專利名稱：：高f值豬血寡肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶解豬血蛋白制備高F值豬血寡肽的技術(shù)，具體涉及用豬血蛋白為原料，通過超聲波破壁、控制蛋白酶酶解、活性炭吸附脫去芳香族氨基酸、噴霧干燥等，屬于食品生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：高F值寡肽是指由37個(gè)氨基酸殘基所組成的混合小肽體系。F值是指支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)與芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)的含量的克分子數(shù)比值(FischerRatio)。高F值寡肽具有護(hù)肝、抗疲勞、醒酒、治療苯丙酮尿癥、降低血清膽固醇、抑制癌細(xì)胞增殖等多種功能。我國臨床上使用的高F值制劑一般是采用純凈結(jié)晶的氨基酸按需要進(jìn)行一定比例配制的。因此價(jià)格比較貴。由于許多實(shí)驗(yàn)證明口服高F值氨基酸混合物的治療是有效的。因此，這啟發(fā)了人們采用水解食物蛋白來制備高F值口服制劑，再者，有人認(rèn)為寡肽在腸道中的吸收行為不同于氨基酸而易于吸收、尤其是三肽或四肽。所以口服寡肽混合物比口服氨基酸混合物對(duì)機(jī)體的補(bǔ)充更有效。因此可以推測(cè)從食物蛋白制備高F值寡肽混合物應(yīng)用于臨床作為口服制劑將是行之有效的。國外關(guān)于高F值寡肽的制備方法的研究，YamashitaM等人(YamashitaM，AraiS，F(xiàn)ujimakiM.A1ow—phenylalanine，high_tyro_sineplasteinasanacceptabledieteticfood.Methodofpreparationbyuseofenzymaticproteinhydrolysisandresynthesis[J]Journaloffoodscience,1976，41(5):1029-1032)首次報(bào)道了利用胃蛋白酶與鏈霉蛋白酶從魚蛋白和大豆分離蛋白中制取了低苯丙氨酸含量的寡肽混合物，產(chǎn)率分別為69.3%和60.9%，苯丙氨酸含量分別為0.05%和0.23%;SoichiA等(SoichiA.Comparativenutritionalvalueforaminoacids，olige_pep_tidesandsoybeanprotein[J]Jaocs，1987，64(12):1692-1695)根據(jù)食物蛋白的理化特性，在進(jìn)行酶水解之前，先進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚?，以便提高水解度及可溶性肽的產(chǎn)量。他們用胃蛋白酶、鏈酶蛋白酶、木瓜蛋白酶以及a-胰凝乳蛋白酶等作用于乳清蛋白制備高F值低聚肽。預(yù)處理過程中先將乳清蛋白分散在水中，然后在9(TC下加熱10min，再用酶處理，可大大提高其水解程度，產(chǎn)品最終得率為81.0X，苯丙氨酸含量為0.30X。由于高F值寡肽特殊生理功能，對(duì)高F值寡肽制備研究熱潮就一直處于高漲狀態(tài)。ShinyaT等(ShinyaT，TanabeS，WatanabeM，AraiS.Enzymaticmodificationofzeintoproductionanon_bitterpeptidefractionwithaveryhighfischerratioforpatientswithh印aticenc印halopathy[J].AgricBiolChem，1991，55(4):1119—1123)在以玉米醇溶蛋白制備高F值寡肽時(shí)，先將玉米蛋白懸浮在乙醇和0.1的KOH溶液中，蛋白分子結(jié)構(gòu)變得更加松散，以利于酶的作用，從而提高可溶性肽的轉(zhuǎn)化率；ShuJi(ShujiA，etal.ProcessingofAsia-PacificBiochemicalEngineeringConference[C].1992:739-742)、Bautista(BautistaJ，etal.Sunflowerproteinhydrolysatesfordietarytreatmentofpatientswithliverfailure[J].JournalAmericanOilChemistrySociety,2000，77(2):121-126.)分別以牛乳酪蛋白、葵花蛋白為原料制備高F值寡月太。Pedroche(J.Pedroche，etal.Productionandcharacterizationofcaseinhy_drolysateswithahighaminoacidFischer'sratiousingimmobilizedproteases[J]InternationalDairy,2004，(528):527-533)等研究用固定化酶水解牛酪蛋白獲得高F值水解產(chǎn)物，用胰乳蛋白酶處理后再用羧肽酶A除去AAA,得到的產(chǎn)物F值達(dá)到30.6，而苯丙氨酸和酪氨酸總值<1.4X，通過BiogelP2凝膠柱過柱后，這種水解物可用以治療肝腦病、酪氨酸血癥和苯丙尿酮癥。目前，國內(nèi)關(guān)于高F值寡肽的研究起步較晚王梅等[WangMei，GuWen-ying.Thepreparationofactivatedcharcoalchro—matogr即hyseparationofmixtureofhighFvalueoligo-peptide[J].JournalofWu-xiuniversityoflightindustry,1998,17(4):41-45(InChinese)]首次采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶降解玉米黃粉制備高F值寡肽混合物，研究比較了玉米醇溶蛋白不同前處理方法對(duì)可溶性肽產(chǎn)量的影響，最終可以得到產(chǎn)率為7.9X高F值寡肽混合物，F(xiàn)值為31.O，芳香族氨基酸的含量為0.06%，完全符合0kitaM等提出的高F值制劑的標(biāo)準(zhǔn)；谷文英[GuWen-ying.HighFischerratiop印tidemixture[J].ChinaFoodAdditives,2000，(2):69-73(InChinese)]、吳紅艷[WuHong_yan，LiuXiao_yan，LiuZong_min，ZhengXi_qim.Pr印aratehighfischerratioofoligo-peptidewithcornscr即[J].Journalofscienceofteachers'collegeanduniversity,2003，(8):43-45(InChinese]等也研究利用玉米黃粉為原料制備高F值寡肽混合物；宋春麗等[SongCh皿-li，ChiYu-jie，S皿Bo，LiuFeng.StudyonTechnologyofPreparingHighFischerRatioSoybeanOligo-peptidewithTwoProteinases[J].Foodscience,2007，28(6):110-113(InChinese)]利用堿性絲氨酸蛋白酶和蛋白酶II對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行兩步定向酶切，來制備具有改善肝昏迷生物活性的高F值寡肽；何慧等[HeHui.Studyonpeptideshydrolyzedfromsoybeanandcornproteinsbyproteaseandtheirbioactivities[J].Scienceandtechnologyofcereals,oilsandfoods,2002，10(1):14-16(InChinese)]研究將大豆蛋白和玉米蛋白按一定比例復(fù)配，用堿性蛋白酶水解，得到F值2.92酶解液，可作為生產(chǎn)高F值寡肽原料。隨著對(duì)各種天然生物材料研究深入，制備高F值寡肽原料也在不斷擴(kuò)大。趙姍姍等[ZhaoShan-shan，GanXin.Studyonoligo-peptidesofhighfischerratiowithkonjacflypowder[J].Chemistry&Bioengineering，2005，(1):10-12(InChinese)]論述了根據(jù)魔芋飛粉開發(fā)制備高F值寡肽可行性；彭曉紅等[PengXiao-hong，KuangYing-qiu，MaoPing-sheng.Theedibleandhealthyfunctionofsilk[J].Jiang_susericllture，2004，(1):23-24(InChinese)]論述將蠶絲用鹽酸水解，再以氫氧化鈉中和后，經(jīng)脫鹽、濃縮、冷凍干燥，制成黃褐色蠶絲低聚肽和氨基酸粉末，從而可將這種低聚肽粉末經(jīng)過除AAA處理，制備高F值低聚肽。劉靜波等[LiuJing-bo，LinSong-yi，ZhangTie-him，ZhaoFa-li，LiuYu.ControllableEnzymeDisassembleConditionsofHighFValueOligo—peptidefromEggWhite[J].JournalofShen-yangAgriculturalUniversity，2007，38(2):174-177(InChinese)]將雞蛋清用堿性蛋白酶和風(fēng)味酶雙酶酶解制備高F值寡肽，為固定化酶在蛋清高F值寡肽的生產(chǎn)技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外生產(chǎn)高F值寡肽原料的來源十分廣泛，來自于動(dòng)物蛋白的有魚蛋白、乳清蛋白、牛乳酪蛋白等；來自于植物蛋白的有玉米醇溶蛋白、大豆蛋白、葵花蛋白等。目前研究最深入的要數(shù)玉米黃粉的高F值寡肽混合物，其它如大豆蛋白等也有一定的報(bào)道。由于國內(nèi)高F值寡肽市場(chǎng)主要呈現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品種類少，產(chǎn)量低，制備條件落后，產(chǎn)品供不應(yīng)求的狀態(tài)。因此，如何利用資源豐富、蛋白質(zhì)含量高、雜質(zhì)少、支鏈氨基酸較芳香族氨基酸含量高、適用于高F值寡肽生產(chǎn)的原料，并且開發(fā)生產(chǎn)高F值寡肽產(chǎn)品的方法成為急待解決的第一個(gè)問題。豬血血紅蛋白的營養(yǎng)價(jià)值很高，特別是賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的含量較高。血紅蛋白中的血紅素具有顏色及腥味，即使在食品中加入少量也會(huì)使食品呈暗棕色并有異味，影響其感官質(zhì)量，從而限制了血紅蛋白的應(yīng)用。我國每年屠宰生產(chǎn)的豬血約有170萬噸，豬血資源十分豐富，但目前我國豬血的利用率不超過10%，并且我國利用豬血資源開發(fā)的產(chǎn)品還比較單調(diào)，除了小部分被加工成血粉或發(fā)酵血粉作為飼料添加劑及用于生化制藥生產(chǎn)血紅素、超氧化物歧化酶、蛋白胨外，相當(dāng)大的一部分都作為廢棄物排出，既污染了環(huán)境，又浪費(fèi)了寶貴的蛋白資源。發(fā)明人長期從事豬血綜合利用方面的研究，發(fā)現(xiàn)豬血的氨基酸組成中，支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的質(zhì)量比為1.75:l，是制備高F值寡肽的理想原料。如果對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理后，利用酶體系的專一性，盡量在水解物肽鏈里保留支鏈氨基酸，而使芳香族氨基酸游離析出，然后經(jīng)選擇性吸附層析將芳香族氨基酸吸附脫離水解物，從而制得高F值水解物，再經(jīng)過一系列處理即可得到豬血高F值寡肽混合物。這對(duì)解決豬血對(duì)環(huán)境的污染和提高蛋白質(zhì)資源的利用率均具有重要意義。目前，國內(nèi)外還未有從豬血中制備高F值寡肽產(chǎn)品的相關(guān)報(bào)道。由于豬血不同于前述的玉米蛋白、大豆蛋白、葵花蛋白等植物來源和魚蛋白、雞蛋清、蠶絲等動(dòng)物來源，因此不能完全照搬前述的現(xiàn)有方法。楊世宇(利用豬血纖維生產(chǎn)水解蛋白注射液，肉類工業(yè)，1987年第3期第40-42頁)報(bào)道了一種利用豬血制備醫(yī)用的血纖維水解蛋白的方法，包括熱堿處理豬血、活性碳或白土除去熱源和過敏原、通過離子交換樹脂純化并干燥濃縮。但該方法僅僅涉及從豬血中制備水解蛋白而不是高F值寡肽，同時(shí)該方法或相類似的方法涉及離子交換樹脂，導(dǎo)致生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)成本高而難以大規(guī)模應(yīng)用。因此，如何提供一種從豬血中制備高F值寡肽產(chǎn)品的方法成為目前急需解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人經(jīng)過長期摸索和實(shí)驗(yàn)確定了本發(fā)明方法，利用蛋白酶酶解豬血蛋白、通過活性炭吸附去除芳香族氨基酸，制備高F值寡肽，包括蛋白酶的選擇及其酶解技術(shù)參數(shù)，吸附劑的選擇及其吸附技術(shù)參數(shù)等。本發(fā)明拓寬了生產(chǎn)高F值寡肽的原料來源，以新鮮豬血為原料，極大地提高蛋白質(zhì)資源的利用率和解決豬血對(duì)環(huán)境的污染；其次，摒棄了常規(guī)方法中生產(chǎn)高F值寡肽需要凝膠過濾或離子柱過濾純化的方法，直接選用蛋白水解、活性碳處理的技術(shù)，通過優(yōu)化技術(shù)參數(shù)，并結(jié)合以可溶性淀粉為載體進(jìn)行的噴霧干燥技術(shù)，取得了顯著的技術(shù)效果。本發(fā)明所述的一種從豬血中制備高F值豬血寡肽的方法，包括(l)豬血抗凝處理；(2)利用堿性蛋白酶水解豬血蛋白，反應(yīng)條件溫度4555t:，加酶量0.350.45g/100mL豬血，初始pH值1012，反應(yīng)時(shí)間68h。(3)將堿性蛋白酶酶解后的豬血蛋白水解液，再用風(fēng)味蛋白酶水解，反應(yīng)條件為溫度4547°C，加酶量0.350.50g/100mL豬血，初始pH值1012，反應(yīng)時(shí)間57h。(4)使用活性炭對(duì)豬血蛋白水解液進(jìn)行高F值化處理，條件為炭液比(即活性碳和反應(yīng)溶液的質(zhì)量比)l:815、溫度405(TC、吸附時(shí)間24h、pH值46。(5)以可溶性淀粉為載體，對(duì)高F值豬血寡肽進(jìn)行噴霧干燥，條件為進(jìn)口風(fēng)19021(TC，出口風(fēng)80IO(TC，最終得到乳白色產(chǎn)品。在實(shí)施方案中，步驟(4)通過高速離心除去活性碳，并用超濾膜截留、純化水解產(chǎn)物。在實(shí)施方案中，使用截留分子質(zhì)量麗CO為lku、面積0.4m2的超濾膜進(jìn)行截留純化，其中在操作終點(diǎn)時(shí)，添加截留液約10%體積的蒸餾水進(jìn)行納濾三次。在實(shí)施方案中，步驟(1)中通過加入5.08.Og/L檸檬酸三鈉進(jìn)行抗凝處理，在超聲波破碎1015min之后，保存?zhèn)溆没蛑苯邮褂谩Ｔ趯?shí)施方案中，步驟(2)加酶量?jī)?yōu)選0.45g/100mL，反應(yīng)溫度優(yōu)選50°C。在實(shí)施方案中，步驟(3)加酶量?jī)?yōu)選0.45g/100mL，反應(yīng)溫度優(yōu)選46t:。在實(shí)施方案中，步驟(3)中通過氫氧化鈉或氫氧化鉀、步驟(4)中通過鹽酸調(diào)節(jié)pH。技術(shù)效果1.本發(fā)明的方法拓寬了生產(chǎn)高F值寡肽的原料來源，以新鮮豬血為原料，極大地提高蛋白質(zhì)資源的利用率和解決豬血對(duì)環(huán)境的污染。2.摒棄了常規(guī)方法中生產(chǎn)高F值寡肽的需要凝膠過濾或離子柱過濾純化的方法，生產(chǎn)周期短、降低了生產(chǎn)成本，適于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。3.本發(fā)明為了通過對(duì)豬血的深加工，提高豬血的附加值，減少環(huán)境污染，為高F值寡肽的原料來源和生產(chǎn)方法提供新的解決方案。4.通過本方法制備的高F值豬血寡肽，分子量集中在8001200Da，其氨基酸及游離氨基酸組成具有良好的平衡性，芳香族氨基酸含量<0.1%，F(xiàn)值〉25，產(chǎn)品得率>10.74%，優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。具體實(shí)施例方式下面，本發(fā)明將用實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但是它并不限于這些實(shí)施例的任一個(gè)或類似實(shí)例。實(shí)施例1:從豬血中制備提取高F值豬血寡肽。第一步檢疫合格的生豬洗凈后采血，加6.Og/L檸檬酸三鈉抗凝，超聲波破碎10min，用NaOH將初始pH值調(diào)至12，加堿性蛋白酶進(jìn)行水解，加酶量0.45g/100mL，在50°C下，酶解7h。第二步堿性蛋白酶酶解后的豬血蛋白水解液，加入風(fēng)味蛋白酶(購自諾維信中國生物技術(shù)有限公司)水解，加酶量O.45g/100mL，46。C下，酶解6h。第三步用鹽酸將豬血蛋白水解液pH值調(diào)至5，再將活化后的活性炭加入豬血蛋白水解液，炭液比1:IO，在45"下，吸附3h，期間每隔1520min攪拌一次。第四步9000r/min轉(zhuǎn)速離心30min除去活性炭，用截留分子質(zhì)量麗CO為lku、面積O.4n^的超濾膜，采用截留液全回流操作方式，工作溫度25t:，在納濾接近終點(diǎn)時(shí)，添加截留液10%左右的蒸餾水納濾三次。最后對(duì)高F值豬血寡肽進(jìn)行噴霧干燥，條件為進(jìn)口風(fēng)190°C，出口風(fēng)90°C，得到高F值豬血寡肽產(chǎn)品為乳白色，分子量集中在8001200Da，其氨基酸及游離氨基酸組成具有良好的平衡性，芳香族氨基酸含量<0.1%，F(xiàn)值為25.98，產(chǎn)品得率為10.68%。實(shí)施例2:從豬血中制備提取高F值豬血寡肽。第一步檢疫合格的生豬洗凈后采血，加7.Og/L檸檬酸三鈉抗凝，超聲波破碎12min，用NaOH將初始pH值調(diào)至10，加堿性蛋白酶進(jìn)行水解，加酶量0.40g/100mL，在52°C下，酶解6h。第二步堿性蛋白酶酶解后的豬血蛋白水解液，加入風(fēng)味蛋白酶(購自諾維信中國生物技術(shù)有限公司)水解，加酶量O.50g/100mL，45t:下，酶解5h。第三步用鹽酸將豬血蛋白水解液pH值調(diào)至5，再將活化后的活性炭加入豬血蛋白水解液，炭液比1:15，在5(TC下，吸附2h，期間每隔1520min攪拌一次。第四步9000r/min轉(zhuǎn)速離心30min除去活性炭，用截留分子質(zhì)量麗CO為lku、面積O.4n^的超濾膜，采用截留液全回流操作方式，工作溫度25t:，在納濾接近終點(diǎn)時(shí)，添加截留液10%左右的蒸餾水納濾三次。最后對(duì)高F值豬血寡肽進(jìn)行噴霧干燥，條件為進(jìn)口風(fēng)190°C，出口風(fēng)90°C，得到高F值豬血寡肽產(chǎn)品為乳白色，分子量集中在8001200Da，其氨基酸及游離氨基酸組成具有良好的平衡性，芳香族氨基酸含量<0.1%，F(xiàn)值為25.98，產(chǎn)品得率為10.68%。權(quán)利要求一種從豬血中制備高F值豬血寡肽的方法，包括(1)豬血抗凝處理；(2)利用堿性蛋白酶水解豬血蛋白，反應(yīng)條件溫度45～55℃，加酶量0.35～0.45g/100mL豬血，初始pH值10～12，反應(yīng)時(shí)間6～8h；(3)將堿性蛋白酶酶解后的豬血蛋白水解液，再用風(fēng)味蛋白酶水解，反應(yīng)條件為溫度45～47℃，加酶量0.35～0.50g/100mL豬血，初始pH值10～12，反應(yīng)時(shí)間5～7h；(4)使用活性炭對(duì)豬血蛋白水解液進(jìn)行高F值化處理，條件為炭液質(zhì)量比1∶8～15、溫度40～50℃、吸附時(shí)間2～4h、pH值4～6；(5)以可溶性淀粉為載體，對(duì)高F值豬血寡肽進(jìn)行噴霧干燥，條件為進(jìn)口風(fēng)190～210℃，出口風(fēng)80～100℃，最終得到乳白色產(chǎn)品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬血中制備高F值豬血寡肽的方法，其中步驟(4)通過高速離心除去活性碳，并用超濾膜截留、純化水解產(chǎn)物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬血中制備高F值豬血寡肽的方法，其中使用截留分子質(zhì)量麗CO為lku、面積0.4m2的超濾膜進(jìn)行截留純化，其中在操作終點(diǎn)時(shí)，添加截留液約10%體積的蒸餾水進(jìn)行納濾三次。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬血中制備高F值豬血寡肽的方法，其中步驟(1)中通過加入5.08.Og/L檸檬酸三鈉進(jìn)行抗凝處理，在超聲波破碎1015min之后，保存?zhèn)溆没蛑苯邮褂谩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬血中制備高F值豬血寡肽的方法，其中步驟(3)中通過添加氫氧化鈉或氫氧化鉀、步驟(4)中通過添加鹽酸調(diào)節(jié)pH。全文摘要本發(fā)明涉及一種高F值豬血寡肽的制備方法，本發(fā)明以新鮮豬血為原料，利用蛋白酶酶解豬血蛋白、通過活性炭吸附去除芳香族氨基酸，制備高F值寡肽，包括蛋白酶的選擇及其酶解技術(shù)參數(shù)，吸附劑的選擇及其吸附技術(shù)參數(shù)等，目的是為了通過對(duì)豬血的深加工，提高豬血的附加值，減少環(huán)境污染，為高F值寡肽的制備提供新的途徑，通過本方法制備的高F值豬血寡肽，分子量集中在800～1200Da，其氨基酸及游離氨基酸組成具有良好的平衡性，芳香族氨基酸含量＜0.1％，F(xiàn)值＞25，產(chǎn)品得率＞10.74％。文檔編號(hào)A23J3/34GK101791039SQ20101013036公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年3月23日優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日發(fā)明者盧向陽,方俊申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)