專利名稱：一種臨床標(biāo)本中病原菌基因鑒定前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床標(biāo)本病原微生物基因檢測，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
國內(nèi)外報道的標(biāo)本前處理方法比較少，沒有專門針對各種不同臨床原始標(biāo)
本的前處理方法。目前主要應(yīng)用到臨床的標(biāo)本前處理有堿裂解法、免疫磁珠 法。堿裂解法利用堿液使標(biāo)本中蛋白質(zhì)發(fā)生變性溶解于堿液中，通過洗脫堿液 達(dá)到分離病原微生物基因的目的。免疫磁珠法通過磁珠吸附蛋白質(zhì)與其它干擾 因子達(dá)到分離病原微生物基因的目的。
臨床利用基因直接鑒定臨床體液標(biāo)本中病原菌實(shí)際應(yīng)用很少，存在的最大 技術(shù)難點(diǎn)在于臨床體液標(biāo)本中含有蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子等干擾因素，而研究證明 蛋白質(zhì)和細(xì)胞中的人類基因組DNA都會干擾抑制病原菌的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。這 種抑制作用在膿性的標(biāo)本尤為突出。免疫磁珠法是目前國內(nèi)最流行的處理方法， 但其抗干擾能力弱，對純培養(yǎng)的細(xì)菌效果好，不適合直接用于臨床標(biāo)本。傳統(tǒng) 的堿裂解法裂解不徹底，很難裂解膿性標(biāo)本。同時堿裂解時間長，容易破壞細(xì) 菌基因，降低提取效率。
熒光定量PCR是1995年美國PE公司發(fā)明一種核酸定量技術(shù)，在普通PCR
的基礎(chǔ)上使用熒光探針達(dá)到核酸定量的目的。具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、操作 簡單的特點(diǎn)，目前臨床廣泛應(yīng)用于血清病毒定量檢查。
雖然熒光定量PCR直接鑒定臨床標(biāo)本中病毒在臨床應(yīng)用較多，但應(yīng)用于其 它病原微生物如細(xì)菌和真菌檢測的卻很少。而臨床感染性標(biāo)本很常見，檢測方 法主要為傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定。由于培養(yǎng)鑒耗時長，臨床往往在未接到實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)報 告時就已經(jīng)開始經(jīng)驗(yàn)用藥進(jìn)行到治療，造成了抗生素的不合理使用'不但加重 患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且還會產(chǎn)生對抗生素的耐藥問題，對后面的治療帶來負(fù)面 的影響。同時有相當(dāng)?shù)牟≡⑸矬w外培養(yǎng)困難，易產(chǎn)生漏診。真菌生長緩慢,報告時間長和易漏診的矛盾更加突出。因此，提供一種能夠在短時間內(nèi)迅速檢 測出臨床標(biāo)本中病原微生物的方法，從而指導(dǎo)臨床用藥，已經(jīng)成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng) 域急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種臨床標(biāo)本直接病原菌基因鑒定前處理方法。 本發(fā)明所涉及的臨床標(biāo)本直接病原菌鑒定前處理方法是釆用兩步裂解法。 所述的兩步裂解法是在單純堿裂解法基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的，在堿裂解前加一步胰 酶裂解步驟。有效的標(biāo)本前處理方法是基因鑒定技術(shù)的關(guān)鍵，只有在標(biāo)本前處 理中提取到了足量的病原菌核酸，才能進(jìn)行直接鑒定。兩步裂解法解決了這一 技術(shù)難點(diǎn)，為直接鑒定提供了可靠的技術(shù)保障。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的
(1) 胰蛋白酶裂解
lml標(biāo)本加入等量20mg/l的胰蛋白酶37°C 2 -4h至標(biāo)本基本液化，抽吸順暢。
(2) 堿裂解
再加入2ml4。/。NaOH 42°C lh, 12000rpm離心15min，去上清，生理鹽水 12000rpm洗滌兩遍取沉淀。向沉淀中加入25jli1雙蒸水與少量磁珠。再用反復(fù) 凍融法，95°C 10min,迅速置于-80。C 10min,再95°C 10min, 12000rpm5min
取上清即可。
適合濃度的胰酶既可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行裂解，又不會破壞微生物的細(xì)胞膜， 不會影響微生物基因的提取。而且經(jīng)胰酶堿裂解后的標(biāo)本，再進(jìn)行堿裂解更容 易的徹底充分，對膿性標(biāo)本效果也很理想。同時堿裂解時間也大幅縮短，減少 了對病原微生物的破壞。最后提取部分結(jié)合了磁珠法的優(yōu)勢，在除去標(biāo)本干擾 因素后，結(jié)合磁珠法進(jìn)行核酸提取。
本發(fā)明可以針對原核病原微生物與真核病原微生物的雙重?zé)晒舛縋CR 的應(yīng)用于臨床病原微生物檢測。具有快速、靈敏度高、操作簡單的特點(diǎn)，并且 可以同時檢測細(xì)菌和真菌，能夠快速報告臨床，指導(dǎo)臨床用藥。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的
1、 標(biāo)本鑒定前的處理
(1 ) lml標(biāo)本加入等量20mg/l的胰蛋白酶37°C 2 -4h至標(biāo)本基本液化，抽 吸順暢。
(2)再加入2ml 4%NaOH 42°C lh， 12000rpm離心15min,去上清，生 理鹽水12000rpm洗滌兩遍取沉淀。向沉淀中加入25^1雙蒸水與少量磁珠。再 用反復(fù)凍融法，95°C lOmin,迅速置于-80。C 10min，再95°C lOmin。 12000rpm 5min取5pl上清備用。
2、 熒光定量PCR擴(kuò)增選取原核生物16SrRNA基因通用引物上游5，-AGT TTG ATC TGG CTC AG -3 ，和下游5 ， — GGA CTA CTA CAG GGT ATC TAA T-3，；真核生物l 8 SrRNA基因間隔區(qū)通用引物上游5，-TCCGTAGGTGAA CCT GCG G-3 ，和下游5 ， - GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3 ，(均由北京萬 泰生物藥業(yè)有限公司提供)。兩對引物的的探針5，端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)分別 是ROX、 HEX , 3，端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)均為ECL IPSE。反應(yīng)體系為25pl組 分如下dNTPs2.0pl 、 10 xPCRBuffer2.5|il 、 MgC12 1.4|iil、 TaqDNA聚合酶 0.化1、原核微生物探針0.4^1、真核微生物探針0.4pl、MRP21 1.0pl、MRP22 l.Opl、 MRPp0.3)al、 ddH20 8 .0^1。最后,加入5 模板。蓋上塑料蓋，瞬時離心后，放 入熒光定量PCR儀中,按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行95 。C預(yù)變性5min , 94 。C3 0s、 55°C15s、 72°C40s擴(kuò)增40個循環(huán)，觀察結(jié)果。
臨床實(shí)驗(yàn)室可利用此方法直接提取標(biāo)本中的核酸，利用熒光定量P CR儀 進(jìn)行檢測。無熒光定量P CR儀的臨床醫(yī)院也可將擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳判斷 陰陽性，從而判別臨床標(biāo)本中是否存在病原微生物感染。有條件的實(shí)驗(yàn)室還可 以進(jìn)一 步進(jìn)行核酸測序判定病原菌的種類。
通過本發(fā)明所述的檢測方法，臨床醫(yī)院能在第一時間內(nèi)直接提取傳染性疾 病的各種原始標(biāo)本中的病原微生物基因，通過熒光定量PCR進(jìn)行臨床標(biāo)本病原 微生物的快速定量診斷，對于病人抗生素的使用具有重要意義?？股氐暮侠?使用減少耐藥率關(guān)系到國家衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展和人民群眾的切身利益。由于真菌的用藥譜較窄，及時診斷出是否存在真菌感染可以有效的提示臨床及早治療。


圖1—1為兩步裂解法處理后標(biāo)本PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果； 圖1—2為磁珠法結(jié)果； 圖1—3為堿裂解結(jié)果； 圖l一4為Maker;
圖2為熒光定量PCR檢測熒光曲線； 曲線1為原核生物ATCC25922大腸埃希氏菌熒光曲線； 曲線2為真核生物ATCC6528克柔假絲酵母菌熒光曲線； 圖3為檢測出的微生物電泳條帶；
圖3—1上端為原核病原微生物ATCC25922大腸埃希氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條 帶，下端為真核病原微生物ATCC6528克柔假絲酵母菌電泳條帶； 圖3—2為1000bp-100bp maker。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。 實(shí)施例1
試劑的準(zhǔn)備
選用下列試劑進(jìn)行本發(fā)明所述的微生物檢測4。/。NaOH堿裂解液，20mg/L 的胰酶，原核生物16SrRNA基因通用上下游探針5，-AGTTTGATCTGGCTC AG-3 ，和5 ，-GGA CTA CTA CAG GGT ATC TAA T-3 ，，真核生物18 S rRNA基因 間隔區(qū)通用上下游探針5， - TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3，和5， - GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3，，磁珠一管(以上均從北京萬泰生物藥業(yè)有限公 司購得)，標(biāo)準(zhǔn)品104、 105 、 106 、 107拷貝的指控品各一管(由中國藥品生 物制品檢定所生產(chǎn))。 實(shí)施例2
臨床標(biāo)本鑒定前的處理(1 )選取含有ATCC25922大腸埃希氏菌和ATCC6528克柔假絲酵母菌的 標(biāo)本lml加入等量20mg/l的胰蛋白酶37。C2h (3h或4h)至標(biāo)本基本液化，抽 吸順暢。
(2)再加入2ml 4%NaOH 42°C lh， 12000rpm離心15min,去上清，生 理鹽水12000rpm洗滌兩遍取沉淀。向沉淀中加入25pl雙蒸水與少量磁珠。再 用反復(fù)凍融法，95°C 10min,迅速置于-80。C 10min,再95°C 10min。 12000rpm 5min取5 pl上清備用。 實(shí)施例3
臨床標(biāo)本中病原微生物的檢測
1、 實(shí)施例2中的標(biāo)本鑒定前的處理
2、 熒光定量擴(kuò)增選取ATCC25922大腸埃希氏菌16SrRNA基因通用引 物上游5， - AGT TTG ATC TGG CTC AG -3，，下游5， - GGA CTA CTA CAG GGTATCTAAT-3，。 ATCC6528克柔假絲酵母菌1 8 SrRNA基因間隔區(qū)通用 引物上游5， 一 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3',下游5， 一 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3'。兩對引物的的探針5，端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)分別是 ROX、 HEX，3，端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)均為ECLIPSE (由北京萬泰生物藥業(yè)有 限公司提供)。反應(yīng)體系為2 5pl組分如下dNTPs 2.0|il 、 10 xpCR Buffer 2.5^1 、 MgC12 1.4pl、 Taq DNA聚合酶0.4^1、 ATCC25922大腸埃希氏菌探針 0.4pl、 ATCC6528克柔假絲酵母菌探針0.4pl、MRP21 1.0pl、MRP22 1.0pl、MRPp OJ(il、 ddH20 8.0nl。最后,力口入5pl模板。蓋上塑料蓋，瞬時離心后，放入熒 光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行95 。C預(yù)變性5min,94 。C3 0 s、55°C 15s、 72。C40s擴(kuò)增40個循環(huán)，觀察結(jié)果。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種臨床標(biāo)本中病原菌基因鑒定前處理方法，包括以下步驟(1)胰蛋白酶裂解；(2)堿裂解。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床標(biāo)本中病原菌基因鑒定前處理方法，其特征 在于，胰蛋白酶裂解是在標(biāo)本中加入等量20mg/l的胰蛋白酶37°C 2 -4h至標(biāo)本 基本液化，抽吸順暢。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的臨床標(biāo)本中病原菌基因鑒定前處理方法，其特征 在于，堿裂解是在胰蛋白酶裂解的基礎(chǔ)上再4。/。NaOH 42°C lh，離心，去上清， 生理鹽水洗滌、離心，2次取沉淀，向沉淀中加入雙蒸水與少量磁珠，再用反 復(fù)凍融法，95°C 10min,迅速置于-80。C 10min,再95°C 10min,離心，取上 清即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種臨床標(biāo)本直接病原菌基因鑒定前處理方法。本發(fā)明的臨床標(biāo)本中病原菌基因鑒定前處理方法采用兩步裂解法，包括胰蛋白酶裂解和堿裂解。采用本發(fā)明的方法處理的標(biāo)本，可以快速的檢測出臨床標(biāo)本中的病原微生物，具有靈敏度高、操作簡單的特點(diǎn)，能夠合理地指導(dǎo)臨床用藥。
文檔編號C12N15/10GK101649318SQ20091015740
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者魯辛辛 申請人:魯辛辛