專利名稱：驅(qū)動基因在胚中表達(dá)的元件及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及組織特異表達(dá)啟動子及其獲得方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動子是指基因中一段能準(zhǔn)確有效起始基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，通常位于基因上游。啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，它與RNA聚合酶及其他蛋白輔助因子等反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)相互作用來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的水平及其時(shí)空表達(dá)的特異性。目前使用最廣泛的組成型啟動子是煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子。同時(shí)，人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子并初見成效，肌動蛋白(Actin)和泛素(WDiquitin)等基因的啟動子已被克隆。Mariani等成功地利用煙草花藥絨氈層特異表達(dá)基因啟動子TA^驅(qū)動核酸酶 Barnase, RnaseTl基因在花藥中特異表達(dá)，破壞絨氈層，獲得雄性不育油菜，這是首次通過基因工程創(chuàng)造出雄性不育系。小麥葉中表達(dá)ipt基因，提高細(xì)胞分裂素含量，可使葉綠素降解減緩，葉衰老變慢。水稻種子中富含谷蛋白(Glutelin)，分析發(fā)現(xiàn)GluB，GluD均在種子中特異表達(dá)。對GluB啟動子區(qū)的詳細(xì)分析還鑒定了決定其表達(dá)特異性的GCN4等核心元件。 以往已經(jīng)利用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子驅(qū)動八氫番茄紅素合酶基因PSY，在水稻胚乳中成功合成了本不存在的β胡蘿卜素(維生素A原)；也利用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子驅(qū)動大豆鐵蛋白基因，使轉(zhuǎn)基因水稻谷粒中鐵和鋅的含量都有所增加，而且促使鐵蛋白主要在胚乳中而不是本來的糊粉層積累。然而，目前為止分離得到的水稻種子特異啟動子并不多，并集中于谷蛋白基因家族。傳統(tǒng)的獲得啟動子元件的方法往往存在通量低，針對性差，工作量大等缺點(diǎn)，而隨著測序技術(shù)的發(fā)展，許多植物的全基因組序列已經(jīng)測序完成，生物芯片技術(shù)的進(jìn)步以及生物信息學(xué)分析方法的完善使人們能夠從基因組學(xué)層面對植物基因的表達(dá)模式有一個(gè)全面的了解，而不是像以往只能局限于有限的基因。Haberer等通過對擬南芥和油菜基因組水平同源基因啟動子區(qū)的種間序列分析，利用類似的生物信息學(xué)方法得到了 384個(gè)新的順式元件，并檢測到了大部分的已知轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的存在，證明了該方法的可行性。而目前，尚未見有基因組層面尋找水稻種子特異啟動子(調(diào)控序列)或增強(qiáng)子的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供組織特異表達(dá)啟動子及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO 5所示。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于與啟動子或啟動子片段操作性連接，調(diào)控目的基因在植物胚中特異性表達(dá)；其中，所述的啟動子片段具有該啟動子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。在另一優(yōu)選例中，所述的植物是具有胚、胚乳和/或種子結(jié)構(gòu)的植物。
在另一優(yōu)選例中，所述的植物是被子植物；較佳地，所述的植物是單子葉植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于調(diào)控目的基因在植物胚中特異性表達(dá)的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物依次具有如下元件(5’ 一3’ ):(多核苷酸-X)n，啟動子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；其中，η為1-100的正整數(shù)；較佳地，η為1_50的正整數(shù)；更佳地為1_30的正整數(shù)； 如 η 可以為 2，3，4，6，8，10，12，16，20 ；其中X為無，或長度在I-IOObp ；較佳地l_50bp，更佳地l_20bp，更佳地l-10bp，更佳地l-5bp，如2、3bp的核酸；其中，啟動子的片段具有該啟動子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的啟動子或其片段含有TATA-盒結(jié)構(gòu)。在另一優(yōu)選例中，所述的啟動子選自(但不限于)煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子，或煙草花葉病毒(CaMV) 35S基本啟動子(CAMV35S mini promoter)。在另一優(yōu)選例中，所述的煙草花葉病毒35S基本啟動子具有SEQ ID NO :27所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物的啟動子或其片段下游還包括一目的基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是外源基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是結(jié)構(gòu)基因。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因序列位于所述啟動子序列的下游，且是與所述的啟動子序列直接鄰近的編碼基因的序列。通常，所述的核酸序列與目的基因序列的間隔小于IOOObp (優(yōu)選的，小于500bp ；更優(yōu)選的，小于200bp ；更優(yōu)選的，小于IOObp ；最優(yōu)選的， 小于50bp)。在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括(但不限于)β_葡萄糖苷酶(GUS)基因、 改善稻米或種子品質(zhì)相關(guān)的基因(如人乳鐵蛋白基因、賴氨酸合成酶基因、beta胡蘿卜素合成基因、直鏈與支鏈淀粉合成酶基因等)。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸、啟動子、目的基因可操作性地相連。在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種植物細(xì)胞(優(yōu)選為非繁殖材料)，所述的細(xì)胞中含有所述的多核苷酸或所述的構(gòu)建物。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的構(gòu)建物的用途，用于調(diào)控目的基因在植物胚中特異性表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種調(diào)控目的基因在植物胚中特異性表達(dá)的方法，所述方法包括(1)提供一構(gòu)建物(表達(dá)載體)，所述構(gòu)建物依次具有如下元件(5’ 一 3’)(多核苷酸-X)n，啟動子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO 5所示；η 為1-100的正整數(shù)；X為無，或長度在I-IOObp的核酸；其中啟動子的片段具有該啟動子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)；(2)將目的基因可操作性地插入到步驟(1)的構(gòu)建物的下游；(3)將步驟⑵插入目的基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞或組織中；和
(4)將步驟C3)獲得的轉(zhuǎn)入了所述多核苷酸的植物細(xì)胞或組織再生成植物，從而目的基因在該植物的胚中特異性表達(dá)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了構(gòu)建的表達(dá)載體的示意圖。圖2顯示了 35S基本啟動子不會使GUS在種子中表達(dá)。圖3顯示了胚乳特異基序(pESl，3，4)的組織特異性表達(dá)情況。圖片第一行為種子，第二行為花，第三行為葉，第四行為莖，第五行為根。如箭頭所示區(qū)域?yàn)榘l(fā)生GUS染色的區(qū)域。圖4胚乳特異基序(pES》，胚特異基序(pBYl)、種子特異基序(pRSl)的組織特異性表達(dá)情況。圖片第一行為種子，第二行為葉，第三行為花，第四行為莖，第五行為根。如箭頭所示區(qū)域?yàn)榘l(fā)生GUS染色的區(qū)域。圖5顯示了順式作用元件(cis-element)預(yù)測的主要流程。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，首次通過篩選分離到一種指導(dǎo)基因在特定植物組織中特異性表達(dá)的多核苷酸(基序)，所述的多核苷酸在與啟動子或啟動子片段(如基本啟動子)連接后，可指導(dǎo)下游的目的基因特異性地表達(dá)在植物的胚中。因此，可應(yīng)用該多核苷酸來調(diào)控植物組織中基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)植物品種改良等。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，除非另外說明，所述的“多核苷酸”或“基序(motif)”是指一條對于調(diào)控基因的表達(dá)有用的核苷酸序列(序列單位)，其可以作為一種順式元件，也可以作為一種增強(qiáng)子。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(qū)(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識別位點(diǎn)。在本文中，所述的啟動子或啟動子區(qū)包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。組織或器官特異型啟動子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官或組織中。所述的“啟動子片段”是指具有該啟動子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的該啟動子的片段；也即，該“啟動子片段”保留了其相應(yīng)的啟動子的基本功能。較佳地，所述的啟動子片段可以是基本啟動子或核心啟動子。如本文所用，“順式調(diào)控元件”或“順式元件”是指對基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率起調(diào)節(jié)作用的保守性堿基序列。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的“可操作(性)地連接”或“操作性連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。如本文所用，“目的基因”是指可由本發(fā)明的基序和啟動子指導(dǎo)表達(dá)的基因。合適的目的基因包括但不限于葡萄糖苷酶(GUQ基因、改善植物品質(zhì)或性狀或表型相關(guān)的基因(如人乳鐵蛋白基因、賴氨酸合成酶基因、beta胡蘿卜素合成基因、直鏈與支鏈淀粉合成酶基因等)、以及種子中激素合成相關(guān)基因等。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“外源的”。如本文所用，術(shù)語“特異性表達(dá)”是指目的基因在特定的時(shí)間和/或特定的組織表達(dá)?！敖M織特異性”又稱“器官特異性”，在一些調(diào)控元件的調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出其相關(guān)的發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。本發(fā)明中，所述的“組織特異性表達(dá)”是指在植物胚乳、胚或種子中特異表達(dá)。通常，如果在某組織或器官中mRNA以比在其它組織或器官中高至少5倍，優(yōu)選至少高10倍，更優(yōu)選至少高100倍，最優(yōu)選至少高1000 倍水平被表達(dá)，則認(rèn)為相關(guān)基因的表達(dá)是組織或器官特異性的。如本文所用，所述的“植物”是具有胚、胚乳結(jié)構(gòu)的植物。本領(lǐng)域人員熟知，植物胚或胚乳的組成成分是相似的，具有胚或胚乳結(jié)構(gòu)的植物具有共同的特性，其基因組中存在許多保守的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的基因或調(diào)節(jié)元件，例如一系列調(diào)控植物形成胚或胚乳的元件。因此可以確定可以調(diào)控目的基因在禾本科植物的胚或胚乳或種子中特異性表達(dá)的基序(或基序-啟動子)也可以調(diào)控目的基因在禾本科植物以外其它具有胚或胚乳結(jié)構(gòu)的植物產(chǎn)生同樣的表達(dá)特性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的植物是被子植物；較佳地，所述的植物是單子葉植物；更佳地，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱寸。如本文所用，所述的“非繁殖材料”是指一種生物材料，其不具有借助光合作用，以水、二氧化碳和無機(jī)鹽等無機(jī)物合成碳水化合物、蛋白質(zhì)來維系生存的特性。本發(fā)明提供一種調(diào)控目的基因在植物組織特異性表達(dá)的基序，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO :6 任一所示。其中，如 SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ IDNO :3 或 SEQ ID NO :4 任一所示的基序可驅(qū)動目的基因在禾本科植物的胚乳中特異性表達(dá)，其核苷酸序列；如SEQ ID N0:5所示的基序可驅(qū)動目的基因在禾本科植物的胚中特異性表達(dá)，其核苷酸序列；如SEQ ID NO 6 所示的基序可驅(qū)動目的基因在禾本科植物的種子中特異性表達(dá)。多核苷酸的雜交是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發(fā)明還涉及與前述指定的核苷酸序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少80%，較佳地至少90%，更佳地至少95%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸?！皣?yán)格條件”或“嚴(yán)緊條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫， 如0. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C;或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清/0. l%Fic0ll，42°C等；或C3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選60%以
6上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸也具有SEQ ID NO :1-6任一所示基序相同的調(diào)控作用。本發(fā)明還包括與本發(fā)明的任一種基序序列具有80%以上，更優(yōu)選90%以上，最優(yōu)選95%以上相同性的核酸，所述核酸也具有SEQ ID NO :1-6任一所示基序相同的調(diào)控作用?！跋嗤浴笔侵赴凑瘴恢孟嗤陌俜直?，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在所述的基序-啟動子的指導(dǎo)下，可以使葡萄糖苷酶(GUS)基因特異地在植物的胚乳、胚或種子中表達(dá)。因此可見，本發(fā)明的基序是一種組織或器官特異性的調(diào)控序列。其對于定點(diǎn)地改良植物的品質(zhì)(通過驅(qū)動目的基因特異性表達(dá))是特別有用的。葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的葡萄糖苷，產(chǎn)生具有發(fā)色團(tuán)或熒光的物質(zhì)，可用分光光度計(jì)、熒光計(jì)或組織化學(xué)等方法對GUS活性進(jìn)行定量和空間定位分析。在本技術(shù)領(lǐng)域中，GUS基因已被廣泛地用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因，特別是其可被用于研究外源基因表達(dá)的具體細(xì)胞和組織部位。本發(fā)明的組織特異性表達(dá)相關(guān)基序在理論研究和農(nóng)藝改良中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。這些基序可以被應(yīng)用于標(biāo)記特定組織，引導(dǎo)特定的功能基因在特定的組織中表達(dá)，以及應(yīng)用于特有組織的生長發(fā)育研究和針對性改良。所述的基序可以是多次重復(fù)(如2-100 次)的，一般多次重復(fù)可以使功能加強(qiáng)，即增強(qiáng)子的效果是可以累加的，增強(qiáng)子序列合在一起，即使其中間插入一些別的序列，轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)的作用也會大大增強(qiáng)(參見朱玉賢，李毅，鄭曉峰；現(xiàn)代分子生物學(xué)；高等教育出版社；2007)。通常，多次重復(fù)序列中，兩個(gè)基序之間插入其它序列(間隔序列)的長度在I-IOObp，較佳地l-50bp，更佳地l-20bp，更佳地I-IObp， 更佳地Hbp，如2、!3bp。所述的間隔序列例如是酶切位點(diǎn)等。多次重復(fù)序列對于轉(zhuǎn)錄作用的加強(qiáng)還可參見陳俊，楊之帆，張文雋；4X3^增強(qiáng)子的克隆及其功能驗(yàn)證；華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，02，118-121 ；脅等亦發(fā)現(xiàn)，對于水稻基因Glu-Bl的啟動子中決定其胚乳表達(dá)特異性的GCN4基序，隨著人工構(gòu)建使其重復(fù)次數(shù)的增多，其驅(qū)動的報(bào)告基因的表達(dá)水平也相應(yīng)得到增強(qiáng)(Wu CY, Suzuki A, Washida H, Takaiwa F. The GCN4 motif in a rice glutelingene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated by0paque-2 in transgenic rice plants. Plant J. 1998，14，673—83)。本發(fā)明的基序通常與啟動子(如基本啟動子)操作性連接，再與目的基因操作性連接，從而驅(qū)動目的基因的特異性表達(dá)。所述的啟動子或其片段沒有特別的限制，只要其含有TATA-盒結(jié)構(gòu)，可引發(fā)轉(zhuǎn)錄， 且在與所述基序連接后對于啟動下游基因表達(dá)是有用的。所述的TATA-盒結(jié)構(gòu)序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在，并被本領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于啟動子研究中。在啟動子上，TATA盒一般處于非常接近轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(通常于50個(gè)堿基對以內(nèi))的位置。本發(fā)明所述的啟動子含有TATA-盒結(jié)構(gòu)，如煙草花葉病毒35S基本啟動子 (CAMV35S mini promoter)。35S基本啟動子區(qū)主要即TATA-盒結(jié)構(gòu)區(qū)，該結(jié)構(gòu)序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在(朱玉賢，李毅，鄭曉峰；現(xiàn)代分子生物學(xué)；高等教育出版社；2007)，并被廣泛應(yīng)用于啟動子研究中，Sien等(Shen H，Yang HJ, Wang ZY.Inducible Expression of OsEBP—89 Gene inRice. Journal Of PlantPhysiology and Molecular Biology,2004,30 (1) :87-93), Wu 等(Wu CY, Suzuki A, Washida H, Takaiwa F. The GCN4 motif in a rice glutelingene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated by0paque-2 in transgenic rice plants. Plant J. 1998,14,673-83 ；Wu C, Washida H, Onodera Y, Harada K, Takaiwa F. Quantitative nature of the Prolamin-box, ACGTand AACA motifs in a rice glutelin gene promoter :minimal cis—elementrequirements for endosperm-specific gene expression. Plant J. 2000,23,415-21), Yoshihara 等(Yoshihara Τ, Washida H, Takaiwa F. A 45_bp proximal regioncontaining AACA and GCN4 motif is sufficient to confer endosperm-specificexpression of the rice storage protein glutelin gene, GluA-3. FEBS Lett. 1996，383，213-8)人在研究中均將不同啟動子(增強(qiáng)子)與35S 基本啟動子融合來啟動目的基因的表達(dá)。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例，所述的啟動子是煙草花葉病毒(CaMV)35S的基本啟動子 (CAMV35S mini promoter)，其含有TATA-盒結(jié)構(gòu)區(qū)，該結(jié)構(gòu)序列在真核生物中高度保守，在原核生物中亦普遍存在，并已被廣泛應(yīng)用于啟動子研究中。所述的35S的基本啟動子的序列如 CGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG AGAG (SEQID NO :27)。所述的啟動子與基序之間直接相連，或者，它們之間還含有其它核苷酸序列，所述其它核苷酸序列的長度在Ι-lOOObp，較佳地l-500bp，更佳地l-200bp，如100bp，50bp， 20bp，10bp。當(dāng)然，其它長度(如更長)的間隔序列也是可以存在的，只要其存在不影響上述各元件之間的操作性相連，不抑制基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。所述的間隔序列例如是酶切位點(diǎn)或隨機(jī)序列等。所述的目的基因相對于基序和啟動子而言可以是外源(異源)的。對所述目的基因的核酸序列沒有特別的限制(如一種結(jié)構(gòu)性核酸序列)，所述的目的基因優(yōu)選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些在農(nóng)業(yè)或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。合適的目的基因包括但不限于改良植物品質(zhì)、性狀或代謝相關(guān)的基因。所述的基序和啟動子還可以與被改進(jìn)的目的基因序列可操作地連接，該目的基因相對于啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進(jìn)來產(chǎn)生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進(jìn)來增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點(diǎn))，將翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，改善蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細(xì)胞信5寸。此外，所述的基序和啟動子可以設(shè)計(jì)成下調(diào)特定基因。這一般是通過將基序和啟動子連接到目的基因序列上來實(shí)現(xiàn)，該序列以反義反向被引導(dǎo)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉這種反義技術(shù)。任何核酸序列可以以這種方式被調(diào)節(jié)。任何一種前述的啟動子和/或目的基因序列可被包含在重組構(gòu)建物(重組載體) 中。作為一種方式，所述的重組載體包括本發(fā)明的基序，在所述的基序的下游包括啟動子，在所述啟動子的下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。當(dāng)需要表達(dá)目的基因時(shí)， 將目的基因連接入適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)內(nèi)，從而將目的基因與基序-啟動子可操作地連接。作為另一種方式，所述的重組載體包括(從5’到3’方向)引導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的
8基序-啟動子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列、抗性選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子或操作子。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要其能夠在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。 表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白 (GFP)等。重組載體中除了含有本發(fā)明的基序-啟動子，還可含有一種或多種其它基序或啟動子。所述的其它啟動子例如是組織特異性的、組成型的或誘導(dǎo)型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花葉病毒19S和!35S(CaMV19S CaMV35S)、增強(qiáng)的CaMV、煙草RB7等。包含上述適當(dāng)?shù)膯幼雍湍康幕虻妮d體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母； 植物細(xì)胞等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgC12。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。對于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。作為一種方式，制備轉(zhuǎn)基因植物的方法是將攜帶基序-啟動子和目的基因(可操作地連接)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌再將含啟動子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉(zhuǎn)基因受體植物例如是水稻、小麥、大麥和玉米。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、表達(dá)特異性的基序的初步篩選本發(fā)明取材營養(yǎng)組織(根，葉，苗)，以及不同發(fā)育階段的水稻種子并將其分為胚和胚乳，制作affymatrix芯片。利用該芯片，可以比較準(zhǔn)確的分離出在水稻種子中特異表達(dá)的基因。本發(fā)明人將胚(或者胚乳)作為一個(gè)分析元素，將營養(yǎng)組織作為另一個(gè)分析元素，找出相對營養(yǎng)組織特異表達(dá)(顯著高表達(dá))的基因，對其進(jìn)行非監(jiān)督聚類，得到表達(dá)模式相近的基因組，對每一組基因啟動子區(qū)進(jìn)行比對(根據(jù)基序的相似性，所處位置，以及gibbs能量等原則)，獲得候選的可能決定了基因表達(dá)特異性的基序(motif，可能為順式元件，也可能屬增強(qiáng)子)。對這部分候選基序本發(fā)明人要進(jìn)行二次過濾篩選。首先，計(jì)算候選基序在整個(gè)基因組范圍內(nèi)以及在種子特異表達(dá)基因中的超幾何分布，檢驗(yàn)其是否高度集中在種子特異高表達(dá)的基因里，選出有顯著差異的基序作后續(xù)分析；其次，根據(jù)第一次篩選的結(jié)果，將其與 PLACE(Plant cis-acting Regulatory DNAElements)和 AGRIS(The Arabidopsis Gene Regulatory Information Server)數(shù)據(jù)庫中己知植物順式元件相比對， 去掉已知元件，得到的成員即為最后的計(jì)算結(jié)果，用于下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。順式作用元件預(yù)測的主要流程見圖5。過濾篩選前得到結(jié)果中，包含有大部分已知的水稻胚或胚乳特異順式元件，超幾何分布差異分析表明其在種子特異表達(dá)基因中顯著密集(P < 0. 05)，證明了本計(jì)算方法的可行性。另外根據(jù)對PLACE和AGRIS中已知元件長度的統(tǒng)計(jì)，本發(fā)明人選取分析的基序長度處于6 31bp范圍內(nèi)。最終，計(jì)算得出胚乳特異基序13個(gè)，胚特異基序18個(gè)，見表1。表1、ρ < 0. 05且在數(shù)據(jù)庫中沒有匹配序列的基序胚(pBY)和種子(pRS)
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
2.權(quán)利要求1所述的多核苷酸的用途，用于與啟動子或啟動子片段操作性連接，調(diào)控目的基因在植物胚中特異性表達(dá)；其中，所述的啟動子片段具有該啟動子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。
3.一種構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物依次具有如下元件(5’一 3’)(多核苷酸-X) n，啟動子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示；其中，η為1-100的正整數(shù)；其中，X為無，或長度在I-IOObp的核酸；其中，啟動子的片段具有該啟動子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的啟動子或其片段含有TATA-盒結(jié)構(gòu)。
5.如權(quán)利要求3或4所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的啟動子或啟動子片段選自煙草花葉病毒35S啟動子，或煙草花葉病毒35S基本啟動子。
6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的煙草花葉病毒35S基本啟動子具有 SEQ ID NO :27所示的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物的啟動子或其片段下游還包括一目的基因。
8.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物是表達(dá)載體。
9.一種植物細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞中含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸或權(quán)利要求3-8任一所述的構(gòu)建物。
10.權(quán)利要求3-8任一所述的構(gòu)建物的用途，用于調(diào)控目的基因在植物胚中特異性表達(dá)。
11.一種調(diào)控目的基因在植物胚中特異性表達(dá)的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物依次具有如下元件(5’一3’)“多核苷酸-幻…啟動子或其片段；其中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:5所示；11為1-100的正整數(shù)； X為無，或長度在I-IOObp的核酸；其中啟動子的片段具有該啟動子的引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)；(2)將目的基因可操作性地插入到步驟(1)的構(gòu)建物的下游；(3)將步驟( 插入目的基因的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞或組織中；和(4)將步驟C3)獲得的轉(zhuǎn)入了所述多核苷酸的植物細(xì)胞或組織再生成植物，從而目的基因在該植物的胚中特異性表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織特異表達(dá)啟動子及其獲得方法和應(yīng)用。本發(fā)明首次通過篩選分離到一條多核苷酸，所述的多核苷酸在與啟動子連接后，可指導(dǎo)下游的目的基因特異性地表達(dá)在植物的胚中，可應(yīng)用這些多核苷酸來調(diào)控植物組織中基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)植物品種改良。
文檔編號C12N15/63GK102206637SQ201010134090
公開日2011年10月5日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者溫碧清, 薛紅衛(wèi) 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院