專利名稱：：馬立克氏病抗性純合基因型雞的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物學(xué)領(lǐng)域，具體是馬立克氏病抗性純合基因型雞的檢測方法。
背景技術(shù)：
：以前選育抗病品系主要用攻毒幸存者的繁殖或/和后裔測定。經(jīng)典的例子是Cornell于1968采用該法進(jìn)行多代選擇，在第4代得到了主要用于科學(xué)研究的康乃爾MD抗病系和易感系。這些方法最簡單，缺點(diǎn)是需要的基礎(chǔ)群數(shù)量大，專門的攻毒環(huán)境，以及繁瑣的后裔測定，育種成本高。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種馬立克氏病抗性純合基因型雞的檢測方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是如下。馬立克氏病抗性純合基因型雞的檢測方法是采用PCR-RFLP技術(shù)，對MDV-1攻毒后的99羽霞煙雞BLB2基因第2外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行AluI、CaiI、CfrI、HinlI、HinfI和RsaI限制性內(nèi)切酶酶切分析，利用對這6個位點(diǎn)酶切分析初步獲得BLB2等位基因純合型雞只7羽；建立擴(kuò)增BF2基因的PCR方法，并通過對獲得的7羽純合雞BLB2與BF2基因測序，最終獲得BLB2/BF2等位基因純合型雞只6羽；結(jié)合攻毒結(jié)果，認(rèn)定其中MD抗性個體4羽，操作步驟如下1)雞攻毒試驗(yàn)攻毒病毒材料的準(zhǔn)備取MDV-1感染的鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，每羽0.3mL腹腔注射10羽1日齡健康雞，隔離飼養(yǎng)至1月齡左右時，翼下采集抗凝血，分離雞外周血淋巴白細(xì)胞(PBLs)，利用禽腫瘤病三重PCR反應(yīng)鑒別診斷技術(shù)進(jìn)行檢測，具體如下，MDV引物為上游引物5'TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3'，下游引物5，GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC3'，REV引物為上游引物5'AAGTAAGGTGGTACGATCGTC3'，下游引物5'CTGCTTCATTCAGGTGTTCGCAAT3'，ALV引物為上游引物5'CATACTGGAGCCAATGGTT3'，下游引物5'AATGTTGTACCGAAGTACT3';引物比例為MDV:REV:ALV=1:2:l;PCR反應(yīng)體系IOXPCRbuffer5iiL、25mMMgCL25iiL、10mMdNTPliiL、25pM上、下游引物各1iiL、Taq酶1.5U、DNA模板5iiL，滅菌三蒸水補(bǔ)足50iiL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95t:預(yù)變性lmin;35個循環(huán)94。C變性lmin、55t:退火lmin、72t:延伸lmin;72"后延伸8min;產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果只有大小為317bp片斷時，可確認(rèn)MDV-l單一感染，采集雞翅靜脈抗凝血作為攻毒材料；雞攻毒試驗(yàn)7日齡時取經(jīng)病毒蝕斑計(jì)數(shù)含2500PFU的MDV-1，以0.4ml/羽腹腔注射所有試驗(yàn)雞，至13周齡結(jié)束實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)雞按常規(guī)方法分別隔離飼養(yǎng)并做常見疾病的防治工作，記錄攻毒后死亡雞及存活雞的腫瘤發(fā)生及其檢測結(jié)果。2)雞PBLs的采集與分離4于攻毒后21天每羽2.02.5mL采集雞血，分離PBLs，抽提DNA，于-2(TC保存?zhèn)溆?。PBLs分離方法采集雞翅靜脈抗凝血約1.Oml，加入含O.5ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，1，500r/min離心810分鐘后，血液被分成數(shù)層，小心吸出分離液面的淺黃色層，即為所需的PBLs。3)試驗(yàn)雞MD的確診用傳統(tǒng)的酚/氯仿DNA抽提方法提取雞PBLs、羽囊、肝臟、脾臟和腎臟等內(nèi)臟器官組織以及MDV-1細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA，經(jīng)禽腫瘤病三重PCR診斷技術(shù)檢測只有大小為317bp片斷時，可確認(rèn)MDV-1單一感染。4)霞煙雞BLB2基因的PCR擴(kuò)增合成用于擴(kuò)增BLB2基因第2外顯子的引物上游弓|物火5'CAGCGTTCTTCTTCTGCGGT3'，下游引物為5'TCACCTTGGGCTCCACTGCG3'，擴(kuò)增片段應(yīng)為374bp;PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer5iiL、80X甘油4iiL、二甲基亞砜2iiL、10mMd證liiL、25pM上、下游引物各1PL、Taq酶1.5U、DNA模板5iiL，滅菌三蒸水補(bǔ)足50iiL;反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95。C預(yù)變性lmin，35個循環(huán)(94。C變性30s、53。C退火30s、72。C延伸30s)，72。C后延伸8min;產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果應(yīng)只有大小為374bp片斷一條；5)PCR產(chǎn)物的酶切分析PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶Alu1、Cai1、Cfr1、Hinl1、HinfI和Rsal進(jìn)行酶切處理。反應(yīng)體系10XbufferlyL，PCR產(chǎn)物5iiL，限制性內(nèi)切酶均為5U，雙蒸水補(bǔ)足10iiL。將樣品混勻后離心，37t:水浴消化過夜，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，分析酶切結(jié)果并利用表3得到純合基因型組合的雞；6)BLB2等位基因純合型雞只的確定對在這6個酶切位點(diǎn)所觀測的純合基因型組合的雞只進(jìn)行BLB2基因的克隆、序列測定。用2X的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，將目的帶切下后用DNA純化回收試劑盒純化回收；除對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序外，并將同一個樣品的2次獨(dú)立擴(kuò)增、純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒作為測序模板，每一個克隆最少挑取5個克隆子分別測序。7)BLB2基因序列同源性檢索鑒定與比較分析通過美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站的BLAST軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定所獲得的DNA序列。用DNAstar軟件對等位基因第2外顯子核苷酸序列和所編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，所引用的GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLB2基因序列來自白來航雞3個不同單倍型MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B"，抗性純合基因型組合雞的BLB2基因應(yīng)與中等MD抗性B6單倍型核苷酸或MD抗性B21單倍型核苷酸同源性較高，而易感抗性純合基因型組合雞的BLB2基因應(yīng)與MD易感型B19單倍型核苷酸同源性較高。8)BF2等位基因純合型雞只的確定合成上游引物為5'GCAGAGCTCCATACCCTGCGGTA3'，下游弓|物為5'TCTCCTGCCCAGCTCAGCCTT3'，用于擴(kuò)增BF2基因第2內(nèi)含子，第2外顯子，第3內(nèi)含子。用1.5%的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，切下目的帶并用試劑盒純化回收，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，并將同一個樣品的2次獨(dú)立擴(kuò)增、純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHsCi感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒測序，每一個克隆最少挑取5個克隆子分別測序；PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer5iiL、80X甘油4iiL、二甲基亞砜2iiL、10mMdNTPliiL、25pM上、下游引物各1PL、Taq酶1.5U、DNA模板5iiL，滅菌三蒸水補(bǔ)足50iiL;反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95。C預(yù)變性lmin，35個循環(huán)(94。C變性30s、53。C退火15s、72。C延伸60s)，72。C后延伸8min。產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖擬膠電泳，擬膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果應(yīng)只有大小為765bp片斷一條。9)BF2基因序列同源性檢索鑒定與比較分析用經(jīng)過我們序列測定的BF2DNA序列在美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站的BLAST軟件上搜索同源序列，以鑒定所獲得的BF2基因；使用DNAstar軟件對我們獲得的BF2等位基因和其它不同單倍型的第2外顯子、第3內(nèi)含子核苷酸序列進(jìn)行比對分析，所引用的GenBank數(shù)據(jù)庫中的BF2基因序列來自白來航雞3個不同單倍型MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B2;抗性純合基因型組合雞的BF2基因應(yīng)與中等MD抗性B6單倍型核苷酸或MD抗性B21單倍型核苷酸同源性較高，而易感抗性純合基因型組合雞的應(yīng)與MD易感型B19單倍型核苷酸同源性較高。10)結(jié)合MDV-1攻毒結(jié)果及BLB2和BF2基因測序結(jié)果確定馬立克氏病抗性純合基因型雞對由BLB2和BF2基因序列測定得到BLB2和BF2純合基因型雞只，結(jié)合它們攻毒后的發(fā)病情況，確定抗性純合基因型雞只。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較的益效是雞馬立克氏病是危害養(yǎng)禽業(yè)的三種主要疾病之一，MDV存在免疫抑制的危害，結(jié)果導(dǎo)致機(jī)體抵抗力以及對其它疫苗的免疫反應(yīng)性下降，極易并發(fā)或繼發(fā)感染其它病原，造成更大的損失。本專利所建立的方法能檢測到MD抗性純合基因型雞，并以其為種雞來繁殖MD抗性雞，這對從遺傳素質(zhì)上做好MD及相關(guān)免疫抑制性疾病的預(yù)防和控制具有極其可觀的經(jīng)濟(jì)效益。圖1是多重PCR檢測YL040920/C6株感染的DEF和感染/非感染雞的不同組織樣品圖。圖中(A)M:DNA標(biāo)準(zhǔn);1:MDV(317bp)，REV(291bp)和ALV(220bp)的陽性對照;2:CVI988(449bp，317bp，185bp)的陽性對照。(B)M:DNA標(biāo)準(zhǔn);1:非感染雞的脾臟;2:感染MDV-1的DEFs;3，4，5，6，7:感染雞的PBLs、羽囊、肝臟、脾臟和腎臟；8:陰性對照。圖2是PCR擴(kuò)增霞煙雞的BLB2基因圖。圖中1.18是DNA標(biāo)準(zhǔn)；2_17是部分樣品圖3是BLB2基因擴(kuò)增片段在Alu1、Cai1、Cfr1、Hinl1、HinfI和RsaI酶切位點(diǎn)的PCR-RFLP基因型電泳檢測圖。圖4是BF2基因重組質(zhì)粒的PCR鑒定和酶切鑒定圖。圖中M:100bpDNA標(biāo)準(zhǔn)；1:重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物(765bp);2:陰性對照；3:重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；4:重組質(zhì)粒。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。但必實(shí)施例1.雞攻毒試驗(yàn)結(jié)果按
發(fā)明內(nèi)容中雞攻毒試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)，攻毒后13周試驗(yàn)結(jié)束，MD抗性霞煙雞存活14羽，普通霞煙雞存活9羽(表1)，存活雞只中MD抗性雞腫瘤發(fā)生個數(shù)遠(yuǎn)少于普通霞煙雞，從而獲得了MD抗性與易感顯著差異的個體。表1.攻毒后試驗(yàn)雞腫瘤有無、死亡及存活情況組別存活、無腫瘤存活、有腫瘤死亡、無腫瘤死亡、有腫瘤Y271027K1221821注K群表示MD抗性雞(C、D組)，Y群表示普通霞煙雞(A、B組)；表中單位為"羽"。A、B、C、D四組雞腫瘤死亡率、腫瘤發(fā)生率等情況如表2所示。經(jīng)t檢驗(yàn)表明MD抗性雞腫瘤死亡率(43.38%)顯著低于(p<0.05)普通霞煙雞(65.15%)，腫瘤發(fā)生率(47.15%)差異極顯著低于(p<0.01)普通霞煙雞(73.86%)，說明這些實(shí)驗(yàn)動物可以作為MD抗性基因研究的主要素材。表2.攻毒后各組試驗(yàn)雞的腫瘤發(fā)生、死亡、細(xì)菌分離情況(表中單位為"羽")組別雞只數(shù)MD(MD)死亡數(shù)死亡率％MD(MD)腫瘤雞只數(shù)腫瘤發(fā)生率％細(xì)菌陽性雞A241666.671875.008B221463.631672.728C271244.441348.1410D261142.311246.15132.雞外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)的采集與分離MDV-1攻毒后于21天無菌采集并分離的全部試驗(yàn)雞PBLs為材料。3.試驗(yàn)雞MD的確診試驗(yàn)雞MD的確診結(jié)果對雞PBLs、羽囊、病雞肝臟、脾臟和腎臟等內(nèi)臟器官組織以及YL040920/C6DEF細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA采用三重PCR方法檢測MDV、REV和ALV。結(jié)果顯示，脾臟和腎臟MDV陽性率達(dá)到100%，肝臟為96.18X，而在全部的檢測樣品中均未發(fā)現(xiàn)ALV、REV的感染，MDV、REV、ALV及疫苗株CVI988陽性對照見圖1(A)，部分試驗(yàn)雞的三重PCR檢測結(jié)果見圖1(B)。4.霞煙雞BLB2基因的PCR擴(kuò)增霞煙雞BLB2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果用建立的擴(kuò)增BLB2基因的PCR方法從霞煙雞PBLs的DNA樣品中均能擴(kuò)增到大小7為374bp的特異性目的片段如圖2所示。對120個個體進(jìn)行PCR-RFLP分型后，對從中所篩選出的8個個體進(jìn)行克隆、測序和同源性比較表明，引物序列與MHCBLB2基因(GenBank收錄號M29763)的錨定序列完全一致；該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物對應(yīng)于目的基因第1內(nèi)含子的3個核苷酸、第2外顯子的第1127至1396位核苷酸、第2內(nèi)含子的第1396至1482位核苷酸和第3外顯子的15個核苷酸序列，長度為374bp。此表明該引物特異地?cái)U(kuò)增了BLB2基因的目的片段。5.PCR產(chǎn)物的酶切分析霞煙雞BLB2基因的PCR擴(kuò)增及PCR-RFLP分析結(jié)果從霞煙雞PBLs的DNA樣品中擴(kuò)增到374bp的片段，測序和同源性比較表明，所擴(kuò)增片段為BLB2基因片段；用限制性內(nèi)切酶Alu1、Cai1、Cfr1、Hinl1、HinfI和RsaI對該片段進(jìn)行酶切，基因型檢測結(jié)果見圖3;利用DNAstar軟件預(yù)測BLB2基因(來自GenBank)酶切后的帶型及本試驗(yàn)中檢測到的帶型見表3。5.PCR產(chǎn)物的酶切分析霞煙雞BLB2基因的PCR擴(kuò)增及PCR-RFLP分析結(jié)果從霞煙雞PBLs的DNA樣品中擴(kuò)增到374bp的片段，測序和同源性比較表明，所擴(kuò)增片段為BLB2基因片段；用限制性內(nèi)切酶Alu1、Cai1、Cfr1、HinlI、HinfI和RsaI對該片段進(jìn)行酶切，基因型檢測結(jié)果見圖3;利用DNAstar軟件預(yù)測BLB2基因(來自GenBank)酶切后的帶型及本試驗(yàn)中檢測到的帶型見表3。表3.BLB2基因片段PCR-RFLP基因型電泳分型8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根據(jù)預(yù)測結(jié)果(表3)及檢測結(jié)果(圖3)，初步確認(rèn)在被檢測的群體中有7羽B(yǎng)LB2等位基因純合型雞只(表4)。表4.在6個限制性酶切位點(diǎn)檢測出的7羽純合基因型組合雞只觀測到的PCR-RFLP基因型C#I戰(zhàn)WIfoaIA5gbA6abbbAfbabB21gbabc23fba3"bD8abbbCbD12fb3b6.BLB2等位基因純合型雞只的確定經(jīng)DNA序列后確定6羽B(yǎng)LB2等位基因純合型雞只，分別是A5、An、B21、C23、D8和7.BLB2基因序列同源性檢索鑒定與比較分析純合基因型雞只的BLB2基因核甘酸序列的比較分析結(jié)果領(lǐng)U定的BLB2基因核甘酸序列與下載的參考序列的比對，同源性比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在6羽B(yǎng)LB2等位基因純合型霞煙雞只中MD抗性個體AU、C23、D12、K8的核苷酸同源性高達(dá)100%，與中等MD抗性B6單倍型核苷酸同源性高達(dá)98.9%;MD抗性個體Au(與C23、D12相同)與易感個體ApBa的核苷酸同源性僅分別為91.4%和93.3%;易感個體~、821間的核甘酸同源性達(dá)95.5%，與白來航雞的819單倍型(MD易感型)核苷酸同源性較高，分別達(dá)96.3%和94.8%。8.BF2等位基因純合型雞只的確定霞煙雞BF2基因的PCR擴(kuò)增及其重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果用建立的擴(kuò)增BF2基因的PCR方法從霞煙雞PBLs的DNA樣品中均能擴(kuò)增到大小為765bp的特異性目的片段，pGM-T-BF2重組質(zhì)粒PCR和EcoRI酶切結(jié)果見圖4;對質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測定后，插入DNA片段的序列經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比較分析表明，所擴(kuò)增片段為BF2基因片段，說明pGM-T-BF2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。9.BF2基因序列同源性檢索鑒定與比較分析純合基因型雞只的BF2基因核甘酸序列的比較分析結(jié)果領(lǐng)淀的BF2基因核甘酸序列與下載的參考序列的比對，同源性比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在6羽B(yǎng)F2等位基因純合基因型霞煙雞只中MD抗性個體An、C23、D12的核苷酸同源性高達(dá)100%，與白來航雞86單倍型(中等MD抗性型)核苷酸同源性較高，達(dá)到93.4%。MD抗性個體D8與MD抗性單倍型B21核苷酸同源性較高達(dá)93.8%;普通個體A5、B21間的核甘酸同源性達(dá)92.5%，并且與MD易感單倍型B19核苷酸同源性分別達(dá)91.6%和92.9%。10.結(jié)合MDV-1攻毒結(jié)果及BLB2和BF2基因測序結(jié)果確定抗性純合基因型雞只對7羽在上面6個酶切位點(diǎn)所觀測的純合基因型組合的雞只進(jìn)行BLB2基因的克隆、序列測定，測序結(jié)果為GenBank登錄號(A5_EU502870，B21_EU579527，D^(與An，C23相同)-EU579528，D8_EU579529);并對7羽在上面6個酶切位點(diǎn)所觀測的純合基因型組10合的雞只進(jìn)行BF2基因的克隆、序列測定，測序結(jié)果為(GenBank登錄號A5_EU620713，B21-EU620714，D12(與A、C23相同)_EU620715和D8_EU581948);測序結(jié)果表明這7羽中僅有6羽為BLB2/BF2等位基因純合基因型雞只，代號分別為A5、An、B21、C23、D8和D12，結(jié)合這6羽B(yǎng)LB2/BF2等位基因純合型雞只攻毒后的發(fā)病情況(表5)，我們推斷An、C23、D12和D8為MD抗性個體。表5.6羽純合基因型雞只攻毒后的發(fā)病情況<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求馬立克氏病抗性純合基因型雞的檢測方法，其特征在于，采用PCR-RFLP技術(shù)，對MDV-1攻毒后的99羽霞煙雞BLB2基因第2外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行AluI、CaiI、CfrI、Hin1I、HinfI和RsaI限制性內(nèi)切酶酶切分析，利用對這6個位點(diǎn)酶切分析初步獲得BLB2等位基因純合型雞只7羽；建立擴(kuò)增BF2基因的PCR方法，并通過對獲得的7羽純合雞BLB2與BF2基因測序，最終獲得BLB2/BF2等位基因純合型雞只6羽；結(jié)合攻毒結(jié)果，認(rèn)定其中MD抗性個體4羽，操作步驟如下1)雞攻毒試驗(yàn)攻毒病毒材料的準(zhǔn)備取MDV-1感染的鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，每羽0.3mL腹腔注射10羽1日齡健康雞，隔離飼養(yǎng)至1月齡左右時，翼下采集抗凝血，分離雞外周血淋巴白細(xì)胞(PBLs)，利用禽腫瘤病三重PCR反應(yīng)鑒別診斷技術(shù)進(jìn)行檢測，具體如下，MDV引物為上游引物5’TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3’，下游引物5’GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC3’，REV引物為上游引物5’AAGTAAGGTGGTACGATCGTC3’，下游引物5’CTGCTTCATTCAGGTGTTCGCAAT3’，ALV引物為上游引物5’CATACTGGAGCCAATGGTT3’，下游引物5’AATGTTGTACCGAAGTACT3’；引物比例為MDV∶REV∶ALV＝1∶2∶1；PCR反應(yīng)體系10×PCRbuffer5μL、25mMMgCL25μL、10mMdNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，滅菌三蒸水補(bǔ)足50μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性1min；35個循環(huán)94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min；72℃后延伸8min；產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果只有大小為317bp片斷時，可確認(rèn)MDV-1單一感染，采集雞翅靜脈抗凝血作為攻毒材料；雞攻毒試驗(yàn)7日齡時取經(jīng)病毒蝕斑計(jì)數(shù)含2500PFU的MDV-1，以0.4ml/羽腹腔注射所有試驗(yàn)雞，至13周齡結(jié)束實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)雞按常規(guī)方法分別隔離飼養(yǎng)并做常見疾病的防治工作，記錄攻毒后死亡雞及存活雞的腫瘤發(fā)生及其檢測結(jié)果；2)雞PBLs的采集與分離于攻毒后21天每羽2.0～2.5mL采集雞血，分離PBLs，抽提DNA，于-20℃保存?zhèn)溆茫籔BLs分離方法采集雞翅靜脈抗凝血約1.0ml，加入含0.5ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，1,500r/min離心8～10分鐘后，血液被分成數(shù)層，小心吸出分離液面的淺黃色層，即為所需的PBLs；3)試驗(yàn)雞MD的確診用傳統(tǒng)的酚/氯仿DNA抽提方法提取雞PBLs、羽囊、肝臟、脾臟和腎臟等內(nèi)臟器官組織以及MDV-1細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA，經(jīng)禽腫瘤病三重PCR診斷技術(shù)檢測只有大小為317bp片斷時，可確認(rèn)MDV-1單一感染；4)霞煙雞BLB2基因的PCR擴(kuò)增合成用于擴(kuò)增BLB2基因第2外顯子的引物上游引物為5’CAGCGTTCTTCTTCTGCGGT3’，下游引物為5’TCACCTTGGGCTCCACTGCG3’，擴(kuò)增片段應(yīng)為374bp；PCR反應(yīng)體系10×PCRbuffer5μL、80％甘油4μL、二甲基亞砜2μL、10mMdNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，滅菌三蒸水補(bǔ)足50μL；反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性1min，35個循環(huán)94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，72℃后延伸8min；產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果應(yīng)只有大小為374bp片斷一條；5)PCR產(chǎn)物的酶切分析PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶AluI、CaiI、CfrI、Hin1I、HinfI和RsaI進(jìn)行酶切處理；反應(yīng)體系10×buffer1μL，PCR產(chǎn)物5μL，限制性內(nèi)切酶均為5U，雙蒸水補(bǔ)足10μL，將樣品混勻后離心，37℃水浴消化過夜，用2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，分析酶切結(jié)果并利用表3得到純合基因型組合的雞；6)BLB2等位基因純合型雞只的確定對在這6個酶切位點(diǎn)所觀測的純合基因型組合的雞只進(jìn)行BLB2基因的克隆、序列測定，用2％的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，將目的帶切下后用DNA純化回收試劑盒純化回收；除對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序外，并將同一個樣品的2次獨(dú)立擴(kuò)增、純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒作為測序模板，每一個克隆最少挑取5個克隆子分別測序；7)BLB2基因序列同源性檢索鑒定與比較分析通過美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站的BLAST軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定所獲得的DNA序列，用DNAstar軟件對等位基因第2外顯子核苷酸序列和所編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，所引用的GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLB2基因序列來自白來航雞3個不同單倍型MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B21，抗性純合基因型組合雞的BLB2基因應(yīng)與中等MD抗性B6單倍型核苷酸或MD抗性B21單倍型核苷酸同源性較高，而易感抗性純合基因型組合雞的BLB2基因應(yīng)與MD易感型B19單倍型核苷酸同源性較高；8)BF2等位基因純合型雞只的確定合成上游引物為5’GCAGAGCTCCATACCCTGCGGTA3’，下游引物為5’TCTCCTGCCCAGCTCAGCCTT3’，用于擴(kuò)增BF2基因第2內(nèi)含子，第2外顯子，第3內(nèi)含子；用1.5％的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，切下目的帶并用試劑盒純化回收，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，并將同一個樣品的2次獨(dú)立擴(kuò)增、純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH6α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒測序，每一個克隆最少挑取5個克隆子分別測序；PCR反應(yīng)體系10×PCRbuffer5μL、80％甘油4μL、二甲基亞砜2μL、10mMdNTP1μL、25pM上、下游引物各1μL、Taq酶1.5U、DNA模板5μL，滅菌三蒸水補(bǔ)足50μL；反應(yīng)循環(huán)參數(shù)95℃預(yù)變性1min，35個循環(huán)94℃變性30s、53℃退火15s、72℃延伸60s，72℃后延伸8min；產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果應(yīng)只有大小為765bp片斷一條；9)BF2基因序列同源性檢索鑒定與比較分析用經(jīng)過我們序列測定的BF2DNA序列在美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站的BLAST軟件上搜索同源序列，以鑒定所獲得的BF2基因；使用DNAstar軟件對我們獲得的BF2等位基因和其它不同單倍型的第2外顯子、第3內(nèi)含子核苷酸序列進(jìn)行比對分析，所引用的GenBank數(shù)據(jù)庫中的BF2基因序列來自白來航雞3個不同單倍型MD中等抗性型B6、MD易感型B19、MD抗性型B2；抗性純合基因型組合雞的BF2基因應(yīng)與中等MD抗性B6倍型核苷酸或MD抗性B21單倍型核苷酸同源性較高，而易感抗性純合基因型組合雞的應(yīng)與MD易感型B19單倍型核苷酸同源性較高；10)結(jié)合MDV-1攻毒結(jié)果及BLB2和BF2基因測序結(jié)果確定馬立克氏病抗性純合基因型雞對由BLB2和BF2基因序列測定得到BLB2和BF2純合基因型雞只，結(jié)合它們攻毒后的發(fā)病情況，確定抗性純合基因型雞只。全文摘要本發(fā)明公開了馬立克氏病抗性純合基因型雞的檢測方法。采用PCR-RFLP技術(shù)，對MDV-1攻毒的99羽霞煙雞BLB2基因第2外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行AluI、CaiI、CfrI、Hin1I、HinfI和RsaI限制性內(nèi)切酶酶切分析，對這6個位點(diǎn)酶切分析初步獲得BLB2等位基因純合型雞只7羽；通過對這7羽純合雞BLB2與BF2基因測序，最終獲得BLB2/BF2等位基因純合型雞只6羽；結(jié)合攻毒結(jié)果，認(rèn)定其中MD抗性個體4羽。本發(fā)明建立的方法能檢測到MD抗性純合基因型雞，并以其為種雞來繁殖MD抗性雞，這對從遺傳素質(zhì)上做好MD及相關(guān)免疫抑制性疾病的預(yù)防和控制具有極其可觀的經(jīng)濟(jì)效益。文檔編號C12Q1/68GK101792801SQ20101010287公開日2010年8月4日申請日期2010年1月29日優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日發(fā)明者李婭,趙子軼,金元昌,韋信賢,韋平申請人:廣西大學(xué)