專(zhuān)利名稱(chēng)：使用酶的蛋白質(zhì)的改性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[相關(guān)專(zhuān)利的記載]本發(fā)明基于日本國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)日本特愿2008-066765號(hào)(2008年3月14日申請(qǐng)) 及特愿2008-294890號(hào)(2008年11月18日申請(qǐng))的優(yōu)先權(quán)主張，該申請(qǐng)中的全部記載內(nèi) 容作為引用包含于本說(shuō)明書(shū)中。本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的改性方法，其特征在于使用作為修飾蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺 殘基的酶的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶兩者發(fā)揮作用而進(jìn)行2種酶反應(yīng)。此外，本 發(fā)明也涉及含有使用此方法的改性蛋白質(zhì)的食品、以特定的比例含有蛋白谷氨酰胺酶及 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶兩者的蛋白質(zhì)改性用酶制劑、發(fā)現(xiàn)向底物蛋白質(zhì)中添加蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶 和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的適當(dāng)添加量比的方法等。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)TG)為催化蛋白質(zhì)及肽中的谷氨酰胺殘基的Y-羧酰胺 基和伯胺之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶。TG作用于作為?；荏w的蛋白質(zhì)中的賴(lài)氨酸殘基的 ε-氨基，引起蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合反應(yīng)。此外，在伯胺不存在的情況下，水可作為酰基受 體而發(fā)揮作用，而催化將谷氨酰胺殘基轉(zhuǎn)化為谷氨酸殘基的脫酰胺反應(yīng)。在食品中應(yīng)用 時(shí)，大部分是通過(guò)蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng)的，目前利用蛋白質(zhì)的凝膠形成性賦予或提高，在 不加熱情況下的蛋白質(zhì)的凝膠化、粘著等性質(zhì)，開(kāi)發(fā)應(yīng)用于魚(yú)餅、火腿、香腸、面類(lèi)、 豆腐、面包等種種用途的TG制劑。另一方面，蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PG)，為對(duì)蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺殘基的 酰胺基具有脫酰胺作用的酶。其詳細(xì)記述如專(zhuān)利文獻(xiàn)1、專(zhuān)利文獻(xiàn)2、非專(zhuān)利文獻(xiàn)1等的 公開(kāi)所示。依據(jù)這些文獻(xiàn)，PG直接作用于蛋白質(zhì)中的酰胺基，因而將蛋白質(zhì)中的谷氨酰 胺殘基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為谷氨酸殘基，生成羧基，因而引起蛋白質(zhì)的負(fù)電荷的增加、靜電斥力的 上升、等電點(diǎn)的降低、水合力的增加等。其結(jié)果是，引起了蛋白質(zhì)的溶解性、水分散性 的增加，乳化力和乳化穩(wěn)定性的上升等種種機(jī)能特性的上升，而期待蛋白質(zhì)的用途得到 擴(kuò)大。因此，已知TG和PG均為產(chǎn)業(yè)上有用的酶，但是至于在這些酶合用的情況下得 到新的附加效果的嘗試，卻基本無(wú)具體實(shí)例的報(bào)道。相反，在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中顯示了作為 TG反應(yīng)控制劑的PG利用實(shí)例，非專(zhuān)利文獻(xiàn)2中也記載有在PG、TG共存的情況下，TG 引起的交聯(lián)反應(yīng)不能發(fā)生。故就有關(guān)TG和PG的反應(yīng)性的差異更詳細(xì)地描述目前的認(rèn) 識(shí)。兩種酶在其底物蛋 白質(zhì)中的靶標(biāo)均為相同的谷氨酰胺殘基。但是，和TG相比，PG 對(duì)蛋白質(zhì)中的各個(gè)谷氨酰胺殘基的底物特異性更廣。認(rèn)為這是因?yàn)?，在TG的情況下，除 了谷氨酰胺殘基以外必須存在賴(lài)氨酸殘基的ε-氨基，而與此相對(duì)，在PG的情況下，除 了谷氨酰胺殘基以外，只需要在反應(yīng)環(huán)境中存在豐富的水即可。例如，對(duì)酪蛋白中的谷 氨酰胺殘基的反應(yīng)性來(lái)說(shuō)，從Km值、kcat值來(lái)看，PG比TG具有壓倒性的高催化效率， 在兩者共存的情況下，PG反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行，脫酰胺化了的谷氨酰胺殘基不能作為T(mén)G的底物，不能進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。實(shí)際上，據(jù)在使用TG的酪蛋白的交聯(lián)高分子化反應(yīng)的途中添加 PG的實(shí)驗(yàn)顯示，結(jié)果是酪蛋白的高分子化在添加的同時(shí)停止。此外，也確認(rèn)了用PG事 先進(jìn)行充分脫酰胺化的酪蛋白已經(jīng)不能作為T(mén)G的底物，即不能進(jìn)行交聯(lián)高分子化(非專(zhuān) 利文獻(xiàn)2)。此外，Y.S.Gu等就本酶對(duì)α-乳清蛋白的反應(yīng)性進(jìn)行了調(diào)查，報(bào)告稱(chēng)6個(gè)谷 氨酰胺殘基中有4個(gè)進(jìn)行了脫酰胺化(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。另一方面，放線菌TG僅能作用 于作為上述4個(gè)中的1個(gè)的谷氨酰胺54，因此可認(rèn)為PG的底物特異性廣于TG。此外， 在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中，利用PG對(duì)谷氨酰胺殘基的高反應(yīng)性，能夠在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)使TG反應(yīng) 停止，列舉了 PG有代替不適于添加入食品中的EDTA和氯化銨等一般公知的TG阻斷劑 的可能性。
然而，現(xiàn)在為止尚無(wú)舉例根據(jù)因PG導(dǎo)致TG反應(yīng)停止以外的觀點(diǎn)而將兩者合用 的方法的提案。不僅如此，至于將TG和PG兩者作用于底物蛋白質(zhì)而得到目的的效果的 條件，更詳細(xì)而言，TG反應(yīng)不因PG而停止，在有PG共存的條件下也不損害TG反應(yīng)及 其改性效果的條件，僅從目前的認(rèn)識(shí)是不能得知的。此外，對(duì)于各種底物蛋白質(zhì)，使TG 和PG在何種比例下作用的情況下，能夠顯示何種效果等，顯示用于有效地使用兩酶的具 體方法的實(shí)例也不存在，故應(yīng)該說(shuō)是全新的嘗試，如要進(jìn)行TG、PG引起的改性蛋白質(zhì) 制品的開(kāi)發(fā)，必須依照各用途摸索最適的反應(yīng)條件是目前的現(xiàn)狀。此外，由于酶反應(yīng)因處理時(shí)間、溫度、酶添加量、底物的種類(lèi)、狀態(tài)、底物特 異性等種種因素，其反應(yīng)量及其效果的程度不同，故在共同的底物中使用2種酶并不容 易，開(kāi)發(fā)者、加工業(yè)者為依照用途決定所需要的食品的制造條件，而需耗費(fèi)大量的時(shí)間 和勞力。究其原因，是因?yàn)槊阜磻?yīng)依處理時(shí)間、溫度、酶添加量、底物的種類(lèi)、狀態(tài)、 底物特異性等種種因素的不同而引起其反應(yīng)量及其效果的程度不同，除此之外，若要使 兩種酶同時(shí)發(fā)揮作用，必須對(duì)所有的組合進(jìn)行研究。因此要求開(kāi)發(fā)自如使用具有共同底 物的2種酶的方法。不過(guò)，現(xiàn)在為止，作為對(duì)TG的底物特異性進(jìn)行研究的方法，已知有使用NMR 的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。也就是說(shuō)，在15N標(biāo)記的氯化銨存在下使任意蛋白質(zhì)與TG作用， 將作為T(mén)G的底物的谷氨酰胺殘基的羧酰胺氮用15N標(biāo)記的蛋白質(zhì)用NMR進(jìn)行觀測(cè)，而 追蹤TG的反應(yīng)的方法。若使用這種方法，可以使用蛋白質(zhì)底物同時(shí)解析反應(yīng)性和底物 特異性。然而，在專(zhuān)利文獻(xiàn)3中，并未記載PG反應(yīng)的谷氨酰胺殘基的羧酰胺氮能用15N 進(jìn)行標(biāo)記。專(zhuān)利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)2000-50887號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)2001-218590號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)2002-332295號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 Yamaguchi 等、Eur.J.Biochem.Vol.268，2001，1410-1412 頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 食品酶化學(xué)的最新技術(shù)和應(yīng)用-食品蛋白混合物的展望-(CMC 出版)、146 153頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3: Y.S.Gu 等、J.Agric.Food Chem.Vol.49，2001，5999-6005 頁(yè)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題
上述專(zhuān)利文獻(xiàn)1 3及非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 3的全部公開(kāi)內(nèi)容作為引用而記載于本說(shuō) 明書(shū)中。以下分析是依照本發(fā)明的觀點(diǎn)得出的。本發(fā)明的目的在于提供使蛋白谷氨酰胺酶及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶兩者作用于蛋白質(zhì)而 使蛋白質(zhì)改性的方法，提供含有使用兩酶進(jìn)行改性的蛋白質(zhì)的食品，提供含有兩酶的蛋 白質(zhì)改性用酶制劑，提供簡(jiǎn)便地發(fā)現(xiàn)蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的適當(dāng)添加量比的 方法。解決課題的手段本發(fā)明者們針對(duì)上述情況進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在為止，在PG存在 的情況下TG不能發(fā)揮作用，難于得到PG、TG的合用效果，但在特定條件下，在PG和 TG共存的情況下，發(fā)現(xiàn)兩酶對(duì)底物蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，可得到兩酶的合用效果。此外，發(fā) 現(xiàn)了以下事實(shí)PG和TG—樣，除了可以催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的脫酰胺化之外， 也可以催化和銨鹽的交換反應(yīng)。也就是說(shuō)，TG或PG所反應(yīng)的谷氨酰胺殘基的羧酰胺氮 可以用15N標(biāo)記。因此發(fā)現(xiàn)，檢出15N標(biāo)記的檢測(cè)法，例如若進(jìn)行1H-15N HSQC測(cè)定， 可由NMR信號(hào)強(qiáng)度估算15N標(biāo)記率，可獲知各反應(yīng)性的差異。此外，還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于各種 蛋白質(zhì)，TG和PG的存在比例與各自的NMR信號(hào)強(qiáng)度比例具有良好的相關(guān)性。此外還 發(fā)現(xiàn)了在以PG對(duì)TG的信號(hào)強(qiáng)度比例(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PG/TG信號(hào)強(qiáng)度比)在0.2 3.0的范 圍的PG/TG的酶重量比或活性比是如下情況的條件TG反應(yīng)不因PG而停止，即使在 PG共存的條件下也不損害TG反應(yīng)及其改性效果。即，在15N標(biāo)記銨鹽存在的情況下， 使TG或PG分別作用于各種底物，使用NMR比較兩者的底物特異性，能夠簡(jiǎn)便地發(fā)現(xiàn) 得到兩酶合用效果的條件。本發(fā)明人等不僅發(fā)現(xiàn)使PG和TG同時(shí)作用的優(yōu)點(diǎn)，而且成功 制定現(xiàn)實(shí)地且容易地決定該條件的方法。也就是說(shuō)，本發(fā)明如下所述。(1)蛋白質(zhì)的改性方法，其通過(guò)使蛋白谷氨酰胺酶及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用于蛋白質(zhì) 而使蛋白質(zhì)改性，其中，蛋白谷氨酰胺酶添加到蛋白質(zhì)中的時(shí)間和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加到 蛋白質(zhì)中的時(shí)間大致相同或者在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用于該蛋白質(zhì)之前。(2) (1)中記載的方法，其中，以活性比計(jì)，添加至蛋白質(zhì)中的蛋白谷氨酰胺酶 和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加量為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.05 3 1。(3) (1)或⑵中記載的方法，其中，以重量比計(jì)，添加至蛋白質(zhì)中的蛋白谷氨 酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加量為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.01 0.7 1。(4) (1)至(3)中任一項(xiàng)記載的改性方法，其中，以NMR信號(hào)強(qiáng)度比計(jì)，是添加 至蛋白質(zhì)中的蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加量為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺 酶=0.2 3.0 1的條件。(5) (1)至(4)中任一項(xiàng)記載的方法，其中，蛋白質(zhì)為選自乳蛋白、乳清蛋白、 大豆蛋白、小麥谷蛋白、血漿、肌肉蛋白質(zhì)、膠原及明膠的1種或2種以上的蛋白質(zhì)。(6)食品，其含有使用⑴至(5)中任一項(xiàng)記載的方法改性過(guò)的蛋白質(zhì)。(7)蛋白質(zhì)改性用酶制劑，其中，以活性比計(jì)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶蛋白谷氨酰胺酶 的摻混比例為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.05 3 1。(8)蛋白質(zhì)改性用酶制劑，其中，以重量比計(jì)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶蛋白谷氨酰胺酶 的摻混比例為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.01 0.7 1。
(9)蛋白質(zhì)改性用酶制劑，其特征在于，以NMR信號(hào)強(qiáng)度比計(jì)，是轉(zhuǎn)谷氨酰胺 酶蛋白谷氨酰胺酶的摻混比例為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.2 3.0 1的條 件。(10)蛋白質(zhì)中的蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的適當(dāng)添加量比的發(fā)現(xiàn)方法， 通過(guò)使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶分別在同位素標(biāo)記的銨鹽的存在下作用于該蛋白 質(zhì)，將該蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基的官能團(tuán)進(jìn)行同位素標(biāo)記，測(cè)定其N(xiāo)MR信號(hào)強(qiáng)度來(lái)進(jìn) 行。發(fā)明效果依據(jù)本發(fā)明，可以提供與單獨(dú)使用TG或PG的任一種酶的情況不同的蛋白質(zhì)的 改性效果，即TG和PG的合用效果，具體而言，可對(duì)受食品所含蛋白質(zhì)影響的該食品的 性質(zhì)進(jìn)行改性，其結(jié)果是能夠得到改善含有蛋白質(zhì)食品的口感(硬度、順滑性等)的效 果、能夠提供蛋白質(zhì)的新型改質(zhì)方法。此外，能夠提供含有使用這樣的改性方法而得到 的具有新型特征的蛋白質(zhì)的食品。此外，還能提供簡(jiǎn)便地發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)中使TG及PG兩 種酶共同對(duì)底物發(fā)揮作用而得到前述效果那樣的合適的條件(添加條件)的方法。附圖簡(jiǎn)述[圖IfNH4Cl存在下的α-乳清蛋白的NMR中的1HJ5N HSQC譜。(實(shí)驗(yàn)例 1)發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明使用的TG，廣泛應(yīng)用于明膠、奶酪、酸奶、豆腐、魚(yú)餅、火腿、香腸、 面類(lèi)等食品的制造和食用肉的肉質(zhì)改善中(日本特開(kāi)昭64-27471號(hào)公報(bào) <參考文獻(xiàn)1>)。 此外，也是用于熱穩(wěn)定的微膠囊的素材、固定化酶的載體的制造等、應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)上種種 的目的中的酶。TG催化蛋白質(zhì)分子中的肽鏈內(nèi)的谷氨酰胺殘基的Y-羧酰胺基的酰基轉(zhuǎn) 移反應(yīng)。若TG使蛋白質(zhì)分子中的賴(lài)氨酸殘基的氨基作為?；荏w而發(fā)揮作用，在 蛋白質(zhì)分子中及分子間形成ε-(Y-谷氨酸)_賴(lài)氨酸鍵。需要說(shuō)明的是，參考文獻(xiàn)1的 記載內(nèi)容作為引用含在本說(shuō)明書(shū)中。作為T(mén)G，有鈣非依賴(lài)性的和鈣依賴(lài)性的，均可使用于本發(fā)明中。作為前者的 實(shí)例，可列舉放線菌、枯草菌等微生物來(lái)源的(例如，參考日本特開(kāi)昭64-27471號(hào)公 報(bào)<參考文獻(xiàn)2>)。作為后者的實(shí)例，可列舉豚鼠肝臟來(lái)源的(例如，參考日本特公平 1-50382號(hào)公報(bào) <參考文獻(xiàn)3>)，人表皮角蛋白細(xì)胞TG (Phillips，M.A.等.(1990) Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，9333 < 參考文獻(xiàn) 4>)，人凝血因子 XIII(Ichinose，Α.等.(1990) Biochemistry 25，6900.<參考文獻(xiàn)5>)，卵菌等微生物來(lái)源的，牛血液、豬血液等動(dòng)物來(lái) 源的，鮭魚(yú)、真鯛等魚(yú)來(lái)源的(例如、關(guān)信夫等、“日本水產(chǎn)學(xué)會(huì)志56卷125 132頁(yè)、 1990年<考文獻(xiàn)6>)，牡蠣來(lái) 源的等。除此之外，可列舉通過(guò)基因重組而生產(chǎn)的(例如， 參考日本特開(kāi)平1-300889號(hào)公報(bào) < 參考文獻(xiàn)7>、日本特開(kāi)平6-225775號(hào)公報(bào) < 參考文 獻(xiàn)8>、日本特開(kāi)平7-23737號(hào)公報(bào) <參考文獻(xiàn)9>。)等。本發(fā)明可使用任意一種，對(duì) 其來(lái)源及制法并無(wú)限定。此外，存在因?yàn)橥凰貥?biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)而在含鈣的溶劑中的 酶反應(yīng)不佳的情況，故對(duì)于這類(lèi)蛋白質(zhì)優(yōu)選使用鈣非依賴(lài)性的TG。例如，上述微生物 來(lái)源的(MTG)(例如，參考日本特開(kāi)昭64-27471號(hào)公報(bào) <參考文獻(xiàn)10>。)等也可以滿(mǎn) 足此條件，可以認(rèn)為是在現(xiàn)階段最適合的。例如，灰橙輪絲鏈輪絲菌(Streptoverticilliumgriseocameum) IFO 12776、肉桂鏈輪絲菌肉桂亞禾中(Streptoverticillium cinnamoneumsub sp.cinnamoneum) IFO 12852,茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobaraense)IFO I38I9 等來(lái) 源的。以下有時(shí)將茂原輪枝鏈霉菌來(lái)源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶稱(chēng)為MTG。需要說(shuō)明的是，上 述參考文獻(xiàn)2 10的記載內(nèi)容作為引用含在本說(shuō)明書(shū)中。
本發(fā)明中使用的TG的活性單位依如下測(cè)定并進(jìn)行定義。即，以芐氧羰基-L-谷 氨酰甘氨酸(Z-Gln-Gly)和羥胺作為底物進(jìn)行反應(yīng)，生成的氧肟酸在三氯乙酸存在的情 況下轉(zhuǎn)換成鐵絡(luò)合物后，在525nm的吸光度下測(cè)定其量。用這樣生成的氧肟酸的量作成 校正曲線，將1分鐘內(nèi)生成1 μ摩爾的氧肟酸鹽的酶量定義為，1單位活性單位。此測(cè) 定方法的細(xì)節(jié)如已有的報(bào)告中所述(例如，參考日本特開(kāi)昭64-27471號(hào)公報(bào) <參考文獻(xiàn) 11>等。)。需要說(shuō)明的是，參考文獻(xiàn)11的記載內(nèi)容作為引用含在本說(shuō)明書(shū)中。本發(fā)明中使用的PG具有直接作用于蛋白質(zhì)的酰胺基、不伴隨切斷肽鍵及交聯(lián)蛋 白質(zhì)而脫酰胺的作用。只要具有該作用即可，對(duì)其種類(lèi)并無(wú)限定。作為這樣的酶的實(shí) 例有專(zhuān)利文獻(xiàn)1或?qū)＠墨I(xiàn)2中公開(kāi)的酶，但并不特別限定于此。PG可使用產(chǎn)生PG的 微生物的培養(yǎng)液進(jìn)行配制。PG配制中使用的微生物并無(wú)特別限定，但可示例如金黃桿 菌(Chryseobacterium)屬、黃桿菌(Flavobacterium)屬、1 急桿菌(Empedobacter)屬的微生 物。至于從微生物的培養(yǎng)液中配制PG的方法，可使用公知的蛋白質(zhì)分離、精制方法 (離心分離、UF濃縮、鹽析、使用離子交換樹(shù)脂等的各種色譜法等)。例如離心分離培養(yǎng) 液以除去菌體，隨后組合鹽析、色譜法等可獲得目的酶。在從菌體內(nèi)回收酶的情況下， 可例如將菌體通過(guò)加壓處理、超聲波處理等破碎后，和上述同樣地進(jìn)行分離、精制而獲 得目的酶。而且，也可以通過(guò)過(guò)濾、離心處理等事先從培養(yǎng)液中回收菌體后，進(jìn)行上述 一系列的工序(菌體的破碎、分離、精制)。還可以通過(guò)冷凍干燥、減壓干燥等干燥法而 使酶粉末化，此時(shí)也可使用合適的賦形劑、干燥輔劑。本發(fā)明的PG的活性單位使用對(duì)專(zhuān)利文獻(xiàn)1記載的方法進(jìn)行改良的方法，即，用 下述方法進(jìn)行測(cè)定。(1)在含有30mM Z-Gln-Gly的176mM的磷酸緩沖液(pH6.5) 100 μ 1中添加含有 PG的水溶液ΙΟμΙ，在37 °C下溫育10分鐘后，加入12% TCA溶液100 μ 1以停止反應(yīng)。 此時(shí)，使用20mM磷酸緩沖液(ρΗ6.0)進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)允姑笣舛葹?.05mg/ml。(2)離心分離(12000rpm、4°C、5分鐘)后，使用F_kit氨(Roche生產(chǎn))對(duì)上清 進(jìn)行NH3的定量。此方法如下所述。(3)在試藥II液(F-kit附件)100 μ 1中添加上清10 μ 1和0.1Μ三乙醇胺緩沖液 (ρΗ8.0) 190 μ 1，在室溫下放置5分鐘后，取100 μ 1測(cè)定340nm處的吸光度(El)。在剩 余的200 μ 1中加入1.0 μ 1的試藥III (谷氨酸脫氫酶)后，于室溫下再放置20分鐘后，測(cè) 定剩余的200 μ 1在340nm的吸光度(E2)。使用附于F_kit的氨標(biāo)準(zhǔn)液制成表示氨濃度和 吸光度(340nm)的變化量的關(guān)系的校正曲線，通過(guò)此校正曲線求出反應(yīng)液中的氨濃度。(4)蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定使用蛋白質(zhì)分析CBB(考馬斯亮藍(lán))溶液(Nacalai Tesque),在檢測(cè)波長(zhǎng)595nm下進(jìn)行測(cè)定。作為標(biāo)準(zhǔn)，使用BSA(Pierce會(huì)社生產(chǎn))。(5)PG的活性用下式進(jìn)行計(jì)算。反應(yīng)液中氨濃度C mo//w/) χ反應(yīng)液量(m/) χ酶稀釋率 比活性(U/mg)= ；---^^-
酶量(m/) χ蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) χ反應(yīng)時(shí)間(min)在本發(fā)明中，有關(guān)PG和TG添加于需改性的蛋白質(zhì)中的時(shí)間，PG添加到蛋白 質(zhì)中的時(shí)間和TG添加到蛋白質(zhì)中的時(shí)間大致相同，或者在TG作用于該蛋白質(zhì)之前。因 此，專(zhuān)利文獻(xiàn)1中記載的將TG反應(yīng)通過(guò)添加PG來(lái)停止的方法為PG添加至蛋白質(zhì)中的 時(shí)間為T(mén)G作用于該蛋白質(zhì)之后，故并不包含于本發(fā)明中。需要說(shuō)明的是，PG添加到蛋 白質(zhì)中的時(shí)間和TG添加到蛋白質(zhì)中的時(shí)間大致相同，意味著在一系列原料投與的工序中 投與PG和TG。即，在商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)中，以在投與原料A后，依次投與原料B、原料 C...的方式來(lái)進(jìn)行，一般是多個(gè)原料事先不混合而依次投與，但在一系列原料投與的工序 中，只要是投與PG和TG，就包含在本發(fā)明的“蛋白谷氨酰胺酶添加到蛋白質(zhì)中的時(shí)間 和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加到蛋白質(zhì)中的時(shí)間大致相同”中。當(dāng)然，事先混合含有PG、TG的 多種原料而進(jìn)行添加的情況，也包含在本發(fā)明的“大致同時(shí)”中。使PG、TG發(fā)生反應(yīng)的溫度一般為；TC 60°C，若保持在此溫度下，在約1分 鐘 約48小時(shí)程度下二者進(jìn)行反應(yīng)。但是，優(yōu)選在5°C 50°C程度下進(jìn)行約5分鐘 約 24小時(shí)的程度。在食品中添加PG、TG的方法是在含有作為底物的蛋白質(zhì)的原料中僅添 WPG、TG,或是和其他的原料一起添加也可。PG和TG的添加量隨著改性蛋白質(zhì)的種 類(lèi)、最終制品和作為目的的效果而可自由地變化，但例如相對(duì)于食品原材料中每克蛋白 質(zhì)重量，TG的添加量在標(biāo)準(zhǔn)上為0.1 100單位。另一方面，相對(duì)于食品原材料中每克 蛋白質(zhì)重量，PG在標(biāo)準(zhǔn)上為0.01 120單位。需要說(shuō)明的是，兩者的上述添加量只是 標(biāo)準(zhǔn)，只要是發(fā)揮本發(fā)明所期待的效果即可，并不一定限制于此。在本發(fā)明中，作用于蛋白質(zhì)的PG和TG的比例很重要。在對(duì)蛋白質(zhì)添加PG的時(shí) 間與添加TG的時(shí)間大致相同或是在TG作用于該蛋白質(zhì)之前的情況下，以活性比計(jì)，在 蛋白質(zhì)中添加蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加量為PG TG = 0.05 3 1、優(yōu)選 PG TG = 0.05 2 1，PG、TG均作用于蛋白質(zhì)，故可以改性蛋白質(zhì)。或者以重量 比計(jì)，PG TG = 0.01 0.7 1，優(yōu)選 PG TG = 0.01 0.4 1，更優(yōu)選 PG TG =0.01 0.3 1，PG、TG均作用于蛋白質(zhì)，故可以改性蛋白質(zhì)。在PG的比例大于上 述比例的情況下，PG的作用與TG相比過(guò)于有效而不能發(fā)揮合用的效果，此外，在小于 上述比例的情況下，相反地由于PG的作用過(guò)弱而無(wú)法期待合用效果。此外，以NMR信號(hào)強(qiáng)度比計(jì)，對(duì)蛋白質(zhì)添加蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的 添加量為PG TG = 0.2 3.0 1，優(yōu)選0.2 2.3 1，如在此條件下，則不管PG、 TG的添加時(shí)間，由于PG、TG均作用于蛋白質(zhì)，故可以改性蛋白質(zhì)。在PG的比例比上 述比例大的情況下，PG的作用與TG相比過(guò)于有效而不能發(fā)揮合用的效果，此外，在小 于上述比例的情況下，相反地由于PG的作用過(guò)弱而無(wú)法期待合用效果。本發(fā)明的NMR信號(hào)強(qiáng)度比如下算出TG或PG在同位素標(biāo)記銨鹽(15N或是14N) 的存在下作用于底物蛋白質(zhì)，在對(duì)該蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基進(jìn)行同位素標(biāo)記之后，測(cè)定 標(biāo)記了的蛋白質(zhì)的NMR譜，通過(guò)NMR信號(hào)強(qiáng)度算出。對(duì)NMR的測(cè)定法并無(wú)特別限定， 但可以采用例如在檢測(cè)15N標(biāo)記了的谷氨酰胺殘基的情況下，可以測(cè)定1H和15N的相關(guān) 譜，例如可以采用測(cè)定HSQC譜。在可得到2個(gè)以上的信號(hào)的情況下，算出各信號(hào)強(qiáng)度的總和作為信號(hào)強(qiáng)度來(lái)計(jì)算。也就是說(shuō)，NMR信號(hào)強(qiáng)度比用“使PG作用的情況下的信 號(hào)強(qiáng)度的和” + “使TG作用的情況下的信號(hào)強(qiáng)度的和”來(lái)表示。作為標(biāo)記化合物，可 以為銨鹽，也可廣泛列舉為氯化銨、硫酸銨等。若為15N標(biāo)記，則使用氮為15N的銨鹽即 可，若為14N標(biāo)記，則使用氮為14N的銨鹽即可。標(biāo)記方法為，在水性溶劑中約pH3.0 約pH9.0的范圍、優(yōu)選約pH4.0 約pH8.0的范圍內(nèi)，在溫度為約4°C 約65°C的范圍、 更優(yōu)選約25°C 約60°C的范圍內(nèi)，可保持需標(biāo)記蛋白質(zhì)及銨鹽即可。反應(yīng)時(shí)間并無(wú)特別 限定，為約30秒 一周，更優(yōu)選約1分鐘 約1日。在此反應(yīng)中，相對(duì)于需標(biāo)記蛋白質(zhì) 的濃度，銨鹽濃度為約10倍以上，優(yōu)選約200倍以上較好，更優(yōu)選需標(biāo)記蛋白質(zhì)的濃度 為約IyM 約40mM的范圍，銨鹽的濃度為約10 μ M 約IOM的范圍。需要說(shuō)明的 是，α-乳球蛋白、酪蛋白、大豆球蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)球蛋白等食品中含有的蛋白質(zhì) 可以進(jìn)行同位素標(biāo)記，故本發(fā)明的NMR信號(hào)強(qiáng)度比可以測(cè)定所有含蛋白質(zhì)的食品。以下顯示了通過(guò)TG或PG的作用，而使蛋白質(zhì)和同位素標(biāo)記的氯化銨進(jìn)行反應(yīng) 的實(shí)例。在將α -乳清蛋白(α -lactalbumin,以下簡(jiǎn)稱(chēng)α -La)作為底物使用的情況下， 配制底物溶液(10mg/ml α-La、200mM15NH4Cl、5 % D20/20mM Tris-HCl (pH7.0)),添 加TG或PG以使底物-酶比為1000 1以后，在37°C下溫育26.5小時(shí)。溫育后的溶液 轉(zhuǎn)移至NMR樣品管中，使用Braker會(huì)社生產(chǎn)的Avance600等，進(jìn)行1H-15N HSQC檢測(cè)。 羧酰胺的氮若使用15N標(biāo)記，由于在15N上結(jié)合了 2個(gè)1H，故對(duì)于1個(gè)15N的化學(xué)位移能 成對(duì)地觀測(cè)到2個(gè)信號(hào)。算出“PG作用情況下的信號(hào)強(qiáng)度的和” + “TG作用情況下 的信號(hào)強(qiáng)度的和”，以此作為NMR信號(hào)強(qiáng)度比。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)并無(wú)特別限定。可列舉為乳蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、小麥 谷蛋白、肌肉蛋白質(zhì)、血漿、膠原、明膠等。此外，還可為將這些蛋白質(zhì)2種以上進(jìn)行 混和得到的物質(zhì)。作為符合本發(fā)明的食品，只要含有對(duì)上述蛋白質(zhì)合用PG、TG而進(jìn)行 改性的蛋白質(zhì)即可，不論原料的種類(lèi)和加工狀態(tài)。包含例如經(jīng)殺菌的狀態(tài)，經(jīng)脫脂的狀 態(tài)，經(jīng)稀釋的狀態(tài)、經(jīng)濃縮的狀態(tài)、經(jīng)干燥的狀態(tài)、除此以外，也包括經(jīng)過(guò)各種各樣的 加工的狀態(tài)。隨后，對(duì)本發(fā)明的酶制劑進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的蛋白質(zhì)改性用酶制劑只要為以下 條件的制劑即可以活性比計(jì)，，作為必須構(gòu)成成分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、蛋白谷氨酰胺酶 的摻混比例為PG TG = 0.05 3 1、優(yōu)選PG TG = 0.05 2 1，或以重量比 計(jì)，摻混比例為PG TG = 0.01 0.7 1、優(yōu)選PG TG = 0.01 0.4 1、更優(yōu)選 PG TG = 0.01 0.3 1，或以NMR信號(hào)強(qiáng)度比計(jì)，PG TG = 0.2 3.0 1、優(yōu)選 PG TG = 0.2 2.3 1，除PG、TG之外，還可摻混在此領(lǐng)域中經(jīng)常使用的乳糖、蔗 糖、麥芽糖醇、山梨醇、糊精、支鏈糊精、環(huán)糊精、淀粉類(lèi)、多糖類(lèi)、膠類(lèi)、果膠等種 種任意成分。此外，還可以含有動(dòng)物性蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)、小麥蛋白質(zhì)等植物性蛋白 質(zhì)。此外，也可根據(jù)需要在在本酶制劑中摻混碳酸氫鈉、枸櫞酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉、 氯化鉀等生理學(xué)上允許的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)。此外，還可以適當(dāng)摻混調(diào)味料、砂糖、香料、色 素、發(fā)色劑(color coupler發(fā)色剤)、抗壞血酸、其鹽類(lèi)等的有機(jī)鹽類(lèi)、乳化劑、油脂等。本發(fā)明包括簡(jiǎn)便地發(fā)現(xiàn)蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的適當(dāng)添加量比的方 法。即，如上所述，使PG和TG在同位素標(biāo)記的銨鹽的存在下分別作用于蛋白質(zhì)，用同 位素標(biāo)記該蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基的官能團(tuán)、測(cè)定其N(xiāo)MR信號(hào)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在NMR信號(hào)強(qiáng)度比中，通過(guò)使蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.2 3.0 1、優(yōu)選0.2 2.3 1 的條件，能確定PG和TG的適當(dāng)添加量比。PG和TG的NMR信號(hào)強(qiáng)度比的上述適當(dāng) 范圍，和底物蛋白質(zhì)的種 類(lèi)無(wú)關(guān)，蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.2 3.0 1，優(yōu) 選0.2 2.3 1，NMR信號(hào)強(qiáng)度比和各底物蛋白質(zhì)中的PG和TG的適當(dāng)添加量比(活 性比、重量比)之間存在相關(guān)，故無(wú)需重復(fù)多次試驗(yàn)來(lái)對(duì)PG和TG的適當(dāng)添加量比(活 性比、重量比)進(jìn)行試錯(cuò)，能夠簡(jiǎn)單的發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)奶砑恿勘?。以下的?shí)施例為列舉實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這 些實(shí)施例。實(shí)驗(yàn)例1將α -乳清蛋白(α -Iactalbumin,以下簡(jiǎn)稱(chēng)α -La) (Sigma生產(chǎn))作為底物使用。 配制底物溶液(10mg/ml α-La、200mM 15NH4CL 5 % D20/20mM Tris-HCl(pH7.0)), 添加TG(來(lái)自味之素“Activa” TG的酶精制品)或PG(專(zhuān)利文獻(xiàn)1記載的金黃桿菌 (Chryseobacterium)屬來(lái)源的)以使底物-酶比為1000 1，然后于37°C下溫育26.5小 時(shí)。溫育后的溶液移至NMR樣品管中，使用NMRCBraker會(huì)社生產(chǎn)Avance600)，進(jìn)行 1H-15N HSQC測(cè)定。26.5小時(shí)后進(jìn)行1H-15N HSQC測(cè)定的結(jié)果如

圖1所示。羧酰胺氮 使用15N標(biāo)記后，由于在15N上結(jié)合了 2個(gè)1H，故對(duì)于1個(gè)15N的化學(xué)位移能成對(duì)地觀測(cè) 到2個(gè)信號(hào)。通過(guò)圖1，可以確定α -La中存在的谷氨酰胺殘基的羧酰胺氮中的一部分 為15N所標(biāo)記，通過(guò)PG成功地顯示了 15N標(biāo)記。這樣，使用本方法，和TG—樣，顯示 PG不僅使脫酰胺反應(yīng)進(jìn)行，也可使氯化銨和谷氨酰胺殘基反應(yīng)。需要說(shuō)明的是，NMR 信號(hào)強(qiáng)度為圖1的橢圓形的點(diǎn)的區(qū)域面積的總和，此區(qū)域面積越大表示反應(yīng)量越多。實(shí)施例1在市售牛奶、0.2Μ 15NH4CL 5 % D2O中分別單獨(dú)添加實(shí)驗(yàn)例1中記載的TG 或PG，算出各添加濃度中的信號(hào)強(qiáng)度。添加TG以使底物/酶比(S/E比)為重量比 7400/1。另一方面，添加PG至以重量比計(jì)為T(mén)G的0.002 5倍。所使用的TG的比活 性為每Img酶蛋白質(zhì)為26單位，PG的比活性為每Img酶蛋白質(zhì)為120單位。添加酶后 的溶液于37°C下溫育3小時(shí)后，移至NMR樣品管中，使用實(shí)驗(yàn)例1記載的NMR，進(jìn)行 1H-15N HSQC測(cè)定。以TG添加量為基準(zhǔn)，與此對(duì)應(yīng)的PG添加量分別用酶重量比(PG/ TG)及活性比(PG/TG)表示。求得的對(duì)應(yīng)于各比的PG/TG信號(hào)強(qiáng)度比的結(jié)果如表1所示。[表1]酶重量比活性比I信號(hào)強(qiáng)度I信號(hào)強(qiáng)度比
pG(PG/TG)(PG/TG)(PG/TG)
2.5"g ---92J-
-12.5^g5234745
-2.5"g ml332
-0.5"g02092147L58
-0.25"gOl0.469 5
-0.025//gΟΟ 0.0462010.216使用市售牛奶配制酸奶。將市售牛奶400g加溫至50°C，以表2中記載的量添 加實(shí)驗(yàn)例1記載的TG、PG0所使用的TG的比活性為每Img酶蛋白質(zhì)為26單位，PG 的比活性為120單位。在50°C下進(jìn)行90分鐘的酶反應(yīng)后，在沸騰浴中一邊混合一邊加 熱。一達(dá)到90°C立即置于冰水中，冷卻至45°C。添加20g(相對(duì)于原料為5% )的發(fā)酵 劑(明志乳業(yè)(株式會(huì)社)保加利亞酸奶)，充分混合后分別注入試飲杯中，每杯40g。使用鋁箔紙覆蓋，于38°C下降低pH至4.5，使其發(fā)酵約3 4小時(shí)。在低溫 (4°C)下保存，翌日進(jìn)行物性評(píng)價(jià)和感官評(píng)價(jià)。至于物性，使用質(zhì)地分析儀(Texture Analyzer英弘精機(jī)生產(chǎn))測(cè)定破斷應(yīng)力。使 用IOmm直徑的圓柱形柱塞，設(shè)定破斷速度為6Cm/min(lmm/秒)。其結(jié)果如表3所示。和對(duì)照品相比，僅添加TG的比較品T的破斷應(yīng)力顯著增 力口。這是TG引起乳蛋白交聯(lián)的結(jié)果。有關(guān)本發(fā)明品1 4，其破斷應(yīng)力仍大于對(duì)照品， 并未損害TG引起的增加破斷應(yīng)力的效果。然而，比較品T-P的破斷應(yīng)力和比較品P相 比則基本無(wú)變化，故能確認(rèn)TG反應(yīng)因PG的加入而基本停止，TG的效果基本并未體現(xiàn)。[表2]
mTG ~PG酵重量比酶活性比 信號(hào)強(qiáng)度比 (mg) (mg) (PG/TG) (PG/TG) (PG/TG) 對(duì)照品---
本發(fā)明品 1 TG5PG ΠΓ0.0115 OOl0.0460.216
本發(fā)明品 2TG5PG Λ5 0.023 0020.092未測(cè)定
本發(fā)明品 3TG5PG Λ50.115 θ7\0461
本發(fā)明品 4TG,PG ΓΤ5 02302092L58
比較品 T TG ΓΤ5 -:::
比較品 P PG- Γ 5---
比較品 T-P~~TG5PG ΓΤ5 Γ 5146^32[表3]
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)的改性方法，其通過(guò)使蛋白谷氨酰胺酶及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用于蛋白質(zhì)而使 蛋白質(zhì)改性，其中，蛋白谷氨酰胺酶添加到蛋白質(zhì)中的時(shí)間和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加到蛋白 質(zhì)中的時(shí)間大致相同或者在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用于該蛋白質(zhì)之前。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，以活性比計(jì)，添加至蛋白質(zhì)中的蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷 氨酰胺酶的添加量為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.05 3 1。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中，以重量比計(jì)，添加至蛋白質(zhì)中的蛋白谷氨酰胺酶和 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加量為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.01 0.7 1。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的改性方法，其中，以NMR信號(hào)強(qiáng)度比計(jì)，是添加至蛋 白質(zhì)中的蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加量為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶= 0.2 3.0 1的條件。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中，蛋白質(zhì)為選自乳蛋白、乳清蛋白、大豆蛋 白、小麥谷蛋白、血漿、肌肉蛋白質(zhì)、膠原及明膠的1種或2種以上的蛋白質(zhì)。
6.食品，其含有使用權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法改性過(guò)的蛋白質(zhì)。
7.蛋白質(zhì)改性用酶制劑，其中，以活性比計(jì)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶蛋白谷氨酰胺酶的摻 混比例為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.05 3 1。
8.蛋白質(zhì)改性用酶制劑，其中，以重量比計(jì)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶蛋白谷氨酰胺酶的摻 混比例為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.01 0.7 1。
9.蛋白質(zhì)改性用酶制劑，其特征在于，以NMR信號(hào)強(qiáng)度比計(jì)，是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶蛋 白谷氨酰胺酶的摻混比例為蛋白谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶=0.2 3.0 1的條件。
10.蛋白質(zhì)中的蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的適當(dāng)添加量比的發(fā)現(xiàn)方法，通過(guò)使 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶分別在同位素標(biāo)記的銨鹽的存在下作用于該蛋白質(zhì)，將 該蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基的官能團(tuán)進(jìn)行同位素標(biāo)記，測(cè)定其N(xiāo)MR信號(hào)強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供使蛋白谷氨酰胺酶及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶兩者作用于蛋白質(zhì)而使蛋白質(zhì)改性的方法，提供含有經(jīng)這兩種酶改性的蛋白質(zhì)的食品，提供含有兩酶的蛋白質(zhì)改性用酶制劑，提供簡(jiǎn)便地發(fā)現(xiàn)以適當(dāng)添加量比將蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加到蛋白質(zhì)中的方法。蛋白谷氨酰胺酶添加到蛋白質(zhì)中的時(shí)間和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶添加到蛋白質(zhì)中的時(shí)間大致相同，或者在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用于蛋白質(zhì)之前，或者，通過(guò)使作用于蛋白質(zhì)的蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的添加比例為規(guī)定的比例而使蛋白質(zhì)改性。通過(guò)使用同位素標(biāo)記銨鹽標(biāo)記的蛋白質(zhì)的NMR信號(hào)強(qiáng)度等發(fā)現(xiàn)蛋白谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的適當(dāng)添加量比。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK102016057SQ200980110108
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者三輪典子, 中村美奈, 中越裕行, 佐藤弘明, 廣瀨文之, 榛葉信久, 橫山敬一, 鈴木榮一郎 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社, 天野酶株式會(huì)社