專利名稱：一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品保藏領(lǐng)域，涉及一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的方法，具體地說(shuō)，是指一種 利用從新疆牧民自制酸奶疙瘩中分離出的乳酸菌制備酸奶發(fā)酵劑從而延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的 方法。
背景技術(shù)：
酸乳(也叫酸奶)多是以鮮牛奶為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化得到的一種酸性適中 的凝聚半固狀奶制品，見(jiàn)參考文獻(xiàn)沈輝，酸乳發(fā)酵凝乳過(guò)程中的理化性質(zhì)和生物活性，《無(wú) 錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)》2000，19(5)。作為乳酸菌發(fā)酵的主要產(chǎn)品之一，酸乳因特有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和 風(fēng)味而受到越來(lái)越多消費(fèi)者的鐘愛(ài)，在產(chǎn)品的質(zhì)量、產(chǎn)量和品種方面都得到了迅速的發(fā)展。 但因?yàn)樗崮淌呛罹娜橹破罚０l(fā)酵結(jié)束后，在產(chǎn)品貯存、運(yùn)輸、銷售、食用前這一過(guò)程 中，菌體仍要生長(zhǎng)繁殖，發(fā)生后酸化，即酸奶的PH值繼續(xù)下降，以至出現(xiàn)消費(fèi)者不可接受的 過(guò)酸味及感官質(zhì)量下降。由于酸奶的保存期短，流通性受到限制，給經(jīng)營(yíng)者造成了很大的困 難，使酸奶的產(chǎn)量徘徊不前，尤其是在我國(guó)運(yùn)輸、消費(fèi)還沒(méi)有形成冷藏鏈一體化的情況下， 酸奶在還沒(méi)有食用之前，其質(zhì)量就大大降低了，這種現(xiàn)狀直接影響了消費(fèi)者和經(jīng)營(yíng)者的利 益，因此，如何延長(zhǎng)酸奶的保質(zhì)期，提高其衛(wèi)生安全性，成為目前食品研究的重要課題之一。目前控制酸奶后酸化的主要方法有1)調(diào)整保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比 例；2)添加外來(lái)物控制菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸；3)改變細(xì)胞膜的通透性；4)使用基因工程和誘變 育種技術(shù)包括物理誘變、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合(生物育種)和基因工程技術(shù)進(jìn)行乳酸 高產(chǎn)菌株的選育，提高菌種產(chǎn)乳酸的能力。在上述方法中，通過(guò)調(diào)整保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例、添加外來(lái)物的方 法只能輕微地減弱后酸化的程度；而通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性和添加細(xì)菌素的方法增加了生 產(chǎn)的成本，不適用于規(guī)模化生產(chǎn)；只有通過(guò)基因工程和誘變育種生產(chǎn)出在低溫和低PH下產(chǎn) 酸能力弱的菌株可從根本上解決酸奶后酸化問(wèn)題。目前，盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)于乳酸菌基因組的 研究有較多的報(bào)道，并取得了很大的進(jìn)展，但由于其復(fù)雜性，對(duì)乳酸菌的基因調(diào)控機(jī)制研究 的還不是很透徹，重組基因控制酸奶后酸化的研究目前鮮有報(bào)道。至今為止，誘變育種和細(xì)胞融合生物選育仍是世界各國(guó)行之有效的重要方法，以 其在篩選優(yōu)良菌株應(yīng)用上的卓越成效而最受推崇。尤其發(fā)酵工業(yè)中的各種優(yōu)良高產(chǎn)菌株絕 大部分都是以誘變育種和生物選育方法獲得的。誘變育種和細(xì)胞融合生物選育除了能提高 產(chǎn)量外，還可達(dá)到改善產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝等目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法，該方法通過(guò) 對(duì)從新疆牧民自制酸奶疙瘩中分離出的乳酸菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到一種抗后酸化菌 株，利用該菌株作為酸奶發(fā)酵劑制備酸奶，從而提高了酸奶的保藏期。應(yīng)用本發(fā)明的提供 的發(fā)酵劑制備的酸奶保鮮期長(zhǎng)，有利于酸奶運(yùn)輸量的增加、成本的降低，產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明提供的延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法，通過(guò)對(duì)篩選菌株進(jìn)行原 生質(zhì)體融合，最終得到一株在貯藏37°C產(chǎn)乳酸量與出發(fā)菌株一樣，但是在10°C貯藏時(shí)，突 變菌株產(chǎn)乳酸量明顯減少的菌株，該突變菌株遺傳穩(wěn)定性較好，不易回復(fù)突變，可以作為酸 奶發(fā)酵劑。具體的制備方法步驟如下步驟一、從新疆酸奶疙瘩中通過(guò)劃線分離和涂布的方法分離得到一株發(fā)酵性能好 的乳酸桿菌(LN1)和一株乳酸球菌(sm)，將乳酸桿菌(LN1)定義為出發(fā)菌株。步驟二、取乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)分別按3%比例接種于脫脂乳培養(yǎng)基 中形成菌液，42°C恒溫培養(yǎng)12h，經(jīng)反復(fù)傳代直至達(dá)到要求的活力。步驟三、原生質(zhì)體制備。分別取乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(sm)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌 液10ml，離心并以原生質(zhì)體穩(wěn)定液洗滌兩次，所用原生質(zhì)體穩(wěn)定液體積與菌液體積相同，洗 滌后收集菌體，轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿中。乳酸桿菌LN1的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為15.00mg/mL，酶解細(xì)胞壁的 時(shí)間為60min，酶解溫度為44°C ；乳酸球菌sm的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為3. 20mg/mL,酶解細(xì)胞壁的時(shí) 間為60min，酶解溫度為44°C。應(yīng)用裂解法和倒置顯微鏡觀察圖法測(cè)定原生質(zhì)體形成率。步驟四、原生質(zhì)體融合。對(duì)上述步驟三中的兩種原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱力滅活，各取 4ml滅活的原生質(zhì)體混合，放置5min后離心，重懸于8ml 35% PEG6000溶液中，37°C水浴保 溫2min，離心，洗滌2次，重懸于8ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液中。步驟五、對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選，得到目的菌株。取步驟四中制備得到的原生質(zhì)體穩(wěn)定液0. lml加入到半固體高滲再生培養(yǎng)基中， 轉(zhuǎn)入滅菌培養(yǎng)皿中置37°C下培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落。將長(zhǎng)出的菌落涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基，在37°C下培養(yǎng)12h，選取菌落分布均勻，菌 數(shù)在100 200之間的培養(yǎng)基，通過(guò)影印法接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基中，分別在20°C和37°C 下培養(yǎng)，選取在37°C下生長(zhǎng)，而在20°C下不長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢的菌落為目的菌株一即為本發(fā)明 所要制備的酸奶發(fā)酵劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)該突變菌株在37°C條件下，產(chǎn)乳酸量跟出發(fā)菌株一樣；在10°C條件下，產(chǎn)乳酸 量比出發(fā)菌株明顯減少，后酸化時(shí)間明顯推遲；以120.00° T作為后酸化指標(biāo)值，發(fā)酵脫脂 乳6h后，在10°C條件下儲(chǔ)存，對(duì)照菌株(德氏乳桿菌保加利亞亞種6032，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微 生物菌種保藏中心，以下簡(jiǎn)稱6032)在第5天出現(xiàn)后酸化(滴定酸度> 120.00° T)，該突 變菌株在第8天出現(xiàn)后酸化。(2)該突變菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，不易回復(fù)突變；(3)篩選得到的抗后酸化突變菌株作為酸奶發(fā)酵劑，提高了酸奶的保藏性，降低了 生產(chǎn)成本；(4)本發(fā)明中選用了原生質(zhì)體融合法，選育出在高溫條件下產(chǎn)酸較強(qiáng)、在低溫條件 下產(chǎn)酸甚微的菌株作為發(fā)酵劑，這種方法較其他方法正突變率高，操作方便，且有效解決了 酸奶后酸化的問(wèn)題。


圖1為本發(fā)明酸奶發(fā)酵劑的制備方法流程圖；圖2為供試菌株LN1、SN1生長(zhǎng)曲線；圖3為供試菌株6032、LN1、N02、N03發(fā)酵乳10°C儲(chǔ)藏期間滴定酸度變化曲線；圖4為供試菌株LN 1、6032、而2、而3在371培養(yǎng)時(shí)滴定酸度值變化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的酸奶發(fā)酵劑的制備方法作進(jìn)一步的詳細(xì) 說(shuō)明。本發(fā)明是一種利用抗后酸化的酸奶發(fā)酵劑延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的方法，通過(guò)原生質(zhì)體 融合方法得到突變菌株，將突變菌株作為酸奶發(fā)酵劑制備酸奶，具體的制備方法流程如圖1 所示，步驟如下(1)從新疆酸奶疙瘩中通過(guò)劃線分離和涂布的方法分離得到發(fā)酵性能好的一株乳 酸桿菌LN1和一株乳酸球菌SN1，將乳酸桿菌LN1定義為出發(fā)菌株。(2)取乳酸桿菌LN1和乳酸球菌Sm分別按3%比例接種于脫脂乳培養(yǎng)基中形 成菌液，42°C恒溫培養(yǎng)12h，經(jīng)反復(fù)傳代直至達(dá)到要求的活力(42°C發(fā)酵6小時(shí)酸度達(dá)到 70. 00-120° T)。(3)制備乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(Sm)的原生質(zhì)體。對(duì)滿足活力要求的菌株進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定其最適生長(zhǎng)溫度、最適接種量、 最適初始PH值，于最佳條件下測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線。分別取乳酸桿菌LN 1和乳酸球菌Sm對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液10mL，離心(3000r/min)并 以原生質(zhì)體穩(wěn)定液(PB)洗滌兩次，原生質(zhì)體穩(wěn)定液(PB)使用體積與菌液體積相同，收集菌 體，轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿中。乳酸桿菌LN1的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為15. 00mg/mL,酶解細(xì)胞壁的 時(shí)間為60min，酶解溫度為44°C ；乳酸球菌sm的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為3. 20mg/mL,酶解細(xì)胞壁的時(shí) 間為60min，酶解溫度為44°C。應(yīng)用裂解法和倒置顯微鏡觀察圖法測(cè)定原生質(zhì)體形成率。(4)將乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(Sm)的原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體融合.對(duì)乳酸桿菌LN1和乳酸球菌Sm的原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱力滅活，各取4ml滅活的 原生質(zhì)體混合，放置5min后離心，重懸于8ml 35% PEG6000溶液中，37°C水浴保溫2min，離 心，洗滌2次，重懸于8ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液中。(5)對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選，得到具備較強(qiáng)的抗后酸化能力的目的菌株 (N02)、 (N03)。取步驟(4)中制備得到的原生質(zhì)體穩(wěn)定液0. lml加入到半固體高滲再生培養(yǎng)基 中，轉(zhuǎn)入滅菌培養(yǎng)皿中置37°C下培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落。挑取長(zhǎng)出的菌落涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)12h，選取菌落分布均 勻，菌數(shù)在100 200之間的平皿，通過(guò)影印法接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基中，分別在20°C和 37°C下培養(yǎng)，選取在37°C下生長(zhǎng)，而在20°C下不長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢的菌落為目的菌。對(duì)上述得到的目的菌做發(fā)酵脫脂乳及貯藏酸性能實(shí)驗(yàn)，與乳酸桿菌LN1和6032所發(fā)酵的脫脂乳為對(duì)照，比較其在貯藏過(guò)程中的PH值和滴定酸度的變化。用上述制備得到的目的菌做發(fā)酵劑制作酸奶，并進(jìn)行突變效應(yīng)的測(cè)定。于10°C儲(chǔ) 藏，隔天測(cè)定其酸度° T-滴定法；pH值-采用pH211型酸度計(jì)；乳酸菌活菌數(shù)-采用高層 瓊脂法；0D值的測(cè)量-采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)600nm。下面結(jié)合圖表對(duì)本發(fā)明關(guān)鍵步驟的結(jié)果進(jìn)行說(shuō)明。(1)測(cè)定生長(zhǎng)曲線乳酸桿菌LN1在37°C、3%接種量、初始pH值6. 6的條件下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一個(gè)較短的 延遲期后，菌株即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，如圖2所示，15h時(shí)菌體濃度達(dá)到最高峰，之后進(jìn)入穩(wěn)定 期，菌體0D值基本保持不變。乳酸球菌sm菌株在41°C、3%接種量、初始pH值7. 0的條件 下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一個(gè)較短的延遲期后，菌株即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，15h時(shí)菌體濃度達(dá)到最高峰，之 后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體0D值基本保持不變。制備原生質(zhì)體的細(xì)菌一般要求處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌體生長(zhǎng)狀態(tài)比較同步，容 易變異，同時(shí)為了保證處理時(shí)具有一定的細(xì)胞濃度以增加可能變異的細(xì)胞總數(shù)，常選用對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)中后期的細(xì)胞進(jìn)行處理。因此，本試驗(yàn)選定菌株LN1和sm培養(yǎng)時(shí)間為12h。(2)原生質(zhì)體制備條件的確定根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表1，通過(guò)均勻試驗(yàn)確定來(lái)原生質(zhì)體制備的最 佳條件。表1LN1原生質(zhì)體制備條件均勻設(shè)計(jì)U8女(85)實(shí)驗(yàn)水平因素表 表2Sm原生質(zhì)體制備條件均勻設(shè)計(jì)U8女(85)實(shí)馬僉水平因素表
表3LN1均勻設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果 利用軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析(回歸分析采用后退法，顯著性水平 a = 0. 05)，得到原生質(zhì)體制備率與酶濃度、酶處理溫度、酶處理時(shí)間的多元一次回歸方程 為Y(% ) = -25. 3+3. 68X(l)+0. 917X(2)+0. 483X(3)方程偏回歸系數(shù)分別為B1 = 1. 12，B2 = 0. 280，B3 = 0. 369，可見(jiàn)各因素對(duì)原生 質(zhì)體制備率(酶解率％ )的影響為酶濃度>酶處理時(shí)間>酶處理溫度。由回歸方程可知X1、X2、X3的系數(shù)為正，表明試驗(yàn)指標(biāo)隨因素的增加而增加，所 以，在確定優(yōu)化方案時(shí)，各因素的取值應(yīng)偏上限，即酶濃度取15. 00mg/mL，酶處理溫度取 44°C，酶處理時(shí)間取60min。將以上各值代入上述回歸方程，得到原生質(zhì)體制備率(酶解率) 最大值為99. 6 %，這一結(jié)果好于表3中的8個(gè)試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到結(jié)果與計(jì) 算結(jié)果相接近。因此得到原生質(zhì)體制備最佳條件為酶濃度取15. 00mg/mL ；酶處理溫度取 44°C ；酶處理時(shí)間取60min。表4Sm均勻設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果
利用軟件對(duì)表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析(回歸分析采用后退法，顯著性水平 a = 0. 05)，得到原生質(zhì)體制備率與酶濃度、酶處理溫度、酶處理時(shí)間的多元一次回歸方程 為Y(% ) = -2. 78+17. 3X(l)+0. 602X(2)+0. 345X(3)方程偏回歸系數(shù)分別為B1 = 1. 11，B2 = 0. 176，B3 = 0. 278，可見(jiàn)各因素對(duì)原生
質(zhì)體制備率(酶解率％)的影響為酶濃度>酶處理時(shí)間>酶處理溫度。與LN 1結(jié)果類 似。由回歸方程可知X1、X2、X3的系數(shù)為正，表明試驗(yàn)指標(biāo)隨因素的增加而增加， 所以，在確定優(yōu)化方案時(shí)，各因素的取值應(yīng)偏上限，即酶濃度取3. 20mg/mL，酶處理溫度取 44°C;酶處理時(shí)間取60min。將以上各值代入上述回歸方程，得到酶解率最大值為100%，這 一結(jié)果好于表4中的8個(gè)試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到結(jié)果與計(jì)算結(jié)果相接近。因 此得到原生質(zhì)體制備最佳條件為酶濃度取3. 20mg/mL，酶處理溫度取44°C，酶處理時(shí)間取 60mino(3)突變菌株篩選結(jié)果挑取在37°C下生長(zhǎng)，而在20°C下不長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢的菌落38個(gè)，逐個(gè)接入脫脂乳試 管中，37°C恒溫培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵乳進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，淘汰產(chǎn)酸過(guò)快、凝乳不良、風(fēng)味欠佳的菌株36 株。對(duì)剩余的2株菌株N02、N03進(jìn)行貯藏期特性測(cè)定，最終篩選出在10°C下產(chǎn)酸緩慢的菌 株 N02、N03。根據(jù)國(guó)標(biāo)規(guī)定，酸奶的正常酸度(° T)應(yīng)介于70. 00 110. 00之間，超過(guò) 110.00° T則被界定為不合格產(chǎn)品。因此，本試驗(yàn)將110.00° T作為后酸化的指標(biāo)值。由圖3可以看出，發(fā)酵脫脂乳在10°C貯藏時(shí)，由于發(fā)酵乳溫度由37°C未能立刻降 到10°C，所以在儲(chǔ)藏第2d時(shí)滴定酸度較儲(chǔ)藏初始時(shí)刻有明顯上升，儲(chǔ)藏3d后發(fā)酵乳溫度 達(dá)到10°C，滴定酸度升高趨勢(shì)減慢，當(dāng)發(fā)酵乳發(fā)生后酸化后由于自身產(chǎn)酸抑制乳酸菌的增 殖，所以滴定酸度增長(zhǎng)幅度較慢。隨貯藏時(shí)間的增加滴定酸度值都逐漸升高。試驗(yàn)中菌株 6032與Lm到第5d時(shí)已經(jīng)發(fā)生后酸化(滴定酸度> 120° T)，而菌株N02與N03在貯藏的 第8d和第7d時(shí)發(fā)生后酸化。目的菌株N02較LN1的發(fā)酵脫脂乳在貯藏時(shí)間上延長(zhǎng)了 3d， 目的菌株N03較LN1的發(fā)酵脫脂乳在貯藏時(shí)間上延長(zhǎng)了 2d。(4)突變效果測(cè)定結(jié)果用液體MRS培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)對(duì)照菌株6032、出發(fā)菌株LN1、目標(biāo)菌株N02、N03,比
較其產(chǎn)酸速率。由圖4可知，37°C下LN1、N02、N03、6032在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，隨著時(shí)間的增加 滴定酸度值都逐漸下降。N02、N03與LN1、6032相比，產(chǎn)酸量有所減少。6h時(shí)，LN1、6032、 N02、N03的滴定酸度值分別為80° T、82.0° T、78° T、81. 0° T，差距不明顯；12h滴定酸度 值分別為130.0° TU35. 0° T、117.3° T、123.0° T，差距比較明顯。說(shuō)明菌株N02、N03 的耐酸性有所減低，對(duì)于延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期是非常有利的。對(duì)目的菌株N02、N03進(jìn)行傳代培養(yǎng)10代，測(cè)定12°C儲(chǔ)藏15d后的滴定酸度，結(jié)果 如表，各代的產(chǎn)酸能力基本一致，變化不大，這充分說(shuō)明了該誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性好，不 容易發(fā)生退變。表5N02、N03突變菌株遺傳穩(wěn)定性
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權(quán)利要求
一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法，通過(guò)原生質(zhì)體融合方法制備得到突變菌株作為酸奶發(fā)酵劑，其特征在于包括以下步驟(a)從新疆酸奶疙瘩中篩選到發(fā)酵性能好的乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)，將乳酸桿菌(LN1)定義為出發(fā)菌株；(b)將乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)分別按3％比例接種于脫脂乳培養(yǎng)基中形成菌液，42℃恒溫培養(yǎng)12h，經(jīng)反復(fù)傳代直至達(dá)到要求的活力；(c)制備乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)的原生質(zhì)體；(d)將乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)的原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體融合；(e)對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選，得到具備較強(qiáng)的抗后酸化能力的目的菌株(NO2)、(NO3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的方法，其特征在于步驟(b)所述的 要求的活力是指在42°C發(fā)酵6小時(shí)酸度達(dá)到70. 00-120° T的情況。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的方法，其特征在于步驟(c)所述的 原生質(zhì)體制備，首先分別取乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液10mL，離心 并以原生質(zhì)體穩(wěn)定液洗滌兩次，原生質(zhì)體穩(wěn)定液使用體積與菌液體積相同，收集菌體，轉(zhuǎn)入 10cm培養(yǎng)皿中；乳酸桿菌(LN1)的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度為15.00mg/mL，酶解 細(xì)胞壁的時(shí)間為60min，酶解溫度為44°C ；乳酸球菌(SW)的原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶 濃度為3. 20mg/mL，酶解細(xì)胞壁的時(shí)間為60min，酶解溫度為44°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的方法，其特征在于步驟(d)所述的 原生質(zhì)體融合具體為對(duì)乳酸桿菌(LN1)和乳酸球菌(SN1)的原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱力滅活， 各取4ml滅活的原生質(zhì)體混合，放置5min后離心，重懸于8ml 35% PEG6000溶液中，37°C水 浴保溫2min，離心，洗滌2次，重懸于8ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的方法，其特征在于步驟(e)具體為 取步驟(d)中制備得到的原生質(zhì)體穩(wěn)定液0. lml加入到半固體高滲再生培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入 滅菌培養(yǎng)皿中置37°C下培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落；挑取長(zhǎng)出的菌落涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，在 37°C下培養(yǎng)12h，選取菌落分布均勻，菌數(shù)在100 200之間的平皿，通過(guò)影印法接種到MRS 瓊脂培養(yǎng)基中，分別在20°C和37°C下培養(yǎng)，選取在37°C下生長(zhǎng)，而在20°C下不長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩 慢的菌落為目的菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種延長(zhǎng)酸奶儲(chǔ)藏期的酸奶發(fā)酵劑的制備方法，屬于食品保藏領(lǐng)域，該方法通過(guò)對(duì)從新疆牧民自制酸奶疙瘩中分離出的乳酸桿菌和乳酸球菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選，得到目的菌株，利用該菌株作為酸奶發(fā)酵劑制備酸奶，從而提高了酸奶的保藏期。應(yīng)用本發(fā)明的提供的發(fā)酵劑制備的酸奶保鮮期長(zhǎng)，有利于酸奶運(yùn)輸量的增加、成本的降低，產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101874519SQ20091023807
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者孫玉清, 王芳, 羅紅霞 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院