一種蛋白酶及其生產(chǎn)菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)蛋白技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白酶及其生產(chǎn)菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶英文名Protease，又叫肽酶peptidase，是生物體內(nèi)一類蛋白質(zhì)水解酶，可 以將蛋白質(zhì)水解生成氨基酸和小分子肽。在自然環(huán)境中，蛋白酶無處不在，動物、植物、微 生物都含有豐富的蛋白酶資源。蛋白酶不僅在生物體的新陳代謝中起著不可替代的作用， 如細胞分化、消化吸收等，與人類的生產(chǎn)生活也息息相關(guān)。作為一種常見的生物催化劑，蛋 白酶是最重要的工業(yè)酶之一，其生產(chǎn)總量占到整個工業(yè)酶市場的65%，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī) 藥、洗滌、制革、化妝品等工業(yè)中。目前，微生物來源蛋白酶是應(yīng)用最廣泛的，因為微生物生 長迅速易于培養(yǎng)并且可以相對容易的改造獲得高產(chǎn)菌株或工程菌株。所以從自然界中篩選 具有特異性活力的蛋白酶是非常有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種蛋白酶及其生產(chǎn)菌株，即從微球菌發(fā)酵粗酶液中分離純 化的蛋白酶，及其制備方法和主要酶學(xué)性質(zhì)，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004] 本發(fā)明首先提供一種藤黃微球菌（Micrococcus luteus) NH54PC02,該菌株保藏于 2014年12月23日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研宄 所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏編號為 CGMCC NO. 10238。
[0005] 本發(fā)明還提供一種從上述藤黃微球菌中分離的蛋白酶，包括有如下的性質(zhì)：
[0006] I) SDS-PAGE 電泳分子量為 25kDa.，
[0007] 2)乙二胺四乙酸二鈉（EDTA)、苯甲基磺酰氟（PMSF)和胃蛋白酶抑制劑 (pepstatin A)能夠完全抑制酶活，
[0008] Fe2+，Ni2+，Cu2+、Zn2+、二甲基亞砜、甲醇、乙醇和異丙醇能夠部分抑制酶活，
[0009] Mn2+可以很好的促進酶活，
[0010] 3)其在pH 6~11的范圍內(nèi)具有較強的酶活力，最適的pH為10.0 ;
[0011] 4)上述的蛋白酶，在40°C保溫Ih后，酶活力保留90% ;
[0012] 上述的蛋白酶其最適的反應(yīng)溫度為50°C。
[0013] 本發(fā)明蛋白酶可以用于水產(chǎn)蛋白（蝦頭、蝦粉、鯧魚蛋白）的水解。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :本發(fā)明微球菌產(chǎn)酶曲線和生長曲線
[0015] 圖2 :本發(fā)明的脂肪酶純化過程電泳圖；其中泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道2為 微球菌發(fā)酵液；泳道3為70 %硫酸銨沉淀透析液；泳道4為DEAE離子交換層析溶液；泳道 5為苯基疏水層析溶液。
[0016] 圖3 :本發(fā)明蛋白酶Mascot評分柱狀圖和本發(fā)明蛋白酶測序覆蓋率
[0017] 圖4 :pH和溫度對本發(fā)明蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響。A，pH對酶活力的影響；B， PH對酶穩(wěn)定性的影響；C，溫度對酶活力的影響；D，溫度対酶穩(wěn)定性的影響；
[0018] 圖5 :本發(fā)明蛋白酶水產(chǎn)品酶解效果：A，水解前后水產(chǎn)品氨基態(tài)氮含量；B，水解前 后水產(chǎn)品多肽含量。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明的酶的純化步驟、酶的性質(zhì)進行詳細描述。
[0020] 實施例1 :蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及分離純化步驟
[0021] 本發(fā)明的酶是從微球菌發(fā)酵粗酶液中分離純化，該菌株是驗從南海沉積物中篩選 得到的，具體描述如下：
[0022] 菌株篩選及培養(yǎng)
[0023] 將凍存于_20°C的南海沉積物在無菌操作臺內(nèi)均質(zhì)后取Ig于IOmL滅菌的陳海水 中震蕩混勻。梯度稀釋上述混勻液至10'每個稀釋梯度取〇. ImL均勻涂布于篩選培養(yǎng)基 平板上，28°C恒溫培養(yǎng)。提取在篩選平板上產(chǎn)生水解圈的單菌落。
[0024] 篩選使用的培養(yǎng)基的組成如下：
[0025] 篩選培養(yǎng)基：5g/L蛋白胨，lg/L酵母粉，0. lg/L檸檬酸鐵，20g/L瓊脂粉，陳海水定 容，121°C蒸氣滅菌20分鐘。
[0026] 種子培養(yǎng)基：5g/L蛋白胨，lg/L酵母粉，0. lg/L檸檬酸鐵，陳海水定容，115°C蒸氣 滅菌20分鐘。
[0027] 發(fā)酵培養(yǎng)基：5g/L蛋白胨，lg/L酵母粉，0. lg/L檸檬酸鐵，陳海水定容，115°C蒸氣 滅菌20分鐘。
[0028] 本發(fā)明中藤黃微球菌在液體培養(yǎng)基中呈黃色，鏡檢為球形；而且其發(fā)酵過程生 產(chǎn)迅速、產(chǎn)酶周期短，在28°C和180rmp條件下培養(yǎng)36-48h即可高產(chǎn)蛋白酶；此外，該藤 黃微球菌在高溫40°C條件下亦可較好的生長并產(chǎn)蛋白酶，有利于減少發(fā)酵過程冷凝循環(huán) 水的使用、降低污染雜菌的可能性，具有較高的工業(yè)應(yīng)用前景。將該菌命名為藤黃微球菌 (Micrococcus luteus) NH54PC02,于2014年12月23日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號中國科學(xué)院微生物研宄所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏編號為 CGMCC NO. 10238。
[0029] 實施例2 :
[0030] 劃線挑取篩選的藤黃微球菌單克隆于種子培養(yǎng)基中28°C ISOrpm震蕩培養(yǎng)24小 時，將種子培養(yǎng)液按照2% (v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C 180rpm震蕩培養(yǎng)36 小時，4°C 6000rpm離心10分鐘得到發(fā)酵粗酶液。
[0031] 粗酶液硫酸銨沉淀
[0032] 離心得到的發(fā)酵粗酶液進行70%硫酸銨沉淀。冰水浴保溫，磁力攪拌的條件下均 勻緩慢地向發(fā)酵粗酶液加入粉碎并干燥的硫酸銨。4°C靜置過夜后離心收集沉淀，用20mM pH 8. OTris-Hcl緩沖液復(fù)溶沉淀，并在此緩沖液中透析。
[0033] DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析
[0034] 用pH 8· 0的20mM Tris-HCl緩沖液充分平衡DEAE S印harose FF離子交換柱 (10cm*l. 2cm)，上樣吸附。然后用 pH 8. 0 的 20mM Tris-HCl 含有 NaCl (0· 1-0. 6M of NaCl) 進行梯度洗脫，收集0D280出峰平衡液及洗脫液。對收集管中的溶液測酶活和蛋白質(zhì)分析。
[0035] Phenyl Sepharose 6Fast Flow 苯基疏水層析
[0036] 上柱前，向上步OM NaCl洗脫液酶液中添加氯化鈉至終濃度為2M再上柱。上柱后 用高濃度到低濃度的氯化鈉緩沖液先后洗脫（2M-1. 5M-1. 0M-0. 5M-0M)，收集洗脫液，對收 集管中