專利名稱：：抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應用，屬于微生物學，分子生物學和基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：2009年，美國ASCO主席在介紹腫瘤進展時提到，癌癥的第一死亡原因是癌癥本身和癌癥復發(fā)，第二位死因就是血栓。癌癥與血栓的關(guān)系非常密切，重視癌癥血栓的預防和治療已成為臨床醫(yī)生今后工作的重點之一。1865年，法國醫(yī)生ArmandTrousseau首次報道了胃癌患者容易形成靜脈血栓，不久，Billroth又于1878年發(fā)現(xiàn)了血栓中存在癌細胞，進一步提出癌變可引起凝血功能紊舌L。臨床上把腫瘤相關(guān)性血栓稱為Trousseau綜合癥。大量的病理、實驗和臨床研究證實了這一現(xiàn)象，而且還發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的癌癥患者都存在局部或全部高凝狀態(tài)。癌癥患者的血栓性疾病包括深靜脈血栓(de印venousthlmmbosis,DVT)、月市檢塞(pulmonaryembolism,ΡΕ)、彌散性血管內(nèi)凝血(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)、門靜脈血檢(portalveinthmrnbosis,PVT)禾口動脈血檢栓塞(arterialthromboembolism,AT)、游走性淺表血栓性靜脈炎(migratorythrombophlebitissuperficial)等，其中下肢DVT最為常見。癌癥患者血栓形成的發(fā)病機理相當復雜，至今尚未完全明確。多種因素通過不同途徑共同導致了癌癥患者的血栓易患傾向，主要包括抗癌治療、腫瘤細胞的表達物及釋放物和致癌基因等因素?？拱┲委煂е卵ㄐ纬?，主要是手術(shù)治療期間形成血栓，化療藥物和放射治療誘發(fā)血栓形成以及患者在接受中心靜脈穿刺置管治療期間，管周纖維蛋白鞘導致血栓形成。癌癥患者所患的血栓性疾病與腫瘤細胞表達和釋放的物質(zhì)關(guān)系密切。腫瘤細胞可通過釋放促凝因子或炎性因子來直接或間接地激活凝血級聯(lián)反應，另一方面，炎性因子亦可刺激腫瘤細胞釋放更多的促凝因子而加劇血液的高凝狀態(tài)。腫瘤細胞表達和釋放的三種主要促凝物質(zhì)為組織因子(TF)、癌促凝物質(zhì)(cancerprocoagulantCP)和絲氨酸蛋白酶(hepsin)0新近的研究表明，某些致癌基因在促進細胞惡變的同時也能夠引起凝血功能紊舌L。如YuJ等證實，導致癌癥產(chǎn)生的某些基因病變?nèi)鏡as基因活化或p53基因失活能夠造成組織因子(TF)的過度表達，誘發(fā)凝血病變。最近的研究還顯示，血栓形成參與了腫瘤的進展、血管生成和轉(zhuǎn)移等機制。除了癌癥治療形成血栓可視為外界因素外，其余兩種因素所形成的血栓都是應機體癌變出現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，血栓的形成有利于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機制可能是纖維蛋白沉積于腫瘤細胞周圍為腫瘤生長提供了2個便利條件一方面為腫瘤細胞附著提供了基質(zhì)，利于其局部擴散和蔓延；另一方面，纖維蛋白凝血塊和相關(guān)的凝血因子能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細胞生長因子的表達(VEGF)，從而為新生血管創(chuàng)造了條件。金黃色葡萄球菌腸毒素C2(staphylococcalenterotoxins，SEC2)是一類細菌超抗原，它們無需抗原遞呈細胞(antigenpresentingcells，APCs)的加工，也不受組織相容性復合體(MHC)的限制，在APC之外與T細胞受體Vβ鏈形成MHCII-SE-TCRVβ復合物，在極低濃度時就能刺激大部分有TCRVii序列的T細胞增殖，使之釋放多種細胞因子，產(chǎn)生極強的免疫應答效應。SEC2可對腫瘤細胞產(chǎn)生超抗原依賴的細胞毒作用(Sag-dependentcell-mediatedT-cell-derivedcytotoxicity,SDCC)，從而產(chǎn)生系統(tǒng)白勺抗腫瘤反應。葡激酶(staphyIokinase，SAK)是由具有溶原性的金黃色葡萄球菌在指數(shù)期后期產(chǎn)生、分泌的一種胞外蛋白。葡激酶的溶栓作用機制是激活體內(nèi)溶栓系統(tǒng)，即通過激活纖溶酶原(Plg)轉(zhuǎn)變成纖溶酶(Pli)，而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓藥物，同其它的溶栓藥物比較，葡激酶具有溶栓活力強，溶栓作用專一，免疫原性低以及過敏反應少等多種特點，而且當血栓被溶解后，葡激酶的對纖溶酶原的激活作用會受到人體內(nèi)α2抗纖溶酶的抑制，避免了出血反應。目前，治療腫瘤及血栓的藥物都為單一功能的藥物，同時具有抗腫瘤及溶栓功能的藥物還未見報道?；赟EC2的抑瘤活性和SAK的溶栓活性，若將這兩種活性蛋白嵌合在一起，構(gòu)建出一種既抗腫瘤又溶栓的雙功能嵌合蛋白，對于治療癌癥并發(fā)血栓的病例具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容針對癌癥患者易形成血栓的問題，本發(fā)明基于SEC2的抗腫瘤活性和SAK的抗血栓作用，構(gòu)建一種抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，使抗腫瘤和抗血栓兩種作用得以同時體現(xiàn)。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，其特征在于由序列表SEQIDNO.1所示的SAK氨基酸序列、序列表SEQIDN0.2所示的linker氨基酸序列和序列表SEQIDN0.3所示的SEC2氨基酸序列構(gòu)成，linker將SEC2和SAK連接在一起，得到氨基酸序列如SEQIDN0.4所示的嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或氨基酸序列如SEQIDN0.5所示的嵌合蛋白SEC2-linker-SAK。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)上述抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白SAK-Iinker-SEC2的方法如下1)構(gòu)建嵌合基因sak-linker-sec2，其DNA序列如SEQIDN0.9所示；2)將得到的嵌合基因sak-linker-sed，經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位點，構(gòu)建出表達嵌合蛋白SAK-Iinker_SEC2的質(zhì)粒pET28a-sak-linker-sec2；3)將質(zhì)粒pET28a-sak-linker-sec2轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌；4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，當菌液吸光度值達到0.6時，在30°C條件下用ImMIPTG誘導45小時，之后離心收集菌體細胞。5)用超聲波破碎菌體細胞，功率200-300W；處理時間6X9sec，9sec間隔；處理后，6000rpm離心lOmin，去除不溶性細胞碎片，收集上清液；6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白SAK-linker-SEC2，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)上述的抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白SEC2-linker-SAK的方法如下1)構(gòu)建嵌合基因sec2-linker-sak，其DNA序列如SEQIDNO.12所示；2)將得到的嵌合基因sed-linker-sak，經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位點，構(gòu)建出表達嵌合蛋白SEC2-linker_SAK的質(zhì)粒pET28a-sec2-linker-sak；3)將質(zhì)粒pET28a-sec2-linker-sak轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌；4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，當菌液吸光度值達到0.6時，在30°C條件下用ImMIPTG誘導45小時，之后離心收集菌體細胞。5)用超聲波破碎菌體細胞，功率200-300W；處理時間6X9sec，9sec間隔；處理后，6000rpm離心lOmin，去除不溶性細胞碎片，收集上清液；6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白SEC2-linker-SAK，其氨基酸序列如SEQIDN0.5所示。本發(fā)明的嵌合蛋白在制備抗腫瘤溶栓藥物中的應用。本發(fā)明，根據(jù)實際需要選擇嵌合蛋白SAK-Iinker-SEC2或嵌合蛋白SEC2-linker-SAK,當藥物制劑以抗腫瘤為主時以嵌合蛋白SEC2-linker-SAK為佳，當藥物制劑以溶栓為主時以嵌合蛋白SAK-Iinker-SEC2為佳。以本發(fā)明的嵌合蛋白SAK-Iinker-SEC2或嵌合蛋白SEC2-linker-SAK為有效成分，添加藥學上常規(guī)的輔料，可制備具有抗腫瘤溶栓雙效的各種藥物制劑。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所構(gòu)建的抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白既保留了SAK的溶栓活性又不減SEC2的抗腫瘤功能，是理想的溶栓抗癌雙效生物制劑。本發(fā)明采用重疊延伸剪接技術(shù)，構(gòu)建嵌合基因，通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)和M親和層析純化法，成功獲得了高蛋白純度的嵌合蛋白，并經(jīng)體外溶栓實驗和體外抑瘤實驗證明了，本發(fā)明的嵌合蛋白分別與SAK和SEC2具有相同的活性，成功實現(xiàn)了溶栓抗癌雙效生物制劑的構(gòu)建。具體實施例方式實施例1抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白SAK-Iinker-SEC2的制備(一)帶有嵌合基因Sak-linker-SeC2的表達質(zhì)粒構(gòu)建為了保證嵌合蛋白中，SAK和SEC2不會發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的影響，本發(fā)明采用由9個丙氨酸組成的柔性連接肽(linker)連接SAK和SEC2。通過重疊延伸剪接技術(shù)構(gòu)建嵌合基因，連接到表達載體pET28a(+)上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。1、嵌合基因sak-linker-sec2的構(gòu)建經(jīng)PCR方法分別克隆得到編碼SAK的基因sak(其DNA序列如SEQIDN0.6所示)和編碼SEC2的基因sec2(其DNA序列如SEQIDN0.7所示的)，并在sak的3，端和sec2的5’端分別加上編碼連接肽(linker)的基因linker(其DNA序列如SEQIDN0.8所示)，然后以linker為互補末端經(jīng)重疊延伸剪接技術(shù)(SOE-PCR)擴增得到嵌合基因sak-linker-sec2(其DNA序列如SEQIDN0.9所示)。同時，為了實現(xiàn)嵌合基因sak-linker-sec2連接到表達質(zhì)粒pET_28a(+)上并能成功表達，通過PCR方法在嵌合基因sak-linker-sec2的5，端加上EcoRI酶切位點及保護堿基，在嵌合基因sak-linker_sec2的3’端加上終止密碼子，XhoI酶切位點及保護堿基。2、構(gòu)建重組質(zhì)粒將帶有酶切位點的嵌合基因sak-linker-sed經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切后，插入到表達載體PET28(+)的EcoRI/XhoI位點，T4連接酶16°C連接過夜，得到連接反應液。3、大腸桿菌的化學轉(zhuǎn)化將連接反應液加入到預先通過氯化鈣法制備的大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)化學方法轉(zhuǎn)化(42V水浴熱激)，之后，將菌液涂布于LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜，以篩選陽性克隆。4、陽性克隆的篩選在含有Kan抗性的LB平板培養(yǎng)基上，挑取陽性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切驗證，確定嵌合基因sak-linker-sed是否被插入到表達質(zhì)粒中。再由上海生工公司(Sangon，China)對得到的重組質(zhì)粒進行測序確認。試驗結(jié)果經(jīng)雙酶切驗證和測序分析綜合表明，表達SAK-Iinker-SEC2的原核表達載體構(gòu)建成功。獲得帶有重組質(zhì)粒pET28a-sak-linker-sec2的重組大腸桿菌。(二)SAK-Iinker-SEC2的誘導表達及純化1、SAK-Iinker-SEC2的誘導表達將帶有重組質(zhì)粒pET28a-Sak-linker-SeC2的重組大腸桿菌接種于含有Kan(卡那霉素，Kanamycine，Kan)(40μg/ml)的IOmlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1216小時，次日按2%的接種量，將培養(yǎng)好的菌液接種到含有Kan(40μg/ml)的200mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當菌液吸光度值達到0.6時，用ImMIPTG進行誘導。為了避免在表達過程中出現(xiàn)包涵體，本發(fā)明選擇在菌體生長不是很活躍的30°C作為誘導溫度，誘導4-5h。2、SAK-linker_SEC2的純化經(jīng)過4個小時的誘導表達后，通過8000rpm離心5分鐘收集菌體細胞。零下20°C過夜凍存菌體，次日取出，室溫放置15分鐘。用超聲波破碎菌體細胞，功率200-300W；處理時間6X9sec，9sec間隔。處理后，6000rpm離心lOmin，去除不溶性細胞碎片，收集上清液。將上清液低速上樣于Ni-NTA親和層析柱，平衡緩沖液(30mMTris-HCl，300mMNaClpH7.6)平衡至基線，洗脫緩沖液(30mMTris-HCl，300mMNaCl，50_300mM咪唑pH7.6)梯度洗脫，收集洗脫峰，濃縮除鹽，SDS-PAGE分析純度。得到帶有組氨酸標簽的重組SAK-Iinker-SEC2。本發(fā)明中，載體質(zhì)粒pET28a(+)編碼了三個用于純化的標簽，C端6XHistag，t7tag和N端6XHistag，本發(fā)明選擇了N端6XHistag。利用Ni離子特異性螯合His的特點，實現(xiàn)含有6XHistag的SAK-Iinker-SEC2與雜蛋白的分離，再通過咪唑競爭6XHistag與Ni離子的結(jié)合實現(xiàn)SAK-Iinker-SEC2的洗脫。試驗結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE驗證，成功表達并純化出嵌合蛋白SAK-Iinker-SEC2，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。(三)體外溶栓活性分析具體實施如下稱取125mg瓊脂糖(電泳級)，加入23ml生理鹽水，煮沸溶解，60°C水浴平衡，加凝血酶14μl(100IU/ml)，人纖溶酶原280μ1(0.5mg/ml)，人纖維蛋白原2.2ml(6mg/ml)，倒入80mm平板內(nèi)冷卻，制成人纖維蛋白平板，用前于4°C放置半個小時。打孔上樣，每個孔的直徑為2mm，上樣量為10μ1，SAK和SAK-linker_SEC2的濃度為50μg/ml，每個樣品設(shè)置3個重復，于37°C恒溫濕盒內(nèi)放置24h后，測溶栓直徑并進行活性比較。實驗結(jié)果SAK的溶栓直徑平均為24.68mm,SAK-1inker_SEC2的溶栓直徑平均為24.72mm,二者的溶栓活性基本相同。(四)體外淋巴細胞(PBMC)增殖活性分析具體實施如下取正常人新鮮外周血5ml，抗凝后(肝素，終濃度0.2mg/ml)，與等量的D-Hanks液混勻，小心地加在等量的淋巴細胞分離液上面，3000rpm離心15min，取出中間的云霧層(PBMC)，再加入等量D-Hanks液混勻，3000rpm離心lOmin，棄上清，然后用3_5mlD-Hanks液重懸PBMC，3000rpm離心lOmin，重復一次，加入適量的含有10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，計數(shù)。將PBMC以IXIO5個/孔的量加入到96孔板中，于CO2含量為5%，37°C的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，次日用含有10%血清的DNEM培養(yǎng)基將待測樣品稀釋至20ng/ml和200ng/ml兩個濃度，加入到96孔板中，以BSA陰性作為對照，PHA-P作為陽性對照，每樣3個復孔；5%C02，37°C培養(yǎng)72h；取出96孔板，按50μ1/孔加入MTT，5%C02，37°C培養(yǎng)4h；3000rpm離心lOmin，加入DMSO120μ1/孔，37°C溶解20min；酶標儀上570nm測定各孔的吸光值。實驗結(jié)果從鼠脾淋巴細胞的增值情況可以看出，無論是較低濃度的20ng還是較高濃度的200ng，SAK-Iinker-SEC2和腸毒素SEC2的增值率是相同的。結(jié)果見表1表1鼠脾淋巴細胞增殖實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(五)體外抑瘤活性分析具體實施如下取正常人新鮮外周血5ml，抗凝后(肝素，終濃度0.2mg/ml)，與等量的D-Hanks液混勻，小心地加在等量的淋巴細胞分離液上面，3000rpm離心15min，取出中間的云霧層(PBMC)，加入等量D-Hanks液混勻，3000rpm離心lOmin，棄上清，用3-5mlD_Hanks液重懸PBMC，3000rpm離心lOmin，重復一次，加入適量的含有10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，計數(shù)。將PBMC以2XIO5個/孔的量加入到96孔板中；倒掉Hella細胞培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，加入2-3mlD-Hanks液洗去殘留的培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一次，加入l_2ml胰酶，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞脫離胰酶，將胰酶倒掉，加入少量含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，計數(shù)。將Hella細胞以1XIO4個/孔的量加入到96孔板中，用含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基將待測樣品稀釋至20ng/ml和200ng/ml兩個濃度，加入到96孔板中，僅加Hella細胞作為腫瘤細胞對照孔，僅加與實驗孔等量的PBMC和待測樣品作為本底釋放孔，每樣3個復孔，5%C02，37°C培養(yǎng)36h；取出96孔板，加入50μ1/孔MTT，5%C02，37°C培養(yǎng)4h；3000rpm離心IOmin,加入DMSO120μ1/孔，37°C溶解20min,酶標儀上570nm測定各孔的吸光值。并按照下面的公式計算抑瘤率抑瘤率(OZo)=IOO-観-本底醒xl00腫瘤對照孔-空白對照孔實驗結(jié)果從抑瘤效果上看，在20ng和200ng兩種不同濃度下，SAK-linker_SEC2都表現(xiàn)出和腸毒素SEC2相同的活力。結(jié)果見表2表2體外抑瘤實驗SEC2SAK-linker-SEC2SEC2SAK-Iinker-SEC2PHA-PBSA(20ng)(20ng)(200ng)(200ng)(陽性對照)(陰性對照)抑瘤率42.73%_42.38%44.68%44.50%_62%11.87%實施例2嵌合蛋白SEC2-1inker-SAK的制備(一)帶有嵌合基因sed-linker-sak的表達質(zhì)粒構(gòu)建1、嵌合基因sec2-linker-sak的構(gòu)建經(jīng)PCR方法分別克隆得到編碼SAK的基因sak(其DNA序列如SEQIDNO.10所示)和編碼SEC2的基因sec2(其DNA序列如SEQIDNO.11所示的)，并在sec2的3，端和sak的5’端分別加上編碼連接肽(linker)的基因linker(其DNA序列如SEQIDNO.8所示)，然后以linker為互補末端經(jīng)重疊延伸剪接技術(shù)(SOE-PCR)擴增得到嵌合基因sec2-linker-sak(其DNA序列如SEQIDNO.12所示)。同時，為了實現(xiàn)嵌合基因sec2-linker-sak連接到表達質(zhì)粒pET_28a(+)上，并能成功表達，通過PCR方法在嵌合基因sec2-linker-sak的5，端加上EcoRI酶切位點及保護堿基，在嵌合基因sec2-linker_sak的3’端加上終止密碼子，XhoI酶切位點及保護堿基。2、構(gòu)建重組質(zhì)粒將帶有酶切位點的嵌合基因sec2_linker-sak經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切后，插入到表達載體PET28(+)的EcoRI/XhoI位點，T4連接酶16°C連接過夜，得到連接反應液。3、大腸桿菌的化學轉(zhuǎn)化將連接反應液加入到預先通過氯化鈣法制備的大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)化學方法轉(zhuǎn)化(42V水浴熱激)，之后，將菌液涂布于LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜，以篩選陽性克隆。4、陽性克隆的篩選在含有Kan抗性的LB平板培養(yǎng)基上，挑取陽性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切驗證，確定嵌合基因sed-linker-sak是否被插入到表達質(zhì)粒中。再由上海生工公司(Sangon，China)對得到的重組質(zhì)粒進行測序確認。試驗結(jié)果經(jīng)雙酶切驗證和測序分析綜合表明，表達SEC2-linker-SAK的原核表達載體構(gòu)建成功。獲得帶有重組質(zhì)粒pET28a-sec2-linker-sak的重組大腸桿菌。(二)SEC2-1inker-SAK的誘導表達及純化1、SEC2-1inker-SAK的誘導表達將帶有重組質(zhì)粒pET28a-SeC2-linker-Sak的重組大腸桿菌接種于含有Kan(卡那霉素，Kanamycine，Kan)(40μg/ml)的IOmlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1216小時，次日按2%的接種量，將培養(yǎng)好的菌液接種到含有Kan(40μg/ml)的200mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當菌液吸光度值達到0.6時，用ImMIPTG進行誘導。為了避免在表達過程中出現(xiàn)包涵體，本發(fā)明選擇在菌體生長不是很活躍的30°C作為誘導溫度，誘導4-5h。2、SEC2-1inker-SAK的純化經(jīng)過4個小時的誘導表達后，通過8000rpm離心5分鐘收集菌體細胞。零下20°C過夜凍存菌體，次日取出，室溫放置15分鐘。用超聲波破碎菌體細胞，功率200-300W；處理時間6X9sec，9sec間隔。處理后，6000rpm離心lOmin，去除不溶性細胞碎片，收集上清液。將上清液低速上樣于Ni-NTA親和層析柱，平衡緩沖液(30mMTris-HCl，300mMNaClpH7.6)平衡至基線，洗脫緩沖液(30mMTris-HCl，300mMNaCl，50_300mM咪唑pH7.6)梯度洗脫，收集洗脫峰，濃縮除鹽，SDS-PAGE分析純度。得到帶有組氨酸標簽的重組SEC2-1inker-SAK。本發(fā)明中，載體質(zhì)粒pET28a(+)編碼了三個用于純化的標簽，C端6XHistag，t7tag和N端6XHistag，本發(fā)明選擇了N端6XHistag。利用Ni離子特異性螯合His的特點，實現(xiàn)含有6XHistag的SEC2-1inker-SAK與雜蛋白的分離，再通過咪唑競爭6XHistag與Ni離子的結(jié)合實現(xiàn)SEC2-1inker-SAK的洗脫。。試驗結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE驗證，成功表達并純化出嵌合蛋白SEC2-linker-SAK。其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示(三)體外溶栓活性分析具體實施同實施例1實驗結(jié)果SAK的溶栓直徑平均為24.68mm,SEC2-1inker-SAK的溶栓直徑平均為18.40mm,嵌合蛋白溶栓活性明顯降低。(四)體外淋巴細胞(PBMC)增殖活性分析具體實施同實施例1實驗結(jié)果從鼠脾淋巴細胞的增值情況可以看出，無論是較低濃度的20ng還是較高濃度的200ng，SEC2-linker-SAK和腸毒素SEC2的增值率是相同的。結(jié)果見表3表3鼠脾淋巴細胞增殖實驗SEC2SEC2-linker-SAKSEC2SEC2-linker-SAKPHA-PBSA__(20ng)_(20ng)_(200ng)_(200ng)_(陽性對照)(陰性對Μ)增殖率50.88%50.37%52.63%52.98%112.28%5.30%(五)體外抑瘤活性分析具體實施同實施例1實驗結(jié)果從抑瘤效果上看，在20ng和200ng兩種不同濃度下，SEC2-linker-SAK都表現(xiàn)出和腸毒素SEC2相同的活力。結(jié)果見表4表4體外抑瘤實驗SEC2SEC2-linker-SAKSEC2SEC2-Iinker-SAKPHA-PBSA_(20ng)_(20ng)_(200ng)_(200ng)_(陽性對照)(陰性對照)抑瘤率42.73%_42.56%44.68%44.77%_62%11.87%權(quán)利要求一種抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，其特征在于由序列表SEQIDNO.1所示的SAK氨基酸序列、序列表SEQIDNO.2所示的linker氨基酸序列和序列表SEQIDNO.3所示的SEC2氨基酸序列構(gòu)成，linker將SEC2和SAK連接在一起，得到氨基酸序列如SEQIDNO.4所示的嵌合蛋白SAK-linker-SEC2或氨基酸序列如SEQIDNO.5所示的嵌合蛋白SEC2-linker-SAK。2.一種利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白的方法，其特征在于步驟如下1)構(gòu)建嵌合基因sak-linker-sec2，其DNA序列如SEQIDNO.9所示；2)將得到的嵌合基因sak-linker-sec〗，經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位點，構(gòu)建出表達嵌合蛋白SAK-Iinker_SEC2的質(zhì)粒pET28a-sak-linker-sec2；3)將質(zhì)粒pET28a-sak-linker-sec2轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌；4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，當菌液吸光度值達到0.6時，在30°C條件下用ImMIPTG誘導45小時，之后離心收集菌體細胞。5)用超聲波破碎菌體細胞，功率:200-300ff；處理時間:6X9sec，9sec間隔；處理后，6000rpm離心lOmin，去除不溶性細胞碎片，收集上清液；6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白SAK-linker-SEC2，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。3.一種利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白的方法，其特征在于步驟如下1)構(gòu)建嵌合基因sec2-linker-sak，其DNA序列如SEQIDNO.12所示；2)將得到的嵌合基因sed-linker-sak，經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位點，構(gòu)建出表達嵌合蛋白SEC2-linker_SAK的質(zhì)粒pET28a-sec2-linker-sak；3)將質(zhì)粒pET28a-sec2-linker-sak轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌；4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，當菌液吸光度值達到0.6時，在30°C條件下用ImMIPTG誘導45小時，之后離心收集菌體細胞。5)用超聲波破碎菌體細胞，功率:200-300W;處理時間:6X9sec，9sec間隔；處理后，6000rpm離心lOmin，去除不溶性細胞碎片，收集上清液；6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白SEC2-linker-SAK，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。4.權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白在制備抗腫瘤溶栓藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應用。本發(fā)明嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4或如SEQIDNO.5所示。嵌合蛋白的制備方法如下構(gòu)建嵌合基因；將嵌合基因經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)，超聲波破碎，將收集的上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白。本發(fā)明的嵌合蛋白，可使抗腫瘤和抗血栓兩種作用得以同時體現(xiàn)。文檔編號C12N15/62GK101805408SQ20101013004公開日2010年8月18日申請日期2010年3月23日優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日發(fā)明者戴有金,胡靜,胡風慶申請人:遼寧大學