專利名稱：：一種添加苯乙酸月桂醇酯制備l-丙氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明為一種添加苯乙酸月桂醇酯制備L-丙氨酸的方法，屬于生化工程和酶工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：L-丙氨酸(L-Alanine)亦稱α-氨基丙酸，白色無臭結(jié)晶性粉末。是生命體內(nèi)與糖代謝密切相關(guān)、需求量較多的氨基酸之一，已在醫(yī)藥、食品及化工等行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，是食品、化妝品、飼料生產(chǎn)的重要添加劑，也是維生素Β6、泛酸鈣、氨基酸營養(yǎng)輸液等藥物合成中間體及其它有機(jī)合成產(chǎn)物的主要原料，如抗氧化劑、誘食劑、除草劑。其生產(chǎn)已成為繼谷氨酸、賴氨酸之后的又一重要的氨基酸產(chǎn)業(yè)。在國外，日本的味之素公司最早開始規(guī)?；a(chǎn)L-丙氨酸。方法也由提取法.化學(xué)合成法，發(fā)展到以L-天冬氨酸(L-Asp)為原料，采用L-天冬氨酸-β-脫羧酶轉(zhuǎn)化的生物反應(yīng)法生產(chǎn)。采用丙酸為原料的化學(xué)合成法收率低，產(chǎn)品純度差，工藝落后，并且存在嚴(yán)重的污染性。生物反應(yīng)法，以L-天冬氨酸為原料經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)而得，全套設(shè)備主要由微生物菌體細(xì)胞培養(yǎng)、酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)、提取精制系統(tǒng)等部分組成。該法設(shè)備投資少，工藝路線短，無污染，成本低，易于操作，引起研究和投資者的關(guān)注并逐漸采用而成為主流。生物反應(yīng)法中，制酶成本占據(jù)了生產(chǎn)成本的較大比重。而由于生產(chǎn)菌種的特性決定了有大量的L-天冬氨酸_β_脫羧酶是存在菌體內(nèi)的，即這部份所謂的胞內(nèi)酶，在生產(chǎn)中沒有被利用而浪費(fèi)。在實(shí)驗(yàn)室，如用超聲波、高壓勻漿破碎法等處理菌體細(xì)胞時，細(xì)胞壁被破壞，酶釋放出來，酶活力顯著提高。但現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)條件無法采用此類破壁技術(shù)，因此如何改進(jìn)制酶工藝，提高有效胞外酶活力，降低制酶和生產(chǎn)成本是現(xiàn)有生產(chǎn)工藝改進(jìn)的重點(diǎn)方向。苯乙酸月桂醇酯是高碳醇、強(qiáng)疏水、弱親水的線型分子，是一種非離子表面活性齊U，能顯著降低溶劑表面張力和液-液界面張力，是一種良好的分散劑、乳化劑、組織改良劑和潤滑劑。低溫下溶于水，有良好的消泡、抑泡作用，且無毒、無刺激性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種添加苯乙酸月桂醇酯制備L-丙氨酸的方法，能夠提高L-天冬氨酸_脫羧酶有效酶活力及酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)的穩(wěn)定性，增加單批次投料量。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案達(dá)到上述目的一種添加苯乙酸月桂醇酯制備L-丙氨酸的方法，包括如下步驟1)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買保藏號為20147的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌種，接入pH7.0的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為含蛋白胨2.0g、牛肉膏1.0g、酵母膏1.0g、氯化鈉1.0g、瓊脂4.Og以及水200ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶及酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)將上述活化的菌種接入pH7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為含富馬酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米漿13g、KH2PO40.6g、MgS040.4g、苯乙酸月桂醇酯0.2-4.Oml以及水2000ml。在上述酶液中添加苯乙酸月桂醇酯0.2-4.0ml，底物L(fēng)-天冬氨酸6000_9000g，pH值為5.0-7.5，溫度為30-45°C的條件下進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)5_7天，生成L-丙氨酸粗品。在菌種產(chǎn)酶或酶促反應(yīng)時添加一定量的苯乙酸月桂醇酯，可以顯著提高L-天冬氨酸_脫羧酶胞外酶活力及酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)的穩(wěn)定性，增加酶的實(shí)際使用效率，從而提高單批次投料量。3)提取精制將上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加60g活性炭脫色，過濾，70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L-丙氨酸產(chǎn)品。所述苯乙酸月桂醇酯為分析純試劑。本發(fā)明的有益效果是1、苯乙酸月桂醇酯用量少，價格低廉，可提高L-天冬氨酸_β_脫羧酶有效酶活力和酶促反應(yīng)穩(wěn)定性，增加單批次投料量。2、不需要改變原有工藝路線和設(shè)備，添加方式簡單，易操作，易使用。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述對照例1)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買保藏號為20147的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌種，接入pH7.0的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為含蛋白胨2.0g、牛肉膏1.0g、酵母膏1.0g、氯化鈉1.0g、瓊脂4.Og以及水200ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶及酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)將上述活化的菌種接入pH7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為含富馬酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米漿13g、KH2PO40.6g、MgS040.4g、水2000ml。上述酶液中添加底物L(fēng)-天冬氨酸5300g，pH值為5.0-7.5，溫度為30°C的條件下進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，攪拌反應(yīng)5天，生成L-丙氨酸粗品。3)提取精制將上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加60g活性炭脫色，過濾，70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L-丙氨酸產(chǎn)品。實(shí)施例11)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買保藏號為20147的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌種，接入pH7.0的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為含蛋白胨2.Og、牛肉膏l(xiāng).Og、酵母膏l(xiāng).Og、氯化鈉l.Og、瓊脂4.Og以及水200ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶及酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)將上述活化的菌種接入pH7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為含富馬酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米漿13g、KH2PO40.6g、MgS040.4g、苯乙酸月桂醇酯0.2ml以及水2000ml。在上述酶液中添加0.2ml的苯乙酸月桂醇酯、底物L(fēng)-天冬氨酸6630g，pH值為5.0-7.5，溫度為30°C的條件下進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，攪拌反應(yīng)5天，生成L-丙氨酸粗品。3)提取精制將上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加60g活性炭脫色，過濾，70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L-丙氨酸產(chǎn)品。實(shí)施例21)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買保藏號為20147的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌種，接入pH7.0的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基含蛋白胨2.Og、牛肉膏1.0g、酵母膏1.0g、氯化鈉1.0g、瓊脂4.Og以及水200ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶及酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)將上述活化的菌種接入pH7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液，即酶液。所述富馬酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米漿13g、KH2PO40.6g、MgSO40.4g、苯乙酸月桂醇酯1.Oml以及水2000ml。在上述酶液中添加1.0ml的苯乙酸月桂醇酯、底物L(fēng)-天冬氨酸7720g，pH值為5.0-7.5，溫度為37°C的條件下進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，攪拌反應(yīng)6天，生成L-丙氨酸粗品。3)提取精制將上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加60g活性炭脫色，過濾，70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L-丙氨酸產(chǎn)品。實(shí)施例31)菌種培養(yǎng)將從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買保藏號為20147的假單胞菌(Pseudomonasdacunhae)菌種，接入pH7.0的斜面培養(yǎng)基，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到活化的菌種。所述斜面培養(yǎng)基為含蛋白胨2.0g、牛肉膏1.0g、酵母膏1.0g、氯化鈉1.0g、瓊脂4.Og以及水200ml。2)發(fā)酵產(chǎn)酶及酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)將上述活化的菌種接入pH7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液，即酶液。所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為含富馬酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米漿13g、KH2PO40.6g、MgS040.4g、苯乙酸月桂醇酯4.0ml以及水2000ml。在上述酶液中添加苯乙酸月桂醇酯4.0ml、底物L(fēng)-天冬氨酸8640g，pH值為5.0-7.5，溫度為45°C的條件下進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，攪拌反應(yīng)7天，生成L-丙氨酸粗品。3)提取精制將上述L-丙氨酸粗品加水6000ml，攪拌升溫至80°C重溶，添加60g活性炭脫色，過濾，70°C減壓濃縮，冷卻析出結(jié)晶，離心分離，洗滌，干燥即得L-丙氨酸產(chǎn)品。上述實(shí)施例中，底物L(fēng)-天冬氨酸的投入、產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸的產(chǎn)出、摩爾轉(zhuǎn)化率、提取收率結(jié)果如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>生成L-Ala量133.1(L-Asp分子量)1)摩爾轉(zhuǎn)化率=--------------X-------------------X100%加入L-Asp量89(L-Ala分子量)實(shí)得L-Ala量2)提取收率=--------------X100%。生成L-Ala量權(quán)利要求一種添加苯乙酸月桂醇酯制備L-丙氨酸的方法，包括菌種培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶和酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)、產(chǎn)品提取和精制步驟，其特征在于，所述發(fā)酵產(chǎn)酶和酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)的具體條件為發(fā)酵產(chǎn)酶將活化的菌種接入pH7.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24h，得到發(fā)酵液，即酶液，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為含富馬酸30g、葡萄糖30g、蛋白胨17g、玉米漿13g、KH2PO40.6g、MgSO40.4g、苯乙酸月桂醇酯0.2-4.0ml以及水2000ml，酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)在上述酶液中添加苯乙酸月桂醇酯0.2-4.0ml，底物L(fēng)-天冬氨酸6000-9000g，pH值為5.0-7.5，溫度為30-45℃的條件下進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)5-7天，生成L-丙氨酸粗品。全文摘要一種添加苯乙酸月桂醇酯制備L-丙氨酸的方法，包括菌種培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶和酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)、產(chǎn)品提取和精制步驟，所述發(fā)酵產(chǎn)酶是將活化菌種接入pH為7.0，體積百分?jǐn)?shù)為0.01-0.2％的苯乙酸月桂醇酯的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24h，得到酶液；酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)是在酶液中添加體積百分?jǐn)?shù)為0.01-0.2％的苯乙酸月桂醇酯，底物L(fēng)-天冬氨酸，pH值為5.0-7.5，溫度為30-45℃的條件下進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成L-丙氨酸。該方法使用苯乙酸月桂醇酯能夠提高L-天冬氨酸-β-脫羧酶有效酶活力和酶促反應(yīng)穩(wěn)定性，增加單批次投料量。文檔編號C12P13/06GK101831467SQ20101015216公開日2010年9月15日申請日期2010年4月21日優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日發(fā)明者何鑫平,吳孔陽,夏小斌,康超,彭康,曹喜秀,曹普美,李湘萍,李燦民,李秋蓉,梁智群,梁耀星,汪晟,白山,黃時海申請人:廣西大學(xué)