個(gè)嵌合性重鏈多肽氨基酸序列， 其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號(hào)為NO. PTA-2883的XAIFN_ChLpDR2載體所編碼。 本文還提供了一種人源化抗體，該抗體包含(1)人源化的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個(gè) 人源化輕鏈多肽氨基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號(hào)為NO. PTA-2882的 VLV30-IgG載體所編碼；和(2)人源化的重鏈可變區(qū)氨基酸序列或整個(gè)人源化重鏈多肽氨 基酸序列，其由ATCC 2001年1月9日保存的登錄號(hào)為NO. PTA-2881的VHV30_IgG2載體所 編碼。還有一方面，本發(fā)明提供了含有有效量的本發(fā)明抗體與藥學(xué)上可接受運(yùn)載體相混 合的藥物組合物。還有一方面，本發(fā)明提供了診斷與細(xì)胞中IFN-a表達(dá)相關(guān)狀態(tài)的方法，該方法包 括使抗-IFN-a抗體接觸細(xì)胞并檢測(cè)IFN-a的存在。還有一方面，本發(fā)明提供了治療患者與IFN-a表達(dá)相關(guān)的疾病或狀態(tài)的方法，該 方法包括給予患者有效量的抗-IFN-a抗體。該患者是哺乳動(dòng)物患者，優(yōu)選人類患者。該 疾病是自身免疫性疾病，如胰島素依賴性糖尿糖(IDDM)；全身性紅斑狼瘡(SLE)；或自身免 疫性甲狀腺炎。本發(fā)明還涉及54. 一種抗IFN-a單克隆抗體，該抗體與至少IFN-a亞型IFN_a 1，IFN-a 2，IFN- a 4，IFN- a 5，IFN- a 8，IFN- a 10 和 IFN_ a 21 結(jié)合并中和 其生物活性。55.如項(xiàng)1所述的抗體，該抗體為鼠抗體。56.如項(xiàng)1所述的抗體，該抗體為人源化抗體。57.如項(xiàng)1所述的抗體，該抗體為人抗體。58.如項(xiàng)1所述的抗體，其中所述生物活性為抗病毒活性。59.如項(xiàng)5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN- a諸亞型至少70%的抗病 毒活性。60.如項(xiàng)5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN- a諸亞型至少80%的抗病
毒活性。61.如項(xiàng)5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN- a諸亞型至少90%的抗病
毒活性。62.如項(xiàng)5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN- a諸亞型至少99%的抗病
毒活性。63.如項(xiàng)1所述的抗體，該抗體能與鼠抗人IFN-a單克隆抗體9F3或其人源化或 嵌合形式結(jié)合基本上相同的IFN-a表位。64.如項(xiàng)1所述的抗體，該抗體是鼠抗人IFN- a單克隆抗體9F3或其人源化或嵌 合形式。65.如項(xiàng)11所述的抗體，該抗體是人源化的抗人IFN- a單克隆抗體9F3的版本 13(V13)。66.如項(xiàng)1所述的抗體，該抗體能與2001年1月18日保藏于ATCC的、保藏號(hào)為 PTA-2917的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗IFN-a抗體結(jié)合基本上相同的IFN-a表位。67.如項(xiàng)1所述的抗體，該抗體為IgG類。68.如項(xiàng)14.所述抗體，該抗體有IgGi，IgG2，IgG3，或IgG4同種型。69.如項(xiàng)1所述的抗體，該抗體為抗體片段。70.如項(xiàng)16所述的抗體，該抗體為Fab片段。71.如項(xiàng)16所述的抗體，該抗體為F(ab，)2片段。72.如項(xiàng)16所述的抗體，該抗體為Fab，片段。73. 一種抗IFN- a抗體輕鏈或其片段，該輕鏈或其片段含有下列⑶R (a)化學(xué)式 RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 L1 ；(b)化學(xué)式 YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；禾口(c)化學(xué)式 QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3。74.如項(xiàng)20所述的抗IFN- a抗體輕鏈片段，該輕鏈片段為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。75. 一種抗IFN- a抗體重鏈或其片段，該重鏈或其片段含有下列⑶R (a)化學(xué)式 GYTFTEYIIH(SEQ ID NO: 10)的 HI ；(b)化學(xué)式 SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2 ；(c)化學(xué)式 WISDFFDY(SEQ ID NO 12)的 H3。76.如項(xiàng)22所述的抗IFN- a抗體重鏈片段，該重鏈片段為重鏈可變結(jié)構(gòu)域。77. 一種抗IFN-a抗體，該抗體含有(A)至少一條輕鏈或其片段，該輕鏈或其片段含有下列⑶R
(a)化學(xué)式 RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 L1 ；(b)化學(xué)式 YASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；和
(c)化學(xué)式 QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3 ；和(B)至少一條重鏈或其片段，該重鏈或其片段含有下列⑶R (a)化學(xué)式 GYTFTEYIIH(SEQ ID NO: 10)的 HI ；(b)化學(xué)式 SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2 ；和(c)化學(xué)式 WISDFFDY(SEQ ID NO 12)的 H3。78.如要求24所述的抗體，該抗體具有同質(zhì)四聚體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有兩個(gè)由二硫 鍵聯(lián)接的抗體重鏈-輕鏈對(duì)。79.如項(xiàng)24所述的抗體，該抗體為線形抗體。80.如項(xiàng)24所述的抗體，該抗體為鼠抗體。81.如項(xiàng)24所述的抗體，該抗體為嵌合抗體。82.如項(xiàng)24所述的抗體，該抗體為人源化抗體。83.如項(xiàng)24所述的抗體，該抗體為人抗體。84. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項(xiàng)1所述的抗體。85. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項(xiàng)11所述的抗體。86. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項(xiàng)12所述的抗體。87. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項(xiàng)24所述的抗體。88. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項(xiàng)20所述的抗體輕鏈或其輕鏈片段。89. 一種分離的核酸分子，該分子編碼項(xiàng)22所述的抗體重鏈或其重鏈片段。90. 一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子含有于2001年1月9日在ATCC保存 的登錄號(hào)PTA-2882的載體中編碼輕鏈多肽的核酸序列。91. 一種分離的核酸分子，該分子含有于2001年1月9日在ATCC保存的登錄號(hào) PTA-2881的載體中編碼重鏈多肽的核酸序列。92. 一種載體，該載體含有項(xiàng)31至38任何一項(xiàng)所述的核酸分子。93. 一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是用項(xiàng)31至38任何一項(xiàng)所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞。94.產(chǎn)生如項(xiàng)1，11，12和24任何一項(xiàng)所述的抗體的方法，該方法包括，在使編碼該 抗體的核酸序列表達(dá)從而產(chǎn)生抗體的條件下，培養(yǎng)含有該核酸序列的宿主細(xì)胞。95. 一種雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系含有項(xiàng)31至38任何一項(xiàng)所述的核酸分子。96. 一種雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系由ATCC于2001年1月18日保存，登錄號(hào) 為 PTA-2917。97. 一種項(xiàng)42所述的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。98. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學(xué)上可接受的載體混合的有效量的 項(xiàng)1所述的抗體。99. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合的有效量 的項(xiàng)11所述的抗體。100. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合的有效量的項(xiàng)12所述的抗體。101. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合的有效量 的項(xiàng)24所述的抗體。102. 一種診斷與細(xì)胞內(nèi)IFN-a表達(dá)有關(guān)的疾病的方法，該方法包括使所述細(xì)胞 與項(xiàng)1所述的抗IFN-a抗體接觸，并檢測(cè)IFN-a的存在。103. 一種治療與患者體內(nèi)IFN-a表達(dá)有關(guān)的疾病的方法，該方法包括給予所述 患者有效量的如項(xiàng)1所述的抗IFN-a抗體。104.如項(xiàng)50所述方法，其中所述患者為哺乳動(dòng)物患者。105.如項(xiàng)51所述方法，其中所述患者為人。106.如項(xiàng)52所述方法，其中所述疾病為自身免疫性疾病。54.如項(xiàng)53所述方法，其中所述疾病選自于胰島素依賴性糖尿病(IDDM)；和全身 性紅斑狼瘡(SLE)；和自身免疫性甲狀腺炎。圖表簡(jiǎn)述

圖1表示用于產(chǎn)生抗人IFN-a單克隆抗體的策略的簡(jiǎn)圖。圖2表示小鼠抗人IFN- a mAb (9F3)能中和重組IFN_ a亞型譜系但不能中和重組 IFN-日。測(cè)試了在mAb 9F3濃度增加時(shí)所示IFN對(duì)腦心肌炎(EMC)病毒在A549細(xì)胞內(nèi)生 長(zhǎng)的抑制。所述數(shù)據(jù)為在mAb 9F3缺乏時(shí)用所示IFN獲得的病毒生長(zhǎng)抑制活性的百分比。圖3A-3B顯示了白細(xì)胞干擾素(Sigma)(圖3A)和類淋巴母細(xì)胞干擾素(NIH參考 品Ga23-901-532)(圖3B)的中和作用。在圖3A中，將20000IU/ml (實(shí)心柱)或5000IU/ ml (空白柱)的白細(xì)胞干擾素(Sigma Product No. 1-2396)與空白對(duì)照物(只有緩沖液) (以“_”表示)，10 :g/ml 小鼠 IgG 對(duì)照物(以“mlgG”表示)，或 10 :g/ml mAb 9F3 (以“9F3” 表示)一起培育。測(cè)試諸稀釋液并顯示殘余活性的量。所示結(jié)果為一式二份測(cè)定的平均值。 在圖3B中，測(cè)定了在所示濃度的mAb 9F3存在或不存在下，類淋巴母細(xì)胞干擾素在10 (實(shí) 心柱)或3(空白柱)IU/ml時(shí)的作用。較高的細(xì)胞病變效應(yīng)表明干擾素活性下降。所示結(jié) 果為一式二份測(cè)定的平均值。圖4描述了電泳遷移率變化試驗(yàn)(EMSA)的結(jié)果，表明IFN- a誘生了 ISGF3/ISRE 復(fù)合物以及9F3 mAb能阻止該復(fù)合物的形成。在存在或缺乏25ng/ml濃度的人IFN- a 2 (以 “a 2”表示)或IFN-3 (以“3 ”表示)時(shí)用10 :g/ml濃度的9F3mAb(以“9F3”表示)或 小鼠IgG對(duì)照抗體(以“IgG”表示)進(jìn)行了 EMSA。圖5A 顯示了小鼠 9F3(小鼠 SEQ ID NO 1)、人源化 9F3 版本 13 (V13，SEQ ID NO: 3)和共有的人可變區(qū)輕鏈k I亞族(huK I，SEQ ID NO ；4)的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的 排列對(duì)比。CDR(L1，SEQ ID NO 7 ；L2,SEQ ID NO :8 ；以及 L3，SEQ ID NO 9)以下劃線突出 顯示。殘基編號(hào)按照Kabat等人，(1991)同上。用星號(hào)標(biāo)明小鼠9F3和V13序列之間的差 異，以及9F3和HuKI序列之間的差異。圖5B 顯示了小鼠 9F3(小鼠 SEQ ID NO :2)、人源化 9F3 版本 13 (V13，SEQ ID NO: 5)和共有的人可變區(qū)重鏈III亞族(huIII，SEQ ID NO ；6)的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的 排列對(duì)比。CDR(H1，SEQ ID NO 10 ；H2,SEQ IDN0 :11 ；以及 H3，SEQ ID NO 12)以下劃線突 出顯示。殘基編號(hào)按照Kabat等人，(1991)同上。用星號(hào)標(biāo)明小鼠9F3和V13序列之間的 差異，以及9F3和huIII序列之間的差異。
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圖6顯示初始mAb 9F3 (左圖)和嵌合蛋白質(zhì)CH8-2 (右圖)對(duì)受腦心肌炎(EMC) 病毒攻擊的A549細(xì)胞中重組IFN- a亞型抑制病毒生長(zhǎng)的中和活性。圖7描述了人源化9F3版本13的模型。VL和VH結(jié)構(gòu)域的骨架顯示為緞帶。⑶R 以白色表示并作標(biāo)記(Ll，L2，L3，HI, H2，H3)?？蚣軅?cè)鏈從人到小鼠的轉(zhuǎn)換以白色表示并 標(biāo)記了殘基編號(hào)。優(yōu)詵實(shí)施例的詳細(xì)描述A.定義除非另有說明，本文所用的技術(shù)與科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人 員共同理解的相同含義。見，例如Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology 第二版，J. Wiley & Sons 出版(NewYork，NY 1994) ；Sambrook 等人， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSprings Harbor Press(Cold Springs Harbor, NY 1989)。為了本發(fā)明的目的，下述術(shù)語定義如下。如本文所用，術(shù)語“I型干擾素”定義為包括任何哺乳動(dòng)物的自然序列的I型干擾 素的所有亞型，包括干擾素_ a，干擾素_ 0，干擾素_ S，干擾素_ (0和干擾素_ t。類似的， 術(shù)語“人I型干擾素”定義為包括自然序列的I型人干擾素的所有亞型，包括人干擾素-a， 干擾素和干擾素種類并且它們能結(jié)合一共同的細(xì)胞受體。除非另外提供解釋，本文所用術(shù)語“干擾素-a "IFN-a ”，“人干擾素-a ”， “人IFN-a”以及“hlFN-a”是指自然序列的人a干擾素的所有種類，包括自然序列的 人干擾素-a的所有亞型。自然的(自然序列)人干擾素-a包含23種或更多密切相 關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)由具有高度結(jié)構(gòu)同源性的不同基因所編碼(Weissmarm和Weber， Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol, 33 251 [1986] ;J.Interferon Res.，13 :443_444[1993]； Roberts 等人 J. Interferon CytokineRes. 18 :805_816 [1998]).人 IFN-a 基因座包含兩個(gè) 亞家族。第一亞家族包括至少14個(gè)有功能的非等位基因，包括編碼IFN-a A，(IFN- a 2)， IFN- a B (IFN- a 8)，IFN- a C (IFN- a 10) , IFN- a D (IFN- a 1) , IFN- a E (IFN_a22)， IFN-a F (IFN-a 21)，IFN-a G (IFN-a 5)禾口 IFN—a H (IFN—a 14)的基因，以及至少具有 80%同源性的擬基因。第二亞家族，a工工或！"，至少包含5個(gè)擬基因和1個(gè)功能性基因(本 文以“IFN-a n 1”或“IFN-T”表示)，該功能性基因表現(xiàn)出與IFN-a基因70%的同源性 (Weissmann 和 Weber [1986]同上)。本文所用術(shù)語“第一種人干擾素-a (hIFN-a)受體”，“ IFN_ a R”，“hlFNARl”、 “IFNARI”和“Uze鏈”是指由Uze等人，位U，60 =225-234(1990)所克隆的557個(gè)氨基酸的 受體蛋白質(zhì)，包括409個(gè)殘基的胞外結(jié)構(gòu)域，21個(gè)殘基的跨膜結(jié)構(gòu)域，以及100個(gè)殘基的胞 內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如Uze等人的229頁圖5所示。上述術(shù)語還包括含有IFNAR1胞外結(jié)構(gòu)域(EOT) (或ECD的片段)的IFNAR1片段。本文所用術(shù)語“第二種人干擾素-a (hIFN-a)受體，，，“IFN_a旦R”，“hIFNAR2”， "IFNAR2”和“Novick 鏈”是指由 Domanski 等人，J. Biol. Chen, 37 21606-21611 (1995)所克 隆的515個(gè)氨基酸的受體蛋白質(zhì)，包含217個(gè)殘基的胞外結(jié)構(gòu)域，21個(gè)殘基的跨膜結(jié)構(gòu)域， 和250個(gè)殘基的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如Domanski等人在21608頁圖1所示。上述術(shù)語還包括含有 IFNAR2胞外結(jié)構(gòu)域(EOT)(或EOT的片段)的IFNAR2片段，以及IFNAR2的可溶形式，如與 免疫球蛋白序列融合的IFNAR2 E⑶，例如下述的IFNAR2 E⑶-IgG Fc。
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與I型干擾素，IFN-a或任何其它多肽相連的術(shù)語“自然序列”，是指與相應(yīng)的自然 衍生的多肽具有相同氨基酸序列的多肽，不論它的制備方式如何。這樣的自然序列多肽可 從自然中分離得到或通過重組和/或合成方法或其任意組合產(chǎn)生。術(shù)語“自然序列”具體 包含該全長(zhǎng)多肽的自然產(chǎn)生的截短或分泌形式(如，胞外結(jié)構(gòu)域序列)，自然產(chǎn)生的變體形 式(如可變剪接形式)和自然產(chǎn)生的等位變體?！熬酆厦告湻磻?yīng)”或“PCR”指一種過程或技術(shù)，在其中微量的核酸RNA和/或DNA的 特定片段，如1987年7月28日公開的美國專利號(hào)NO. 4，683，195中所述那樣被擴(kuò)增。通常 地，需要獲得感興趣的區(qū)域兩端或之外的序列信息，這樣可設(shè)計(jì)出寡核苷酸引物；這些引物 的序列與待擴(kuò)增模板的相反鏈相同或相似。兩種引物的5 ‘末端核苷酸可與所擴(kuò)增材料的 兩末端重合。PCR可用于擴(kuò)增特定的RNA序列，整個(gè)基因組DNA的特定DNA序列，全細(xì)胞RNA 轉(zhuǎn)錄的cDNA，噬菌體或質(zhì)粒序列，等等。見Mullis等人，Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol. 51 :263 (1987) ；Erlich，編，PCR Technology (StocktonPress, NY, 1989).本文所用的 PCR是一種(但不是僅有的)核酸聚合酶反應(yīng)方法的例子，用于擴(kuò)增測(cè)試的核酸樣品，其包 括用已知核酸作為引物和核酸聚合酶來擴(kuò)增或產(chǎn)生核酸的特定片段?！翱贵w” (Ab)和“免疫球蛋白(Ig)”是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w表現(xiàn)出對(duì) 特定抗原的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。例 如，后一種多肽由淋巴系統(tǒng)低水平產(chǎn)生，在骨髓瘤中則水平升高。“自然抗體和免疫球蛋白”通常是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，包含兩 條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與一條重鏈相 連，而且不同的免疫球蛋白同種型重鏈之間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也具有有 規(guī)律相間隔的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈一端為可變區(qū)(VH)，隨后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈 一端為可變區(qū)(VL)，另一端為一恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)相對(duì)，輕鏈的 可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對(duì)。認(rèn)為特殊的氨基酸殘基形成了輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的界 面(Chothia 等人，J. Mol. Biol. 186 651 [1985] ；Novotny 和 Haber，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 4592[1985] ；Chothia 等人，Nature342 :877_883 [1989])。術(shù)語“可變”指如下情況抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上極其不同，用于各個(gè) 特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū) 中。它集中存在于輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)稱謂互補(bǔ)決定域(CDR)或高變區(qū)的3個(gè)區(qū)段中?？?變區(qū)中具有較高保守性的部分稱為框架區(qū)(FR)。每條天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)都含有4個(gè) FR區(qū)，大部分采取0折疊構(gòu)型，通過3個(gè)⑶R相連；3個(gè)⑶R形成環(huán)狀連接，有時(shí)形成3折 疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的⑶R通過FR區(qū)緊密靠近，并與另一鏈的⑶R—起構(gòu)成抗體的抗 原結(jié)合位點(diǎn)(見Kabat等人，[1991]同上)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn) 出各種效應(yīng)器功能，如參與抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒性?？贵w的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，各具有 一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))和一殘余的“Fc”片段(其名稱反映其易于結(jié)晶的能力)。胃蛋白酶處 理產(chǎn)生F(ab’)2片段，其具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能交聯(lián)抗原?！癋v”是含有完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv中，該區(qū)域由 非共價(jià)鍵緊密聯(lián)接的輕鏈和重鏈可變區(qū)的二聚體組成。在單鏈Fv中，重鏈和輕鏈可變區(qū)可 通過一柔性肽接頭共價(jià)連接，因而輕鏈和重鏈能以類似于雙鏈Fv中的“二聚體”結(jié)構(gòu)相連。正是在這種構(gòu)型中每個(gè)可變區(qū)的3個(gè)CDR互相作用確定了 VH-VL 二聚體表面的抗原結(jié)合位 點(diǎn)。6個(gè)CDR共同賦予了抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，盡管親和力低于完整的結(jié)合位點(diǎn)， 一個(gè)可變區(qū)(或只含有對(duì)抗原特異的3個(gè)CDR的半個(gè)Fv)仍然能識(shí)別并結(jié)合抗原。Fab片段也含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHI)。Fab ‘片段不同于Fab 段之處在于其在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域羧基未端添加了幾個(gè)殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè) 半胱氨酸。Fab，-SH指恒定區(qū)的半胱氨酸具有自由巰基的Fab，。F (ab，)2抗體片段最初產(chǎn) 生為成對(duì)的Fab’片段，此成對(duì)Fab’段之間有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也 是已知的。任何脊椎動(dòng)物抗體(免疫球蛋白)的輕鏈可根據(jù)它們恒定區(qū)的氨基酸序列分入兩 個(gè)明顯不同的型之一，稱為K和入。根據(jù)重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同類。有五大類免疫球蛋白 IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，這些類中的幾種可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，如IgGpIgGpIgG^ IgG4、IgAi和IgA2。對(duì)應(yīng)不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為a、S、￡、Y和y。免 疫球蛋白不同類的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。術(shù)語“抗體”包括完整的免疫球蛋白的所有類和亞類。術(shù)語“抗體”也包括抗體片 段。術(shù)語“抗體”明確包括單克隆抗體，包括抗體片段克隆?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，其含有完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？?體片段的例子包括Fab，F(xiàn)ab', F(ab')和Fv片段；雙抗體(diabodies)；單鏈抗體分子，包 括單鏈Fv(SCFv)分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。本文所用術(shù)語“單克隆抗體”指從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體(或抗體片 段)，即，構(gòu)成該群體的抗體個(gè)體除了可能的自然產(chǎn)生的極少量突變外其他都相同。單克 隆抗體具有高度特異性，只針對(duì)一個(gè)抗原位點(diǎn)。另外，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表 位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品相反，每種單克隆抗體只針對(duì)于抗原上的一 個(gè)決定簇。除了它們的特異性，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)是可通過雜交瘤培養(yǎng)來合成，而且不 會(huì)污染有其它免疫球蛋白。修飾詞“單克隆”表明該抗體的特征是從基本上的同質(zhì)的抗 體群獲得的，而不應(yīng)解釋為需要通過任何特別方法來生成。例如，可通過Kohler等人， Nature, 256 =495(1975)最先描述的雜交瘤方法制備或用重組DNA方法(見，如美國專利號(hào) NO. 4，816，567)制備用于本發(fā)明的單克隆抗體?！皢慰寺】贵w”還包括含有抗原識(shí)別和結(jié)合 位點(diǎn)的抗體片段的克隆(Fv克隆)，例如采用Clackson等人，Nature, 352 =624-628(1991) 和Marks等人J. Mol. Biol，222 :581_597 (1991)中所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離獲得。本文單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)以及這些抗體的片段， 此抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與一種特定動(dòng)物所衍生的或?qū)儆谀程囟惢騺嗩惪?體的抗體中相應(yīng)序列相同或相似，而該鏈的其余部分與另一種動(dòng)物所衍生的或?qū)儆诹硪?類或亞類抗體的抗體中相應(yīng)序列相同或相似，只要他們表現(xiàn)出所需的生物活性(授于 Cabilly 等人的美國專利號(hào) N0. 4，816，567 ；Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 6851-6855[1984])。非人(如小鼠)抗體的“人源化”形式是嵌合性的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或 其片段(如FV，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)，其中含有從非人免疫 球蛋白衍生的最小序列。人源化抗體大部分是人免疫球蛋白(受者抗體)；其中部分或全部的受者互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基，被來自非人動(dòng)物(供者抗體)(如大鼠、小鼠或家兔) 的具有所需特異性、親和性和活性的殘基所取代。有些情況中，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū) (FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基所取代。另外，人源化抗體可含有在受者抗體中或輸入的CDR 或框架序列中都沒有的殘基?？蛇M(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步精細(xì)化和優(yōu)化抗體的性能?？傊?人源化抗體含有至少1個(gè)，典型地2個(gè)基本上整個(gè)這樣的可變區(qū)，其中CDR區(qū)全部或基本 全部對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，而FR區(qū)全部或基本全部是人免疫球蛋白序列的FR 區(qū)。較佳地，人源化抗體還至少含有免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分(Fc)，通常為人免疫球蛋 白的。更多細(xì)節(jié)見 Jones 等人，Nature，321 :522_525 (1986) ；Reichmann 等人 Nature，332 323-329(1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 593-596(1992) ；and Clark, Immunol. Today 21 =397-402 (2000).人源化抗體包括Primatized ，其中該抗體的抗原結(jié)合區(qū)域衍 生自用感興趣抗原免疫的獼猴產(chǎn)生的抗體衍生?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)域以單一多肽 鏈存在。通常，scFv多肽還包含VH和VL區(qū)之間的多肽接頭，這使scFv形成抗原結(jié)合的所 需結(jié)構(gòu)° 對(duì)于 scFv 的綜述可見 Pluckthun, ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg 禾口 Moore 編.Springer-Verlag, New York,269-315 頁(1994), Dair Acqua 禾口 Carter, Curr. Opin. Struct. Biol. 8 :443_450 (1998)和 Hudson, Curr. Op in, Immunol. 11 :548_557(1999)。術(shù)語“雙抗體”指具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段含有在同一多肽 鏈(VH-VL)中的相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。采用的接頭短至不允許同 一鏈上的兩個(gè)區(qū)域之間形成配對(duì)，而迫使此二結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)從而產(chǎn) 生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于雙抗體的有更多描述，例如，見EP 404, 097 ；W0 93/11161 ；和 Hoi linger 等人，Proc. Natl. AcadSci, USA, 90 =6444-6448 (1993)?！胺蛛x的”抗體是已經(jīng)鑒定且與其天然環(huán)境成分相分離的和/或回收的抗體。其天 然環(huán)境的污染成分是可能會(huì)干擾該抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可包括酶，激素以及其 它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施例中，可提純?cè)摽贵w至(1)純度用Lowry方法測(cè)定 抗體重量在95%以上，最好在重量99%以上，(2)提純至足夠獲得N-未端或內(nèi)部氨基酸序 列的至少15個(gè)殘基的水平(使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀)，或(3)用考馬斯藍(lán)，或優(yōu)選銀染色在還原 或非還原條件下，用SDS-PAGE測(cè)定為均一性。由于沒有抗體天然環(huán)境的至少一種成分，分 離的抗體包括重組細(xì)胞中原位產(chǎn)生的抗體。然而一般情況下，分離的抗體將經(jīng)過至少一步 純化步驟制備?！爸泻托钥贵w”指一種抗體分子，該抗體分子能消除或顯著降低其所結(jié)合的靶抗原 的效應(yīng)器功能。因此，“中和性”抗IFN-a抗體能消除或顯著降低效應(yīng)器的功能，如IFN-a 的受體結(jié)合功能和/或?qū)?xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)。對(duì)于本發(fā)明的目的，可監(jiān)測(cè)抗-IFN-a抗體中和IFN_a的受體活化活性的能力， 例如，在1995年6月1日公開的W095/14930中所述的激酶受體活化(KIRA)試驗(yàn)中，測(cè)定 候選抗體降低IFNAR1/R2受體復(fù)合物的酪氨酸磷酸化(由于配體結(jié)合而致)的能力。對(duì)于本發(fā)明的目的，優(yōu)選通過監(jiān)測(cè)對(duì)IFN-a抗病毒活性的中和作用，測(cè)試 抗-IFN- a抗體中和IFN- a的細(xì)胞應(yīng)答誘導(dǎo)能力，如Kawade，J. InterferonRes. 1 61-70 (1980)，或 Kawade 和 Watanabe，J. Interferon Res. 4 :571_584 (1984)，或 Yousef i 等人，Am，J，Clin, Pathol. 83 735-740 (1985)所述，或通過在電泳遷移率變化試驗(yàn)中，測(cè)試抗 IFN-a抗體中和IFN-a激活信號(hào)分子，干擾素-刺激因子3 (ISGF3)，結(jié)合于干擾素刺激 反應(yīng)元件(ISRE)衍生的寡酸苷酸的能力的能力，如Kurabayashi等人Mol.Cell Biol. 15 6386(1995)所述?！帮@著”降低指降低靶抗原(如IFN- a )的效應(yīng)器功能(如受體(IFNAR2)結(jié)合和/ 或誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答)至少約60 %，或至少約70 %，較佳至少約75 %，更佳至少約80 %，再佳至 少約85 %，還要佳至少約90 %，還要更佳至少約95 %，最佳至少約99 %。優(yōu)選本文所定義的 “中和性”抗體能中和IFN-a抗病毒活性的至少約60%，或至少約70%，較佳至少約75%， 更佳至少約80 %，再佳至少約85 %，還要佳至少約90 %，還要更佳至少約95 %，最佳至少約 99%，如Kawade (1980)，同上或Yousefi (1985)，同上的抗病毒試驗(yàn)所測(cè)定的那樣。在另一 優(yōu)選實(shí)施例中，本文所用“中和性”抗體由于與IFN-a結(jié)合，能降低IFNAR1/IFNAR2受體復(fù) 合物的酪氨酸磷酸化至少約60 %，或至少約70 %，較佳至少約75 %，更佳至少約80 %，再佳 至少約85 %，還要佳至少約90 %，還要更佳至少約95 %，最佳至少約99 %，如上述參考文獻(xiàn) KIRA試驗(yàn)所測(cè)定的那樣。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施例中，本文所用的中和性抗IFN-a抗體能中 和全部，或基本全部的IFN-a亞型而不能中和IFN-日。在本文中，術(shù)語“基本上全部”指中 和性抗 IFN- a 抗體能至少中和 IFN- a 1，IFN- a 2，IFN- a 4，IFN- a 5，IFN- a 8，IFN- a 10， 以及 IFN-a 21。對(duì)于本發(fā)明的目的，抗IFN-a抗體阻斷IFN_a與受體結(jié)合的能力，定義為在競(jìng)爭(zhēng) 結(jié)合試驗(yàn)中某濃度的抗體降低或消除IFN-a與IFNAR2結(jié)合的特性或能力，與此試驗(yàn)中同 等濃度的無關(guān)對(duì)照抗體對(duì)IFN-a結(jié)合IFNAR2的效果相比較。優(yōu)選，與無關(guān)對(duì)照抗體相比， 阻斷性抗IFN- a抗體降低IFN- a與IFNAR2的結(jié)合至少約50%，或至少約55%，或至少約 60 %，或至少約65 %，或至少約70 %，或至少約75 %，或至少約80 %，或至少約85 %，或至少 約90 %，或至少約95 %，或至少約99 %。對(duì)于本發(fā)明的目的，可用常規(guī)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)測(cè)定抗IFN-a抗體阻斷IFN_a結(jié)合 IFNAR2 白勺能力，如 Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow和David Lane (1988)所述。例如，可改進(jìn)下述例2所述IFN-a結(jié)合ELISA試 驗(yàn)以采用在抗IFN-a抗體和可溶性IFNAR2之間的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。這一試驗(yàn)按以下步驟進(jìn)行 在微量滴定板上包被IFN- a，將該包被板與混合了所選濃度的標(biāo)記的IFNAR2 EOT-人IgG Fc融合蛋白質(zhì)的未標(biāo)記抗IFN-a抗體或未標(biāo)記對(duì)照抗體的連續(xù)的稀釋液一起培育，檢測(cè) 并測(cè)量各培育混合液中的信號(hào)，然后比較各抗體稀釋液顯示的信號(hào)測(cè)量結(jié)果。在一特別優(yōu)選實(shí)施例中，本文所用的阻斷性抗IFN-a抗體能阻斷全部或基本全 部IFN-a亞型的IFNAR2-結(jié)合而不與IFN-0交叉反應(yīng)。在本文中，術(shù)語“基本全部”指阻 斷性抗 IFN- a 抗體將至少阻斷 IFN- a 1，IFN- a 2，IFN- a 4，IFN- a 5，IFN- a 8，IFN- a 10， 以及IFN-a 21的IFNAR2結(jié)合。在一特別優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的阻斷性抗IFN-a抗體將 阻斷所有已知的IFN-a亞型與IFNAR2的結(jié)合。術(shù)語“表位”用于指蛋白質(zhì)抗原上的(單可隆或多可隆)抗體結(jié)合位點(diǎn)。可通過“表位作圖”鑒定與特定表位結(jié)合的抗體。本領(lǐng)域有許多已知方法可用 于作圖和特征鑒定蛋白質(zhì)上表位的位置，包括分辨抗體-抗原復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)試 驗(yàn)，基因片段表達(dá)試驗(yàn)，和合成肽為基礎(chǔ)的試驗(yàn)，例如，見Harlow和Lane的第11章，UsingAntibodies, a Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York，1999所述。競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)本文上下文都有討論。根據(jù)基因片段表達(dá)試驗(yàn)，將 編碼該蛋白質(zhì)的開放可讀框隨機(jī)地或通過特定的遺傳構(gòu)建而片段化，并測(cè)定該蛋白質(zhì)的表 達(dá)片段與所測(cè)抗體的反應(yīng)活性。例如，可用PCR產(chǎn)生基因片段然后在體外轉(zhuǎn)錄并在放射性 氨基酸存在下翻譯為蛋白質(zhì)。再用免疫沉淀和凝膠電泳測(cè)定該抗體與放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì) 片段的結(jié)合。采用展示在噬菌顆粒表面的隨機(jī)肽序列大文庫(噬菌體文庫)也可鑒定某些 表位?；蛘?，可在簡(jiǎn)單結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)試結(jié)合于測(cè)試抗體的重疊肽片段的確定文庫。后一種 方法適合于確定大約5到15個(gè)氨基酸的線形表位。若一種抗體與參比抗體識(shí)別相同或空間重疊的表位，則這兩種抗體結(jié)合“基本上 相同的表位”。測(cè)定兩抗體是否結(jié)合相同或空間重疊的表位的應(yīng)用最廣泛和快速的方法，是 競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，該試驗(yàn)可有各種不同形式的布局，使用標(biāo)記抗原或標(biāo)記抗體。通常，將抗原固定 在96孔平板上，用放射性或酶標(biāo)記測(cè)量未標(biāo)記抗體阻斷標(biāo)記抗體結(jié)合的能力。本文所用術(shù)語氨基酸或氨基酸殘基，指天然存在的L氨基酸或指下文在變體方面 所述的D氨基酸。本文使用通常所用的表示氨基酸的1字母和3字母縮寫(Bruce Alberts 等人，Molecular Biology of The Cell, GarlandPublishing, Inc. , New York(第三版 1994)。本文所用關(guān)于多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”，定義為在排列序列 和導(dǎo)入缺口(如需要)，以獲得最大百分比的序列同一性而不將任何保守性替代看作部分 序列同一性后候選序列中的氨基酸殘基與某序列中的氨基酸殘基相同的百分比?？梢员?領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)的各種方法獲得排列對(duì)比以測(cè)定氨基酸序列同一性的百分比，例如，可采用 公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST，BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟件。 本領(lǐng)域那些技術(shù)人員可確定測(cè)量排列對(duì)比的適當(dāng)參數(shù)，包括需要獲得被比較序列全長(zhǎng)的最 大排列對(duì)比的任何算法。為此目的，如下文所述使用序列對(duì)比計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2，可獲得 氨基酸序列同一性的百分比。ALIGN-2序列對(duì)比計(jì)算機(jī)程序由Genentech公司制作，其原 代碼與使用者文件已在美國版權(quán)辦公室，華盛頓特區(qū)，20559登記備案，它在美國版權(quán)登記 處登記號(hào)為NO. TXU510087。ALIGN-2程序可通過Genentech公司(舊金山南部，加利佛尼 亞)公開獲得，而ALIGN-2程序的原代碼和其使用指南在國際專利申請(qǐng)出版物2000年7月 6日的W02000/39297中公布。ALIGN-2程序應(yīng)編制為在UNIX操作系統(tǒng)上使用，較佳地是數(shù) 字UNIX V4. 0 D。所有的序列對(duì)比參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)置且不變。用于本文目的，某給定氨基酸序列A對(duì)某給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性 百分比(或者描述為某給定氨基酸序列A具有或含有與某給定氨基酸序列B的氨基酸序列 同一性百分比)計(jì)算如下100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X是在A和b的程序性對(duì)比中，經(jīng)序列排列對(duì)比程序ALIGN-2評(píng)價(jià)為同一性匹 配的氨基酸殘基數(shù)目，而Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢岳斫獍被嵝蛄蠥的長(zhǎng)度不等同 于氨基酸序列B的長(zhǎng)度時(shí)，A對(duì)B的氨基酸序列同一性百分比并不等于B對(duì)A的氨基酸序列 同一性百分比。除非另有特別說明，本文所用的所有氨基酸序列同一性百分比數(shù)值均如上 所述采用ALIGN-2序列對(duì)比的算機(jī)程序獲得。然而，氨基酸序列同一性百分比也可采用序 列對(duì)比程序NCBI-BLAST2 測(cè)定(Altschul 等人，Nucleic AcidsRes. 25 :3389_3402 (1997))。
18NCBI-BLAST2 序列對(duì)比程序可從 http //www, ncbi. mlm. nih. gov 下載。NCBI-BLAST2 使 用一些檢索參數(shù)，其中所有的這些檢索參數(shù)設(shè)置為缺省值，包括，例如，無屏蔽(unmask) =是，鏈(strand)=全部，期望的事物出現(xiàn)(expected occurrences) = 10，最低復(fù)雜性 長(zhǎng)度(minimum low complexity length) = 15/5，多遍 e 值(multi-pass e-value)= 0.01，多遍常數(shù)(constant for multi-pass) = 25，最終空格排列對(duì)比落選(dropoff for finalgapped alignment) = 25 以及評(píng)分矩陣(scoring matrix) = BL0SUM62。在采用NCBI-BLAST2作氨基酸序列對(duì)比的情況下，某給定氨基酸序列A對(duì)某給定 氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(或者描述為給定氨基酸序列A具有或含有與給 定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比)計(jì)算如下100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X是在A和B的程序性對(duì)比中，經(jīng)序列排列對(duì)比程序NCBI-BLAST2評(píng)價(jià)為同 一性匹配的氨基酸殘基數(shù)目，而Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)。可以理解氨基酸序列A的長(zhǎng) 度不等同于氨基酸序列B的長(zhǎng)度時(shí)，A對(duì)B的氨基酸序列同一性百分比并不等于B對(duì)A的 氨基酸序列同一性百分比。當(dāng)核酸被放置在與另一核酸序列功能性相關(guān)的位置上時(shí)，是“操作性相連接”的。 例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA表達(dá)為參與某多肽分泌的前蛋白，則其與該多肽 的DNA操作性相連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響某序列的轉(zhuǎn)錄，則其與該編碼序列操作性 相連接；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的定位易于翻譯，則其與該編碼序列操作性相連接。通常 “操作性連接”指所連接的DNA序列是毗鄰的，如果是分泌性前導(dǎo)序列，應(yīng)是毗鄰且在讀碼 框內(nèi)。然而，增強(qiáng)子不需要毗鄰?？稍诜奖愕南拗菩晕稽c(diǎn)上通過連接反應(yīng)即實(shí)現(xiàn)此種連接。 如果沒有這樣的位點(diǎn)，可按常規(guī)方法采用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。術(shù)語“疾病狀態(tài)”指細(xì)胞或整個(gè)哺乳動(dòng)物的一種生理狀態(tài)，該狀態(tài)中發(fā)生了細(xì)胞或 身體功能，系統(tǒng)或器官功能的中斷，停止或失調(diào)。術(shù)語“有效量”指有效治療(包括預(yù)防)哺乳動(dòng)物的疾病，失調(diào)或有害生理狀態(tài)的 藥物量。在本發(fā)明中，“有效量”的抗IFN-a抗體可以降低、減緩或延遲自身免疫失調(diào)癥如 IDDM或SLE ；降低，防止或抑制(即，某種程度的減緩優(yōu)選停止)自身免疫失調(diào)癥如IDDM或 SLE的發(fā)生；和/或某種程度上減輕一種或多種與自身免疫失調(diào)癥如IDDM或SLE有關(guān)的癥 狀。在本發(fā)明方法中，術(shù)語“控制”和其語法異體詞，是指對(duì)有害狀態(tài)(即生理狀態(tài)，如 自反應(yīng)性T細(xì)胞的產(chǎn)生和自身免疫性的發(fā)生)的防止，部分或完全抑制，降低，延遲或減緩?！爸委煛敝钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防或防止措施。需要治療者包括那些已患有疾病和那些 易患疾病或那些必須預(yù)防疾病者。對(duì)于本發(fā)明的目的，有益的或所需的臨床結(jié)果包括，但不 限于，緩解癥狀，減輕疾病程度，穩(wěn)定(即不惡化)疾病狀態(tài)，延遲或減緩疾病的發(fā)展，好轉(zhuǎn) 或減輕疾病狀態(tài)，減輕(無論部分或全部)，無論是可檢測(cè)或不可檢測(cè)?！爸委煛边€指與不接 受治療的預(yù)期存活相比的延長(zhǎng)存活。需要治療者包括那些已患疾病或失調(diào)癥和那些易患疾 病或那些必須預(yù)防疾病者?！八幬飳W(xué)上可接受的”運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑是在所用的劑量和濃度下對(duì)接觸其 的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無毒的那些。生理上可接受的運(yùn)載體常常是水性的PH緩沖溶液。生理 上可接受的運(yùn)載體的實(shí)例包括緩沖液，如磷酸鹽，檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗
19壞血酸；小分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白； 親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸，或賴氨 酸；單糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑，如EDTA ；糖醇，如 甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑，如Tween ，聚乙二醇 (PEG)，和 Pluronics 。治療對(duì)象“哺乳動(dòng)物”指歸入哺乳類的任何動(dòng)物，包括人，家養(yǎng)動(dòng)物和家畜，和動(dòng)物 園，競(jìng)賽或?qū)櫸飫?dòng)物，如狗，馬，貓，牛等。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。B.講行本發(fā)明的方法1抗體的產(chǎn)生⑴多克隆抗體制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域已知的?？稍诓溉閯?dòng)物體中產(chǎn)生多克隆抗體，例 如，一次或多次注射某免疫制劑和(如果需要)佐劑。通常，可通過多處皮下或腹膜內(nèi)注射 將該免疫制劑和/或佐劑注射入哺乳動(dòng)物體內(nèi)?？赡苡杏玫氖菍⒃撁庖咧苿┡c已知在被免 疫接種的動(dòng)物體中具有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，諸如血清清蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。 可采用的佐劑例子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，可用各種，優(yōu)選所有的IFN-a亞型的混合物免疫接種動(dòng) 物，以產(chǎn)生對(duì)IFN-a諸亞型具有廣泛反應(yīng)活性的抗IFN-a抗體。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，用 人IFN-a諸亞型的混合物免疫接種動(dòng)物，這些亞型存在于仙臺(tái)病毒所誘導(dǎo)的伯基特淋巴 瘤細(xì)胞(Namalva細(xì)胞)分泌的人類淋巴母細(xì)胞干擾素中，如下文例1所述那樣。該人類淋 巴母細(xì)胞干擾素的合適制品可從Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo)購得(產(chǎn)品號(hào) No.1-9887)。(ii)單克隆抗體單克隆抗體可用雜交瘤方法(最初由Kohler等人，Nature 256 :495 (1975)所述) 制備，或用重組DNA法(美國專利號(hào)N0 4，816，567)制備。在雜交瘤方法中，將小鼠或其他合適的宿主動(dòng)物，如倉鼠或獼猴，按如上所述進(jìn)行 免疫接種以誘導(dǎo)產(chǎn)生或能產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，該抗體能與免疫接種所用的蛋白質(zhì)特異性 結(jié)合?；蛘?，體外進(jìn)行淋巴細(xì)胞免疫接種。然后以合適的融合劑(如聚乙二醇)將淋巴細(xì) 胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles and Practice,59-103 頁[AcademicPress,1996]。將如此制得的雜交瘤細(xì)胞接種在合適的培養(yǎng)基中培育，培養(yǎng)基優(yōu)選含有1種或多 種能抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，該雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌 呤，氨基蝶呤，和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，其中的物質(zhì)能阻止HGPRT缺陷性細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些能有效融合，能支持選出的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定性高水平 產(chǎn)生抗體，且對(duì)培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨 髓瘤系，如由M0P-21和MC-11小鼠腫瘤衍生的骨髓瘤細(xì)胞(可從美國加利福尼亞圣地亞 哥 Salk Institute Cell Distribution 中心購得)和 SP-2 或 X63_Ag8_653 細(xì)胞(可從 the American Type CultureCollection, Rockcville, Maryland USA 購得)。也J艮道了人 骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系來產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol. 133 =3001.
20(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 頁，Marcel Dekker, Inc.，New York, [1987])。測(cè)定有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培育液是否產(chǎn)生了針對(duì)該抗原的單克隆抗體。優(yōu)選用免 疫沉淀法或體外結(jié)合試驗(yàn)(如放射免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA))測(cè)定雜 交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。例如單克隆抗體的結(jié)合親和力可用Scatchard分析法(Mimson等人 AnalBiochem. 107 220(1980))測(cè)定。鑒定到產(chǎn)生具有所需特異性，親和力，和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可將該 細(xì)胞用有限稀釋法亞克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，MonoclonalAntibodies principles and Practice，59-103頁Academic Press，1996)。為此目的的合適培育基包括，如DMEM或 RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞也可在動(dòng)物體內(nèi)作為腹水瘤生長(zhǎng)。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，如A蛋白瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法，凝膠 電泳，透析或親和層析法，可將亞克隆分泌的單克隆抗體適當(dāng)?shù)貜呐嘤?，腹水中，或?清中分離出來。用常規(guī)方法(如，采用能與單克隆抗體重鏈和輕鏈的編碼基因特異性結(jié)合的寡核 苷酸探針)，不難將編碼單克隆抗體的DNA分離出來并測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可作為此種DNA的 優(yōu)選來源。一旦分離出來，可將該DNA置入表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì) 胞，猴COS細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞，或不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞中，以獲 得在重組宿主細(xì)胞中的單克隆抗體的合成。也可修飾此DNA，例如，用人重鏈和輕鏈恒定區(qū) 的編碼序列取代同源小鼠序列(Morrison等人，Proc. Nat. Acad，Sci. 81 6851[1984])或者 將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)連接。按此方式制 備具有本文抗IFN-a單克隆抗體的結(jié)合特異性的“嵌合性”或“雜合”抗體。通常用這種非免疫球蛋白多肽取代本發(fā)明抗體的恒定區(qū)或取代本發(fā)明抗體的一 個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，以產(chǎn)生一種嵌合性二價(jià)抗體，該抗體含有一個(gè)對(duì)IFN-a特異性 的抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)一個(gè)不同抗原有特異性的另一抗原結(jié)合位點(diǎn)。也可采用已知的合成蛋白質(zhì)化學(xué)方法(包括那些涉及交聯(lián)劑的方法)體外制備嵌 合性或雜合抗體。例如，采用二硫化物交換反應(yīng)或形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于此目 的的適合試劑包括亞胺硫醇鹽和4巰基丁酰亞氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidat e)。抗體的重組制備將在下文更詳細(xì)描述。(iii)人源化抗體人源化抗體通常具有從非人類來源引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人 氨基酸殘基常稱作“輸入”殘基，該殘基通常取自“輸入”的可變區(qū)。人源化可用Winter及 其同事的方法通過用嚙齒動(dòng)物的CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行(Jones等 人，Nature 321 :522_525 [1986] ；Riechmann 等人，Nature 332 :323_327 [1988] ；Verhoeyen 等人，Science239 1534-1536 [1988]；綜述 Clark, Immunol. Today 21 :397_402 [2000])。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合性抗體(Cabilly,同上)，其中基本上不到一個(gè) 完整的人可變區(qū)被非人動(dòng)物的相應(yīng)序列所取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人抗體中的一 些CDR殘基和可能一些FR殘基被嚙齒動(dòng)物抗體的類似位點(diǎn)的殘基所取代。
重要的是待人源化的抗體保留了對(duì)抗原的高度親和力以及其它有利的生物特性。 為了達(dá)到這一目標(biāo)，根據(jù)優(yōu)選的方法，利用親本與人源化序列的三維模型通過分析親本序 列和不同概念人源化產(chǎn)物的過程，制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可購得且為 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。闡述并演示所選的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)型結(jié)構(gòu)的 計(jì)算機(jī)程序市場(chǎng)有售。視查這些演示得以分析候選免疫球蛋白序列的殘基在功能中的可能 作用，如，分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的殘基。這樣，可從共有序列和輸 入序列中選出FR殘基并組合從而獲得所需的抗體特性，如對(duì)靶抗原的親和力增加?？傊?CDR殘基直接并最根本地參與了對(duì)抗原結(jié)合的影響。進(jìn)一步詳述見美國專利No. 5821337。(iv)人抗體由于缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞系，使用相同技術(shù)產(chǎn)生人mAb的嘗試受到阻礙。用 異源骨髓瘤(小鼠*人雜交骨髓瘤)作為融合伴侶(Kozbor，J. Immuno. 133 3001 (1984)； Brodeur 等人，Monoclonal Production Techniques andApplications, 51-63 Jjt, Marcel Dekker，Inc.，New York, 1987)獲得了最好結(jié)果?；蛘?，可用 Epstein-Barr 病毒(EBV)感 染使人抗體分泌細(xì)胞永生化。然而，EBV感染細(xì)胞難于克隆而且通常只產(chǎn)生相對(duì)低得率的 免疫球蛋白(James 和 Bell，J. Immunol. Methods 100 5-40[1987]) 將來，通過導(dǎo)入轉(zhuǎn)化 基因的確定組合，有可能獲得人B細(xì)胞的永生化。最近證明端粒酶催化亞基與SV40大T癌 蛋白和H-ras致癌等位基因一起表達(dá)導(dǎo)致正常人上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)變突 出 了這種可能性(Hahn 等人，Nature 400 464-468[1999])現(xiàn)在，已能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，這些動(dòng)物(經(jīng)免疫接種)產(chǎn)生沒有內(nèi)源 免疫球蛋白產(chǎn)物的人類抗體全集(Jakobovits等人，NATURE362 :255_258[1993] ；Lonberg 禾口 Huszar， Int. Rev. Immunol. 13 :65_93[1995] ；Fishwild 等人，Nat. Biotechnol. 14 845-851[1996] ；Mendez 等 Nat. Genet, 15 146-156[1997] ；Green, J Immunol Methods 231 11-23[1999] ；Tomizuka 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722_727[2000]；綜述見 Little等人，Immunol. Today 21 =364-370 [2000]) 0例如，已有描述說在嵌合性和種系突變 小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合性缺失導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源抗體的產(chǎn)生(Jakobovits 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551_2555 [1993])。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn) 移到這類種系突變小鼠中導(dǎo)致了抗原攻擊后人抗體的產(chǎn)生(Jakobovits等Nature，362 255-258[1993])。Mendez 等人(Nature Genetics 15 146-156[1997])已制備了一種轉(zhuǎn)基因小鼠， 命名為“XenoMouse II”，當(dāng)受到抗原攻擊時(shí)，它會(huì)產(chǎn)生高親和力的完全人的抗體。這可 通過將兆堿基的人重鏈和輕鏈基因座種系整合引入上述缺失內(nèi)源JH區(qū)段的小鼠體內(nèi)而獲 得。XenoMouse II含有1，020Kb的人重鏈基因座(約含有66個(gè)VH基因，完整的DH和JH 區(qū)以及3個(gè)不同的恒定區(qū)ii，5，Y)，還含有800Kb的人K基因座(含有32fVK基因，JK 區(qū)段，和CK基因)。這些小鼠產(chǎn)生的抗體與人抗體在所有方面看都極為相似，包括基因重 排，組裝，以及全集。由于缺失內(nèi)源JH區(qū)段阻止了小鼠基因座的基因重排，人抗體優(yōu)先于內(nèi) 源抗體而表達(dá)。Tomizuka 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722_727 [2000])最近描述了通 過在一種內(nèi)源性IgH和IgK基因座被滅活的小鼠品種中導(dǎo)入兩個(gè)獨(dú)立的人染色體片段 (hCFs)一個(gè)含有整個(gè)Ig重鏈基因座(IgH，約1.5Mb)而另一個(gè)含有整個(gè)K輕鏈基因座(IgK，約2Mb)，產(chǎn)生了一種雙轉(zhuǎn)移染色體(Tc)小鼠。這些小鼠產(chǎn)生了抗原特異性的人抗體 應(yīng)答反應(yīng)而無小鼠抗體。此Tc技術(shù)使得能夠在小鼠或其他動(dòng)物中進(jìn)行兆堿基的復(fù)雜的基 因座或基因簇(如編碼T細(xì)胞受體，主要組織相容性復(fù)合體，P450簇等)的人源化。該方 法的另一優(yōu)點(diǎn)是不需要克隆大的基因座。這是重大進(jìn)步，因?yàn)榧词故褂媒湍溉斯と旧w仍 然難以進(jìn)行含有整個(gè)Ig基因座的兆堿基大小的DNA片段的克隆(Peterson等人.Trends Genat. 13 :61-66[1997] ； Jacobovits, Cvrr Biol. 4 :761_763 [1994])。此外，已知人 IgH 基 因座的恒定區(qū)含有難于克隆的序列(Kang和Cox，Genomics35 189-195 [1996])。另外，可采用噬菌體展示技術(shù)從未免疫接種供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因 全集體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段(McCafferty等人，Nature 348 :552_553[1990]；綜述 見 Kipriyanov 禾P Litlle, Mol. Biotechnol. 12 173-201[1999] ；Hoogenboom 禾P Chames, Immunlo. Today 21 :371_378[2000])。根據(jù)這一技術(shù)，可將抗體V區(qū)基因框內(nèi)克隆入絲狀噬 菌體如M13或fd的主要或次要包膜蛋白質(zhì)基因中，并在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體 片段。因?yàn)榻z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇也導(dǎo)致 了顯示這些特性的抗體的編碼基因的選擇。因而，噬菌體模擬了B細(xì)胞的有些特性。噬菌 體展示可以多種形式進(jìn)行(綜述見Johnson和Chiswell，Current Opinion inStructural Biology 3 564-571[1993] ；Winter 等人’ Annu. Rev. Immunol. 12 433-455[1994]； Dair Acqua 禾口 Carter，Curr. Opin. Struct. Biol. 8 443-450 [1998] ；Hoogenboom 禾口 Chames, Immunol. Today 21 :371_378 [2000])。V基因區(qū)段的一些來源可用于噬菌體展示。 Clackson等(Nature 352 =624-628,1991)從免疫小鼠脾臟獲得的V基因小隨機(jī)組合文庫 中分離得到抗唑酮抗體的多樣性陣列。按照Marks等人，J. Mol. Biol. 222 :581_597 [1991] 或Griffiths等人，EMB0 J. 12 :725_734 (1993)所述技術(shù)可構(gòu)建未經(jīng)免疫的人供體的V基 因全集和分離得到針對(duì)抗原(包括自身抗原)的多樣性陣列的抗體。在天然免疫應(yīng)答中， 抗體基因高速積聚突變(體細(xì)胞超突變)。導(dǎo)入的某些變化將賦予更高的親和力，在隨后 的抗原攻擊期間展示高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞優(yōu)先復(fù)制和分化。采用稱為“鏈改 組”的技術(shù)可以模擬這一自然過程(Marks等人，Bio/Technol. 10 :779_783 [1992])。在該 方法中，噬菌體展示獲得的“原代”人抗體的親和力可通過隨后用未經(jīng)免疫供體的V區(qū)基 因的天然存在的變體(文庫)置換重鏈和輕鏈V區(qū)基因而改進(jìn)。這一技術(shù)得以產(chǎn)生具有 nM范圍親和力的抗體和抗體片段。制備極大噬菌體抗體全集的方法(也稱為“母體全文 庫，，)已由 Waterhouse 等人 Nucl. Acids Res. 21 :2265_2266 (1993)所描述，而且已報(bào)道了 從此種大噬菌體文庫中直接分離得到高親和力的人抗體，見Griffiths等人，EMB0 J. 13 3245-3260(1994)。基因改組也可用于從嚙齒動(dòng)物抗體中衍生出人抗體，其中該人抗體具有 與起始嚙齒動(dòng)物抗體類似的親和力和特異性。根據(jù)這一方法，也稱為“表位印記法”，用人V 區(qū)基因全集取代通過噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒動(dòng)物抗體的重鏈或輕鏈V區(qū)基團(tuán)，產(chǎn)生了 嚙齒動(dòng)物_人嵌合體。經(jīng)抗原選擇導(dǎo)致分離得到能恢復(fù)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人可變區(qū)， 即，表位控制(印記)伴侶選擇。重復(fù)這一過程以取代其余的嚙齒動(dòng)物V區(qū)，獲得了人抗體 (見PCT專利申請(qǐng)W0 93/06213，公布于1993年4月1日)。與通過⑶R移植進(jìn)行的嚙齒動(dòng) 物抗體傳統(tǒng)人源化不同的是，該技術(shù)提供了完全人的抗體，該抗體沒有嚙齒動(dòng)物來源的框 架或⑶R殘基。( V )雙特異性抗體
雙特異性抗體是對(duì)至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體(優(yōu)選人或 人源化抗體)。在本例中，結(jié)合特異性的其中一種是對(duì)IFN- a的而提供了中和抗體，而另一 種是對(duì)其它任何抗原。本領(lǐng)域已知制備雙特異性抗體的方法。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組產(chǎn)生基于 兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Millstein和 Cuello, Nature 305 :537_539[1983])。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分類，這些雜交 瘤(四源雜交瘤(quadroma))產(chǎn)生了 10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具 有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。此種正確分子的純化(通常以親和層析法進(jìn)行)相當(dāng)麻煩且產(chǎn) 量低。類似方法公開于PCT申請(qǐng)出版物NO. W0 93/08829中(1993年5月13日出版)，和 Traunecker 等人，EMB0J. 10 :3655_3659 (1991)。根據(jù)一種不同而且更優(yōu)選的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體_抗原結(jié)合位點(diǎn)) 的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。優(yōu)選與至少含有部分鉸鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū) 的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選在至少一個(gè)融合物中存在含有輕鏈結(jié)合必需位點(diǎn)的重 鏈第一恒定區(qū)(CH1)?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合物的DNA和如果需要的話編碼免疫球 蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體中，共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物中。在所用三條多肽鏈 以不相等比率用于構(gòu)建時(shí)提供最大產(chǎn)量的實(shí)施例中，該方法為調(diào)節(jié)此三條多肽片段的互相 比例提供了很大靈活性。然而，當(dāng)至少兩條多肽鏈以相同比例表達(dá)以產(chǎn)生高得率或此比例 沒有特別意義時(shí)，可以將兩條或所有三條多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體中。在該方 法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，構(gòu)成該雙特異性抗體的兩臂中，一臂上為具有第一種結(jié)合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈，而另一臂上為雜合免疫球蛋白重鏈_輕鏈對(duì)(提供第二種結(jié)合特 異性)。已發(fā)現(xiàn)，由于免疫球蛋白輕鏈只存在于該雙特異性分子的一半中，這提供了容易的 分離方法，這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于從不需要的免疫球蛋白鏈混合物中分離所需的雙特異性 組合物。產(chǎn)生雙特異性抗體的更多細(xì)節(jié)見，例如Suresh等人，Methods inEnzymology 121， 210(1986)。(VI)異質(zhì)偶聯(lián)抗體異質(zhì)偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。異質(zhì)偶聯(lián)抗體含有兩個(gè)共價(jià)連接的抗體。例 如，已提出這樣的抗體可將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不良細(xì)胞(美國專利號(hào)N0. 4，676，980)，和治 療HIV感染(PCT申請(qǐng)出版物W0 91/00360和W0 92/200373 ；EP 03089)?？捎梅奖愕慕宦?lián) 方法制備異質(zhì)偶聯(lián)抗體。適合的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域所熟知并與一些交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國 專利號(hào) N0. 4，676，980 中。(vn)抗體片段在某些實(shí)施例中，中和性抗IFN-a抗體(包括小鼠，人和人源化抗體，以及抗體變 體)是一種抗體片段。已發(fā)展了各種技術(shù)來制備抗體片段。傳統(tǒng)上通過完整抗體的蛋白水 解消化衍生這些片段(見，Morimoto 等人 J.Biochem.Biophys. Methods 24 107-117 [1992] 和Brerman等人，Science 229 :81 [1985])。然而，這些片段現(xiàn)在可用重組宿主細(xì)胞直接 生產(chǎn)(綜述見 Hudson，Curr. Opin. Immunol. 11 :548_557 [1999] ；Little 等人 Immunol. Today21 =364-370[2000]) 0例如，可從大腸桿菌直接回收Fab，-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)形成 F(ab，)2 片段(Carter 等人.，Bio/Technology 10 163-167 [1992])。在另一實(shí)施例中，使用亮氨酸拉鏈GCN4促進(jìn)F(ab，)2分子的裝配來形成F(ab，)2。根據(jù)另一方法，F(xiàn)v, Fab或 F(ab' )2片段可從重組宿主細(xì)胞培育物中直接分離得到。熟練從業(yè)者知道制備抗體片段的 其它技術(shù)。(通)抗體的氨基酸序列變體考慮了本文所述抗IFN-a抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能需要改善抗體的結(jié) 合親和力和/或其他生物特性。通過在編碼抗IFN-a抗體鏈的核酸中導(dǎo)入合適的核苷酸 變化或通過肽合成，制備抗IFN-a抗體的氨基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如，缺失， 和/或插入和/或取代抗IFN-a抗體的氨基酸序列內(nèi)的一些殘基。制作缺失、插入，和取 代的任何組合以獲得最終結(jié)構(gòu)，只要該最終結(jié)構(gòu)具有所需特性。氨基酸變化也可能改變抗 IFN- a抗體的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。中和性抗IFN-a抗體作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的常用鑒定方法稱為 “丙氨酸掃描誘變法”，如 Cunningham and Wells, Science, 244 1081-1085 (1989)所述。鑒 定殘基或靶殘基組(如帶電荷的殘基，精氨酸，天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸，和谷氨酸)并用 中性或帶負(fù)電荷的氨基酸替代(最優(yōu)選是丙氨酸或聚丙氨酸)以影響氨基酸與抗原的相互 作用。然后那些對(duì)于取代表現(xiàn)出功能敏感性的氨基酸位置通過在取代位點(diǎn)進(jìn)一步導(dǎo)入其它 突變而細(xì)化。這樣，雖然預(yù)先確定了導(dǎo)入氨基酸序列突變的位點(diǎn)，但不需要預(yù)先確定突變本 身的性質(zhì)。例如為了分析某給定位點(diǎn)的突變性能，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨 機(jī)誘變并篩選具有所需活性的表達(dá)的抗IFN-a抗體變體。氨基酸序列的插入包括氨基和/或羧基末端的融合(長(zhǎng)度范圍從一個(gè)殘基到包 含100個(gè)或更多殘基的多肽)以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。未端插入的例子 包括具有N末端甲硫氨酰殘基的抗IFN-d中和性抗體，或與一表位標(biāo)簽融合的抗體?？?IFN-a抗體分子的其他插入性變體包括在抗體的N或C末端融合能增加抗體的血清半衰期 的多肽或酶。另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體在中和性抗IFN-a抗體分子中至少有 一個(gè)氨基酸殘基被去除并在其位置插入了 一個(gè)不同的殘基。取代誘變的最關(guān)注位置包括高 變區(qū)，但也考慮FR的改變。保守性取代見表1題頭為“優(yōu)選的取代”。如果這些取代導(dǎo)致生 物活性改變，那么可，見表1中稱為“示范性取代”，或如下文所述參見氨基酸分類導(dǎo)入更多 的實(shí)質(zhì)性變化并篩選產(chǎn)物。表一
原殘基示范性取代優(yōu)選的取代丙氨酸(A)纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸纈氨酸精氨酸(R)賴氨酸，谷氨酰胺；天冬酰胺賴氨酸天冬酰胺(N)谷氨酰胺；組氨酸；天冬氨酸；賴氨酸；精氨酸谷氨酰胺天冬氨酸(D)谷氨酸；天冬酰胺谷氨酸
25 選擇在維持(a)取代區(qū)多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)型，(b)靶位點(diǎn)上分子 的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小方面的作用明顯不同的取代，進(jìn)行抗體生物特性的實(shí) 質(zhì)性修飾。根據(jù)共同的側(cè)鏈性質(zhì)，將天然存在的殘基分成以下幾組(1)疏水的正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；
(2)中性、疏水的半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸；(3)酸性的天冬氨酸，谷氨酸；(4)堿性的天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸，；(5)影響鏈取向的殘基甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族的色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守性取代需要將這些類別之一的一個(gè)成員換成另一類別的成員不參與維持中和性抗IFN- a抗體正確構(gòu)型的任何半胱氨酸殘基也可被取代(通 常用絲氨酸)以改善該分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體加入半胱氨酸 鍵以改善其穩(wěn)定性(尤其當(dāng)抗體是如FV片段的抗體片段時(shí))。特別優(yōu)選的取代變體類型包括取代親本抗體(如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè) 高變區(qū)殘基。通常，為進(jìn)一步發(fā)展選擇的所得變體將具有改進(jìn)的生物活性(相對(duì)于產(chǎn)生它 們的親本抗體而言)。產(chǎn)生這樣的取代變體的方便方法是通過噬菌體展示的親和力成熟。 簡(jiǎn)單而言，可進(jìn)行幾個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(如6-7位點(diǎn))的突變以在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨 基酸取代。如此產(chǎn)生的抗體變體作為與包裹在每個(gè)顆粒中的M13基因III產(chǎn)物的融合物， 以單價(jià)形式從絲狀噬菌體顆粒中展示。然后如本文所述篩選噬菌體展示的變體的生物活性 (如，拮抗劑活性)。為了鑒定進(jìn)行修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定 對(duì)抗原結(jié)合有明顯貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?，或另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以 鑒定抗體和IFN-a之間的接觸點(diǎn)可能是有利的。根據(jù)本文所述技術(shù)，這種接觸殘基和相鄰 殘基是取代的候選者。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述篩選變體組并在一個(gè)或多個(gè)相關(guān) 試驗(yàn)中選出具有優(yōu)良特性的抗體來進(jìn)一步開發(fā)。(IX)糖基化變體抗體在它們的恒定區(qū)保守位置上糖基化(Jefferis和Lund，Chem. Immunol. 65 111-128[1997] ；Wright 和 Morrison，TrendsBiotechnol. 15 :26_32[1997])。免疫球蛋白 的寡糖側(cè)鏈影響蛋白質(zhì)的功能(Boyd等人，Mol. Immunol. 32 1311-1318[1996] ；ffittwe 和Howard, Biochem. 29 :4175_4180[1990])，和能影響糖蛋白構(gòu)型和所呈現(xiàn)三維表面的 糖蛋白部分之間分子內(nèi)相互作用(Jefferis和Lund，同上，；Wyss和Wagner，Current Opin. Biotech. 7 409-416[1996]) 寡糖也能基于特導(dǎo)性識(shí)別結(jié)構(gòu)將給定的糖蛋白靶向 某些分子。例如，已有報(bào)導(dǎo)說在未半乳糖基化的IgG中，其寡糖部分翻轉(zhuǎn)出CH2之間間 隔，使末端N-乙酰葡糖胺殘基可結(jié)合甘露糖結(jié)合蛋白質(zhì)(Malhotra等人，Nature Med. 1 237-243[1995])。用糖肽酶從中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞產(chǎn)生的CAMPATH-1H(識(shí)別人淋巴 細(xì)胞的CDw52抗原的重組人源化鼠單克隆IgGl抗體)中去除寡糖，導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解 (CMCL)完全減低(Boyd等人Mol. Immunol. 32 1311-1318 [1996])，而使用神經(jīng)氨酸酶選擇 性去除唾液酸殘基不會(huì)引起DMCL的損失。也已報(bào)道抗體的糖基化會(huì)影響依賴于抗體的細(xì) 胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。特別地，根據(jù)報(bào)道，具有四環(huán)素調(diào)節(jié)的0 (1，4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移 酶III (GnTIII)( 一種催化等分GlcNAc形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)的CH0細(xì)胞，具有改進(jìn)的 ADCC 活性(Umana 等 Meture Biotech, 17 176-180，1999)。通?？贵w的糖基化是N連接或0連接。N連接指糖部分結(jié)合于天冬酰胺殘基的側(cè) 鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何 氨基酸)是糖部分與天冬酰胺側(cè)鏈的酶促結(jié)合的識(shí)別序列。這樣，在多肽中存在這些三肽序列之一產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。0連接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，或木糖 之一結(jié)合于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨 酸。抗體的糖基化變體是抗體的糖基化模式被改變的變體。改變意味著抗體中缺失一 個(gè)或多個(gè)原有的糖部分，在抗體中加入一個(gè)或多個(gè)糖部分，改變糖基化組成(糖基化模式) 和糖基化程度，等等。通過改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上述的三肽序列可方便地實(shí)現(xiàn)將糖基 化位點(diǎn)加入抗體中(對(duì)于N連接糖基化位點(diǎn))。也可在原抗體序列中加入或取代一個(gè)或多 個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基進(jìn)行這種改變(對(duì)于0連接糖基化位點(diǎn))。類似地，改變抗體的天然 糖基化位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸也可實(shí)現(xiàn)糖基化的消除。通過改變核酸序列通?？筛淖儼被嵝蛄?。用本領(lǐng)域已知的各種方法制備 抗-IFNa抗體的氨基酸序列變體的編碼核酸分子。這些方法包括但不限于，從天然來源中 分離(就天然存在的氨基酸序列變體而言)，或通過對(duì)抗-IFN抗體的先前制備的變體或非 變體的寡酸苷酸介導(dǎo)(或定點(diǎn))的誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。也可不改變氨基酸序列或核苷酸序列而改變抗體的糖基化(包括糖基化模式)。 糖基化主要取決于用于表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞。由于用于表達(dá)作為潛在治療劑的重組糖蛋白 (如抗體)的細(xì)胞類型極少為天然細(xì)胞，可以預(yù)見抗體糖基化模式的明顯變異(見Hse等人 J Biol. Chem, 272 =9062-9070. 1997)。除了選擇宿主細(xì)胞外，在抗體重組產(chǎn)生過程中影響糖 基化作用的因素包括生長(zhǎng)方式，培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)密度，氧合作用，PH值，純化方案等。業(yè)已 提出各種方法在具體宿主生物體中獲得糖基化模式的改變，包括導(dǎo)入或過度表達(dá)參與寡糖 產(chǎn)生的某些酶(美國專利No. 5，047，335 ；5, 510，261 ；和5，278，229)。糖基化，或某些類型 的糖基化，可從糖蛋白中經(jīng)過酶促反應(yīng)而消除，例如使用內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)。此外，可以 基因改造重組宿主細(xì)胞，如，制造某些類型多糖加工的缺陷。這些以及類似技術(shù)是本領(lǐng)域熟 知的。 可采用常規(guī)的糖類分析技術(shù)(包括凝集素層析，NMR,質(zhì)譜，HPLC，GPC，單糖組分分 析，順序酶消化，以及使用高PH陰離子交換層析根據(jù)電荷分離寡糖的HPAEC-PAD)不難分 析抗體的糖基化結(jié)構(gòu)。為了分析目的而釋放寡糖的方法也是已知的，包括但不限于酶處理 (通常用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)切-0 -半乳糖苷酶進(jìn)行)，用強(qiáng)堿性環(huán)境消除以主要釋放0連 接結(jié)構(gòu)，以及用無水胼釋放N連接和0連接寡糖的化學(xué)方法。( X )抗體的其它修飾本文所公開的中和性抗IFN-a抗體也可配制成免疫脂質(zhì)體。含此抗體的脂質(zhì)體 可用本領(lǐng)域已知的方法制備，如 Epstein 等人.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 3688[1985]； Hwang 等人，.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；以及美國專利 No. 4，485，045 和 4，544，545.所述。具有增加的血循環(huán)期的脂質(zhì)體公開于美國專利NO 5，013，556中。用含有磷脂酰膽堿，膽固醇和磷脂酰乙醇胺聚乙二醇衍生物(PEG-PE)的脂質(zhì)組 合物進(jìn)行反相蒸發(fā)方法可產(chǎn)生特別有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體擠壓通過確定孔徑的濾器以產(chǎn) 生具有所需直徑的脂質(zhì)體。如Martin等人 ，J. Biol. Chem. 257 =286-288 (1982)所述通過 鏈間二硫鍵反應(yīng)，可將本發(fā)明抗體的Fab’片段與脂質(zhì)體偶聯(lián)。可任選地在該脂質(zhì)體中含有 化療劑(如多柔比星)。見 Gabizon 等人 J. National Cancer Inst. 81(19) ；1484(1989)。
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通過將抗體與一種前藥活化酶偶聯(lián)，此酶能將前藥(如肽基化療劑，見 W081/01145)轉(zhuǎn)變成活性藥物，也可在ADEPT中應(yīng)用本發(fā)明的抗體。見，例如，W088/07378 和美國專利NO 4，975，278?？捎糜贏DEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括能作用于前藥的任何酶，此酶能將前藥 轉(zhuǎn)變成顯示所需生物特性的更活躍形式。本發(fā)明方法中使用的酶包括但不限于，用于將含磷酸鹽的前藥轉(zhuǎn)變成游離藥物的 堿性磷酸酶；用于將含硫酸鹽前藥轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的芳基硫酸酶；用于將無毒5-氟胞嘧啶 轉(zhuǎn)變成抗癌藥物(5_氟尿嘧啶)的胞嘧啶脫氨酶；用于將含肽的前藥轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的蛋 白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋 白酶B和L)；用于轉(zhuǎn)變含D-氨基酸取代前藥的D-丙氨酰羧肽酶；用于將糖基化的前藥轉(zhuǎn)變 為游離藥物的糖類裂解酶，如半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；用于轉(zhuǎn)變內(nèi)酰胺衍生藥物 為游離藥物的3內(nèi)酰胺酶；青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于將在 其氨基氮分別用苯氧乙?；虮揭阴；鶊F(tuán)衍生的藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物。另外，具有酶活性的 抗體，在本領(lǐng)域稱為“抗體酶”，可用于將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物(見Massey，Nature 328 :457-458(1987))?？贵w-酶偶聯(lián)物可按本文所述方法制備，將抗體酶輸送給所需的細(xì) 胞群?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)將酶與中和性抗IFN-a抗體共價(jià)結(jié)合，如使用上述的異 質(zhì)雙功能交聯(lián)劑。另外，用本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)可構(gòu)建融合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)至少 含有與本發(fā)明酶的功能活性部分相連的本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合區(qū)(見Neuberger等人， Nature 312 :604_608[1984])。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，可能需要采用抗體片段而不是完整的抗體。在此情況 下，可能需要修飾抗體片段以增加其血清半衰期。例如這可通過在抗體片段中摻入一補(bǔ)救 性受體結(jié)合表位(如，通過在抗體片段內(nèi)合適區(qū)域的突變，或在肽標(biāo)簽中摻入該表位，然后 與抗體片段末端之一或中間融合，如，通過DNA或肽合成)而實(shí)現(xiàn)。見1996年10月17日 公布的 W0 96/32478。通常，補(bǔ)救性受體結(jié)合表位構(gòu)成一個(gè)區(qū)域，其中Fc區(qū)的一個(gè)或二個(gè)環(huán)上的任一個(gè) 或多個(gè)氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移到該抗體片段的類似位置。甚至更優(yōu)選Fc區(qū)的一個(gè)或二個(gè)環(huán)上 的3個(gè)或多個(gè)殘基被轉(zhuǎn)移。更優(yōu)選此表位取自Fc區(qū)(如IgG)的CH2結(jié)構(gòu)域并且轉(zhuǎn)移到此 抗體的CH1，CH3或VH區(qū)或1個(gè)以上的這些區(qū)域中?；蛘?，此表位取自Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域 并且轉(zhuǎn)移到該抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)或這二個(gè)區(qū)。中和性抗IFN-a抗體的共價(jià)修飾也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。如果需要，可通過 化學(xué)合成或抗體的酶促裂解或化學(xué)裂解制備。用能夠與所選側(cè)鏈或N端或C端殘基反應(yīng) 的有機(jī)衍生試劑與此抗體的靶氨基酸殘基反應(yīng)，將其它類型的抗體共價(jià)修飾引入此分子 中。典型的多肽共價(jià)修飾在美國專利5，534，615中有描述，參考文獻(xiàn)中?？贵w共價(jià)修飾的 優(yōu)選類型包括以美國專利 4，640, 835 ；4, 496，689 ；4, 301，144 ；4, 670, 417 ；4, 791，192 或 4，179，337中所述方式將抗體與各種非蛋白性聚合物之一相連，如聚乙二醇，聚丙二醇，或 聚氧化烯。2、篩選具有所需特性的抗體產(chǎn)生抗體的技術(shù)上文已有描述。具有所需的廣泛的中和特性的抗IFN-a抗體可
29用本領(lǐng)域已知方法來鑒定。⑴結(jié)合試驗(yàn)例如，將候選抗體與一種或多種IFN- a亞型，或各種IFN_ a亞型的陣列或混合物 一起培育，并監(jiān)測(cè)結(jié)合和IFN-a生物活性的中和，可在IFN-a結(jié)合試驗(yàn)中鑒定本發(fā)明的中 和性抗IFN-a抗體?？刹捎眉兓腎FN-a多肽進(jìn)行此結(jié)合試驗(yàn)。在一實(shí)施例中，該結(jié)合 試驗(yàn)是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)，其中評(píng)價(jià)在IFN-a結(jié)合方面候選抗體與一個(gè)已知抗IFN-a抗體 競(jìng)爭(zhēng)的能力。此試驗(yàn)可以不同方式進(jìn)行，包括ELISA形式，也在下列實(shí)施例中闡述。如下所 述，也可用BIAcore 生物傳感器試驗(yàn)監(jiān)測(cè)候選抗體的IFN-a結(jié)合。可采用本領(lǐng)已知的任何合適的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來特征鑒定候選抗IFN-a單克隆抗 體與小鼠抗人IFN-a單克隆抗體9F3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合某具體IFN-a種類的能力。常規(guī)競(jìng)爭(zhēng)試 驗(yàn)在 Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow 禾口 David Lane (1988)中有所描述。在另一實(shí)施例中，可改進(jìn)如下例2所述的IFN_ a結(jié)合性 ELISA試驗(yàn)以利用候選抗體與9F3抗體之間的IFN- a結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。該試驗(yàn)按如下方法進(jìn)行 在微量滴定板上包被IFN- a，用與所選濃度的標(biāo)記9F3抗體相混合的未標(biāo)記抗IFN- a抗 體或未標(biāo)記對(duì)照抗體的系列稀釋液溫育已包被的滴定板，檢測(cè)并測(cè)量9F3抗體標(biāo)記物的信 號(hào)，然后比較抗體的不同稀釋液所顯示的信號(hào)測(cè)量結(jié)果。(ii)抗病毒試驗(yàn)例如，如 Kawade，J. Interferon Res. 1 :61_70(1980)或 Kawade 禾口 Watanabe， J. Interferon Res. 4 =571-584(1984)所述，通過監(jiān)測(cè)IFN_a的抗病毒活性的中和，可測(cè)定 候選抗體中和IFN-a生物活性的能力。簡(jiǎn)而言之，將與候選抗體的不同稀釋液預(yù)先混合的 固定濃度的IFN-a加入到人羊膜衍生FL細(xì)胞中，并用適當(dāng)?shù)牟《?如新培斯病毒)測(cè)定 候選抗體中和IFN-a的抗病毒活性的能力。用國際參考品人IFN-a (NIH Ga23-901_527) 測(cè)定，以國際單位(IU)表示滴定度。如果某一濃度的抗體比在同等濃度對(duì)照抗體存在下所測(cè)定的抗病毒活性抑制基 線水平抑制了更多的抗病毒活性，那么認(rèn)為該候選抗IFN-a抗體能夠抑制所選IFN-a亞 型的抗病毒活性。任選地，在抗病毒活性試驗(yàn)中與在同等濃度對(duì)照抗體存在下所測(cè)的基線 活性相比，某一濃度候選抗IFN-a抗體將抑制所選IFN-a亞型的抗病毒活性的至少約 60 %，或至少約70 %，較佳至少約75 %，或更佳至少約80 %，或再佳至少約85 %，或還要佳 至少約90 %，或還要更佳至少約95 %，或最佳至少約99 %。如果候選抗體的任何濃度不顯 示比在同等濃度對(duì)照抗體存在下所測(cè)抗病毒活性抑制基線水平更多的抗病毒活性抑制度， 那么認(rèn)為該候選抗IFN-a抗體不能抑制所選IFN-a亞型的抗病毒活性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，滴定在病毒感染性試驗(yàn)中所用的每種干擾素至一濃度，該 濃度提供與IFN-a標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)選單位數(shù)所誘導(dǎo)的相同水平的病毒生長(zhǎng)抑制。該濃度的作用 是提供受測(cè)試干擾素的標(biāo)準(zhǔn)化單位。為了評(píng)價(jià)抗IFN-a抗體抑制不同IFN-a亞型的抗病 毒活性的能力，對(duì)每種待測(cè)試IFN-a亞型測(cè)定了抗IFNa抗體抑制具體IFN_a亞型抗病 毒活性(滴定至提供標(biāo)準(zhǔn)化活性單位的濃度)50%的有效濃度(EC50)。在一個(gè)實(shí)施例中，如下例1所述進(jìn)行抗病毒活性中和試驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，在96孔微 量滴定板上培養(yǎng)A549細(xì)胞至密度5X105個(gè)A549細(xì)胞/孔。在37°C以100 1的總體 積將0. 2單位/ : 1的所選IFN- a亞型(標(biāo)準(zhǔn)化至0. 2單位/ : 1的NIH參考標(biāo)準(zhǔn)品重組人
30IFN-ci2)與候選抗IFN-a抗體的系列稀釋液培育1小時(shí)。然后將各100 1體積的抗體 /干擾素培育混合物加入到微量滴定板的各孔的5X105A549細(xì)胞和100 1的培育基中， 各孔中獲得最終100單位/ml的IFN-a濃度。37°C培育該細(xì)胞培養(yǎng)混合物24小時(shí)。然后 將細(xì)胞用2X 105pfu的腦心肌炎(EMC)病毒攻擊并37c再培育24小時(shí)。培育后，用可見光 顯微鏡檢或結(jié)晶紫染色測(cè)定細(xì)胞活力。對(duì)每個(gè)待檢測(cè)的IFN-a亞型測(cè)定候選抗IFN-a抗 體在試驗(yàn)中抑制具體IFN-a亞型抗病毒活性50%的有效濃度(EC50)。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試IFN_ a 亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN-a亞型的EC50 高達(dá)約20 :g/ml，或高達(dá)約10 :g/ml，或高達(dá)約5 :g/ml，或高達(dá)約4 :g/ml，或高達(dá)約3 :g/ ml，或高達(dá)約2 :g/ml，或高達(dá)約1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 1 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 1 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 2 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 4 g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 3 g/ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 2 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 3 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 3 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 4 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 4 g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 3 g/ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 4 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 5 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 5 :g/ml 至約 1 :g/ml 的。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 6 :g/ml 至約 20 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 10 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 4 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 3 g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 2 :g/ml，從約 0. 6 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 7 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 7 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 8 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 4 g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 3 g/ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 8 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 0. 9 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 5 g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 2 :g/ ml，從約 0. 9 :g/ml 至約 1 :g/ml。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在上述A549細(xì)胞EMC病毒抑制試驗(yàn)中，對(duì)受測(cè)試 IFN-a亞型表現(xiàn)出抗病毒活性中和作用的抗IFN-a抗體，將顯示對(duì)各受測(cè)試IFN_ a亞型 的 EC50 從約 1 :g/ml 至約 20 :g/ml，從約 1 :g/ml 至約 10 :g/ml，從約 1 :g/ml 至約 5 :g/ml， 從約 1 :g/ml 至約 4 :g/ml，從約 1 :g/ml 至約 3 :g/ml，從約 1 :g/ml 至約 2 :g/ml。(iii)交叉阻斷試驗(yàn)為了篩選能與感興趣抗體所結(jié)合的IFN-a表位相結(jié)合的抗體，可進(jìn)行如 "Antibodies, A Laboratory Manual，，，Cold Spring Habor Laboratory, Ed Harlow 禾口 David Lane，1988所述的常規(guī)交叉阻斷試驗(yàn)?；蛘?，或此外，可用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行表 位作圖。例如，可用Fendly等人.，Cancer Research50 1550-1558 (1990)所述的競(jìng)爭(zhēng)結(jié) 合分析測(cè)定受本發(fā)明單克隆抗體結(jié)合的IFN-a表位。在另一個(gè)例子中，在微量滴定板上用 直接熒光進(jìn)行交叉阻斷研究。此方法中，使用已建立的方法(Wofsy等人.Select Methods in CellularImmunology, 287 頁，Mishel 禾口 Schiigi 編 San Francisco :ff.J. Freeman Co. (1980))，將感興趣的單克隆抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)。微量滴定板的孔用所 選IFN-a包被，將包被孔與(l)FITC標(biāo)記的感興趣單克隆抗體和(2)未標(biāo)記的受試單克隆 抗體的混合物一起培育，并且定量測(cè)定各孔的熒光以確定此抗體所顯示的交叉阻斷水平。 如果與無關(guān)單克隆抗體對(duì)照相比各單克隆抗體彼此阻斷了 50%或更多的結(jié)合，那么認(rèn)為這 些單克隆抗體針對(duì)一共同表位。在細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物試驗(yàn)中所獲結(jié)果然后可在動(dòng)物中測(cè)試，如小鼠模型，和人臨 床實(shí)驗(yàn)。若需要，可將已鑒定具有所需特性的鼠單克隆抗體轉(zhuǎn)變成嵌合抗體，或用本領(lǐng)域所 熟知的技術(shù)人源化，包括“基因轉(zhuǎn)變誘變”方法，如美國專利N0. 5，821，337中所述，本文參 考引用該完整專利。本文的特定抗IFN-a抗體的人源化也在下列實(shí)例中描述。(iv)噬菌體展示方法可利用組合文庫鑒定本發(fā)明抗IFN-a抗體，以篩選具有所需活性的合成性抗體克隆。原則上，篩選含有展示與噬菌體包膜蛋白融合的抗體可變區(qū)(Fv)的各種片段(如， Fab，F(xiàn)(ab’)2等)的噬菌體的噬菌體文庫，選出合成性抗體克隆。用所需抗原的親和層析 淘選這樣的噬菌體文庫。表達(dá)能與所需抗原結(jié)合的Fv片段的克隆被抗原吸附并因而與文 庫中的非結(jié)合性克隆相分離。然后從抗原上洗脫結(jié)合性克隆，可另加幾輪抗原吸附/洗脫 循環(huán)進(jìn)一步富集。通過設(shè)計(jì)合適的抗原篩選方法以選出感興趣的噬菌體克隆，然后采用此 感興趣噬菌體克隆的Fv序列和如Kabat等人(1991)，同上所述的合適恒定區(qū)(Fc)序列構(gòu) 建全長(zhǎng)的抗IFN-a抗體克隆，可獲得本發(fā)明任何IFN-a抗體。噬菌體展示文庫的構(gòu)建抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域由輕(VL)鏈和重(VH)鏈的兩個(gè)各含有約110個(gè)氨基酸 的可變(V)結(jié)區(qū)構(gòu)成，二者都有三個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。如Winter等人.，Ann. Rev. Immunol, 12 =433-455(1994)所述，可變區(qū)可在噬菌體上功能性展示；或者作為單鏈 Fv(scFv)片段，其中VH和VL通過一條短而柔性的肽共價(jià)相連，或者作為D(ab’)2片段，其 中二片段分別與恒定區(qū)融合并且非共價(jià)互相作用。如本文所用，scFv編碼噬菌體克隆和 Fab或F(ab’)2編碼噬菌體克隆都稱為“Fv噬菌體克隆”或“Fv克隆”。動(dòng)物的原初文庫(抗原攻擊前的文庫)提供了能與基本上任何非自身分子以中等 親和力0V1約為Kf-lOl1)結(jié)合的抗體?？贵w結(jié)合位點(diǎn)的序列多樣性在種系中不直接編 碼但以組合方式由V基因區(qū)段組裝。在人重鏈中，從不到50個(gè)VH基因區(qū)段中取得前兩個(gè) 高變環(huán)(HI和H2)，與D區(qū)段和JH區(qū)段聯(lián)合產(chǎn)生第三個(gè)高變環(huán)(H3)。在人輕鏈中，從不到 約30個(gè)V8和不到約30個(gè)V6區(qū)段中取得前兩個(gè)高變環(huán)(L1和L2)和第三個(gè)(L3)的大部 分以完成第三個(gè)高變環(huán)(L3)。干細(xì)胞中V基因區(qū)段的每種組合性重排產(chǎn)生了表達(dá)單個(gè)VH-VL組合的B細(xì)胞。免 疫接種引發(fā)了制造結(jié)合免疫原的組合的B細(xì)胞增值(克隆擴(kuò)增)并分泌相應(yīng)抗體。然后通 過誘變和選擇(稱為親和力成熟)過程這些天然抗體成熟至高度親和力(KZ為109-10M-1)。 此后，通常取出這些細(xì)胞以制備雜交瘤并產(chǎn)生高親和力的單克隆抗體。如Winter 等人 Ann. Rev. Immunol, 12 :433_455 (1994)所述，在此法三步中，VH 和 VL基因文庫可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分別克隆并在噬菌體文庫中隨機(jī)重組，然后搜尋 抗原結(jié)合克隆。免疫接種來源的文庫提供了對(duì)免疫原的高親和力抗體，而不需要構(gòu)建雜交 瘤。另外，如Griffiths等人EMB0J. 12 :725-734 (1993)所述，可將該原初文庫克隆以在無 需免疫接種的前提下提供對(duì)廣泛范圍的非自身和自身抗原的人抗體的一種來源。最后，如 Hoogenboom 和 Winter. J. Mol. Biol.，227 :381_388 (1992)所述，通過克隆自干細(xì)胞的未經(jīng) 重排的V或VIII基因區(qū)段，并采用含有隨機(jī)序列的PCR引物以在體外編碼CDR3高變區(qū)并完成 重排，也可合成制得原初文庫。噬菌體展示模仿了 B細(xì)胞。通過與次要包膜蛋白p III融合使用絲狀噬菌體來展示 抗體片段。如Marks等人J. Mol. Biol. 222 =581-597 (1991)所述，抗體片段可作為單鏈Fv 片段展示，其中VH和VL區(qū)通過一柔性的多肽接頭連接在同一多肽鏈上，或如Hoogenboom 等人，Nucl. AcidsRes. ,19 :4133_4137 (1991)所述，作為 Fab (包括 F (ab，)2)片段展示，其 中一條鏈與PIII融合而另一條分泌入細(xì)菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中，在那兒組裝成Fab-包膜蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)，通過取代一些野生型包膜蛋白在噬菌體表面展示。當(dāng)抗體片段與P III的N端融合時(shí)， 此噬菌體有傳染性。然而，如果切下P III的N末端結(jié)構(gòu)域并與第二結(jié)構(gòu)域形成融合，此噬菌體無傳染性，而野生型P III必須通過輔助噬菌體提供。可將噬菌體的p III融合物和其它蛋白質(zhì)全部編碼在同一噬菌體復(fù)制子中或不同 復(fù)制子上。使用兩個(gè)復(fù)制子時(shí)，在噬菌粒(含有噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒)上編碼P III融合 物。如，Vieira和Messing，Meth. Enzymol, 153 :3_11 (1987)所述，用提供所有噬菌體蛋白質(zhì) (包括pill)但由于缺乏起點(diǎn)在與噬菌粒競(jìng)爭(zhēng)中自身難以被包裝的輔助噬菌體(如M13K07) 通過“挽救”，將噬菌體包入噬菌體顆粒中。在一優(yōu)選方法中，如Bass等人Proteins，8 309-314(1990)和 W092/09690 (PCT/US91/09133 公布于 1992 年 6 月 11 曰)所述，設(shè)計(jì)噬菌 體展示系統(tǒng)，使得重組噬菌體可在允許不多于微量的噬菌體顆粒在顆粒表面展示一個(gè)以上 拷貝的FV —包膜蛋白融合物的條件下在宿主細(xì)胞中培養(yǎng)。一般，從人或動(dòng)物收獲的免疫細(xì)胞中獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果需要偏 性選擇抗IFN-a克隆的文庫，可用IFN-a免疫接種該對(duì)象以產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并回收脾細(xì)胞 和/或循環(huán)性B細(xì)胞外周血淋巴細(xì)胞(PBL)用于文庫構(gòu)建。在一優(yōu)選實(shí)施例中，在具有功 能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內(nèi)源抗體產(chǎn)生系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗人 IFN-a抗體應(yīng)答而獲得偏性選擇抗人IFN-a克隆的人抗體基因片段文庫，因而IFN_ a免 疫接種產(chǎn)生的B細(xì)胞可產(chǎn)生抗IFN- a的人序列抗體。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，為了產(chǎn)生(包括生成對(duì)IFN-a諸亞型具有廣泛反應(yīng)活性的 抗IFN-a抗體的B細(xì)胞)抗體應(yīng)答用不同的優(yōu)選所有的IFN-a亞型的混合物免疫接種動(dòng) 物。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，如下例1所述，用存在于人類淋巴母細(xì)胞干擾素(由仙臺(tái)病毒誘 生的伯基特淋巴瘤細(xì)胞(Namalva細(xì)胞)分泌)中的人IFN_a諸亞型混合物免疫接種動(dòng)物。 此種人類淋巴母細(xì)胞干擾素的適用制品可從Sigma Chemical Compay, St. Louis, MO購得。用適當(dāng)?shù)暮Y選方法分離表達(dá)IFN-a特異性膜結(jié)合抗體的B細(xì)胞，如用IFN_ a 親和層析分離細(xì)胞或使細(xì)胞吸附于熒光色素標(biāo)記的IFN-a，然后用熒光激活細(xì)胞分選法 (FACS)，可獲得抗IFN-a反應(yīng)活性細(xì)胞群的進(jìn)一步富集?；蛘?，使用未免疫供體的脾細(xì)胞和/或B細(xì)胞或其它PBL，提供可能的抗體文庫的 更好提呈，并且也得以使用IFN-a無抗原性的動(dòng)物(人或非人)構(gòu)建抗體文庫。為了體 外摻入抗體基因構(gòu)建物的文庫，收獲該對(duì)象的干細(xì)胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核 酸。感興趣的免疫細(xì)胞可從各種動(dòng)物獲得，如人、小鼠、大鼠、兔、luprine、犬、貓、豬、牛、馬、
鳥類等。可從感興趣的細(xì)胞回收編碼抗體可變基因區(qū)段(包括VH和VL區(qū)段)的核酸并擴(kuò) 增。如 Orlandi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86 :3833_3837 (1989)所述，在重排 VH 和VL基因文庫的情況中，分離淋巴細(xì)胞的基因組DNA或mRNA然后用匹配于重排VH和VL 基因的5’和3’端的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，可獲得所需的DNA，然后制得用于表達(dá) 的多樣性 V 基因文庫。如 Orlandi 等人，(1989)和 Ward 等人，Nature，341 :544_546 (1989) 所述，用編碼成熟V結(jié)構(gòu)域的外顯子5’端上的后引物和基于J區(qū)段內(nèi)的前引物，可從cDNA 和基因組DNA中擴(kuò)增此V基因。然而，如Jones等人，Biotechnol，9 =88-89(1991)所述，對(duì) 于cDNA擴(kuò)增，后引物也可基于前導(dǎo)外顯子，而如Sastry等人，Proc. Natl. Acad. Sci, (USA)， 86 =5728-5732 (1989)所述，前引物也可基于恒定區(qū)。如Orlandi等人，(1989)或者Sastry 等人(1989)所述，為了將互補(bǔ)性最大化，可在引物中摻入簡(jiǎn)并性。優(yōu)選地，如Marks等 人，J. Mol.Biol，222 :581-597(1991)中方法所述或如 Orum 等人，Nucleic AcidsRes. ,21 4491-4498(1993)方法所述，采用針對(duì)各V基因家族的PCR引物以擴(kuò)增存在于免疫細(xì)胞核酸 樣品中所有可得的VH和VL排列，使該文庫多樣性最大化。如Orlandi等人(1989)所述， 為了將擴(kuò)增的DNA克隆入表達(dá)載體，可將稀有的限制性位點(diǎn)引入PCR引物一端中作為標(biāo)記， 或如Clackson等人Nature，352 :624_628 (1991)所述，用標(biāo)記的引物進(jìn)行進(jìn)一步PCR擴(kuò)增。合成性重排的V基因文庫可在體外由V基因區(qū)段衍生。大部分的人VH基因區(qū)段 已被克隆與測(cè)序(Tomlinson等人，J.Mol.，Biol.，227 :776_798 (1992)所報(bào)導(dǎo))，以及作圖 (Matsuda等人，Nature Genet. ,3 =88-94(1993)所報(bào)導(dǎo))；這些克隆的區(qū)段(包括HI和H2 環(huán)的所有主要構(gòu)象)用編碼不同序列和長(zhǎng)度的H3環(huán)的PCR引物可產(chǎn)生多樣性VH基因文庫 (如 Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227 :381_388 (1992)所述)。用位于單個(gè)長(zhǎng)度的 長(zhǎng)H3環(huán)中的所有序列多樣性也可制備VH文庫(Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457-4461(1992)所述)。人 V6 和 V8 區(qū)段已被克隆和測(cè)序(Williams 和 Winter，Eur. J. Immunol. ,23 :1456_1461 (1993)報(bào)導(dǎo))并可用于制取合成性輕鏈文庫。以一系列VH和 VL折疊和L3以及H3長(zhǎng)度為基礎(chǔ)的合成性V基因文庫，將編碼大量的結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。V 基因編碼DNA經(jīng)擴(kuò)增之后，種系V基因區(qū)段可按照Hoogenboom和Winter，J. Mol. Biol227 381-388(1992)所述方法體外重排。以幾種方法將VH和VL基因文庫聯(lián)合在一起，可構(gòu)建抗體片段的文庫。每一種文 庫可構(gòu)建在不同載體中，在體外重組這些載體，如Hogrefe等人，Gene, 128 119-126 (1993) 所述，或體內(nèi)組合感染，例如 Waterhouse 等人，Nucl. Acids Res. ,21 :2265_2266 (1993)所 述的loxP系統(tǒng)。體內(nèi)重組法利用Fab片段的二鏈性質(zhì)來克服大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率所帶來的 文庫大小限制。分別克隆原初VH和VL文庫，一個(gè)克隆入噬菌粒而另一個(gè)克隆入噬菌體載 體。然后用噬菌體感染含噬菌粒的細(xì)菌，將兩文庫聯(lián)合，使得每個(gè)細(xì)胞都含有不同的組合而 且文庫大小只受所存在細(xì)胞數(shù)目的限制(約1012克隆)。兩載體都含有體內(nèi)重組的信號(hào)， 使得VH和VL基因被重組于一個(gè)復(fù)制子上而且共同包裝入噬菌體毒粒中。這些巨大文庫提 供了大量有良好親和力0V1為約10_8M)的多樣性抗體。另外，可將這些文庫依次克隆至同一載體中，如Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88 =7978-7982 (1991)所述，或用PCR組裝起來，然后克隆，如Clackson等人， Nature 352:624-628(1991)所述。PCR組裝也可用于將VH和VL DNA與編碼一柔性肽間隔 物的DNA相連接以形成一個(gè)單鏈Fv(SCFv)文庫。在另一技術(shù)中，“細(xì)胞內(nèi)PCR組裝”用于在 淋巴細(xì)胞中通過PCR組合VH和VL基因，然后克隆所連接的基因文庫(如Embleton等人， Nucl. Acids Res. ,20 3831-3837 (1992)所述)。原初文庫(或者天然或者合成的)所產(chǎn)生的抗體可能具有中度親和力0V1為 約10_6 lCTM—1)，但通過構(gòu)建和重選擇次級(jí)文庫也可在體外模仿親和力成熟(如Winter 等人(1994)，同上所述)。例如使用易錯(cuò)聚合酶(Leung等人，Technique, 1 11-15 (1989) 報(bào)導(dǎo))以 Hawkins 等人，J. Mol. Biol.，226 :889_896 (1992)的方法或以 Gram 等人，Proc. Natl. Acad, SciUSA. 89 =3576-3580 (1992)的方法可在體外隨機(jī)引入突變。此外，通過在 所選個(gè)體的Fv克隆中隨機(jī)突變一個(gè)或多個(gè)CDR，如采用帶有跨越感興趣CDR的隨機(jī)序列 的引物作PCR，并篩選更高親和力的克隆可進(jìn)行親和成熟過程。W0 9607754 (公開于1996 年3月14日)描述了在免疫球蛋白輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)中誘導(dǎo)突變產(chǎn)生輕鏈基因文庫的方 法。另一有效方法是重組通過噬菌體展示對(duì)得自非免疫供體的天然存在V區(qū)變體文庫選出
35的VH或VL結(jié)構(gòu)域，并通過幾輪鏈改組篩選更高的親和力(如Marks等人，BiotechnollO 779-786(1992)所述)。這一技術(shù)產(chǎn)生了具有10_9M范圍親和力的抗體和抗體片段。膽 謝本廳雅輸IFN-ci械a^IFN- a 的合成利用已公布的干擾素的氨基酸和核酸序列(如見J. InterferonRes.，13 443-444(1993)、含有各種I型干擾素基因組和cDNA序列的匯編參考文獻(xiàn)和該文引用的 參考文獻(xiàn))可設(shè)計(jì)本文所用的IFN-a亞型的編碼核酸序列。對(duì)于IFN-aA(IFN-a2)、 IFN- a B (I FN- a 8)、I FN- a C (IFN_ a 10)、I FN- a D (IFN_ a 1)、IFN_ a E (IFN_ a 22)、 IFN-a F(IFN-a 21)、IFN-a G (IFN-a 5)、IFN-a H (IFN-a 14)氨基酸序列或 cDNA 序 列，見Goeddel等人，Nature, 290 :20_26 (1981) 23-24頁的圖3和圖4。對(duì)于編碼 IFN- a 7 (IFN- a J)的氨基酸序列的 cDNA,見 Cohen 等人，Dev. Biol. Standard, 60 111-112(1985)。用本領(lǐng)域已知的各種方法可制備編碼感興趣的干擾素的DNA。這些方法 包括但不限于 Engels 等人 Agnew. Chem. Int. Ed. Eghl. ,28 :716_734 (1989)中所述任何一種 化學(xué)合成方法，如三酯，亞磷酸酯，亞磷酰胺和H膦酸酯方法。在一個(gè)實(shí)施例中，在干擾素編 碼DNA的設(shè)計(jì)中采用表達(dá)宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子。另外，編碼干擾素的DNA也可從基因組 或cDNA文庫中分離得到。構(gòu)建了編碼感興趣干擾素的DNA分子之后，將該DNA分子操作性連接于表達(dá)載體 如質(zhì)粒中的表達(dá)調(diào)控序列，其中調(diào)控序列可為用此載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞所識(shí)別?？傊|(zhì)粒 載體包含有復(fù)制和調(diào)控序列，這些序列衍生于與宿主細(xì)胞相容的物種。此載體通常帶有一 個(gè)復(fù)制位點(diǎn)以及編碼蛋白質(zhì)(能夠提供在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表型選擇)的序列。對(duì)于原核宿主的表達(dá)，合適的載體包括pBR322(ATCC No. 37017)、phGH107 (ATCC No. 40011)、PB0475、pS0132、pRIT5、PRIT20 或 pRIT30 系列中的任何載體(Nilsson 禾口 Abrahmsen，Meth. Enzymol.，185 144—161 (1990))、pRIT2T、pKK233_2、pDR540 禾口 pPL-lambda。本文所適用的含有表達(dá)載體的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌K12株294(ATCC NO. 31446)，大腸桿菌株 JM101 (Messing 等人，Nucl. Acid Res. ,9 309 (1981))，大腸桿 菌株 B,大腸桿菌株 II1776(ATCC No. 31537)，大腸桿菌株 c600 (Appleyard, Genetics, 39 =440(1954)),大腸桿菌株W3110 (F-、、-、原養(yǎng)型，ATCC編號(hào)27325)，大腸桿菌株 27C7 (W3110, tonA, phoA E15, (argF-lac) 169，ptr3, degP41, ompT, kanr)(美國專利 No. 5288931，ATCC No. 55244)，枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和假單胞菌 jM o除原核生物之外，真核生物如酵母菌，或多細(xì)胞生物衍生的細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞。 對(duì)于酵母宿主細(xì)胞的表達(dá)，如普通的面包酵母或釀酒酵母，合適的載體包括基于2微米的 質(zhì)粒，整合載體和酵母人工染色體(YAC)載體的附加型復(fù)制性載體。對(duì)于昆蟲宿主細(xì)胞的 表達(dá)，如Sf9細(xì)胞，合適的載體包括桿狀病毒載體。對(duì)于植物宿主細(xì)胞的表達(dá)，特別是雙子 葉植物宿主如煙草，合適的表達(dá)載體包括衍生自根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的載體。然而，最關(guān)注脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括受SV40轉(zhuǎn)化的猴 腎CV1系(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎系(293或?yàn)樯L(zhǎng)于懸浮培養(yǎng)中而亞克隆293 細(xì)胞，Graham等人，J. Gen Virol.，36 :59 (1977))；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國 倉鼠卵巢細(xì)胞 /-DHFR (CH0, Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216 (1980))；小鼠塞托利細(xì)胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. ,23 :243_251 (1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1587)；人子宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2)； 犬腎細(xì)胞(MDCK，QTCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺 細(xì)胞(W138 ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(HepG2, HB 8065)；小鼠乳房腫瘤 _ 060562，ATCC CCL 51) ；TRI 細(xì)胞(Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sci.，383 44-68 (1982)) ；MRC5 細(xì)胞； FS4細(xì)胞；以及人肝癌細(xì)胞系Ofep G2)。對(duì)于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)，有用的載體包括SV40 衍生的載體，巨細(xì)胞病毒衍生的載體如PRK載體，包括pRK5和pRK7 (Suva等人，Science, 237:893-896(1987)，EP 307, 247(3/15/89), EP 278776 (8/17/88))，痘苗病毒或其它痘病 毒衍生的載體，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如莫落尼鼠白血病病毒(MoMLV)衍生的載體。任選地，將編碼感興趣干擾素的DNA操作性連接于一分泌性前導(dǎo)序列，導(dǎo)致宿主 細(xì)胞將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。分泌前導(dǎo)序列的例子包括stll，ecotin, lamB，皰疹⑶， lpp，堿性磷酸酶，轉(zhuǎn)化酶，以及a因子。也適用于本文的是蛋白質(zhì)A的36氨基酸前導(dǎo)序列 (Abrahmsen 等人，EMB0J.，4 3901 (1985))。轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并優(yōu)選用本發(fā)明上述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化，并在已改進(jìn)適合于誘導(dǎo) 啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴(kuò)增編碼所需序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育。轉(zhuǎn)染指宿主細(xì)胞攝入表達(dá)載體，不論編碼序列實(shí)際上是否表達(dá)。許多轉(zhuǎn)染方法是 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知的，例如磷酸鈣沉淀和電穿孔。當(dāng)表明該載體操縱已在宿主細(xì) 胞中發(fā)生時(shí)，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)化指將DNA引入生物體使得DNA可復(fù)制(作為染色體外元件或通過染色體整 合)。取決于所用的宿主細(xì)胞，采用適合該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用氯化鈣作鈣處 理(如 Sambrook 等人，Molecular Cloning (第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory, NY(1989) 1.82節(jié)所述)通常用于含有大量細(xì)胞壁屏蔽的原核生物或其他細(xì)胞。根瘤農(nóng)桿 菌感染用于某些植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，如Shaw等人，Gene, 23 =315(1983)和1989年6月29號(hào) 公開的W089/05859所述。對(duì)于沒有細(xì)胞壁的哺乳細(xì)胞，優(yōu)選如Sambrook等人(同上第 16. 30-16. 37節(jié))所述的磷酸鈣沉淀方法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的總體方面內(nèi)容在 Axel的1983年8月16日公布的美國專利4，399，216中有所描述。通常根據(jù)Van Solingen 等人，J. Bact.，130 946 (1977)和 Hsiao 等人，Proc. Natl. Acad. Scia (USA)，76 3829 (1979) 的方法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。然而，也可采用將DNA引入細(xì)胞的其它方法，如核注射，電穿孔，或原 生質(zhì)體融合。如Sambrook等人(同上)所述，可培養(yǎng)用于產(chǎn)生感興趣干擾素的原核宿主細(xì)胞?？捎酶鞣N培養(yǎng)基培養(yǎng)用于產(chǎn)生感興趣干擾素的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞?？少彽玫呐囵B(yǎng) 基如 Ham，s F10 (Sigma)，Minimal EssentialMedium( (MEM)，Sigma)，RPMI-1640 (Sigma)，和 Dulbecco's Modified Eagle，sMedium( (DMEM)，Sigma)適用于培育宿主細(xì)胞。另外，如 Ham 禾口 Wallace，Meth. Enz. ,58 44(1979), Barnes 禾口 Sato，Anal. Biochem.，102 255(1980), U. S. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；或 4，560，655 ；W0 90/03430 ；W0 87/00195 ； U. S. Pat. Re 30，985 ；或U. S. 5，122，469所述的任何培養(yǎng)基(所有這些公開內(nèi)容納入本文參 考文獻(xiàn)中)，可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。如需要，這些培養(yǎng)基可補(bǔ)加激素和/或其它生長(zhǎng)因 子(如胰島素，運(yùn)鐵蛋白，或表皮生長(zhǎng)因子)，鹽類(如氯化鈉，鈣，鎂，以及磷酸鹽)，緩沖液 (如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，抗生素(如慶大霉素藥物)，微量元素(限于通常以微
37摩爾范圍的最終濃度存在的無機(jī)化合物)，以及葡萄糖或等同的能源。也可包括本領(lǐng)域技術(shù) 人員所知的適當(dāng)濃度的任何其他所需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件，如溫度，PH值等等，是那些先前與 所選表達(dá)宿主細(xì)胞一起使用的，并且對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是清楚的。
本文所提宿主細(xì)胞包括體外培養(yǎng)的細(xì)胞以及宿主動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞。在胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)或周質(zhì)間隙分泌系統(tǒng)中，可通過破壞宿主細(xì)胞膜/細(xì)胞壁(如滲 透休克或用洗滌劑溶解宿主細(xì)胞膜)從培養(yǎng)細(xì)胞中回收重組表達(dá)的干擾素蛋白質(zhì)。另外， 在胞外分泌系統(tǒng)中，可由培養(yǎng)基中回收重組蛋白質(zhì)。第一步，離心培養(yǎng)基或裂解液以除去任 何顆粒性細(xì)胞碎片。然后分離膜與可溶性蛋白組分。通常從可溶性組分中純化得到干擾素。 如果IFN-α表達(dá)為膜結(jié)合種類，可用洗滌劑溶解從膜組分中回收膜結(jié)合肽。然后用合適的 方法(如免疫親和或離子交換柱上的分級(jí)；乙醇沉淀；反相HPLC ；硅土或陽離子交換樹脂 (如DEAE)層析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；如使用S印hadexG-75的凝膠過濾；疏 水親和樹脂和使用固定在基質(zhì)上的干擾素受體的配體親和法)進(jìn)一步純化該粗肽提取物。本文所用的許多人IFN- α可從商業(yè)來源獲得，如從Sigma (St. Louis, MO)， Calbiochem-Novabiochem Corporation(San Diego, CA)或 ACCURATEChemical & Scientific Corporation (Westbury, NY)獲得。標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法如 Maniatis 等人，Molecular Cloning :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)所述用于構(gòu)建 質(zhì)粒，該質(zhì)粒能指導(dǎo)各種hIFN-α轉(zhuǎn)位進(jìn)入大腸桿菌周質(zhì)空隙中。利用加入到引物中的 NsiI和StyI限制性位點(diǎn)在hIFN- α的不同亞型的cDNA克隆上進(jìn)行PCR反應(yīng)(Goeddel等， Nature 290 :20_26 (1981)。然后將這些PCR產(chǎn)物亞克隆入表達(dá)載體pB0720的相應(yīng)位點(diǎn)(如 Cunningham等人，Science243 1330-1336 (1989)所述)。所得的質(zhì)粒將 h_IFN_ α 亞型的產(chǎn) 生置于大腸桿菌PhoA啟動(dòng)子和熱穩(wěn)定腸毒素II信號(hào)肽的調(diào)控下(如Chang等人，Gene55 189-196(1987)所述)。用美國生物化學(xué)測(cè)序酶試劑盒2. O版本證實(shí)每個(gè)基因的正確DNA 序列。將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌株27C7(ATCC # 55244)中并在10升發(fā)酵罐中培養(yǎng)(如 Carter等人，Bio/Technology 10 163-167 (1992)所述)。用親和層析法從含有各個(gè)IFN-α 的大腸桿菌糊漿中純化得到人hIFN。裂解細(xì)菌，并以10，OOOxg離心裂解液除去碎片。將上 清液加到含有小鼠抗 hIFN-α B 抗體(LI-I)(如 Staehelin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 78 1848-1852(1981)所述獲得)的免疫親和柱上。用 Roy 等人，Journal of Chromatography, 303 =225-228(1984)的改進(jìn)方法將LI-I固定在可控孔玻璃上。用含20% (W/V)甘油pH為 3. O的0. IM檸檬酸鹽從該柱中洗脫結(jié)合的干擾素。純化的IFN用SDS-PAGE和免疫印跡法 分析，和用本文所述的hIFN誘導(dǎo)的抗病毒試驗(yàn)測(cè)試生物活性。如Rehberg 等人，J. Biol. Chem.，257 11497—11502 (1992)或 Horisberger 和 Marco，Pharmac. Ther. ,66 507-534 (1995)所述，獲得了人 IFN-α 2/1 雜合分子 (IFN- α 21_62/ α 64_166)。b. IFN- α 的固定為了用于噬菌體展示克隆的親和層析分離，可將純化的IFN-α吸附于合適的基 質(zhì)，如瓊脂糖珠，丙烯酰胺珠，玻璃珠，纖維素，多種丙烯酸共聚物，羥基甲基丙烯酸酯凝 膠，聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物，尼龍，中性和離子型運(yùn)載體，等等。用如Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)所述方法可實(shí)現(xiàn)IFN-α蛋白質(zhì)與基質(zhì)的附著。將蛋白質(zhì)配體附著在多糖基質(zhì)(如瓊脂糖、葡聚糖或纖維素)的常用技術(shù)包括用鹵化氰活化運(yùn)載體并隨 后將肽配體的主要脂肪胺或芳香胺與該活化基質(zhì)偶聯(lián)。另外，IFN-a可用于包被吸附板孔，表達(dá)在固定于吸附板的宿主細(xì)胞上或用于細(xì) 胞分選，或偶聯(lián)生物素而用于用鏈霉親合素包被的玻璃珠來捕獲，或用于任何其他已知的 淘選噬菌體展示文庫的方法中。c、淘選方法在適合于用吸附劑結(jié)合至少一部分噬菌體顆粒的條件下使噬菌體文庫樣品， 與固定的IFN-a接觸。通常，選擇此條件包括pH值，離子強(qiáng)度，溫度等來模擬生理?xiàng)l 件。洗滌結(jié)合于固相的噬菌體并用酸(如Barbas等人，Proc.Natl.Acad. Sci USA,88 7978-7982(1991)所述)，或用堿(如Marks 等人，J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991)所述)， 或用IFN-a抗原(如類似于Clackson等人，Nature，352 =624-628(1991)的抗原競(jìng)爭(zhēng)法的 方法)洗脫。在一輪選擇中，可富集噬菌體20-1000倍。另外，可將富集的噬菌體培養(yǎng)在細(xì) 菌培養(yǎng)物中并進(jìn)行更多輪選擇。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，用各種固定的IFN-a亞型連續(xù)地溫育噬菌體以鑒定和進(jìn) 一步特征分析對(duì)大部分(優(yōu)選全部)IFN_a亞型表現(xiàn)出明顯結(jié)合的噬菌體克隆。此方法中， 噬菌體先與一特定IFN-a亞型一起溫育。洗脫結(jié)合于此亞型的噬菌體并用另一 IFN-a亞 型選擇。對(duì)所有IFN-a亞型重復(fù)此結(jié)合與洗脫過程。最后，該方法獲得了對(duì)所有IFN-a 亞型具有廣譜反應(yīng)活性的噬菌體展示抗體群。除IFN-a外用其它種類IFN檢測(cè)這些噬菌 體，以選擇那些對(duì)其他種類IFN不顯示明顯結(jié)合的克隆。最后，可檢測(cè)所選出的噬菌體克隆 中和各種IFN-a亞型的生物活性(如抗病毒活性)的能力，最后選出展現(xiàn)對(duì)大部分(優(yōu)選 全部)IFN-a亞型有廣泛中和活性的抗體的克隆。選擇效率依賴許多因素，包括洗滌時(shí)的解離動(dòng)力學(xué)，和單個(gè)噬菌體上的各個(gè)抗體 片段能否同時(shí)與抗原結(jié)合。具有快速解離動(dòng)力學(xué)(和弱結(jié)合親和力)的抗體可用短時(shí)洗滌， 多價(jià)噬菌體展示和固相中抗原高密度包被來保留。高密度通過多價(jià)相互作用不僅能穩(wěn)定噬 菌體，還有利于已解離的噬菌體重結(jié)合。用長(zhǎng)時(shí)間洗滌和單價(jià)噬菌體展示(如Bass等人， Proteins, 8 :309_314 (1990)和W092/09690所述)，以及抗原低密度包被(如Marks等人， Biotechnol. ,10 :779_783 (1992)所述)可促進(jìn)具有慢解離動(dòng)力學(xué)(和良好結(jié)合親和力)的 抗體的選擇?？稍趯?duì)IFN-a具有不同親和力(甚至微弱差別的親和力)的噬菌體抗體之間進(jìn) 行選擇。然而，所選抗體的隨機(jī)突變(如按照上述親和力成熟技術(shù)的某些技術(shù)進(jìn)行)可能產(chǎn) 生許多突變體，大部分能結(jié)合抗原，且少數(shù)具有高親和力。通過限制IFN-a，可競(jìng)爭(zhēng)出罕見 的高親和力噬菌體。為了保留所有較高親和力的突變體，可與過量的生物素化IFN-a (但 用低于IFN-a靶摩爾親和力常數(shù)的摩爾濃度的生物素化IFN-a) —起溫育噬菌體。用鏈 霉親合素包被的順磁珠可捕獲高親和力結(jié)合性噬菌體。此種“平衡捕捉”使得抗體根據(jù)它 們的結(jié)合親和力而被選出，其靈敏度能夠從大大過量的低親和力噬菌體中分離出親和力只 高2倍的突變克隆。也可操縱用于洗滌結(jié)合于固相的噬菌體的條件來根據(jù)解離動(dòng)力學(xué)進(jìn)行 區(qū)分。在一個(gè)實(shí)施例中，將噬菌體與固定在固體支撐物(如上述層析聚合物基質(zhì))上的 不同IFN-a亞型一起連續(xù)溫育。此方法中，噬菌體先與一特定IFN-a亞型一起溫育。用合適的洗脫液(如能將結(jié)合的噬菌體釋放到溶液中的鹽或酸性緩沖液)從固相中洗脫結(jié)合于 該亞型的噬菌體。然后，將洗脫的噬菌體克隆用另一 IFN-a亞型選擇。為了富集與可溶性 IFNAR2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IFN-a的克隆群，從一系列IFN_ a亞型層析分離物中回收噬菌體克隆，將 其與預(yù)先吸附于IFN-a的固定IFNAR2的復(fù)合物一起溫育，然后從溫育反應(yīng)混合物中回收 未吸附的噬菌體克隆。選擇方法可設(shè)計(jì)為使用任何合適的批次層析技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施例中，使噬菌體克 隆吸附在懸浮的IFN-a衍生聚合物基質(zhì)珠上。離心回收吸附的珠，以合適的洗脫緩沖液重 懸回收的珠并溫育，合適的洗脫液沖洗是能使結(jié)合的噬菌體釋放到溶液中的鹽或酸性緩沖 液，離心洗脫混合物，從上清液中回收洗脫的噬菌體克隆，然后對(duì)于每種其它IFN-a亞型 都重復(fù)此吸附/洗脫程序。為了富集能與可溶性IFNAR2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IFN-a的克隆群，將 從IFN-a亞型層析分離物回收的噬菌體克隆與預(yù)吸附至IFN-a的IFNAR2衍生聚合物基 質(zhì)珠懸浮液一起溫育，離心溫育混合物，然后從上清液中回收未吸附的噬菌體克隆。在另一實(shí)施例中，設(shè)計(jì)選擇方法來富集在每次親和層析分離中能抑制IFN-a與 IFNAR2結(jié)合的噬菌體群落。此方法中，使噬菌體與各種固定在固體支撐物上的特定IFN-a 亞型一起連續(xù)溫育，然后用含有過量可溶性IFNAR2(如IFNAR2 E⑶-IgG Fc)的洗脫液，在 可溶性IFNAR2能夠置換與IFNAR2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固定化IFN-a的噬菌體克隆的條件下從固相 中洗脫。對(duì)每種特定IFN-a亞型重復(fù)此結(jié)合與洗脫過程。在另一實(shí)施例中，使噬菌體克隆吸附于懸浮的IFN-a衍生聚合物基質(zhì)珠上，離心 回收吸附的珠，以含有過量可溶性IFNAR2(如IFNAR2 ECD-IgGFc)的合適的洗脫緩沖液重 懸回收的珠，在可溶性IFNAR2能夠置換與IFNAR2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合固定化IFN-a的條件下培 育，使結(jié)合的噬菌體釋放到溶液中，離心洗脫混合物，從上清液中回收洗脫的噬菌體克隆， 然后對(duì)于每種其它IFN- a亞型都重復(fù)此吸附/洗脫程序。最后，此法獲得對(duì)廣泛IFN- a亞型具有IFNAR2結(jié)合抑制活性的噬菌體展示抗體 群。然后可測(cè)試這些噬菌體對(duì)其它IFN種類(除了 IFN-a種類)如IFN-3的作用，以選 出那些對(duì)其他種類IFN不顯示明顯結(jié)合的克隆。最后，可測(cè)試所選噬菌體克隆中和各種 IFN-a亞型生物活性，如抗病毒活性的能力，最終選出展現(xiàn)對(duì)大多數(shù)(優(yōu)選全部)IFN_a亞 型有廣泛中和活性的抗體的克隆?？笽FN-a克隆的活性選擇在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了抗IFN-a抗體，該抗體能結(jié)合并中和大多數(shù)(優(yōu) 選全部)IFN-a亞型的活性，但并不明顯結(jié)合或中和其他種類干擾素的活性。例如用前述 用于抗體的基本上相同方法，可測(cè)試不同噬菌體克隆中和不同IFN-a亞型抗病毒活性的 能力。4、可溶性IFNAR2_IgG的制備采用與Haak-Frendscho 等人，Immunology 79 :594_599 (1993)所述用于構(gòu)建鼠 IFN受體免疫黏附素的相似方法，可產(chǎn)生基于hIFNAR2胞外域的人免疫球蛋白融合蛋白 (免疫黏附素)的編碼cDNA(pRKS hIFNAR2-IgG克隆)。簡(jiǎn)而言之，如W089/02922 (PCT/ US 88/03414，公布于1989年4月6日)實(shí)施例4所述構(gòu)建質(zhì)粒pRK⑶42FC1。從公開的 序列(Novick 等人，Cell,77 391-400[1994])中獲得成熟 hIFNAR2 ECD 的前 216 個(gè)殘 基的cDNA編碼序列。用hIFNAR2 EOT編碼cDNA代替pRK⑶42Fei的⑶4編碼序列以形成pRK5hIFNAR2-IgG克隆。使用磷酸鈣沉淀技術(shù)通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在人胚胎腎293細(xì)胞中表 達(dá)hIFNAR2-IgG。通過蛋白質(zhì)A_s印harose凝膠柱親和層析(如Haak_Frendscho等人， (1993)，同上所述)從無血清細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一步純化此免疫黏附素。用含20% (W/ V)甘油，pH為3. 0的0. 1M檸檬酸鹽緩沖液洗脫結(jié)合的hIFNAR2-IgG。根據(jù)SDS-PAGE， hIFNAR2-IgG純化至95%純以上。5、抗IFN-a抗體的診斷應(yīng)用本發(fā)明的抗IFN-a抗體是IFN-a表達(dá)診斷試驗(yàn)中的獨(dú)特研究試劑。如前所述， 在某些自身免疫疾病如IDDM，SLE以及自身免疫性甲狀腺炎中IFN-a表達(dá)增加。使用對(duì)大 部分IFN-a亞型有廣泛反應(yīng)活性的本發(fā)明抗IFN-a抗體可檢測(cè)并定量測(cè)量這些疾病中各 種IFN-a亞型的增加表達(dá)。抗IFN-a抗體也用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來源中親和純 化各種IFN-a亞型。在許多眾所周知的診斷試驗(yàn)方法之任一中可采用抗IFN-a抗體以檢測(cè)IFN-a。 例如，從所需來源中獲得樣品，將該樣品與抗IFN-a抗體混合使得該抗體與存在于混合物 中的任何IFN- a亞型形成抗體/IFN- a復(fù)合物，并且檢測(cè)存在于混合物中的任何抗體/ IFN-a復(fù)合物，可測(cè)定生物樣品的IFN-a。以本領(lǐng)域已知的適合特定樣品的方法可制備 試驗(yàn)用的生物樣品。根據(jù)所用試驗(yàn)的類型選擇將樣品與抗體混合的方法以及檢測(cè)抗體/ IFN-a復(fù)合物的方法。這種試驗(yàn)包括競(jìng)爭(zhēng)和夾心試驗(yàn)，以及空間抑制試驗(yàn)。競(jìng)爭(zhēng)和夾心方 法采用相分離步驟作為該方法的完整部分而空間抑制試驗(yàn)在單個(gè)反應(yīng)混合物中進(jìn)行。IFN-a的分析方法都采用1種或多種下列試劑標(biāo)記IFN_ a的類似物，固定化 IFN-a的類似物，標(biāo)記的抗IFN-a抗體，固定化抗IFN-a抗體和立體偶聯(lián)物。標(biāo)記試劑也 稱為“示蹤劑”。所用標(biāo)記是任何不干擾IFN-a和抗IFN_a抗體結(jié)合的可檢測(cè)的官能度。用于 免疫試驗(yàn)的許多標(biāo)記是已知的，例子包括那些可直接檢測(cè)的分子，如熒光色素，化學(xué)發(fā)光 劑，和放射性標(biāo)記以及必須經(jīng)反應(yīng)或衍生才能檢測(cè)到的分子，如酶。這些標(biāo)記的例子包 括放射性同位素32P、14C、125I、3H和1311，熒光團(tuán)如稀土螯合物或熒光素及其衍生物，羅丹明 及其衍生物，丹酰，傘形酮，螢光素酶，如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶(美國專利NO 4，737，456)，螢光素，2，3-二氫酞嗪二酮，辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶，0 -半孔糖 苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，如葡糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡糖-6-磷酸脫氫 酶，雜環(huán)氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與使用過氧化氫氧化染料前體的酶如HRP，乳過 氧化物酶，或微過氧化物酶偶聯(lián)，生物素/親合素，自旋標(biāo)記，噬菌體標(biāo)記，穩(wěn)定的的自由
其絕絕
35 寸寸o可用常規(guī)方法將這些標(biāo)記共價(jià)結(jié)合于蛋白質(zhì)或多肽。例如，可用偶聯(lián)劑如二醛， 碳化二亞胺，馬來酰氫亞胺，雙亞氨酸酯，雙重氮化聯(lián)苯胺等以上述熒光、化學(xué)發(fā)光和酶標(biāo) 記對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記。如見美國專利NO. 3，940，475 (熒光測(cè)定)和3，645，090 (酶)；Hunter 等人，Nature, 144 945(1962) ；David 等人，Biochemistry, 13 1014-1021 (1974) ；Pain 等 人，].Immunol. Methods, 40 :219_230 (1981)；禾口 Nygren, J. Histochem. AndCytochem. ,30 407-412(1982)。本文優(yōu)選的標(biāo)記是酶，如辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。這些標(biāo)記(包括酶)與抗體的偶聯(lián)是免疫試驗(yàn)技術(shù)普通技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)操作 方法。如參見 0’ Sullivan 等人，“Methods for the Preparation of Enzyme-antibodyConjugates for Use in Enzyme Immunoassay,，，收編在 Metnods in Enzymology, J. J. Langone 禾口 H. Van Vunakis 編，第 73 卷(AcademicPress, New York, New York, 1981), 147-166 頁。對(duì)某些試驗(yàn)方法需要固定試劑。固定需要將抗IFN-a抗體與溶液中保持游離的 IFN-a相分離。常規(guī)上，在試驗(yàn)步驟之前不溶解抗IFN-a抗體或IFN_ a類似物而實(shí)現(xiàn)這 一分離，如通過吸附于水不溶性基質(zhì)或表面(Bermich等人，美國專利3，720，460)，通過共 價(jià)偶聯(lián)(例如，用戊二醛交聯(lián))，或者后來不溶解抗IFN-a抗體或IFN-a類似物，如免疫沉 淀法。其它的試驗(yàn)方法，已知為競(jìng)爭(zhēng)或夾心試驗(yàn)，已經(jīng)完善建立并廣泛用于商品化診斷產(chǎn)業(yè)。競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)依賴示蹤劑IFN-a類似物與測(cè)試樣品IFN_ a競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)量的抗 IFN-a抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的能力。通常在競(jìng)爭(zhēng)之前或/之后不溶解抗IFN-a抗體然后將 結(jié)合于抗IFN-a抗體的示蹤劑和IFN-a與未結(jié)合的示蹤劑和IFN_ a相分離。通過傾析 (其中結(jié)合伴侶為預(yù)先不溶解的)或離心(其中結(jié)合伴侶在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)之后被沉淀)進(jìn)行 此分離。試驗(yàn)樣品IFN-a的量與結(jié)合的示蹤劑的量(通過標(biāo)記物質(zhì)的量測(cè)定)成反比。 用已知數(shù)量的IFN-a制作劑量反應(yīng)曲線并與試驗(yàn)結(jié)果作比較，以定量測(cè)定試驗(yàn)樣品中的 IFN-a量。當(dāng)用酶作為可檢測(cè)標(biāo)記時(shí)，這些試驗(yàn)稱為ELISA系統(tǒng)。另一種競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)稱為“均相”試驗(yàn)，不需要相分離。在此，制備并使用IFN-a與酶 的偶聯(lián)物，這樣當(dāng)抗IFN-a抗體結(jié)合于IFN-a時(shí)，所含抗IFN_a抗體調(diào)節(jié)了酶活性。此 例中，IFN-a或其免疫活性片段以雙功能有機(jī)橋與酶(如過氧化物酶)偶聯(lián)。用抗IFN-a 抗體選擇所用的偶聯(lián)物，使得抗IFN-a抗體的結(jié)合抑制或加強(qiáng)了標(biāo)記酶的活性。此方法本 身以EMIT命名而廣泛使用。立體偶聯(lián)物用于均相試驗(yàn)的空間位阻方法中。將低分子量的半抗原與小IFN-a 片段共價(jià)連接合成這些偶聯(lián)物使得抗半抗原的抗體基本上不能與抗IFN-a抗體同一時(shí)間 結(jié)合此偶聯(lián)物。在此試驗(yàn)方法下，試驗(yàn)樣品中所含IFN-a將結(jié)合抗IFN-a抗體，從而使 抗_半抗原抗體與此偶聯(lián)物結(jié)合，導(dǎo)致偶聯(lián)物半抗原的特性改變，如，當(dāng)半抗原是熒光團(tuán)時(shí) 發(fā)生熒光改變。夾心試驗(yàn)尤其適用于IFN-a或抗IFN_ a抗體的測(cè)定。順序夾心試驗(yàn)中，使用固 定的抗IFN-a抗體吸附試驗(yàn)樣品的IFN-a，通過洗滌除去試驗(yàn)樣品，用結(jié)合的IFN-a吸附 第二個(gè)標(biāo)記的抗IFN-a抗體，然后將殘余的示蹤劑與結(jié)合物質(zhì)相分離。結(jié)合的示蹤劑量與 試驗(yàn)樣品的IFN-a量成正比。在“同時(shí)”夾心試驗(yàn)中，試驗(yàn)樣品在加入標(biāo)記的抗IFN-a之 前不分離。用抗IFN-a單克隆抗體作為一種抗體，多克隆抗IFN-a抗體作為另一種抗體 的順序夾心試驗(yàn)可用于測(cè)試樣品的IFN-a。前文只是IFN- a的示范性診斷試驗(yàn)?，F(xiàn)在或以后開發(fā)的采用抗IFN_ a抗體測(cè)定 IFN-a的其他方法，也包括在本文范圍之內(nèi)，包括上述的生物試驗(yàn)法。6、治療組合物與抗IFN-a抗體的給藥將具有所需純度的抗體與任選的生理上可接受的運(yùn)載體，賦形劑或穩(wěn)定劑 (Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Alfoson, R.編，Mack Publishing Co. (Easton, PA 1995))混合制備本發(fā)明的抗IFN-a抗體治療制劑以凍干餅或水溶液形式貯存?？山邮艿倪\(yùn)載體，賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對(duì)受者無毒性， 且包括緩沖液，如磷酸鹽，檸檬酸鹽，以及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量 (少于約10個(gè)殘基)多肽，蛋白質(zhì)，如血清清蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚 乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖以及其 它糖類包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑如EDTA ；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離 子如鈉；和/或非離子表面活性劑如Tween，Pluronics或聚乙二醇(PEG)。用于體內(nèi)給藥的抗IFN-a抗體必須是無菌的。在凍干和重建之前或之后，通過無 菌過濾膜過濾不難實(shí)現(xiàn)這一要求。通?？笽FN-a抗體以凍干形式或溶液貯存。通常將治療性抗IFN-a抗體組合物置于帶無菌入口的容器中，例如帶有可被皮 下注射針刺穿的塞子的靜脈輸液袋或小管中。根據(jù)已知方法進(jìn)行抗IFN-a抗體的給藥，如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、 眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腦脊髓內(nèi)或病灶內(nèi)途徑注射或灌注，或如下所述的緩釋系統(tǒng)。抗體優(yōu)選是全 身給藥的。緩釋制品的合適例子包括以有形物品形式如薄膜，或微膠囊的半滲透性聚合物基 質(zhì)。緩釋基質(zhì)包括聚酯，水凝膠，聚交酯(美國專利3，773，919，EP 58，481)，L-谷氨酸和 L-谷氨酸Y乙酯的共聚物(Sidman等人，Biopolymers，22 :547_556 (1983)，聚(甲基丙烯 酸 2-羥基乙酯(Langer 等人，J. Biomed. Mater. Res.，15 167-277 (1981)和 Langer. Chem Tech. 12 =98-105,1982)，乙烯-乙酸乙烯(Langer 等人，同上)或聚-D-(-) -3 羥丁酸(EP 133,988)。緩釋抗IFNAR2抗體組合物也包括脂質(zhì)體包裹的抗體。按已知方法(DE3218121 ； Epstein 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 3688-3692,1985 ；Hwang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77 :4030-4034,1980 ；EP 52，322 ；EP36, 676 ；EP88, 046 ；EP143, 949 ；EP142,641 ； 曰本專利申請(qǐng)83-118008 ；美國4，485，045和4，544，545，以及EP102，324)制備含抗體的脂 質(zhì)體。通常脂質(zhì)體是小的(約200-800埃)單層類型，其中脂類含量大于約30mol%的膽固 醇，為獲得最適抗體療法調(diào)整所選比例?？笽FN-a抗體也可通過吸入給藥。用于液體制劑的商品化霧化器(包括噴射霧 化器和超聲霧化器)可用于給藥。液體制劑可直接霧化，而凍干粉末可在重建后霧化。另 外，抗IFN-a抗體用氟碳配方和計(jì)量劑量吸入器氣溶膠化，或作為凍干和碾磨粉吸入。治療上所用的抗IFN-a抗體的“有效量”將取決于例如治療對(duì)象、給藥途徑、所用 抗IFN-a抗體的類型，以及患者狀況。因此，治療學(xué)家必需滴定劑量并按需修改給藥途徑 以獲得最佳治療效果。通常，臨床醫(yī)生將給予抗IFN-a抗體直到獲得所需效果的劑量。用 常規(guī)試驗(yàn)不難監(jiān)控該治療過程。用本發(fā)明抗IFN-a抗體治療的患者包括臨床前患者或那些最近發(fā)作免疫介導(dǎo)疾 病，尤其是自身免疫性疾病的患者?；颊呤潜景l(fā)明治療對(duì)象，直到?jīng)]有健康組織需要受保護(hù) 避免免疫介導(dǎo)的破壞。例如，患胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的患者可從用本發(fā)明抗IFN-a 抗體的治療中得益，直到患者的胰島細(xì)胞不再有活力。在免疫介導(dǎo)的或自身免疫性疾病的 發(fā)展過程中，需要盡可能早的給予抗IFN-a抗體，并且要持續(xù)治療只要必須保護(hù)健康組織 不受患者免疫系統(tǒng)的破壞。例如，治療IDDM患者直到胰島素監(jiān)測(cè)顯示有充分的胰島應(yīng)答和 胰島壞死減少的其它跡象(如抗_胰島-抗體滴度降低)，之后患者可撤銷抗IFN-a抗體 治療一段試驗(yàn)時(shí)間，監(jiān)測(cè)此期間內(nèi)胰島素反應(yīng)和抗胰島抗體的水平有無復(fù)發(fā)。
在用抗IFN-a抗體治療與預(yù)防免疫介導(dǎo)的或自身免疫性疾病中，以復(fù)合優(yōu)良藥 物規(guī)范的方式制備此抗體組合物，確定劑量并給藥。上文所考慮因素包括待治療的具體疾 病、待治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀況、患病原因、抗體輸送的部位、抗體的具體 類型、給藥方法、給藥時(shí)間表，以及醫(yī)生已知的其他因素。待給予的抗體的“治療有效量”將 視這些因素而定，而且是預(yù)防，緩解或治療此病(包括治療慢性自身免疫性疾病和移植物 受者中維持免疫抑制)所必需的最小量。此量宜低于對(duì)宿主有毒或使宿主對(duì)感染顯著易感 的量。作為一般建議，腸胃道外給予該抗體的初步藥學(xué)有效量范圍是每天病人體重每公 斤約0. l-50mg,典型的初步抗體劑量范圍是0. 3-20mg/kg/天，更佳是0. 3_15mg/kg/天。所 需的劑量可通過抗體的單次推注給藥，多次推注給藥或連續(xù)輸注給藥來輸遞，取決于醫(yī)師 希望達(dá)到的藥物動(dòng)力學(xué)衰減模式。如上所指，這些抗體的建議量應(yīng)經(jīng)過大量的治療性斟酌。如上所示，選擇適當(dāng)劑量 與時(shí)間表的關(guān)鍵因素是所獲結(jié)果。此抗體不需要，但任選地可與當(dāng)前用于預(yù)防或治療所示免疫介導(dǎo)的或自身免疫性 疾病的一種或多種制劑一起配制。例如，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，此抗體可與糖皮質(zhì)類固醇聯(lián) 合給予。這些其他制劑的有效量取決于配方所含抗IFN-a抗體的量，疾病或治療類型，以 及上述的其它因素。這些制劑通常以相同劑量和前述給藥途徑或以上所用劑量的1-99%使用。以下實(shí)例中可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的更多細(xì)節(jié)，進(jìn)一步明確了本發(fā)明的范圍。此說明書所 引用的所有參考文獻(xiàn)及其中所引用的參考文獻(xiàn)都在這里完整引入以作參考。
實(shí)施例提供以下實(shí)例來闡明而不限制。提供實(shí)例的目的是為了向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 提供如何制備和應(yīng)用本發(fā)明的化合物，組合物，及方法，而無意限制發(fā)明者所認(rèn)為的發(fā)明范 圍。已作出努力確保所用數(shù)字的準(zhǔn)確度(如，數(shù)量，溫度，等)，但是應(yīng)該說明有一些實(shí)驗(yàn)性 誤差和偏差。除另有注明，分是重量等分，溫度是攝式度，而壓力為大氣壓或接近大氣壓。在 說明書中所有引用的公開內(nèi)容納入本文作為參考文獻(xiàn)引用。實(shí)施例1廣泛反應(yīng)活性的小鼠抗IFN-a單克隆抗體的產(chǎn)生和特性鑒定材料與方法對(duì)IFN-a諸亞型具有廣泛反應(yīng)性的鼠單克隆抗體用人IFN- a諸亞型的混合物順次免疫接種小鼠產(chǎn)生大量候選mAbs，然 后篩選其結(jié)合能力和活性，從而開發(fā)了泛-IFN-a中和性抗體。特別地，用重懸在 MPL-TDM(Ribi Immunochemical Research, Inc. ，Hamilton, MT)巾白勺 2. 5 :g
hIFN-a (Product No. 1-9887 of Sigma, St. Louis, M0)免疫接種 Balb/c 小鼠各后腿足墊 9 次(間隔兩周)。最后一次加強(qiáng)注射后第三天，用35%聚乙二醇將胭窩淋巴結(jié)細(xì)胞與鼠類 骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag 8. U. 1 (ATCC CRL1597)融合。在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交瘤。融合后第 十天，在ELISA中先篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液與不同種類hIFN-a結(jié)合的mAbs。如下所述，測(cè) 試了所選雜交瘤培養(yǎng)上清液抑制IFN對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的抗病毒細(xì)胞病變效應(yīng)的 能力。如圖1所示，從1794個(gè)融合孔中獲得的3個(gè)mAbs能中和一組多種IFN-a亞型。亞
44克隆并重分析這三個(gè)mAbs。中和IFN-a的抗病毒活性如Yousefi，S.，等人，Am. J. Clin. Pathol. ,83 :735_740 (1985)所述測(cè)試 了候選 抗體中和IFN-a的抗病毒活性的能力。簡(jiǎn)而言之，用受腦心肌炎(EMC)病毒攻擊的人肺 癌A549細(xì)胞進(jìn)行了該試驗(yàn)。以100 1的總體積將mAb的系列稀釋液與各種單位的I型 干擾素一起溫育37°C 1小時(shí)。然后以100 1的細(xì)胞培養(yǎng)基將這些混合物與5X105個(gè) A549細(xì)胞一起溫育24小時(shí)。然后用2X105pfu的EMC病毒攻擊細(xì)胞24小時(shí)。在溫育后， 用可見光顯微鏡檢查或結(jié)晶紫染色測(cè)定細(xì)胞活力。中和性抗體滴定度(EC50)定義為能中 和100單位/ml的I型IFN 50%的抗病毒細(xì)胞病變作用的抗體濃度。用NIH參考品重組 人IFN-a 2為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定本研究中所用I型IFN的單位。所測(cè)的各種I型IFN的比活性如 下IFN- a 2/ a 1 (IFN- a 2 殘基 1-62/- a 1 殘基 64-166 (2 X 107IU/mg)，IFN- a 1 (3 X 107IU/ mg)，IFN- a 2 (2 X 107IU/mg)，IFN- a 5 (8 X 107IU/mg)，IFN- a 8 (19 X 107IU/mg)，以 及 IFN- a 10 (1. 5X 105IU/mg)。所測(cè)的白細(xì)胞 IFN 是 Sigma 產(chǎn)品 No. 1-2396。所測(cè) 的類淋巴母細(xì)胞IFN是NIH參考標(biāo)準(zhǔn)品Ga23_901-532。在申請(qǐng)人請(qǐng)求下，在Access Biomedical (SanDiego, CA)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中使用上述試驗(yàn)方式獲得圖3B所示數(shù)據(jù)。電泳遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)IFN的大多數(shù)立即作用與潛伏性胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑和轉(zhuǎn)錄激活(STAT)蛋白的激活 相聯(lián)系，產(chǎn)生多蛋白復(fù)合體，干擾素刺激的基因因子3(ISGF-3)，其誘發(fā)靶啟動(dòng)子干擾素刺 激應(yīng)答元件(ISRE)的轉(zhuǎn)錄。ISGF3包含3個(gè)蛋白質(zhì)亞基STAT1，STAT2和p48/ISGF3 y。 P48蛋白質(zhì)屬于干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)家族，且是直接與ISRE互相作用的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。 這樣，監(jiān)測(cè)IFN治療反應(yīng)中的ISRE特異性細(xì)胞DNA結(jié)合復(fù)合體提供了評(píng)價(jià)IFN對(duì)靶細(xì)胞作 用的簡(jiǎn)單，快捷而方便的方法。進(jìn)行這種分析的方便形式之一是電泳遷移變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA)， 其中IFN治療所誘發(fā)的ISRE結(jié)合活性，導(dǎo)致了相應(yīng)于ISRE的共同序列的放射標(biāo)記的雙鏈 寡酸苷酸探針的電泳遷移率變動(dòng)?；旧先鏚urabayashi 等人，Mol. Cell Biol.，15 6386(1995)所述進(jìn)行了該試 驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，將5ng的特定IFN-a亞型加上不同濃度(5-100 y g/ml的抗IFN-a mAb在 37°C下與5X105個(gè)Hela細(xì)胞在200iiL的DMEM中溫育30分鐘。加入hIFN-a前將細(xì)胞與 抗體4°C預(yù)溫育15分鐘。在PBS中洗滌細(xì)胞并懸于125iiL緩沖液A中(10mM HEPES PH7. 9， 10mM KC1，0. ImM ETDA，ImMDTT，ImM 苯甲基磺酰氟，10 ii g/ml 亮抑蛋白酶肽，10 ii g/ml 抑蛋 白酶肽)。在冰上培育15分鐘后，加入0.025% NP40裂解細(xì)胞。通過離心獲得核沉淀，懸 于 50 微升緩沖液 B(20mM HEPES, pH7. 9,400mM NaCl,0. ImM EDTA, ImM DTT，lmM 苯甲基磺 酰氟、10微克/毫升亮抑蛋白酶酞、10微克/毫升抑蛋白酶肽)中，并保持在冰上30分鐘。 離心澄清核組分并在70°C下保存上清液直至使用。利用DNA聚合酶I Klenow填充反應(yīng)用 32P-dATP (3000Ci/mM, Amersham)由單鏈寡酸苷酸(ISG 15 頂部5，-GATCGGGAAAGGGAAACCG AAACTGAAGCC-3，[SEQ ID NO. 13]，ISG15 底部，5，-GATCGGCTTCAGTTTCGGTTTCCCTTTCCC-3，[ SEQ IDN0. 14])制得雙鏈探針。使用BlO-Spin 30柱(Bio-Rad)從未摻入放射性核苷酸 中提純標(biāo)記的寡核苷酸。室溫下培養(yǎng)結(jié)合反應(yīng)液(在15yL結(jié)合緩沖液(lOmMTris-HCl， pH7. 5,50mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT，ImM苯甲基磺酰氟和15%甘油)中含有5yL核提取 物，25000cpm標(biāo)記探針和2ii g非特異性競(jìng)爭(zhēng)物聚(dl-dC)-聚(dI_dC)) 30分鐘。將DNA-蛋
45白質(zhì)復(fù)合體在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中解析并用作放射自顯影圖分析。在單獨(dú)反應(yīng)混 合物中加入350ng的未標(biāo)記ISG15探針測(cè)定試驗(yàn)的特異性。用抗STAT1抗體以超變動(dòng)試驗(yàn) 證實(shí)ISGF3特異復(fù)合體的形成。克隆編碼9F3抗IFN- a單克隆抗體的基因產(chǎn)生、克隆并測(cè)序鼠抗人IFN-amAb 9F3。用于大腸桿菌中的F (ab) s表達(dá)與誘變 的質(zhì)粒pEMXI 先前已有描述(Werther 等人，J. Immunol. 157 :4986_4995 [1996])。簡(jiǎn)單而言， 此質(zhì)粒含有編碼共有的人K亞組1輕鏈(VLK1-CL)和共有的人亞組III重鏈(VHIII-CH1) 的DNA片段和堿性磷酸酶啟動(dòng)子。采用VL和VH的共有序列先前已有描述(Carter等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 =4285-4289[1992])。MM我們前已經(jīng)表明IDDM患者的胰島表達(dá)了廣譜的IFN- a亞型(Huang等人， Diabetes 44 :658_664 [1995])。我們也闡述了在IDDM和IFN-3或IFN-Y的表達(dá)之間沒 有明顯關(guān)系(Huang等人，[1995]同上)。雖然特定IFN-a亞型的表達(dá)作為SLE病理學(xué)的 一部分還沒有被確定，對(duì)于IDDM，是與IFN-a相關(guān)，而不與IFN-0或IFN-Y相關(guān)(Hooks， 等人，Arthritis & Rheumatism 25 396-400[1982] ；Kim 等人，Clin. Exp. Immunol. 70 562-569 [1987] ；Lacki 等，J. Med. 28 :99_107 [1997] ；Robak 等人，Archivum Immunologiae et TherapiaeExperimentalis 46 :375_380[1998] ；Shiozawa等，Archritis & Rheumatism 35 417-422[1992] ；von Wussow 等人，Rheumatology International 8 :225_230 [1988])。 這些觀察使得我們提出對(duì)于IDDM或SLE的治療干預(yù)需要候選抗體能中和大多數(shù)的IFN-a 亞型而同時(shí)保留其它干擾素(日，Y和(0)和白細(xì)胞介素的完整活性，該活性是宿主防御所 需要的。它們之一(9F3)能夠中和廣譜重組干擾素-a亞型并進(jìn)一步作了特征鑒定。如圖 2所示，9F3能中和7種重組干擾素(IFN- a -2，4，5，8和10 (圖2)和IFN- a 1以及21 (表 2和圖6)的抗病毒活性。這些IFN-a亞型包括如I型干擾素序列系統(tǒng)樹圖闡明的全譜序 列。更重要的是，能中和IFN-a諸亞型的9F3 mAb不能中和IFN_3 (圖2，表2)或IFN-Y。 如圖2所示IFN-0活性的略微增加在其他試驗(yàn)中不可再現(xiàn)，看起來這是試驗(yàn)誤差的結(jié)果。已經(jīng)開發(fā)了其它中和 IFN-a 的 mAb (Tsukui et al. , Microbiol. Immunol. 30 1129-1139[1986] ；Berg, J. Interferon Res.4 481-491 [1984] ；Meager and Berg, J.Interferon Res. 6 729-736[1986]；美國專利 No. 4，902，618 ；及 EP 公開 No. 0, 139,676B1)0然而，這些抗體只中和有限數(shù)目的重組IFN-a亞型，不能中和廣譜 IFN-a亞型，如那些由活化白細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-a亞型。相反，9F3mAb能中和活化白細(xì)胞產(chǎn) 生的IFNa亞型異質(zhì)性混合物的至少95%抗病毒活性(圖3A)。類似地，9F3mAb也能阻斷 另一類淋巴母細(xì)胞IFN制品(NIH參考標(biāo)準(zhǔn))的抗病毒活性，如在另一試驗(yàn)中所測(cè)得的那樣 (圖 3B)。采用另一種生物試驗(yàn)法也可測(cè)定9F3mAb中和IFN- a的能力。該試驗(yàn)根據(jù)在DNA 結(jié)合試驗(yàn)即電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)中IFN-a激活信號(hào)分子，干擾素刺激基因因子3(ISGF3) 與衍生自干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)的寡核苷酸結(jié)合的能力(Horvath et al. , Genes Dev.9 :984-994[1995])。I型干擾素信號(hào)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)依靠蛋白復(fù)合體ISGF3的激活，包 括兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物及轉(zhuǎn)錄活化物(STAT)蛋白，STAT1和STAT2，以及干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)蛋白，P48/ISGF3 y (Wathelet et al. ,Mol. Cell 1 :507_518[1998])。后者是 ISGF3 的 DNA 序列識(shí)別亞基且直接與 ISRE 相互作用(McKendry et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 11455-11459[1991] John et al.，Mol. Cell. Biol. 11 :4189_4195[1991])。用 IFN-a 或 IFN-0處理COS細(xì)胞，導(dǎo)致相應(yīng)于ISGF3與ISRE衍生探針結(jié)合的復(fù)合體的出現(xiàn)。9F3 mAb 阻斷了 IFN-a誘導(dǎo)的而不是IFN-3誘導(dǎo)的復(fù)合體的出現(xiàn)(圖4)。另外，9F3mAb能中和該 試驗(yàn)中所測(cè)試的6種重組IFN- a亞型的活性(表2)。表2mAb 9F3對(duì)I型IFN誘導(dǎo)ISGF3形成的抑制作用
mAbIFN- a 2/1IFN- a 1IFN- a 2IFN- a 5IFN- a 8IFN-a 21IFN-09F3. 18. 5++++++++++++++++IgGl 9F3對(duì)IFN誘導(dǎo)的復(fù)合體的抑制作用程度如表中所示_表示誘導(dǎo)條帶沒有改變； +表示誘導(dǎo)條帶部分丟失而+++表示誘導(dǎo)條帶被大部分消除。所用mAb為lOyg/ml，所用 IFN- a 為 25ng/ml。已建立了 9F3能中和廣泛種類的重組IFN- a亞型及活化白細(xì)胞產(chǎn)生的IFN- a亞 型的混和物，我們克隆并測(cè)序了編碼9F3 mAb重和輕鏈的cDNA。提純重和輕鏈而所衍生的 N末端氨基酸用于設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于N末端的簡(jiǎn)并5’引物，而對(duì)應(yīng)于小鼠K輕鏈和IgG2重鏈的 恒定結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)3’引物。用常規(guī)PCR技術(shù)克隆對(duì)應(yīng)cDNA并測(cè)定嵌入的核苷酸序列。圖5 顯示了鼠類9F3單克隆抗體VL(5A)和VH(5B)，人源化版本(V13)以及人重鏈III亞組和 人K輕鏈III亞組的共有序列的序列比對(duì)。為確保所克隆的cDNA編碼了反映9F3 mb特異 性與特性的正確Mab，使用如圖5所示的小鼠cDNA序列和人CH1結(jié)構(gòu)域生成了重組嵌合蛋 白。所得嵌合體(CH8-2)能完全中和多種重組IFN-a亞型(圖6)。然后用重和輕鏈的氨 基酸序列生成人源化抗體。實(shí)施例2 9F3泛_IFN_ a中和性單克隆抗體的人源化材料與方法人源化F(ab)s的構(gòu)建為了構(gòu)建人源化9F3的第一個(gè)F(ab)變體，在pEMXl的含脫氧尿苷的模板上進(jìn)行 定點(diǎn)誘變(Kunkel,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488_492[1985])。將 6 個(gè) CDR 改為鼠 9F3 序列(圖5)，每個(gè)CDR中所包含的殘基來自于基于序列的CDR定義(Kabat等人(1991)見上 文)。因此F-1由具有6個(gè)完整鼠⑶R序列的完整人框架(VLK亞組1和VH亞組III)組成。 從F-1的質(zhì)粒模板構(gòu)建了所有其它F(ab)變體的質(zhì)粒。用商品化試劑盒(Qiagen，Valencia， CA)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌株XL-1 Blue中(Stratagene，San Diego，CA)，用于制備雙鏈和 單鏈 DNA。用雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sequenase,U. S. Biochemical Corp. , Cleveland, OH) 對(duì)每個(gè)變體編碼輕鏈和重鏈的DNA完全試序。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌株16C9(MM294的衍 生物)中，接種在含有50 u g/ml羧芐青霉素的Luria肉湯平板上，并選擇單個(gè)菌落以表達(dá) 蛋白質(zhì)。37°C下，單菌落培養(yǎng)在5ml Luria肉湯-100 ii g/ml羧芐青霉素中5-8小時(shí)。將這5ml培養(yǎng)物加入到500ml含有50 u g/ml羧芐青霉素的AP5培養(yǎng)基中并在4L帶擋板搖瓶中 37°C培養(yǎng)20小時(shí)。AP5培養(yǎng)基含有1.5g葡萄糖，ll.Og Hycase SF，0. 6g酵母提取物(檢 定的)，0. 19 克 MgS04(無水的)，1.07g NH4C1，3. 73g KCl，1.2g NaCl，120ml 1M三乙醇胺， pH7. 4加到1L水中，然后用0. liiM Sealkeen過濾器過濾除菌。在1L離心瓶中以3000 X g 離心收獲細(xì)胞并除去上清液。凍結(jié)1小時(shí)之后，將沉淀重懸于25ml冷的10mM Tris-lmM EDTA-20%蔗糖，pH7. 5 中，加入 250 u L 的 0. 1M 苯甲酰胺(Sigma, St. Louis, M0)抑制蛋白 水解。冰上緩慢攪拌3小時(shí)后，以40000xg離心樣品15分鐘。然后將上清液加到已用10mM Tris-lmM EDTA，pH7. 5 平衡的蛋白 G-S印harose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden)柱中 (柱床體積0. 5ml)。用10ml 10mM Tris-lmM EDTA，pH7. 5洗滌此柱并用3ml 0. 3M甘氨酸， pH3. 0 洗脫到 1. 25ml 1M Tris, pH8. 0 中。然后用 Centricon-30 (Amicon，Beverly, MA)將 F(ab)的緩沖液更換為PBS并濃縮到0. 5ml的最終體積。所有F(ab) s跑SDS-PAGE電泳膠 以確定純度，并用電噴射質(zhì)譜法驗(yàn)證各變體的分子量。用定量氨基酸分析測(cè)定F(ab)濃度。嵌合性與人源化IgG的構(gòu)建為了產(chǎn)生嵌合性和人源化9F3的人IgG2版本，將合適的鼠或人源化的VL和 VH(F-13，表3)結(jié)構(gòu)域亞克隆入分開的前述pRK載體中(Eaton et al.，Biochemistry 25: 8343-8347 [1986])，該載體含有編碼人IgG2 CHl_Fc或人輕鏈CL結(jié)構(gòu)域的DNA。用雙脫氧 核苷酸測(cè)序法驗(yàn)證編碼各變體的完整輕鏈和完整重鏈的DNA。嵌合性IgG含有與人CH1結(jié) 構(gòu)域氨基酸SerH113融合的完整鼠9F3VH結(jié)構(gòu)域，和與人CL結(jié)構(gòu)域氨基酸LysL107融合的 完整鼠9F3VL結(jié)構(gòu)域。采用高效方法(Gormanet al.，DNA Prot. Eng. Tech. 2 :3_10 [1990])將重鏈和 輕鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系293中(Graham et al.，J. Gen. Virol. 36 59-74[1977])。將培養(yǎng)液改為無血清培養(yǎng)液，每日收獲至5天。用蛋白A-S印harose CL-4B (Pharmacia)從合并的上清液中提純抗體。用Centricon-30 (Amicon)將洗脫抗體的 緩沖液換為PBS，濃縮至0. 5ml，用Millex-GV(Millipore，Bedford, MA)除菌過濾并在4°C 下保存。用定量氨基酸分析測(cè)定IgG2濃度。IFN- a結(jié)合試驗(yàn)在ELISA中，在各孔中加入50iiL PBS配的0. liig/ml IFN_a包被96孔微量 滴定板(Nimc)4°C培養(yǎng)過夜。然后用洗滌緩沖液(PBS加0.05% Tween20)洗板三次。用 200 ill SuperBlock (Pierce)封閉微量滴定板諸孔室溫溫育1小時(shí)。用洗滌緩沖液再洗板 三次。洗滌后，在所選孔中加入100 iU起始于10 y g/ml人源化mAb的系列稀釋液。在振 搖器上室溫溫育滴定板1小時(shí)，并用洗滌緩沖液洗三次。接著，將100 yL與山羊抗人Fab 特異性抗體(Cappel)偶聯(lián)的辣根過氧化物酶以試驗(yàn)緩沖液(溶于PBS中的0.5%牛血清 白蛋白，0.05% Tween20)作1 1000稀釋，加入到各孔中。室溫振搖器上溫育滴定板，然 后用洗滌緩沖液洗三次，然后在各孔中加入100 yl底物(TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺； Kirkegaard & Perry)室溫溫育10分鐘。各孔中加入100 u L終止液(購自Kirkegaard & Perry)終止反應(yīng)，在自動(dòng)微量滴定板讀數(shù)器中讀取450nm處吸光值。BIA core 生物傳感器試驗(yàn)用 BIA core 生物傳感器(Karlsson et al. , Methods :A companion toMethods in Enzymology 6 :97_108 [1994])測(cè)定了 IFN-a 與人源化 F (ab) s，嵌合性和人源化 IgG2
48抗體的結(jié)合。將IFN- a以pH6. 3，50mM MES緩沖液配的IFN- a 60 u g/ml固定在傳感芯片 上。使抗體以磷酸鹽緩沖鹽水Tween-20配的抗體75 u g/ml (500nM)接觸芯片。測(cè)定 抗體的結(jié)合速率(on-rate) (kon)。
鼠和人源化F (ab) s的計(jì)算機(jī)圖解模型 用VL和VH結(jié)構(gòu)域(圖5A和B)序列構(gòu)建了鼠9F3 VL-VH結(jié)構(gòu)域的計(jì)算機(jī)圖解模 型(圖7)。用此模型確定哪個(gè)框架殘基應(yīng)該摻入到人源化抗體中。還構(gòu)建了人源化F(ab) 模型以驗(yàn)證鼠框架殘基的正確選擇。如前所述(Carter etal.，[1992]見上文；Werther et al.，[1996]見上文)構(gòu)建了這些模型。MM將人重鏈亞型III和輕鏈亞型I的共有序列用作圖5所示的人源化框架(Kabat et al.，(1991)見上文)。此框架已成功用于其它鼠抗體的人源化(Carter etal.，Proc.Natl. Acad. Sci.USA 89 :4285_4289[1992] ；Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623_2632[1993]； Eigenbrot et al. , Proteins 18 :49_62[1994] ；Werther et al. , J. Immunol. 157 4986-4995 [1996])。先制備所有人源化變體并篩選在大腸桿菌中表達(dá)的F(ab) s的結(jié)合。 500ml搖瓶中通常得率為0. 1-0. 4mg F(ab)。已根據(jù)序列高變性(Kabat et al.，(1991)見上文)或F (ab)-抗原復(fù)合體的晶體 結(jié)構(gòu)(Chothia et al.，Nature 342 :877_883[1989])明確了互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基。雖然 以序列為基礎(chǔ)的CDR大于以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的CDR，這兩種限定(范圍)除了 CDR-H1外通常是 一致的。根據(jù)以序列為基礎(chǔ)的限定范圍，CDR-H1包括殘基H31-H35，而以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的限定 范圍是CDR-H1的殘基為H26-H32 (輕鏈殘基以L為前綴，重鏈殘基以H為前綴)。對(duì)于本研 究，⑶R-H1的限定范圍是此二者的結(jié)合，即，包括殘基H26-H35。用以序列為基礎(chǔ)的限定范 圍來確定其它CDR (Kabat et al.，(1991)見上文)。在最初的變體F-1中，從小鼠抗體的CDR殘基轉(zhuǎn)移到人框架。另外，生成含有帶 F-1輕鏈(Ch-1)的嵌合重鏈和帶嵌合輕鏈(Ch-2)的F-1重鏈組成的F(ab)s并試驗(yàn)結(jié)合能 力。F-1與IFN-a結(jié)合極差(表3)。對(duì)Ch-1和Ch_2結(jié)合親和力的比較(表3)表明需要 改變F-1 VH結(jié)構(gòu)域中的框架殘基以增強(qiáng)結(jié)合。表3 a鼠殘基為粗體字；殘基編號(hào)方式根據(jù)Kabat等人(1991)。標(biāo)準(zhǔn)字體標(biāo)明了由人 框架殘基到小鼠的變化。斜體字標(biāo)明了由小鼠框架殘基到人的變化。用ELISA測(cè)試Fab與 IFN-a的結(jié)合，結(jié)果以10iig/ml 0D450mm提供。SD，標(biāo)準(zhǔn)偏差；n，實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)。先前的人源化過程(Xianget al.，J. Mol.Biol. 253 :385_390 [1995] ；fferther et al.，[1996]見上文)與F(ab)_抗原晶體結(jié)構(gòu)的研究(Chothia et al.，[1989]見上文； Tramontano et al. ,J. Mol.Biol. 215 175-182 [1990])已顯示 了殘基 H71 和 H73 能對(duì)結(jié)合 產(chǎn)生深度影響(可能通過影響⑶R-H1和⑶R-H2的構(gòu)型)。將H71和H73位置的人殘基改 變成其小鼠對(duì)應(yīng)物僅僅微弱改善結(jié)合(版本F-2，表3)。在位置H67，H69和H78 (版本F-3) 的更多的同時(shí)改變以及隨后ArgH94Ser (版本F-4)和AlaH24Thr (版本F-5)的改變顯著改 善了結(jié)合(表3)。由于位置H67，H69和H78已經(jīng)同時(shí)改變，每個(gè)各自變回人共有序列框架 殘基；版本F-7，F(xiàn)-8，F(xiàn)-9和F-10顯示位置H67人殘基是優(yōu)選的，位置H69并未顯示對(duì)鼠或人殘基有任何偏愛，而位置H78優(yōu)選鼠殘基。 在之前的人源化過程中，我們已發(fā)現(xiàn)緊鄰⑶R-H1和⑶R-H2的框架環(huán)，F(xiàn)R3 (Kabat et al.，(1991)見上文)內(nèi)的殘基能影響結(jié)合(Eigenbrot et al.，(1994)見上文)。因此， 將此環(huán)中的兩個(gè)殘基改變?yōu)樗鼈兊氖髮?duì)應(yīng)物賴氨酸H75變?yōu)樾∈蟮慕z氨酸(版本F-11) 和天冬酰胺H76變?yōu)槭缶彼?版本F-12)。只有天冬酰胺H76變成精氨酸提高了結(jié)合(表 3)。檢驗(yàn)鼠和人源化F(ab) s的模型，表明了掩蔽在VL_VH界面并與⑶R-H3互相作用 的殘基L46也可能對(duì)CDR-H3構(gòu)象的決定和/或VL與VH結(jié)構(gòu)域間的互相作用的影響起作 用。類似地，緊鄰于⑶R-L2的L49位置在人共有序列(酪氨酸)和9F3 (絲氨酸)序列之 間不同。因此，同時(shí)取代亮氨酸L46纈氨酸和酪氨酸L49絲氨酸殘基，產(chǎn)生了具有更進(jìn)一步 改善的結(jié)合(表3)的變體(F-13)。根據(jù)所有產(chǎn)生的變體中的最佳結(jié)合，選擇F-13作為最 終人源化版本。將衍生于F-13的VH和VL結(jié)構(gòu)域分別與人IgG2 CHl-Fc和人CL結(jié)構(gòu)域融合，產(chǎn) 生了人源化重組抗IFN-a單克隆抗體(V13IgG2)。然后將V13IgG2的Kon速率和KD值與 嵌合性IgG2或鼠9F3相比較。V13IgG2和嵌合性IgG2結(jié)合于固定化IFN-a的BIACore 測(cè)定顯示它們的1( 速率相似(表4)。采用Kinexa 技術(shù)的親和力測(cè)量表明，與親本鼠9F3 抗體相比，V13IgG2對(duì)IFNa的親和力降低了 2倍(表4)。表 4 a. V13IgG2是與人IgG2 CHl_Fc相連的F_13 VH結(jié)構(gòu)域和與人CL結(jié)構(gòu)域相連的 F-13 VL結(jié)構(gòu)域；ChIgG2是與人IgG2 CHl_Fc相連的鼠9F3 VH結(jié)構(gòu)域和與人CL結(jié)構(gòu)域相 連的鼠9F3 VL結(jié)構(gòu)域。bKoff/Kon。材料的保藏以下材料已存放在美國典型培養(yǎng)物保藏所(10801 University Blvd.，Manassas， VA 20110-2209，USA(ATCC))
MMATCC保藏號(hào)保藏日期
1、分泌9F3鼠抗-IFN-aPTA-29172001年1月18日
單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系
(Id. Ref. :9F3. 18. 5)
2、表達(dá)嵌合性CH8-2全長(zhǎng)PTA-28832001年1月9日
IgG的重鏈的pRK基礎(chǔ)載體
(Id. Ref. :XAIFN-ChHpDR2)
3、表達(dá)嵌合性CH8-2全長(zhǎng)PTA-28802001年1月9日
IgG的輕鏈的pRK基礎(chǔ)載體
(Id. Ref. :XAIFN-ChLpDRl)
4、表達(dá)人源化V13全長(zhǎng)PTA-28812001年1月9日
IgG2重鏈的pRK基礎(chǔ)載體
(Id. Ref. :VHV30-IgG2)
5、表達(dá)人源化V13全長(zhǎng)PTA-28822001年1月9日
IgG2輕鏈的pRK基礎(chǔ)載體
(Id. Ref. :VLV30-IgG)
根據(jù)關(guān)于國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保肩変的布達(dá)佩斯條約及其實(shí)施細(xì)則的
條款進(jìn)行此保藏。自保藏之日起，保證所保藏的活培養(yǎng)物維持30年。保藏物在布達(dá)佩斯條 約條款下由ATCC可獲得并遵循Genentech公司和ATCC之間的協(xié)定，其保證相關(guān)美國專利 授權(quán)或者任何美國或外國專利申請(qǐng)公開(無論哪個(gè)先來)后，該保藏物培養(yǎng)產(chǎn)生的后代公 眾可永久和不受限制的得到，并保證對(duì)美國專利商標(biāo)委員會(huì)根據(jù)35U. S. C § 122和該委員 會(huì)規(guī)則包括37C. F. R § 1. 14具體參考886 0G 638所確定的人可得到該保藏物后代。本申請(qǐng)受托人同意如果保藏的材料培養(yǎng)物在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)死亡或損失或 遭受破壞，將立即用另一相同材料替換此材料。可獲得該保藏材料并不構(gòu)成許可實(shí)施本發(fā) 明，那樣做就違反了政府當(dāng)局根據(jù)其專利法所授予的權(quán)利。認(rèn)為先前所寫的說明書足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。因?yàn)楸疚牡谋４鎸?shí)施 例的目的是闡述本發(fā)明的某些方面，任何功能上相同的構(gòu)建物都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，所 以本發(fā)明并不限于該保藏的構(gòu)建物所限定的范圍。本文材料的保藏并不構(gòu)成承認(rèn)本文中的 描述不足以使本發(fā)明任何方面得以實(shí)施，包括其最佳形式，也不構(gòu)成將權(quán)利要求的范圍限 制在本說明書所描述的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)懂得除了本文所顯示和描述的內(nèi)容外， 可根據(jù)以上描述對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些都落在附屬權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種抗IFN-α單克隆抗體，該抗體與至少IFN-α亞型IFN-α1，IFN-α2，IFN-α4，IFN-α5，IFN-α8，IFN-α10和IFN-α21結(jié)合并中和其生物活性。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體為鼠抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體為人源化抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體為人抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述生物活性為抗病毒活性。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-a諸亞型至少70%的抗 病毒活性。
7.如權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-a諸亞型至少80%的抗病毒活性。
8.如權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-a諸亞型至少90%的抗病毒活性。
9.如權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述抗體能中和所述IFN-a諸亞型至少99%的抗病毒活性。
10.如權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體能與鼠抗人IFN-a單克隆抗體9F3或其人源化 或嵌合形式結(jié)合基本上相同的IFN-a表位。
11.如權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體是鼠抗人IFN-a單克隆抗體9F3或其人源化或 嵌合形式。
12.如權(quán)利要求11所述的抗體，該抗體是人源化的抗人IFN-a單克隆抗體9F3的版本 13(V13)。
13.如權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體能與2001年1月18日保藏于ATCC的、保藏號(hào)為 PTA-2917的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗IFN-a抗體結(jié)合基本上相同的IFN-a表位。
14.如權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體為IgG類。
15.如權(quán)利要求14.所述抗體，該抗體有IgGpIgG2，IgG3，或IgG4同種型。
16.如權(quán)利要求1所述的抗體，該抗體為抗體片段。
17.如權(quán)利要求16所述的抗體，該抗體為Fab片段。
18.如權(quán)利要求16所述的抗體，該抗體為F(ab’)2片段。
19.如權(quán)利要求16所述的抗體，該抗體為Fab’片段。
20.一種抗IFN-a抗體輕鏈或其片段，該輕鏈或其片段含有下列CDR:(a)化學(xué)式RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 L1 ；(b)化學(xué)式Y(jié)ASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；禾口(c)化學(xué)式QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3。
21.如權(quán)利要求20所述的抗IFN-a抗體輕鏈片段，該輕鏈片段為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
22.—種抗IFN-a抗體重鏈或其片段，該重鏈或其片段含有下列⑶R:(a)化學(xué)式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO 10)的 HI ；(b)化學(xué)式SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2 ；(c)化學(xué)式WISDFFDY(SEQ ID NO 12)的 H3。
23.如權(quán)利要求22所述的抗IFN-a抗體重鏈片段，該重鏈片段為重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
24.一種抗IFN-a抗體，該抗體含有(A)至少一條輕鏈或其片段，該輕鏈或其片段含有下列CDR(a)化學(xué)式RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 7)的 L1 ；(b)化學(xué)式Y(jié)ASNLES (SEQ ID NO 8)的 L2 ；禾口(c)化學(xué)式QHSWGIPRTF (SEQ ID NO 9)的 L3 ；禾口(B)至少一條重鏈或其片段，該重鏈或其片段含有下列CDR(a)化學(xué)式GYTFTEYIIH(SEQ ID NO 10)的 HI ；(b)化學(xué)式SINPDYDITNYNQRFKG (SEQ ID NO 11)的 H2 ；禾口(c)化學(xué)式WISDFFDY(SEQ ID NO 12)的 H3。
25.如權(quán)利要求24所述的抗體，該抗體具有同質(zhì)四聚體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有兩個(gè)由二硫 鍵聯(lián)接的抗體重鏈-輕鏈對(duì)。
26.如權(quán)利要求24所述的抗體，該抗體為線形抗體。
27.如權(quán)利要求24所述的抗體，該抗體為鼠抗體。
28.如權(quán)利要求24所述的抗體，該抗體為嵌合抗體。
29.如權(quán)利要求24所述的抗體，該抗體為人源化抗體。
30.如權(quán)利要求24所述的抗體，該抗體為人抗體。
31.一種分離的核酸分子，該分子編碼權(quán)利要求1所述的抗體。
32.—種分離的核酸分子，該分子編碼權(quán)利要求11所述的抗體。
33.一種分離的核酸分子，該分子編碼權(quán)利要求12所述的抗體。
34.一種分離的核酸分子，該分子編碼權(quán)利要求24所述的抗體。
35.一種分離的核酸分子，該分子編碼權(quán)利要求20所述的抗體輕鏈或其輕鏈片段。
36.一種分離的核酸分子，該分子編碼權(quán)利要求22所述的抗體重鏈或其重鏈片段。
37.一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子含有于2001年1月9日在ATCC保存的登 錄號(hào)PTA-2882的載體中編碼輕鏈多肽的核酸序列。
38.一種分離的核酸分子，該分子含有于2001年1月9日在ATCC保存的登錄號(hào) PTA-2881的載體中編碼重鏈多肽的核酸序列。
39.一種載體，該載體含有權(quán)利要求31至38任何一項(xiàng)所述的核酸分子。
40.一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是用權(quán)利要求31至38任何一項(xiàng)所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主 細(xì)胞。
41.產(chǎn)生如權(quán)利要求1，11，12和24任何一項(xiàng)所述的抗體的方法，該方法包括，在使編碼 該抗體的核酸序列表達(dá)從而產(chǎn)生抗體的條件下，培養(yǎng)含有該核酸序列的宿主細(xì)胞。
42.一種雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系含有權(quán)利要求31至38任何一項(xiàng)所述的核酸分子。
43.一種雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系由ATCC于2001年1月18日保存，登錄號(hào)為 PTA-2917。
44.一種權(quán)利要求42所述的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。
45.一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學(xué)上可接受的載體混合的有效量的權(quán)利 要求1所述的抗體。
46.一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合的有效量的權(quán) 利要求11所述的抗體。
47.一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合的有效量的權(quán) 利要求12所述的抗體。
48.一種藥物組合物，該藥物組合物含有與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合的有效量的權(quán) 利要求24所述的抗體。
49.一種診斷與細(xì)胞內(nèi)IFN-a表達(dá)有關(guān)的疾病的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與權(quán)利 要求1所述的抗IFN-a抗體接觸，并檢測(cè)IFN-a的存在。
50.一種治療與患者體內(nèi)IFN-a表達(dá)有關(guān)的疾病的方法，該方法包括給予所述患者有 效量的如權(quán)利要求1所述的抗IFN-a抗體。
51.如權(quán)利要求50所述方法，其中所述患者為哺乳動(dòng)物患者。
52.如權(quán)利要求51所述方法，其中所述患者為人。
53.如權(quán)利要求52所述方法，其中所述疾病為自身免疫性疾病。
54.如權(quán)利要求53所述方法，其中所述疾病選自于胰島素依賴性糖尿病(IDDM)；和全 身性紅斑狼瘡(SLE)；和自身免疫性甲狀腺炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗-干擾素α的抗體，更具體地，本發(fā)明總體上涉及產(chǎn)生和特征鑒定對(duì)各種IFNα亞型具有廣泛反應(yīng)活性的中和性抗-IFNα單克隆抗體。本發(fā)明還涉及這種抗-IFN-α抗體在診斷和治療與IFN-α表達(dá)增高有關(guān)的疾病，特別是自身免疫性疾病，如胰島素依糖性糖尿病(1DDM)和全身性紅斑狼瘡中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101857636SQ20101018070
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2002年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月22日
發(fā)明者A·春塔拉帕伊, J·K·金, L·G·普雷斯塔, T·斯圖爾特 申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份有限公司